CN115887311B

CN115887311B - 一种皮肤外用组合物及其作为蓝光吸收剂和抗氧化剂的应用

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Publication number: CN115887311B
Application number: CN202111162538.9A
Authority: CN
Inventors: 吴鲜鲜; 钟烨; 邹岳
Original assignee: Shanghai Natural Hall Group Co ltd
Current assignee: Shanghai Natural Hall Group Co ltd
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2025-01-17
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: CN115887311A

Abstract

本发明公开了一种皮肤外用组合物及其作为蓝光吸收剂和抗氧化剂的应用。该皮肤外用组合物包括诃子果提取物、EGCG和溶剂，所述诃子果提取物与所述EGCG的质量比为(0.01～300)：1；所述组合物中，所述诃子果提取物的质量分数为0.005％～1％，所述质量分数是指所述诃子果提取物与所述溶剂的质量比。本发明的组合物相较于相同质量的单一组分诃子果提取物，具有更好的蓝光吸收作用和抗氧化作用，而相较于相同质量的单一组分的EGCG具有很好的抗氧化作用。

Description

一种皮肤外用组合物及其作为蓝光吸收剂和抗氧化剂的应用

技术领域

本申请涉及一种皮肤外用组合物及其作为蓝光吸收剂和抗氧化剂的应用。

背景技术

人类长期处于一种日光暴露的环境，通常日光按照光谱划分，可分为三部分：紫外线（波长200~400nm）、可见光（波长400~800nm）和红外线（800nm~1mm）。其中对人体危害最大的属紫外线和可见光。紫外线根据波长可分为UVA(320~400nm)，UVB（290~320nm）和UVC（200~290nm），波长越短，生物危险性越大。UVC因为被臭氧层吸收，所以不会到达地球表面，对皮肤造成损伤。但UVA和UVB可以分别到达皮肤的真皮和表皮，诱导脂质过氧化、蛋白质氧化修饰等，对皮肤带来不同程度的损伤，导致皮肤过早老化。据报道，UVB是到达地球表面的太阳辐射中最具破坏性的成分，若皮肤广泛的地暴露于UVB会给皮肤带来各种不良影响，如水肿、晒伤、增生、炎症、红斑及免疫抑制等，并甚至可能发展成为皮肤癌。目前，关于UVB造成的皮肤损伤的相关分子机制已被研究，包括氧化应激、炎症反应和细胞凋亡。其中，氧化应激对皮肤损伤至关重要，占紫外线照射造成皮肤损伤的50%。在几种氧化应激源中，活性氧（ROS）被认为与紫外线辐射引起的皮肤损伤过程密切相关。

活性氧ROS是细胞有氧反应的产物，在吞噬细胞发挥吞噬和杀伤功能中起着重要的作用。一般来说，人体内ROS的水平处在一种动态平衡。然而，当机体受到外界刺激，如：UVB诱导的皮肤损伤模型中，某些主要抗氧化酶，包括过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶，以及限制酶谷胱甘肽被耗尽，导致机体内环境有氧代谢失调，机体内ROS稳态异常，就会引起氧化应激。氧化应激会损害细胞大分子成分，这些大分子成分主要负责调控与细胞损伤和死亡相关的信号传导和分化过程^[7]，例如：细胞成分（蛋白质、脂质和DNA）的损伤、基因组不稳定性（基因突变增加）、细胞死亡及遗传信息转录翻译等一系列生命过程。

产生ROS的主要物理介质除了上述提到的紫外线外，可见光也会对皮肤造成一定的伤害，而可见光中最具穿透力的是波长为400~500nm的高能量波段——蓝光。尤其是近几年，电子设备的普及虽然极大地方便了人们的日常生活，但同时也让人们暴露在蓝光下的机会越来越多，进而对人体的眼睛、皮肤产生一定的危害。蓝光可以穿透表皮到达真皮层，诱导细胞中线粒体产生活性氧自由基，引发DNA损伤，细胞受损，胞外基质减少，从而加速皮肤衰老。Ju Ah等人发现蓝光照射诱导了角质形成细胞中TRPV1的活化，从而诱导ROS的产生，并且随着蓝光的能量越高，细胞内生成ROS的水平越高，呈现能量依赖的趋势。早前，瑞士Rahn公司也利用蓝光诱导人角质形成细胞产生ROS，以验证其3种化妆品成分抵御蓝光的能力，结果也证明这3种活性物质都能有效降低蓝光诱导HACAT细胞产生的ROS。同时，由于长脉管酒渣鼻被认为是由皮肤ROS含量升高引起的，这种情况导致小血管形成和扩张，微循环增加，使得皮肤发红甚至引起炎症状态，尤其是在颧骨区。皮肤暴露在蓝光下可能会加剧这种状态。因此，在化妆品中添加抗氧化剂可以有效地减少皮肤中的ROS含量，缓解皮肤发红和酒渣鼻的现象。

综上，若要使人类皮肤免受ROS水平升高带来的损伤，化妆品成分中最好含有能减少紫外线及蓝光照射产生的额外ROS的活性物质。目前寻找安全有效的化学预防性化合物或者天然产物，来保护人们免受太阳辐射的伤害已经引起广泛注意。

诃子果提取物属天然来源，系君子科植物诃子树果实中有效成分。在蒙药和藏药中尤为常见，具有很好的抗菌，抗过敏，抗病毒的功效。并且它含有30%~40%的鞣质，具有良好的抗氧化效果。目前市面上蓝光吸收剂大多用于工业领域，化妆品领域较少，植物类蓝光吸收剂更是少见，而诃子在蓝光吸收方面未见报道。因此将诃子用于化妆品市场具有很好的推广潜力。

没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶茶多酚的主要组成成分，是从茶叶中提取出的儿茶素类单体，具有抗炎、抗菌、抗癌等功效。其中EGCG的抗氧化活性也常被报道。但由于它在储存过程中的不稳定性以及在高浓度时可能会对皮肤产生致敏性，所以旨在通过复配一种天然成分，在降低EGCG浓度的同时又能取得更好的抗氧化功效。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中没食子儿茶素没食子酸酯在高浓度时有致敏性、限制其用途的缺陷，而提供一种皮肤外用组合物及其作为蓝光吸收剂和抗氧化剂的应用。本发明的皮肤外用组合物相较于相同质量的单一组分诃子果提取物，具有更好的蓝光吸收和抗氧化作用，而相较于相同质量的单一组分的EGCG具有很好的抗氧化作用。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题。

一种皮肤外用组合物，其包括诃子果提取物、EGCG和溶剂，所述诃子果提取物与所述EGCG的质量比为（0.01~300）：1；

所述皮肤外用组合物中，所述诃子果提取物的质量分数为0.005%~1%，所述质量分数是指所述诃子果提取物与所述溶剂的质量比。

本发明中，所述的EGCG是指没食子儿茶素没食子酸酯。

本发明中，所述的EGCG可为本领域常规，例如纯度在99%以上的ECGG，或者是添加含EGCG的植物提取物，例如茶提取物，只要能够得到优异的有蓝光吸收作用和抗氧化作用的皮肤外用组合物即可。其中，所述诃子果提取物与所述EGCG的质量比为（0.01~300）：1中“所述EGCG”的质量是以纯EGCG的质量计。

本发明中，所述诃子果提取物与所述EGCG的质量比较佳地为（0.33~100）：1，例如2：1、3.33：1、1.67：1、10：1、15：1、20：1、23.3：1或50：1。

本发明中，所述诃子果提取物的质量分数较佳地为0.005%~0.3%，例如0.01%、0.03%、0.07%、0.1%或0.2%。

本发明中，所述诃子果提取物中较佳地含有30%~40%的鞣质，%为鞣质的质量与所述诃子果提取物总质量的百分比。

本发明中，所述诃子果提取物可为本领域常规，例如市售或自制得到。

其中，市售例如购自于美国sytheon公司。

其中，自制所述诃子果提取物的制备方法较佳地包括以下步骤：水提取诃子果粉末得滤渣和滤液，将所述滤渣进行水提取后，合并两次所述水提取得到的滤液；所述水提取时的固液比为1：（9~11），例如1：10。

所述诃子果粉末例如为泛喜马拉雅地带的干诃子果粉碎后过60目筛得到。

所述水提取的温度较佳地为90~100℃，例如90℃。

所述水提取的时间较佳地为1.5~2.5h，例如2h。

本发明中，所述EGCG的质量分数较佳地为0.001%~0.5%，例如0.005%、0.003%、0.002%、0.001%或0.3%，所述质量分数是指所述EGCG与所述溶剂的质量比。

本发明中，所述EGCG可为本领域常规的市售可得的EGCG。例如购自于上海汇朗公司。

本发明中，所述的溶剂可为本领域常规，一般为在化妆品中常用的溶剂，例如包括乙醇、异丙醇和水中的一种或多种。其中，所述的水一般为去离子水。

本发明中，所述的皮肤外用剂中一般还可包括分散剂。

本发明中，较佳地，所述诃子果提取物的质量分数为0.1%~0.2%，所述EGCG的质量分数为0.001%~0.002%。采用这一特定的组合相比于单一组分，能够实现更佳的蓝光吸收效果。

本发明中，较佳地，所述诃子果提取物的质量分数为0.005%~0.01%，所述EGCG的质量分数为0.003%~0.005%。采用这一特定的组合，相比于单一组分，具有更强的抗氧化性。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.005%，所述EGCG的质量分数为0.005%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.01%，所述EGCG的质量分数为0.003%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.03%，所述EGCG的质量分数为0.002%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.07%，所述EGCG的质量分数为0.003%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.1%，所述EGCG的质量分数为0.001%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.2%，所述EGCG的质量分数为0.002%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.01%，所述EGCG的质量分数为0.005%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.01%，所述EGCG的质量分数为0.001%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.005%，所述EGCG的质量分数为0.003%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.1%，所述EGCG的质量分数为0.03%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.1%，所述EGCG的质量分数为0.3%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为1%，所述EGCG的质量分数为0.3%。所述溶剂例如为去离子水。

本发明中，所述皮肤外用组合物的制备方法可为本领域常规，将所述诃子果提取物、所述EGCG和所述溶剂混合即可。

其中，所述混合的顺序例如可以是先将所述诃子果提取物与所述EGCG后，再与所述溶剂混合；还可以是将所述诃子果提取物、所述EGCG分别与溶剂混合后，再合并混合。

本领域技术人员可对所述诃子果提取物的溶液和所述EGCG的溶液进行稀释以获得满足实验需要的所述含诃子果提取物的组合物。

本发明还提供一种所述皮肤外用组合物作为蓝光吸收剂或抗氧化剂的应用。

本发明还提供一种所述皮肤外用组合物在制备皮肤外用制剂时作为蓝光吸收成分或抗氧化成分的应用。

本发明还提供了一种皮肤外用剂，所述皮肤外用剂包括所述的皮肤外用组合物。

本发明中，所述的皮肤外用剂较佳地为不具备疾病治疗用途的化妆品，所述的化妆品可为本领域常规的化妆品，较佳地为化妆水、精华液、乳液和乳霜中的一种或多种。所述的皮肤外用剂中，除本发明所述皮肤外用组合物外，其余组分均为本领域常规的组分，例如去离子水以及功能活性物、保湿剂、油分、乳化剂、增稠剂、防腐剂、稳定剂、香料、色素和pH调节剂中的一种或多种。

本发明中，所述皮肤外用剂中，所述皮肤外用组合物的含量较佳地为0.001~2%，例如0.13%，百分比为所述皮肤外用组合物的干重与所述皮肤外用剂的总质量的百分比。

当所述的皮肤外用剂为化妆水时，所述的化妆水例如包括以下组分：甘油5%，多元醇类A 3-6%，甜菜碱1%，泛醇0.5%，甘草酸二钾0.05-0.1%，聚乙二醇-32 0.5%，表面活性剂A0.15-0.2%，防腐剂A 0.4-0.45%，黄原胶0-0.15%，香料0.03%和发酵上清液0.0001%-10%，所述皮肤外用组合物0.001~2%；其余用去离子水补充至100%。其中，所述多元醇类A为丁二醇、1,2-戊二醇和双丙甘醇中的一种或多种。所述表面活性剂A为聚山梨醇酯-20和PEG-40氢化蓖麻油中的一种或多种。所述防腐剂A为羟苯甲酯和苯氧乙醇。

当所述皮肤外用剂为精华液时，所述精华液例如包括以下组分：甘油5%，多元醇类B 3-6%，泛醇1%，甘草酸二钾0.1%，尿囊素0.1%，表面活性剂B 0.05-3.6%，防腐剂B 0.25-0.45%，黄原胶0.2-0.4%，丙烯酸树脂Pemulen TR-2 0.3%，香料0.05%，发酵上清液0.0001%-10%，所述皮肤外用组合物0.001~2%，其余用去离子水补充至100%。其中，所述多元醇类B为丁二醇和/或1,3-丙二醇。所述表面活性剂B为聚甘油-2油酸酯和/或聚甘油-10油酸酯。所述防腐剂B为羟苯丙酯、羟苯甲酯和苯氧乙醇中的任两种或者三种。所述丙烯酸树脂Pemulen TR-2为一种丙烯酸（酯）类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物。

当所述皮肤外用剂为乳液时，所述乳液例如包括以下组分：甘油5%，1,3-丙二醇5%，泛醇1%，生育酚乙酸酯0.5%，聚二甲基硅氧烷2%，乳化剂A165 2%，油类C 2-3%，异硬脂酸异丙酯3%，鲸蜡硬脂醇0.5%，防腐剂C 0.3%，黄胶原 0.5%，EDTA二钠0.1%，发酵上清液0.0001%-10%，所述皮肤外用组合物0.001~2%；其余用去离子水补充至100%。所述皮肤外用剂中还包含三乙醇胺，所述三乙醇胺的含量以调节所述皮肤外用剂的pH值至5.5-7为准；其中，所述油类C为矿油和/或异十六烷。所述防腐剂C为羟苯甲酯和/或羟苯丙酯。所述乳化剂A165为市售商品，其含有甘油硬脂酸酯和PEG-100 硬脂酸酯。其中，所述黄原胶为糖类，经黄单胞杆菌发酵，产生的一种胞外微生物多糖。

当所述皮肤外用剂为乳霜时，所述乳霜例如包括以下组分：甘油5%，1,3-丙二醇5%，泛醇1%，生育酚乙酸酯0.5%，聚二甲基硅氧烷2%，乳化剂A165 2%，油类D 2-8%，异硬脂酸异丙酯3%，鲸蜡硬脂醇2-3%，防腐剂D 0.3%，丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物2%，EDTA二钠0.1%，发酵上清液0.0001%-10%，所述皮肤外用组合物0.001~2%；其余用去离子水补充至100%。所述皮肤外用剂中还包含三乙醇胺，所述三乙醇胺的含量以调节所述皮肤外用剂的pH值至5.5-7为准；其中，所述油类D为矿油和/或异十六烷；所述防腐剂D为羟苯甲酯和/或羟苯丙酯。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明中诃子果提取物、以及诃子果提取物与EGCG的复配物在蓝光吸收方面的应用未见报道，并且通过实验证明，该复配物在抗氧化方面具有增强的效果，兼具蓝光吸收和抗氧化的双重功效。

附图说明

图1为效果实施例1中皮肤外用组合物的蓝光吸收光谱。

图2为效果实施例2中皮肤外用组合物的DPPH自由基清除实验结果。

图3为效果实施例3中皮肤外用组合物对H₂O₂诱导HACAT细胞产生ROS的影响。

图4为效果实施例3中流式分析在本发明中皮肤外用组合物作用下HACAT细胞内ROS浓度的变化。

图5为效果实施例4中皮肤外用组合物对UVB诱导HACAT细胞产生ROS的影响。

图6为效果实施例2中质量分数为0.0103%的皮肤外用组合物的DPPH自由基清除实验结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

试剂与器材：

DPPH，美国Sigma公司；

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），上海汇朗公司；

L-抗坏血酸（VC），国药集团化学试剂有限公司；

DMEM培养基、四季青血清，美国Thermofisher公司；

活性氧检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；

HACAT细胞，美国ATCC公司；

紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器公司；

荧光微孔板检测仪，美国Perkin Elmer公司；

流式细胞仪，美国Thermofisher公司，

Bio Sun紫外照射系统，法国VILBER公司；

诃子果提取物（以下简称：诃子），美国sytheon公司；

诃子果提取物还可自制得到，具体制备工艺为：取产于泛喜马拉雅地带的干诃子果100g，清洗干净，干燥后经高速粉碎机粉碎后过60目筛，称取50g粉末于圆底烧瓶中，按照固液比1:10加入去离子水500mL搅拌提取，提取温度90℃，提取时间2h。离心过滤收集滤液，滤渣中再加入去离子水500mL在温度为90℃的条件下搅拌提取2h，离心过滤收集滤液。将两次滤液合并，对滤液进行冷冻干燥，得诃子果提取物。

统计分析：文中所有实验均进行3次，每个实验组平行样本至少3个。数据用平均值±标准偏差（Mean±SD）。通过双尾t检验计算P值，P<0.05被认为具有显著性差异。数据图表中“**”代表P<0.01；“***”代表P<0.001；“****”代表P<0.0001。

实施例

称取40mg的诃子果提取物和1mg的EGCG分别加入10g去离子水中，配制成诃子果提取物的质量分数为0.4%和EGCG的质量分数为0.01%的待测液，然后根据具体的实验需求进行稀释后将上述两种待测液混合即得作为蓝光吸收剂和抗氧化剂的组合物。

效果实施例1 蓝光光谱吸收

将实施例1中质量分数为0.4%诃子果提取物的待测液、质量分数为0.01%EGCG的待测液进行稀释，最终分别配制成如下表1所示的组合物，以水调基线，在400~500nm的范围内扫描相同体积的各个样品的蓝光光谱。

表1

注：“0.005%+0.005%”表示的是组合物中诃子果提取物的质量分数为0.005%、EGCG的质量分数为0.005%，其他组合物表示为相同的含义。

由图1可知，本发明的组合物对波长为400~450nm蓝光的吸收能力较强，吸光度较高，而400~450nm波段是蓝光中对人体皮肤有害的波段。随着组合物中诃子果提取物的浓度增加，吸光度增加，吸光度与浓度呈正相关关系。当诃子果提取物浓度为0.2%，EGCG浓度为0.002%时，吸光度可达1.41，说明诃子果提取物和EGCG的组合物具有很好的吸收蓝光的能力，通过降低蓝光的透过率，达到蓝光防护作用。

皮肤通过细胞上视蛋白光感受器感知蓝光，过度暴露在蓝光中会导致细胞中的视蛋白聚集，从而引起细胞损伤，延迟屏障修复。

该组合物在两个重要方面起到蓝光防护的作用：一是诃子果提取物的化学结构含共轭双键，而且诃子果提取物中含有的多种化合物独特的化学结构以及相互之间的配合能够更有利于吸收蓝光波段，对蓝光有过滤作用，能够削弱蓝光的强度，作为高能量蓝光的过滤器，直接吸收蓝光起到防护作用，第二是作为抗氧化剂，通过清除UVA、UVB、蓝光诱导产生的活性氧物质起到抗氧化损伤的作用。

效果实施例2 清除DPPH自由基

目前在体外模型中对抗氧化的研究最常用的是DPPH自由基清除实验，自由基在517nm处具有最大的吸光度；当加入抗氧化物质后，通过观察溶液颜色的变浅程度，以比较待测物的抗氧化能力。

具体实验过程如下：

（1）DPPH测试液的配制：称取4mg DPPH试剂，用无水乙醇定容至100mL，得到0.1mmol/L的DPPH溶液，贮存于棕色瓶中备用；

（2）样品组配制：样品用纯水溶解，分别配制成质量分数为0.01%和0.005%的诃子果提取物；质量分数为0.005%、0.003%和0.001%的EGCG；最终配制成如表2所示的组合物的样品液，然后取样品液0.2mL，分别加入2.8mL DPPH反应液作为样品组；空白组取样品溶液0.2mL，加入2.8mL无水乙醇；对照组取纯水0.2mL，加入2.8mL DPPH反应液；混匀后，置于暗处室温反应30min，测定其在517nm处的吸光度值。

（3）阳性组的配制：2mg/mL维生素C溶液（VC溶液），分别配制成0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL不同浓度加入2.8mL DPPH反应液与样品对照清除率。

（4）数据处理：DPPH清除率（%）=（1-(A₁-A_空)/(A₂-A_空)）×100

式中，A₁是样品液在517nm处的吸光度值，A_空是空白组在517nm处的吸光度值，A₂是对照品在517nm处的吸光度值。测试结果如下表2和图2所示。

表2

根据上述表格和图2可知，特定含量的诃子果提取物和EGCG的复配，相比于同等条件下单独组分的DPPH清除率具有显著的提升，可高达90%以上。

为了比较组合物与相同浓度单体的DPPH清除效果，进一步做了0.0103%的诃子和0.0103%的EGCG的DPPH自由基清除实验，测试结果如下表3和图6所示。

表3

效果实施例3 活性氧清除

通过荧光探针DCFH-DA进行活性氧ROS的检测，以比较诃子果提取物、EGCG的单一组分与它们的复配物在抗氧化方面的功效。

具体实验过程如下：

（1）样品液配制：样品用纯水溶解，分别配制成0.01%和0.005%的诃子果提取物；0.005%和0.003%的EGCG；最终配制得到如表4所示的组合物的样品液。

（2）细胞培养：正常人角质细胞HACAT使用DMEM培养基+10%四季青血清+1%青霉素/链霉素/两性霉素在T175瓶中生长。对于酶标仪定量实验和流式分析实验，分别以2X10⁴个/孔的密度种在96孔板和2X10⁶个/孔的密度种在6孔板中。24h小时后，用无血清培养基配制不同浓度的样品液对细胞进行预处理2h，然后去除原培养液，加入终浓度为10uM/L的荧光探针DCFH-DA与细胞孵育30min，再进行后续活性氧诱导及检测实验。细胞保持培养在37℃含有5%CO₂的培养箱中。

（3）H₂O₂诱导ROS实验：探针孵育结束后，加入一定浓度H₂O₂处理细胞30min。采用荧光微孔板检测仪在485/535 nm测定吸光度。对于后续进行流式处理的细胞，胰酶消化后用PBS洗涤，然后上机检测。

为了体现单一的诃子果提取物和EGCG以及诃子果提取物与EGCG的复配物对于ROS的抑制效果，本发明设置单一的诃子果提取物和EGCG以及它们的复配物为实验组，此外，还设置了空白实验组（简称NT）和对照组（即VC，浓度为0.02%），分别用于表示H₂O₂诱导前的ROS水平和VC对于ROS的抑制效果。测试结果如下表4所示。

表4

如图3所示，在H₂O₂诱导氧化损伤模型中，所有实验组均有效降低了由H₂O₂刺激产生的ROS，不管是诃子提取物、EGCG还是上述物质的复配物的抑制效果均优于阳性对照VC的抑制效果。

具体地，0.01%诃子果提取物+0.003%EGCG，0.005%诃子果提取物+0.005%EGCG这两组复配物的抑制率分别为76%和67%，相同条件下各自单一组分的抑制率分别为52%和46%，可以发现，组合物对于ROS水平的抑制效果远远优于单一组分的抑制效果。

为了进一步验证组合物得到抗氧化效果，我们进行了流式分析检测。

如图4所示，当未用H₂O₂刺激（NT组）时，空白组的荧光强度在10³左右；当H₂O₂刺激后，细胞荧光强度明显向右偏移，说明此时胞内有较高水平的ROS产生。观察实验组，发现实验组的细胞都有向初始状态偏移的趋势，其中0.01%诃子果提取物+0.003%EGCG的复配组（图4中的0.01+0.003 诃子+EG组）最接近未经任何处理的细胞状态，证明含诃子果提取物的组合物有明显抑制活性氧的效果。

效果实施例4 UV诱导ROS实验

使用UVB以诱导细胞光氧化模型扩展诃子果提取物和EGCG在抗氧化方面的应用。

通过与效果实施例3中相同的方法，在探针孵育结束后，使用15mJ UVB照射以诱导活性氧的产生，然后PBS洗涤，荧光微孔板检测仪在485/535nm测定吸光度。测试结果如图5所示，各实验组的具体荧光强度数据如下表5所示。

表5

结果表明，同H₂O₂诱导氧化损伤模型结果一致，在光氧化模型中，所有实验组都显著消除UVB诱导的ROS。将不同浓度的复配物与各自的单体进行比较，0.01%诃子果提取物+0.003%EGCG和0.005%诃子果提取物+0.005%EGCG两组复配物对光氧化模型的细胞显示出明显的保护作用。

本发明利用紫外可见光分光光度计，通过待测物在400~500nm波段的吸收能力证实本发明的组合物具有吸收蓝光的作用，并且将本发明的组合物配制成不同浓度的溶液，针对DPPH自由基的清除作用和活性氧ROS抑制作用进行检测，结果显示本发明的组合物有增强的抗氧化功效。

Claims

1.一种皮肤外用组合物，其特征在于，其包括诃子果提取物、EGCG和溶剂；

所述诃子果提取物的质量分数为0.01%，所述EGCG的质量分数为0.003%；

或者，所述诃子果提取物的质量分数为0.005%，所述EGCG的质量分数为0.005%。

2.如权利要求1所述的皮肤外用组合物，其特征在于，所述诃子果提取物中含有30%~40%的鞣质，%为鞣质的质量与所述诃子果提取物总质量的百分比；

所述诃子果提取物的制备方法包括以下步骤：水提取诃子果粉末得滤渣和滤液，将所述滤渣进行水提取后，合并两次所述水提取得到的滤液；所述水提取时的固液比为1：（9~11）。

3.如权利要求2所述的皮肤外用组合物，其特征在于，所述水提取时的固液比为1：10。

4.如权利要求2所述的皮肤外用组合物，其特征在于，所述水提取的温度为90~100℃。

5.如权利要求4所述的皮肤外用组合物，其特征在于，所述水提取的温度为90℃。

6.如权利要求2所述的皮肤外用组合物，其特征在于，所述水提取的时间为1.5~2.5h。

7.如权利要求6所述的皮肤外用组合物，其特征在于，所述水提取的时间为2h。

8.如权利要求1所述的皮肤外用组合物，其特征在于，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.005%，所述EGCG的质量分数为0.005%；所述溶剂为去离子水；

或者，所述皮肤外用组合物包括以下组分：诃子果提取物、EGCG和溶剂；所述诃子果提取物的质量分数为0.01%，所述EGCG的质量分数为0.003%；所述溶剂为去离子水。

9.如权利要求1~8中任一项所述的皮肤外用组合物，其特征在于，所述皮肤外用组合物的制备方法包括以下步骤：将所述诃子果提取物、所述EGCG和所述溶剂混合即可。

10.如权利要求9所述的皮肤外用组合物，其特征在于，所述混合为先将所述诃子果提取物与所述EGCG混合后再与所述溶剂混合；

或者，所述混合为将所述诃子果提取物、所述EGCG分别与所述溶剂混合后，再合并混合即得。

11.一种如权利要求1~10中任一项所述的皮肤外用组合物在制备皮肤外用剂时作为蓝光吸收成分和/或抗氧化成分的应用。

12.一种皮肤外用剂，其特征在于，其含有如权利要求1~10中任一项所述的皮肤外用组合物。

13.如权利要求12所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述皮肤外用剂为化妆水、精华液、乳液和乳霜中的一种或多种；

所述皮肤外用剂中，所述皮肤外用组合物的含量为0.001%~2%，%为所述皮肤外用组合物的干重与所述皮肤外用剂的总质量的百分比。

14.如权利要求13所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述皮肤外用剂中，所述皮肤外用组合物的含量为0.13%。