CN115894427A

CN115894427A - 近红外频率上转换荧光探针及其制备方法和在检测生物硫醇中的应用

Info

Publication number: CN115894427A
Application number: CN202211461378.2A
Authority: CN
Inventors: 吴勇权; 马晓; 曾红; 李勋
Original assignee: Gannan Normal University
Current assignee: Gannan Normal University
Priority date: 2022-11-17
Filing date: 2022-11-17
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2042-11-17
Also published as: CN115894427B

Abstract

本发明提供了近红外频率上转换荧光探针及其制备方法和在检测生物硫醇中的应用，属于荧光探针技术领域。在生物硫醇存在的环境下，本发明提供的近红外频率上转换荧光探针中的2,4‑二硝基苯磺酰基会水解为羟基，生成具有强荧光发射能力的水解产物，从而实现生物硫醇的快速且灵敏性检测。此外，本发明提供的近红外频率上转换荧光探针用于生物硫醇荧光检测时，既具有下转换680nm激发的荧光增强效果，又具有808nm激发上转换荧光增强特性，在荧光成像时生物组织的穿透力更强，因此具有较好的荧光成像效果。

Description

近红外频率上转换荧光探针及其制备方法和在检测生物硫醇中的应用

技术领域

本发明涉及荧光探针技术领域，尤其涉及近红外频率上转换荧光探针及其制备方法和在检测生物硫醇中的应用。

背景技术

半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是含有巯基官能团的生物硫醇，在许多生理过程中发挥着重要作用，这些生物硫醇的水平异常与许多疾病高度相关，如阿尔茨海默氏病、心血管疾病、骨质疏松症、癌症、肝损伤、白细胞丢失等，它们在人类的生理和病理学中具有特殊的意义。传统的检测小分子生物硫醇的方法有电化学、高效液相色谱法和质谱法，由于这些方法成本高、操作繁琐，未能广泛应用于生物硫醇的检测。因此在生理条件下构建一种快速且灵敏检测生物硫醇的荧光探针具有广阔的应用前景。

目前为止，已有许多荧光成像探针可用于生物硫醇的检测，多数都是采用斯托克斯荧光(即下转换荧光)检测方法，被短波长光激发后发射出长波长的荧光。当探针在体内应用时，光学成像质量会受到激发光波长的影响，在近红外区域激发可以提供可见光不能达到的最佳穿透深度，对所有生物分子的吸光度可以达到很低。反斯托克斯的频率上转换发光(FUCL)染料具有较高的吸收率和可调的激发和发射波长，结构易于修饰，可以避免染料的光漂白，减少自荧光，加深穿透深度，光稳定性较好。在大于800nm的照射下激发的反斯托克斯发光，仪器误差会被最小化，具有良好的灵敏度和准确性，并且大于800nm波长的能量密度偏低，能有效地减少光对生物组织的损伤，非常适合荧光传感和荧光成像。但目前报道的在近红外区同时实现下转换发光策略和上转换发光策略的荧光材料种类有限。因此，开发一种既能对生物硫醇有快速响应，又能在近红外区域激发(808nm)的上转换荧光探针仍然是一个重大的挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供近红外频率上转换荧光探针及其制备方法和在检测生物硫醇中的应用，本发明提供的近红外频率上转换荧光探针能够实现生物硫醇的快速且灵敏性检测，既具有下转换680nm激发的荧光增强效果，同时又具有808nm激发上转换荧光增强特性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种近红外频率上转换荧光探针，具有式I所示结构：

本发明提供了上述技术方案述近红外频率上转换荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

将化合物II与化合物III进行Knoevenagel缩合反应，得到具有式I所示结构的近红外频率上转换荧光探针；所述化合物II具有式II所示结构，所述化合物III具有式III所示结构：

优选地，所述化合物II与化合物III的摩尔比为1：(1～1.2)。

优选地，所述Knoevenagel缩合反应在保护气氛以及缚酸剂和有机溶剂存在条件下进行。

优选地，所述Knoevenagel缩合反应的温度为75～90℃，时间为8～12h。

优选地，所述化合物II的制备方法包括以下步骤：

将4-(二乙氨基)水杨醛与2,4-二硝基苯磺酰氯进行取代反应，得到化合物II。

优选地，所述对4-(二乙氨基)水杨醛与2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1：(1～1.5)；所述取代反应在保护气氛以及缚酸剂和有机溶剂存在条件下进行。

本发明提供了上述技术方案所述近红外频率上转换荧光探针在检测生物硫醇中的应用。

优选地，所述生物硫醇为半胱氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。

优选地，在检测所述生物硫醇时，检测条件包括：激发波长为680nm或808nm，收集700～850nm范围内的荧光强度。

本发明提供了一种具有式I所示结构的近红外频率上转换荧光探针(记为荧光探针RhDN)。在生物硫醇存在的环境下，本发明提供的近红外频率上转换荧光探针中的2,4-二硝基苯磺酰基会水解为羟基，生成具有强荧光发射能力的水解产物，从而实现生物硫醇的快速且灵敏性检测。此外，本发明提供的近红外频率上转换荧光探针用于生物硫醇荧光检测时，既具有下转换680nm激发的荧光增强效果，又具有808nm激发上转换荧光增强特性，在荧光成像时生物组织的穿透力更强，因此具有较好的荧光成像效果。

本发明提供了所述近红外频率上转换荧光探针的制备方法，反应步骤少、操作简单，条件易控。

附图说明

图1为荧光探针RhDN待测液荧光强度与三种生物硫醇的响应时间曲线图，激发波长为680nm(A)或808nm(B)；

图2为荧光探针RhDN与三种生物硫醇在不同浓度条件下的紫外吸收光谱和荧光发射光谱图，激发波长为680nm；

图3为荧光探针RhDN待测液的荧光强度与三种生物硫醇在不同浓度条件下荧光强度变化图和线性关系图，激发波长为680nm；

图4为荧光探针RhDN与三种生物硫醇在不同浓度条件下的上转换发光光谱图和荧光强度变化图，激发波长为808nm；

图5为荧光探针RhDN的上转换发光强度与三种生物硫醇在不同浓度条件下的线性关系图，激发波长为808nm；

图6为荧光探针RhDN选择性检测三种生物硫醇的荧光强度柱状图，激发波长为680nm(A)或808nm(B)；

图7为荧光探针RhDN与不同氨基酸作用后再加三种生物硫醇后的荧光强度柱状图，激发波长为680nm(A)或808nm(B)；

图8为荧光探针RhDN在孵育活细胞不同时间下的荧光成像图；

图9为荧光探针RhDN在活细胞中外源性与内源性硫醇的荧光成像图。

具体实施方式

本发明提供了上述技术方案所述近红外频率上转换荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为已知化合物，可以由商业途径获得，也可以按相关文献设计方法合成。

本发明首先对所述化合物II以及化合物III的制备方法进行详细说明。

在本发明中，所述化合物II的制备方法优选包括以下步骤：

在本发明中，所述对4-(二乙氨基)水杨醛与2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比优选为1：(1～1.5)，更优选为1：(1～1.2)。在本发明中，所述取代反应优选在保护气氛以及缚酸剂和有机溶剂存在条件下进行。在本发明中，所述缚酸剂优选包括吡啶、三乙胺或碳酸铯，更优选为三乙胺；所述缚酸剂与4-(二乙氨基)水杨醛的用量比优选为(400～600)μL：1mmol，更优选为(450～500)μL：1mmol。在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷，具体可以为无水二氯甲烷；所述有机溶剂与4-(二乙氨基)水杨醛的用量比优选为(12～20)mL：1mmol，更优选为(15～17)mL：1mmol。

本发明优选将4-(二乙氨基)水杨醛、2,4-二硝基苯磺酰氯、缚酸剂与有机溶剂混合，得到取代反应料液。在本发明中，所述4-(二乙氨基)水杨醛、2,4-二硝基苯磺酰氯、缚酸剂和有机溶剂混合优选是将4-(二乙氨基)水杨醛、缚酸剂和部分有机溶剂在保护气氛下进行混合，得到第一混合物；将2,4-二硝基苯磺酰氯和剩余有机溶剂混合，得到第二混合物；在0℃条件下将所述第一混合物逐滴加入第二混合物中，得到取代反应料液。在本发明中，所述部分有机溶剂优选为有机溶剂总量的60～70％，更优选为67％。

得到取代反应料液后，本发明将所述取代反应料液进行取代反应，得到取代产物体系。在本发明中，所述取代反应优选包括依次进行第一阶段反应和第二阶段反应；所述第一阶段反应的温度优选为0℃，时间优选为1～2h，更优选为1.5h；所述第二阶段反应的温度优选为20～30℃，具体可以为室温(25℃)，时间优选为1～3h，更优选为2～3h。在本发明中，所述取代反应优选在保护气氛以及搅拌条件下进行；本发明对于所述搅拌没有特殊的限定，能够保证取代反应顺利进行即可。

完成所述取代反应后，本发明优选将所得取代产物体系用二氯甲烷稀释，采用去离子水进行萃取，萃取完成后所得有机相采用无水硫酸钠干燥，之后抽滤，将滤液进行减压旋蒸除去溶剂，得到粗产物；以石油醚-乙酸乙酯混合物为洗脱剂将所述粗产物进行柱层析分离，将所得洗脱液进行减压旋蒸除去洗脱剂，得到的红色固体产物即为化合物II。在本发明中，所述萃取的次数优选为3次；所述干燥的时间优选为15～20min；所述洗脱剂中石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为3:1。

在本发明中，所述化合物III制备方法优选包括以下步骤：在0℃条件下，向50mL浓度为96～98wt％的浓硫酸中以2～3mL/min速率滴加3.0～3.5mL环己酮，随后在搅拌的同时少量多次的加入15～16.5mmol的4-二乙氨基酮酸，所述4-二乙氨基酮酸的加料过程持续1～2h，加料完毕后，将所得反应体系转移至氮气氛围中，在85～95℃条件下进行亲核加成反应2～3h；反应结束后，将所得产物体系以2～3mL/min速率加入装有冰的烧杯中，然后将3～4mL浓度为70wt％的高氯酸溶液加入所述烧杯中，等固体完全析出后，减压抽滤，用蒸馏水多次洗涤后干燥，得到红棕色固体，即为化合物III的粗产物，无需进一步纯化，直接用于下一步反应。在本发明中，所述高氯酸溶液中高氯酸的作用是使产物成盐，析出固体；即所述化合物III中具体是由高氯酸根提供负电荷。

得到化合物II与化合物III后，本发明将所述化合物II与化合物III进行Knoevenagel缩合反应，得到具有式I所示结构的近红外频率上转换荧光探针。在本发明中，所述化合物II与化合物III的摩尔比优选为1：(1～1.2)。在本发明中，所述Knoevenagel缩合反应优选在保护气氛以及缚酸剂和有机溶剂存在条件下进行。在本发明中，所述Knoevenagel缩合反应用缚酸剂优选包括醋酸钾或三乙胺，更优选为醋酸钾；所述缚酸剂与化合物II的摩尔比优选为(1～2)：1，更优选为(1.2～1.4)：1。在本发明中，所述Knoevenagel缩合反应用有机溶剂优选包括乙酸酐或乙酸，更优选为乙酸；所述有机溶剂与化合物II的用量比优选为(6～9)mL：1mmol，更优选为(6～7)mL：1mmol。

本发明优选将化合物II、化合物III、缚酸剂与有机溶剂混合，进行Knoevenagel缩合反应。在本发明中，所述Knoevenagel缩合反应的温度优选为75～90℃，更优选为75～80℃；时间优选为8～12h，更优选为10～12h。在本发明中，所述Knoevenagel缩合反应优选在保护气氛、搅拌条件下进行；本发明对于所述搅拌没有特殊的限定，能够保证Knoevenagel缩合反应顺利进行即可。

完成所述Knoevenagel缩合反应后，本发明优选向所得产物体系中加入去离子水，在搅拌条件下采用碳酸氢钠调节体系的pH值为6～7(即，呈弱酸性或中性)，此时体系中有大量固体析出，减压抽滤得到固体粗产物；以二氯甲烷-甲醇混合物为洗脱剂对所述固体粗产物进行柱层析分离，将所得洗脱液进行减压旋蒸除去洗脱剂，得到的蓝色固体即为具有式I所示结构的近红外频率上转换荧光探针。在本发明中，所述洗脱剂中二氯甲烷与甲醇体积比优选为20:1。本发明提供的具有式I所示结构的近红外频率上转换荧光探针中具体是由高氯酸根提供负电荷。

本发明对制备所述近红外频率上转换荧光探针时所需保护气体种类没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的保护气体即可，具体如氮气。

在本发明的实施例中，制备具有式I所示结构的荧光探针的反应式具体如下：

本发明提供了上述技术方案所述近红外频率上转换荧光探针在检测生物硫醇中的应用。在本发明中，所述生物硫醇优选为半胱氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。在本发明中，在检测所述生物硫醇时，检测条件优选包括：激发波长(λ_ex)为680nm或808nm，收集700～850nm范围内的荧光强度(即发射光的波长为700～850nm)。

本发明提供的近红外频率上转换荧光探针能够实现生物硫醇的快速、灵敏性检测，具体的，如下反应式所示：

本发明以氧杂蒽为母体、2,4-二硝基苯磺酰基为检测基团设计合成了所述近红外频率上转换荧光探针(RhDN)。在生物硫醇存在下，2,4-二硝基苯磺酰基会水解为羟基，该水解产物(RhDN-OH)可以发射出近红外荧光。通过与生物硫醇响应后的近红外频率上转换荧光探针荧光强度的变化使其可以实现对生物硫醇的快速、灵敏性检测。此外，频率上转换性能可以避免荧光探针的光漂白，减少自荧光，加深穿透深度，非常适合荧光传感和荧光成像。

本发明提供的近红外频率上转换荧光探针能够对生物硫醇进行检测，在本发明的实施例中，优选以二甲基亚砜-磷酸盐缓冲液(简写为DMSO/PBS，二甲基亚砜与磷酸盐缓冲液体积比为3：7，pH＝7.4)为溶剂，测试了RhDN在加入三种生物硫醇(Cys、Hcy和GSH)前后的荧光强度变化值，结果显示RhDN荧光强度与三种生物硫醇浓度呈良好的线性关系；同时，本发明提供的RhDN对三种生物硫醇具有较快的响应速率，RhDN与Cys或GSH反应在7min内即可达到稳定，与Hcy反应在25min可以达到稳定；而且RhDN响应三种生物硫醇基本不受其他氨基酸(谷氨酰胺、苯丙氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、络氨酸、甘氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苏氨酸)的干扰。

此外，MCF-7细胞在RPMI 1640培养基中只用荧光探针RhDN，可以看到微弱的荧光；然而，MCF-7细胞在RPMI 1640培养基中用半胱氨酸预孵育，再用荧光探针RhDN进一步孵育后，荧光成像时观察到MCF-7细胞上有明显的荧光信号。MCF-7细胞在RPMI 1640培养基中用N-乙基马来酰亚胺预孵育，再用荧光探针RhDN进一步孵育后，观察到更微弱的荧光信号。这说明本发明提供的近红外频率上转换荧光探针能够用于活细胞中生物硫醇的检测。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将2,4-二硝基苯磺酰氯266mg(1mmol)溶于无水二氯甲烷(5mL)中，在冰浴(0℃)条件下，逐滴滴入具体氮气保护且装有4-(二乙氨基)水杨醛200mg(1mmol)、无水二氯甲烷(10mL)和三乙胺(500μL)的圆底烧瓶中，加料完毕后在氮气保护中于冰浴条件下搅拌反应1.5h，之后升温至室温(25℃)，在氮气保护中于室温条件下搅拌反应3h；反应结束后将所得产物体系转移至分液漏斗中，用二氯甲烷(15mL)稀释，采用去离子水(15mL)进行萃取，共萃取三次，萃取完成后所得有机相采用无水硫酸钠干燥15min，之后抽滤，将滤液进行减压旋蒸除去溶剂，得到粗产物；以石油醚-乙酸乙酯混合物(石油醚与乙酸乙酯的体积比为3:1)为洗脱剂将所述粗产物进行柱层析分离，将所得洗脱液进行减压旋蒸除去洗脱剂，得到红色固体产物。

对所述红色固体产物进行表征，表征数据具体如下：¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.73(s,1H),8.68(d,J＝2.2Hz,1H),8.56(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),8.37(d,J＝8.6Hz,1H),7.70(d,J＝9.0Hz,1H),6.65(dd,J＝9.0,2.5Hz,1H),6.53(d,J＝2.5Hz,1H),3.45(q,J＝7.2Hz,4H),1.24(t,J＝7.1Hz,6H)。

由上述表征数据可知，所述红色固体产物为化合物II：

将环己酮(3.3mL，32mmol)以2.5mL/min速率滴加到0℃的浓硫酸(浓度为98wt％，50mL)中，然后在搅拌条件下分批缓慢加入4-二乙氨基酮酸(5.0mg，16mmol)，所述4-二乙氨基酮酸的加料过程持续1h，加料完毕后，将所得反应体系转移至氮气氛围中，在90℃反应2h；反应结束后冷却至室温(25℃)，将所得产物体系以3mL/min速率倒入200g的冰块中，加入高氯酸溶液(浓度为70wt％，3.5mL)，此时析出大量固体，减压抽滤并用冷水洗涤，之后于真空干燥箱干燥，得到的红棕色固体即为化合物III的粗产物，无需进一步纯化，直接用于下一步反应。

将化合物II(1mmol)、化合物III(1mmol)、醋酸钾(1.4mmol)和乙酸(6mL)加入到圆底烧瓶中，在氮气保护中加热至75℃，在搅拌条件下进行Knoevenagel缩合反应12h；Knoevenagel缩合反应结束后，将所得产物体系加入到150mL去离子水中，之后采用碳酸氢钠调节体系pH值为7，此时体系中有大量固体析出，减压抽滤，得到固体粗产物；以二氯甲烷-甲醇混合物(二氯甲烷与甲醇体积比为20:1)为洗脱剂对所述固体粗产物进行柱层析分离，将所得洗脱液进行减压旋蒸除去洗脱剂，得到蓝色固体产物。

对所述蓝色固体产物进行表征，表征数据具体如下：¹HNMR(400MHz,Methanol-d₄)δ8.54–8.48(m,2H),8.17–8.06(m,2H),7.72–7.59(m,3H),7.43(d,J＝9.0Hz,1H),7.24–7.19(m,1H),7.12(d,J＝2.5Hz,2H),6.85–6.75(m,2H),6.70(d,J＝2.6Hz,1H),3.68(p,J＝6.8Hz,4H),3.49(dt,J＝8.3,6.6Hz,4H),2.65(s,3H),2.39(s,1H),2.18(s,1H),1.77(dd,J＝8.9,4.6Hz,1H),1.34(t,J＝7.1Hz,6H),1.22(t,J＝7.0Hz,6H).HRMS(ESI)[M+]⁺C₄₁H₄₁N₄O₁₀S⁺:calcd,781.2538；found,781.2532。

由上述表征数据可知，所述蓝色固体产物为具有式I所示结构的近红外频率上转换荧光探针(即为荧光探针RhDN)：

实施例2

以二甲基亚砜-磷酸盐缓冲液(简写为DMSO/PBS，二甲基亚砜与磷酸盐缓冲液体积比为3:7，pH＝7.4)为溶剂，测试实施例1制备的荧光探针RhDN在同一摩尔当量三种生物硫醇条件下的荧光强度随时间的变化情况，具体如下：

将荧光探针RhDN溶于DMSO/PBS中，得到浓度为10μmol/L的RhDN溶液，在37℃条件下向所述RhDN溶液中加入一定量的半胱氨酸(1mmol/L，20μL)、同型半胱氨酸(10mmol/L，2μL)或谷胱甘肽(10mmol/L，2μL)标准溶液，在37℃条件下对所得待测液分别进行30min荧光检测(λ_ex＝680nm或λ_ex＝808nm)，得到752nm/760nm处的荧光强度与三种生物硫醇的响应时间关系。

图1为荧光探针RhDN待测液荧光强度与三种生物硫醇的响应时间曲线图，激发波长为680nm(A)或808nm(B)。由图1可知，当用1当量的三种生物硫醇分别处理RhDN溶液后，所得待测液的荧光强度迅速增强，且在较短时间(半胱氨酸或谷胱甘肽约7min、同型半胱氨酸约25min)内即可达到稳定，说明本发明提供的荧光探针对生物硫醇具有较快的响应速率，表明该荧光探针可以作为生物硫醇的实时检测荧光探针。

实施例3

以二甲基亚砜-磷酸盐缓冲液(简写为DMSO/PBS，二甲基亚砜与磷酸盐缓冲液体积比为3:7，pH＝7.4)为溶剂，测试实施例1制备的荧光探针RhDN在不同浓度的三种生物硫醇下的荧光响应性能，具体如下：

将荧光探针RhDN溶于DMSO/PBS中，得到浓度为10μmol/L的RhDN溶液，在37℃条件下向所述RhDN溶液中依次滴加一定量的半胱氨酸(1mmol/L)、同型半胱甘酸(10mmol/L)或谷胱甘肽(10mmol/L)标准溶液，使所得待测液中半胱氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽的浓度依次为0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L、10μmol/L、11μmol/L、12μmol/L，然后将所述待测液分别依次进行荧光检测(λ_ex＝680nm或λ_ex＝808nm)，通过分析752nm或760nm处的荧光强度与三种生物硫醇浓度的关系，评估所述荧光探针RhDN对生物硫醇的响应性能。

图2为荧光探针RhDN与三种生物硫醇在不同浓度条件下的紫外吸收光谱和荧光发射光谱图，激发波长为680nm；图3为荧光探针RhDN待测液的荧光强度与三种生物硫醇在不同浓度条件下荧光强度变化图和线性关系图，激发波长为680nm。由图2和图3可知，在激发波长为680nm时，随着Cys、Hcy或GSH浓度的增大，待测液的荧光强度逐渐增强，并且三种生物硫醇浓度均为7μmol/L时达到平衡状态。待测液的荧光强度与Cys、Hcy或GSH分别呈良好的线性关系(R_Cys ²＝0.994、R_Hcy ²＝0.995、R_GSH ²＝0.991)，可采用公式Y＝3730.2X+2685.7、Y＝3235.9X+3109.2或Y＝2537.1X+3531.7表示，其中，Y为752nm处的荧光强度，X为Cys、Hcy或GSH的浓度，计算出检出限分别为0.22μM、0.26μM、0.33μM。

图4为荧光探针RhDN与三种生物硫醇在不同浓度条件下的上转换发光光谱图和荧光强度变化图，激发波长为808nm；图5为荧光探针RhDN的上转换发光强度与三种生物硫醇在不同浓度条件下的线性关系图，激发波长为808nm。由图4和图5可知，在激发波长为808nm时，随着Cys、Hcy或GSH浓度的增大，待测液的荧光强度逐渐增强，并且三种生物硫醇浓度均为7μmol/L时达到平衡状态。待测液的荧光强度与Cys、Hcy或GSH分别呈良好的线性关系(R_Cys ²＝0.995、R_Hcy ²＝0.993、R_GSH ²＝0.992)，可采用公式Y＝71221.7X+75282.5、Y＝52578.8X+70863.0或Y＝62965.7X+75844.5表示，其中，Y为760nm处的荧光强度，X为Cys、Hcy或GSH的浓度，计算出检出限分别为75.1nM、101.8nM、84.9nM。

实施例4

以二甲基亚砜-磷酸盐缓冲液(简写为DMSO/PBS，二甲基亚砜与磷酸盐缓冲液体积比为3:7，pH＝7.4)为溶剂，以不同氨基酸作为干扰分析物，测试实施例1制备的荧光探针RhDN对生物硫醇检测的选择性，具体如下：

将荧光探针RhDN(2μL，10mmol/L)溶于装有2mL DMSO/PBS的塑料管中，向所得RhDN溶液中分别添加半胱氨酸(20μL，1mmol/L)水溶液、同型半胱氨酸(2μL，10mmol/L)水溶液或谷胱甘肽(2μL，10mmol/L)水溶液以及干扰分析物谷氨酰胺(Gln)水溶液、苯丙氨酸(Phe)水溶液、天冬酰胺(Asn)水溶液、甲硫氨酸(Met)水溶液、丝氨酸(Ser)水溶液、亮氨酸(Leu)水溶液、脯氨酸(Pro)水溶液、天冬氨酸(Asp)水溶液、谷氨酸(Glu)水溶液、缬氨酸(Val)水溶液、络氨酸(Tyr)水溶液、甘氨酸(Gly)水溶液、精氨酸(Arg)水溶液、组氨酸(His)水溶液、异亮氨酸(Ile)水溶液、丙氨酸(Ala)水溶液、苏氨酸(Thr)水溶液，其中加入干扰分析物水溶液的量均为2μL，初始浓度均为10mmol/L；在37℃条件下将所得待测液分别进行荧光检测(λ_ex＝680nm或λ_ex＝808nm)。图6为荧光探针RhDN选择性检测三种生物硫醇的荧光强度柱状图，激发波长为680nm(A)或808nm(B)；由图6可知，当RhDN溶液中分别加入不同的干扰分析物时，只有三种生物硫醇表现出显著的荧光强度增强，而加入干扰分析物时待测液的荧光强度基本没有变化，这表明本发明提供的荧光探针RhDN可以检测三种生物硫醇，对其他氨基酸没有检测效果。

将荧光探针RhDN(2μL，10mmol/L)溶于装有2mL DMSO/PBS的塑料管中，向所得RhDN溶液中分别添加上述干扰分析物(2μL，10mmol/L)，在37℃条件下孵育30min作为待测液分别进行荧光检测(λ_ex＝680nm或λ_ex＝808nm)，随后加入半胱氨酸(20μL，1mmol/L)水溶液、同型半胱氨酸(2μL，10mmol/L)水溶液或谷胱甘肽(2μL，10mmol/L)水溶液在37℃下分别进行10min、20min、10min孵育，然后分别进行荧光检测(λ_ex＝680nm或λ_ex＝808nm)，通过分析752nm或760nm处的荧光强度评估各干扰分析物对探针RhDN检测生物硫醇的干扰性结果。图7为荧光探针RhDN与不同氨基酸作用后再加三种生物硫醇后的荧光强度柱状图，激发波长为680nm(A)或808nm(B)；由图7可知，当RhDN溶液中加入不同的干扰分析物时，待测液的荧光强度基本没有变化，随后加入三种生物硫醇后，荧光强度有明显的增强，这表明本发明提供的荧光探针RhDN在检测生物硫醇时不受其他氨基酸的干扰。

实施例5

分析实施例1制备的荧光探针RhDN在活细胞中的成像应用，具体如下：

将MCF-7细胞接种到玻片(Φ15mm)上，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃、5％二氧化碳条件下培养24h；移除培养基并用PBS缓冲液洗涤两次，加入1998μL的RPMI 1640培养基和2μL荧光探针RhDN溶液(10mmol/L)，在二氧化碳培养箱中共同孵育5min、15min、30min、60min；孵育完成后用PBS缓冲液洗涤三次，之后在激光共聚焦显微镜(Olympus FV1000)下对MCF-7细胞进行荧光成像。

图8为荧光探针RhDN在孵育活细胞不同时间下的荧光成像图；如图8所示，在635nm激发下，通过观察700～800nm处的荧光信号，细胞在5min时就可以看见荧光信号，孵育30min时细胞内荧光强度和60min时细胞内的荧光强度无明显变化，说明荧光探针RhDN可以在较短的时间内进入细胞，具有良好的细胞膜通透性。

实施例6

将MCF-7细胞接种到玻片(Φ15mm)上，加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃、5％二氧化碳条件下培养24h，将所得MCF-7细胞按照下述对照组和实验组进行处理：

作为对照组，在1998μLRPMI 1640培养基中添加2μL荧光探针RhDN溶液(10mmol/L)，将MCF-7细胞在所得RPMI 1640培养基中，于37℃、5％二氧化碳条件下培养30min。

作为实验组1，在1800μLRPMI 1640培养基中添加200μL半胱氨酸(1mmol/L)，将MCF-7细胞在所得RPMI 1640培养基中，于37℃、5％二氧化碳条件下培养60min，将所得MCF-7细胞用PBS洗涤三次除去多余的半胱氨酸；在1998μLRPMI 1640培养基中添加2μL荧光探针RhDN溶液(10mmol/L)，将洗涤后MCF-7细胞玻片放入在所得RPMI 1640培养基中，于37℃、5％二氧化碳条件下培养30min。

作为实验组2，在1996μLRPMI 1640培养基中添加4μLNEM(N-乙基马来酰亚胺，50mmol/L)，将MCF-7细胞在所得RPMI 1640培养基中，于37℃、5％二氧化碳条件下培养40min，将所得MCF-7细胞用PBS洗涤三次除去多余的NEM；在1998μLRPMI 1640培养基中添加2μL荧光探针RhDN溶液(10mmol/L)，将洗涤后MCF-7细胞玻片放入在所得RPMI 1640培养基中，于37℃、5％二氧化碳条件下培养30min。

用倒置共聚焦荧光显微镜(Olympus FV1000)对实验组和对照组培养后的MCF-7细胞进行荧光成像，结果见图9。图9为荧光探针RhDN在活细胞中外源性与内源性硫醇的荧光成像图。由图9可知，MCF-7细胞在RPMI1640培养基中只用荧光探针RhDN孵育时，有微弱的荧光信号；而当MCF-7细胞在RPMI 1640培养基中用100μmol/L的半胱氨酸预孵育，再用RhDN进一步孵育后，荧光成像时观察到MCF-7细胞上有明显的荧光信号增强效果；当MCF-7细胞在RPMI 1640培养基中用100μmol/L的NEM预孵育，再用RhDN进一步孵育后，荧光成像时观察到MCF-7细胞上有明显的荧光信号减弱效果。因此，通过细胞荧光成像的实验结果，表明本发明提供的荧光探针RhDN能够用于活细胞中生物硫醇的检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种近红外频率上转换荧光探针，具有式I所示结构：

2.权利要求1所述近红外频率上转换荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物II与化合物III的摩尔比为1：(1～1.2)。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述Knoevenagel缩合反应在保护气氛以及缚酸剂和有机溶剂存在条件下进行。

5.根据权利要求2～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述Knoevenagel缩合反应的温度为75～90℃，时间为8～12h。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物II的制备方法包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述对4-(二乙氨基)水杨醛与2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1：(1～1.5)；所述取代反应在保护气氛以及缚酸剂和有机溶剂存在条件下进行。

8.权利要求1所述近红外频率上转换荧光探针在检测生物硫醇中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生物硫醇为半胱氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，在检测所述生物硫醇时，检测条件包括：激发波长为680nm或808nm，收集700～850nm范围内的荧光强度。