CN115607569A - 一种钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料及其制备方法和应用。本发明提供一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，所述人造酶材料由负载了钌团簇的钛酸钡纳米颗粒通过热处理制得。本发明提供了一种新型的基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，所得人造酶材料具有过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性和卤素过氧化物酶活性。所得人造酶材料通过类过氧化物酶途径产生丰富的•O2 ‑自由基，可以有效地将H2O2底物转移到O2，从而缓解了恶性肿瘤中的缺氧状况，并且所得材料通过US辐照诱导的1O2的产生放大了ROS水平，可以适应TME特异性催化治疗，以对抗恶性肿瘤。

Description

一种钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物催化领域，具体涉及一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤，例如黑色素瘤，具有高度的多样性、复杂性和异质性，由于其高发病率和死亡率，仍然是一个全球性问题。在癌症中，肿瘤细胞的氧化还原平衡阈值远高于正常细胞，并且对活性氧（ROS）升高更敏感的成熟机制引起了相当大的关注。从这个角度来看，ROS产生方法已被广泛探索为直接或间接杀死癌细胞的武器。尽管在过去几十年中，许多尝试都致力于通过ROS治疗恶性肿瘤，但许多目前报道的基于ROS的纳米疗法已经揭示了抗肿瘤效率不足或严重抑制。最近，外部刺激诱导的ROS生成在恶性肿瘤的治疗中引起了越来越多的关注，例如光、X射线、微波、超声（US）。尽管新兴的临床消融程序已逐渐应用于癌症治疗，如微波消融和射频消融，但顽固的凝固性坏死组织、侵入性出血风险增加以及容易复发，使得有必要找到其他更有效或新颖的癌症治疗策略。
US刺激诱导的ROS生成（即单线态氧（1O2））由于其独特的深组织渗透量和很少的副作用，已被选为恶性肿瘤的一种有前途的非侵入性癌症治疗方法。由于US具有良好的空间和时间可控性，可以在局部肿瘤组织中精确生成ROS，而不会对正常组织造成明显损害，从而将抗肿瘤治疗期间的潜在副作用降至最低。在纳米化学和纳米催化的最新进展的推动下，已成功制备了多种具有酶样ROS产生活性的基于纳米材料的声敏化剂，并将其应用于治疗恶性肿瘤。然而，高度复杂的肿瘤微环境（TME）仍然抑制声致敏剂的体内催化抗肿瘤效率，特别是具有超低O2浓度的肿瘤缺氧条件将抑制US刺激诱导的ROS生成，并导致免疫系统不敏感，这最终使得难以获得令人满意的抗肿瘤效果。
发明内容
基于上述缺陷可知，迫切需要设计一种治疗性纳米平台，该平台集成了高效生物催化活性氧生成、超声增强活性氧生成和同时缓解肿瘤缺氧。基于此，本发明提供一种新型的基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，所述人造酶材料是将负载了钌金属团簇的钛酸钡进行热处理制得；所得人造酶材料通过类过氧化物酶途径产生丰富的•O2 -自由基，可以有效地将H2O2底物转移到O2，从而缓解了恶性肿瘤中的缺氧状况，并且所得材料通过US（超声）辐照诱导的1O2的产生放大了ROS水平，可以适应TME特异性催化治疗，以对抗恶性肿瘤。
本发明的技术方案：
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，所述人造酶材料由负载了钌团簇的钛酸钡纳米颗粒通过热处理制得。
进一步，所述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料中钌团簇的粒径为1～3nm。
进一步，所述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料具有过氧化物酶活性（POD）、过氧化氢酶活性（CAT）和卤素过氧化物酶活性（HPO）。
进一步，所述热处理条件为：300～500℃热处理2～4h，热处理在惰性气体氛围中进行。
进一步，所述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料的TON值（单位活性催化中心的最大转换底物数量）为63.29×10-3 s-1。
进一步，所述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料的Vmax =0.320μΜ s-1。
进一步，所述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料通过超声处理能够放大产ROS的水平。
进一步，所述负载了钌团簇的钛酸钡纳米颗粒采用下述方法制得：先将RuCl3·xH2O和钛酸钡在去离子水中搅拌混匀，再在反应釜中于100～200℃热处理12～30h；然后进行分离过滤得产物，所得产物经洗涤和干燥即得所述负载了钌团簇的钛酸钡纳米颗粒；其中，所述RuCl3·xH2O和钛酸钡的摩尔比为：1：30～1：5。
进一步，所述负载了钌团簇的钛酸钡纳米颗粒中钌团簇由Ru-O配位紧密结合于钛酸钡表面。
本发明要解决的第二个技术问题是提供上述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料的制备方法，所述制备方法为：将负载了钌团簇的钛酸钡纳米颗粒在惰性气体氛围中于300～500℃热处理2～4h。
本发明要解决的第三个技术问题是指出上述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料在生物催化剂、抗肿瘤，抗菌或生物传感器中的用途。
本发明要解决的第四个技术问题是提供一种抗肿瘤药物，其活性中心包括上述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料。
进一步，所述肿瘤为黑色素瘤。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种新型的基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，所述人造酶材料是将负载了钌团簇的钛酸钡纳米颗粒进行热处理制得；所得人造酶材料具有过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性和卤素过氧化物酶活性。所得人造酶材料通过类过氧化物酶途径产生丰富的•O2 -自由基，可以有效地将H2O2底物转移到O2，从而缓解了恶性肿瘤中的缺氧状况，并且所得材料通过US辐照诱导的1O2的产生放大了ROS水平，可以适应TME特异性催化治疗，以对抗恶性肿瘤。
附图说明
图1为本发明实施例中人造酶材料RuNC/BTO的合成过程图。
图2为：（a）实施例1中所得BTO的SEM图，插图为BTO的光学图像；（b）a的插图中BTO的平均尺寸图。
图3为不同温度处理下的BTO的XRD图，其中，PDF#05-0626指xrd标准卡片即传统的立方BaTiO3结构的XRD图。
图4为：（a）RuNC/BTO的 SEM图，插图为RuNC/BPO的光学图；（b）RuNC/BTO的平均尺寸图。
图5（a-c）为RuNC/BTO的STEM图。
图6 （a）和（b）均为RuNC/BTO的STEM图。
图7 为RuNC/BTO的EDX光谱图，图中HAADF表示高角环形暗场像。
图8为：（a）RuNP/BTO的SEM图，a的插图为RuNP/BPO的光学图；（b）RuNP/BTO的平均尺寸图。
图9（a）为RuNP/BTO的TEM图；（b）RuNP/BTO的-HRTEM图。
图10（a）和（b）为RuO/BTO的TEM图，（b）的插图为RuO/BTO的模型。
图11 为RuO/BPO的HRTEM图。
图12为：（a）RuNC/BTO分散在PBS（50 μg mL-1）中的廷德尔效应图；（b） 样品在PBS（100 μg mL-1）中的分散稳定性结果图，所有样品可以保持分散60分钟以上。
图13为 RuNC/BTO、RuNP/BTO和RuO/BTO的Ru 3d5/2的XPS光谱图。
图14 为RuNC/BTO、RuNP/BTO和RuO/BTO的Ru物种的相应百分比图。
图15为：（a）在RuNC/BTO和H2O2的存在下，通过基于TMB的测定进行POD模拟活性结果图；其中对照组指：不加任何材料只有TMB和H2O2；（b）不同pH下 RuNC/BTO的POD模拟活性结果图。
图16为：（a）对比例3所得产物（Cu2(OH)3Cl的SEM形貌图，（b）为其POD活性结果图。
图17为：（a）动力学分析中RuNC/BTO、RuNP/BTO和RuO/BTO的V0结果图；插图为λ=652nm时的吸光度值结果；（b）动力学分析中RuNC/BTO、RuNP/BTO和RuO/BTO的V max最大反应速度和K m迈克尔斯常数结果图。
图18 为HE的荧光光谱用于检测对照组（对照组指不加任何材料只有HE和H2O2）、RuNC/BTO、RuNP/BTO和RuO/BTO不同样品产生的•O2 -的结果图。
图19为RuNC/BTO用于记录•O2 -信号的EPR光谱图。
图20为在TMB存在下，所得人造酶材料催化氧化H2O2过程生成自由基，判断生成的是哪种自由基，利用三种抑制剂来与产物反应观察会与哪种抑制剂反应；得到的自由基淬灭实验图；由图可知：•OH被TBA猝灭，•O2 -被BQ猝灭，1O2被NaN3猝灭。
图21为使用CB作为试剂检测BTO、RuO/BTO、RuNP/BTO和RuNC/BTO的HPO模拟活性结果图，其中对照组指不加材料组只加了天青石蓝和H2O2，a.u.表示任意单位。
图22为：（a）BTO、RuO/BTO、RuNP/BTO和RuNC/BTO的O2生成结果图；（b） BTO、RuO/BTO、RuNP/BTO和RuNC/BTO的H2O2消耗图。
图23为本发明不同人造酶材料处理后钙蛋白AM/PI染色的HUVEC细胞的荧光成像图。
图24为本发明不同人造酶材料处理后膜联蛋白V-FITC/PI染色的B16F10细胞的流式细胞术凋亡分析结果图。
图25 为本发明不同人造酶材料处理后钙蛋白AM/PI染色的B16F10细胞的荧光成像图。
图26 为不同人造酶材料处理后DCFH-DA染色的B16F10细胞的荧光成像结果图。
图27 为本发明人造酶材料活性氧催化肿瘤纳米疗法的体内评估抗肿瘤实验设计示意图。
图28为采用对照组（指不加材料不加超声同样实验条件培养的实验小鼠）、US组、RuO/BTO组、RuNP/BTO组、RuNC/BTO组和RuNC+US组不同处理的Balb/c小鼠的体重曲线图。
图29为活性氧催化肿瘤纳米疗法的体内评估结果：（a）治疗后的代表性肿瘤图；（b） 各组肿瘤的H&E图；（c） 各组肿瘤的CD31图；（d） 各种治疗后TUNEL染色的肿瘤切片的荧光图；（e） 不同人造酶材料处理后Ki67染色的肿瘤切片的荧光图；（f） 各种治疗后CRT染色的肿瘤切片的荧光图。
具体实施方式
本发明利用生物相容性的钛酸钡（BaTiO3，BTO），以及过渡金属Ru物种在多电子反应中的优异催化活性，将钛酸钡负载的Ru团簇进行热处理制得了一种新型人造酶材料（BTO支撑的Ru簇合酶RuNC/BTO）；所得人造酶材料具有过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性和卤素过氧化物酶活性。本发明所得RuNC/BTO的形态和化学/电子结构分析结果表明： RuNC/BTO由BTO表面负载丰富的Ru纳米团簇而构成，Ru团簇由Ru-O配位紧密结合于BTO表面。
酶活性结果证明：所得RuNC/BTO可以通过类过氧化物酶途径产生丰富的•O2 -自由基；在POD模拟中，RuNC/BTO的周转率（TON）为63.29×10-3 s-1。此外，过氧化氢酶样活性测定表明，RuNC/BTO可以有效地将H2O2底物转移到O2，这缓解了恶性肿瘤中的缺氧状况，并通过US诱导的1O2的产生放大了ROS水平。
本发明相应的细胞和动物实验表明 RuNC/BTO生物催化剂能用用于多模式抗肿瘤。可见，本发明确实提供了一种有效的簇合酶，它可以适应TME特异性催化治疗，以对抗恶性肿瘤。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。
本发明实施例中用到的材料：
RuCl3·xH2O（氯化钌水合物）、Ba(OH)2·H2O（氢氧化钡，98%）；Ti[O(CH2)3CH3]4（Ti丁醇，97%）、氢氧化铵溶液（25%NH3在H2O中）、乙醇（分析试剂，AR）、过氧化氢溶液（AR，30重量%在水中）、乙酸（99.7%）、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB，≥99.5%）、Celestin蓝（CB，97.0%）、乙酸（99.7%）、5,5-二甲基-1-吡咯烷-N-氧化物（DMPO，97.0）、苯醌（BQ）、叔丁醇（TBA）、NaN3、磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.2-7.4）和二氢乙锭（HE）从阿拉丁（中国上海）获得。实验中使用的纯水（18.2 MΩ·cm）由Milli-Q Academic系统（Millipore Corp，Billerica，MA，USA）生产。
实施例1～3 金属团簇酶RuNC/BTO的制备：
步骤1：BTO纳米颗粒的合成：
基于溶剂热法，使用Ba(OH)2·H2O和Ti-丁醇作为起始材料，将25 mmol的Ti-丁醇与10 mL乙醇混合，然后加入3.5 mL氢氧化铵溶液得共混液。将37.5 mmol的Ba(OH)2·H2O溶于12.5 mL去离子水中，制备透明的氢氧化钡溶液。
然后将氢氧化钡水溶液加入到共混液中混匀，将最终悬浮液转移到100 mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，并在200℃下热处理48小时得相应得产物。反应后，用乙酸和高纯度乙醇反复洗涤（洗涤至少3次）所得产物，然后在烘箱中60℃下干燥24小时得BTO纳米颗粒。
步骤2：Rux/BTO纳米颗粒的合成（采用水热离子交换法）：
将一定摩尔比的RuCl3·xH2O和BTO纳米颗粒分散在40 mL去离子水中，超声处理使其均匀，然后转移到100 mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，并在180°C下热处理24 h；通过过滤分离得Rux/BTO，之后用去离子水洗涤，然后在60°C下在烘箱中干燥得Rux/BTO纳米颗粒；其中，RuCl3·xH2O和BTO的摩尔比分别为1：15（对应实施例1）、1：5（对应实施例2）、1：10（对应实施例3），分别命名为：Rux/BTO（1：15）、Rux/BTO（1：5）和Rux/BTO（1：10）。
步骤3：基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料（RuNC/BTO）的制备：
将上述所得RuxBTO（1：15）纳米颗粒通过在Ar气流下以5 ℃ min-1的斜率在管式炉中加热至300 ℃，然后在300 ℃下保持2 h，最后在Ar流下自然冷却至室温制得金属团簇酶RuNC/BTO（实施例1）；图1为本发明实施例中人造酶材料RuNC/BTO的合成过程图。
对比例1 RuNP/BTO的制备：
步骤1和步骤2与实施例1相同，区别仅在于步骤3不同：将实施例1所得Rux/BTO（1：15）在Ar气流下以5 ℃ min-1的斜率在管式炉中加热至900 ℃，然后在900 ℃下保持2小时，最后在Ar流下自然冷却至室温得到产物RuNP/BTO。
对比例2 RuO/BTO的制备：
步骤1和步骤2与实施例1相同，区别仅在于步骤3不同：将实施例1所得RuxBTO（1:15）纳米颗粒通过在空气气氛下以5 ℃ min-1的升温速率加热至300 ℃，然后在300 ℃下保持2小时，使炉自然冷却至室温，制得产物RuO/BTO。
对比例3 使用金属Cu制备的团簇酶材料：
制备过程与实施例1相同，其区别仅在于：将RuCl3·xH2O替换为CuCl2·2H2O。
试验例1微观结构测试：
1）检测方法：
使用Thermo Fisher Scientific（FEI）Apreo S HiVoc获得扫描电子显微镜（SEM）图像；金涂层沉积有约1 nm的层。透射电子显微镜（TEM）由Tecnai G2 F30 S-TWIN在300kV下操作。像差校正的高角度环形暗场扫描TEM（AC HAADF-STEM）在配备有5个冷场发射电子源和DCOR探针校正器（CEOS GmbH）的JEOL JEM-ARM 200F扫描透射电子显微镜上进行。本发明未进行说明的均按照常规测试即可。
2）检测结果：
本发明实施例1中制得的BTO的SEM图像及其尺寸如图2所示，图2表明本发明通过溶剂热工艺预制备了平均直径约为108 nm的半导体BTO纳米颗粒。X射线衍射的结果如图3，由图3可知：BTO的图案与传统的立方BaTiO3结构非常一致，并且其在900 ℃下处理2小时后，BTO的晶体结构也几乎没有任何变化，表明BTO在Ru纳米团簇的后续退火处理期间是热稳定的衬底。
实施例1所得RuNC/BTO纳米颗粒的SEM图像及其尺寸如图4所示，由图可知，RuNC/BTO纳米颗粒保持均匀分散的特征，平均尺寸：~111 nm。以原子分辨率进一步研究Ru纳米团簇，对RuNC/BTO进行了高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM），结果如图5a-c和图6所示，原子HAADF-STEM图像证实BTO表面上存在超小型Ru团簇（用圆圈标记，尺寸：1-2nm）。衬底显示出几乎完美的晶格排列，可以容易地找到钙钛矿的阵列结构，并且具有0.399nm和0.289 nm的晶面间距的晶格条纹可以分别归属于BTO（100）和BTO（101）；面间距为0.135 nm和0.205nm的晶格条纹可以分别归属于Ru（110）和Ru（101）。RuNC/BTO的能量色散X射线光谱（EDX）元素图如图7所示，显示了Ba、Ti和O在载体上的均匀分布，但Ru信号仅位于表面上，进一步证明了Ru纳米团簇在BTO表面上的成功锚定。
本发明对比例1所得的产物RuNP/BTO的SEM图及其尺寸如图8所示，由图可知，其平均尺寸~112 nm。图9为RuNP/BTO的TEM（图9a）和HRTEM（图9b）结果，由图可知，RuNP/BTO上的Ru纳米颗粒（平均直径约4.5 nm）明显大于RuNC/BTO上（尺寸：1-2 nm），这表明高温将导致Ru在BTO表面上的团聚。
本发明对比例2所得产物RuO/BTO的TEM和HRTEM结果分别如图10和图11，根据面间距为0.225 nm的晶格条纹的结果，RuO/BTO上的Ru物种已被验证为处于氧化状态，其可归属于RuO2（200）。RuNC/BTO、RuNP/BTO和RuO/BTO的平均尺寸显示出可忽略的差异，并且所有三个样品都可以在PBS中保持良好的分散性（图12）。
图13为 RuNC/BTO、RuNP/BTO和RuO/BTO的Ru3d5/2的XPS光谱；由图可知，RuNC/BTO和RuNP/BTO的Ru3d5/2光谱可分为属于Ru4+和Ru0物种的两个峰，RuO/BTO的Ru3d5/2谱可分为Ru4+与Ru3+物种。与RuNP/BTO相比，RuNC/BTO在金属Ru0的3d结合能方面显示出约0.20 eV的显著正位移，表明Ru物种与BTO底物之间存在强电子转移，这可能调节RuNC/BTO在ROS催化期间的氧化还原反应性质。图14为 RuNC/BTO、RuNP/BTO和RuO/BTO的Ru物种的相应百分比，由图可知，RuNC/BTO显示Ru0（41.72%）和Ru 4+（58.28%）的平衡百分比，而RuNP/BTO显示过多Ru0（76.78%），RuO/BTO显示几乎没有Ru0物种。
试验例2 通过TMB测定测定实施例和对比例所得产物的POD样活性：
1) 检测方法：
将材料溶液（2 mg mL-1，10 μL）加入NaOAc HOAc缓冲液（100 mM，pH 4.5）中，然后分别加入25 μL TMB（10 mg mL-1）和25 μL H2O2（0.1M）；混合物的最终体积为2 mL。然后，将混合物的一部分用于在652 nm的吸光度下进行紫外可见光谱测量。
2) 检测结果：
实施例1所得RuNC/BTO的POD活性结果如图15，由图15可知，RuNC/BTO以pH依赖性方式显示出最佳的POD样性能，生物催化剂可以在肿瘤微环境（pH=6.0）下实现非常高的POD样活性。实施例2和实施例3最终所得产物也具有与实施例1相当的POD活性。
本发明对比例3 使用金属Cu制备的材料的仿酶测试结果如图16，由图可知，最终所得产物并不具有POD性能。
试验例3 稳态酶动力学研究：
周转数（TON）结果如图17和表1，由图17可知：与RuNP/BTO和RuO/BTO相比，RuNC/BTO表现出显著增强的V max和更低的K m，从而表明Ru基簇合酶中心对H2O2的催化动力学和亲和力更有效。本发明还将本发明所得酶材料的催化活性与许多最近报道的最新POD模拟物进行了比较，包括单原子生物催化剂、金属纳米颗粒和金属氧化物，结果如表1。由图17和表1可知，本发明RuNC/BTO表现出最高的TON值（63.29×10-3 s-1）。
表1 本发明与H2O2和其他报道的人工酶的类POD催化动力学常数的比较
人工酶 K<sub>m</sub> (mM) <i>V</i><sub>max</sub> (μΜ s<sup>-1</sup>) TON (10<sup>-3</sup> s<sup>-1</sup>) 文献
Ru<sub>NC</sub>/BTO 25.77 0.320 63.29 本发明
Pt cube 1.000 0.002 0.257 <i>Adv. Funct. Mater.</i> 2018, 28, 1801484.
MnO<sub>2</sub> / 0.006 0.056 <i>Nat. Commun.</i> 2019, 10, 1.
Mn<sub>2</sub>O<sub>3</sub> 12.530 1.010 7.979 <i>Nat. Commun.</i> 2019, 10, 1.
Mn<sub>3</sub>O<sub>4</sub> / 0.013 0.099 <i>Nat. Commun.</i> 2019, 10, 1.
CoO 92.100 1.140 8.550 <i>Nat. Commun.</i> 2019, 10, 1.
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Ru NPs 2.206 0.580 5.858 /
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TON=Vmax/[E]，[E] 是整个纳米材料中金属的摩尔浓度。
试验例4用氢乙啶（HE）检测•O2 -：
1）检测方法：
将1.5 mL 100 μg·mL-1样品缓冲液（1.0 M醋酸盐缓冲液（pH 4.5））溶液与1.5 μL0.1 M H2O2水溶液在37℃下混合40 min。然后将1.5 mL HE乙醇溶液（1 mg·mL-1）加入到系统中。随后，在荧光测量之前，将溶液涡旋并保持不受干扰40分钟；结果如图18。
2）检测结果：
如图18所示，RuNC/BTO的特征峰强度显著高于RuNP/BTO和RuO/BTO，从而证实RuNC/BTO比RuNP/BTO和RuO/BTO产生的•O2 -量高得多。
试验例5 电子顺磁共振（EPR）测量：
1）检测方法：
将500微升本发明所得生物催化剂（指将RuNC/BTO溶于溶剂DMSO中制得0.1 mg mL-1的生物催化剂）和25 μL H2O2（1 M）加入到2 mL DMSO中，然后加入10μL DMPO（二甲基吡啶N-氧化物）；通过Bruker EPR EMX Plus（美国Bruker北京科技有限公司）在9.8 GHz频率（微波功率：1 mW）下进行EPR测量。
2）检测结果：
采用电子顺磁共振（EPR）检测生成的ROS类型，如图19所示，可以看出RuNC/BTO生成的ROS是•O2 -。另外，自由基猝灭实验也证实了•O2 -的产生（如图20）；测试中未检测到明显的•OH或1O2生成。
试验例6 HPO类催化性能测试：
1）检测方法：
制备200 μM PBS溶液（pH 5.8）中的天青石蓝溶液，然后向1880 μL CB溶液中加入100 μL RuNC/BTO （2mg mL-1）、20μL H2O2（3%）以引发反应。通过测量反应30分钟后CB在645nm和520 nm之间的波数下的吸收变化来研究催化活性。
2）检测结果：
如图21所示，RuNC/BTO的吸光度强度值I520 nm/I645 nm为3.51，与RuNP/BTO（2.29）和RuO/BTO（0.56）相比，其催化活性最高。
试验例6 CAT催化性能测试：
1）检测方法：
H2O2消耗：2mL PBS（pH=7.4）溶液中的H2O2与RuNC/BTO的浓度分别为10 mM和50 μg/mL。然后，将50 μL上述溶液与Ti（SO4）2溶液（100 μL，13.9mM）混合，并每10分钟记录405 nm处的吸光度值，直到60分钟。反应达到30分钟后，测试溶液在405 nm的吸光度以评估生物催化剂的H2O2清除能力。
O2生成测定：20mL PBS（pH=7.4）溶液中的H2O2与RuNC/BTO的浓度分别为100 mM和10μg/mL，然后使用溶解氧计（INESA，JPSJ-605F）每5 s测量O2浓度，测量时长为300 s。
2）检测结果：
如图22所示，本发明所得RuNC/BTO具有优异的过氧化氢酶样活性。
综上可知，本发明的RuNC/BTO确实具有优越的ROS生成活性，并且其可以通过US刺激进一步放大。
试验例7 活死细胞染色实验：
1）检测方法：
将B16F10细胞以每孔2×105个细胞的密度接种到24孔培养板中，并在37℃和5%CO2中孵育24小时。随后，用不同的组处理B16F110细胞，纳米剂的浓度为100 µg mL-1，US的参数为1 MHz、1.0 W cm-2、1 min、30%占空比。然后，应用Calcein AM/PI染色试剂对活细胞进行绿色荧光染色，对死细胞进行红色荧光染色。使用倒置荧光显微镜系统常规检测荧光。
2）检测结果：
不同酶材料处理后钙蛋白AM/PI染色的HUVEC细胞的荧光成像结果如图23，由图可知，即使在200 µg/mL的浓度下也几乎出现绿色荧光，因此表明所获得的材料在200 µg/mL以下显示出优异的生物相容性。
试验例8 体外评估：
1）检测方法：
将B16F10细胞以每孔2×105个细胞的密度接种到24孔培养板中，并在37℃和5%CO2中孵育16小时；随后，根据不同的组用处理过的B16F110细胞进行处理，纳米剂的浓度为100µg mL-1，US的参数为1 MHz、1.0 W cm-2、1 min、30%占空比。然后，应用DCFH-DA染色试剂对B16F10细胞进行染色。使用倒置荧光显微镜系统和流式细胞术常规检测荧光。
将B16F10细胞以每孔5×105个细胞的密度接种到12孔培养板中，并在37℃和5%CO2中孵育24小时。随后，根据不同的组用处理过的B16F110细胞进行处理，纳米剂的浓度为100µg mL-1，US的参数为1 MHz、1.0 W cm-2、1 min、30%占空比。然后，应用膜联蛋白V-FITC/PI染色试剂对B16F10细胞进行染色。使用流式细胞术常规检测荧光。
2）检测结果：
分别用RuO/BTO、RuNP/BTO、RuNC/BTO和RuNC/BTO+US（超声）不同生物催化剂处理B16F10细胞，结果如图24所示，由图可知：与RuO/BTO和RuNP/BTO组相比，RuNC/BTO组具有高得多的凋亡率。
在不同酶材料处理后的B16F10细胞的活/死测定中，活细胞用钙调素AM染成绿色，死细胞用PI染成红色；与流式细胞术细胞凋亡分析类似，RuNC/BTO和RuNC/BTO+US均显示出非常有效的癌细胞杀伤能力，尤其是RuNC/BTO+US（图25）。
通过ROS探针（2,7-二氯荧光素二乙酸酯，DCFH-DA）确认了通过生物催化和US扩增过程产生的胞内ROS，如图26所示，与RuO/BTO和RuNP/BTO组相比，RuNC/BTO组呈现出更高的绿色荧光强度，并且当引入US时，平均荧光强度可以进一步增强。
试验例10 体内实验：
1）检测方法：
雄性Balb/c小鼠（6周龄）购自华富康生物技术。将皮下右肩胛下平均肿瘤体积为100-150 mm3的B16F10荷瘤Balb/c小鼠随机分为六组：（1）对照组，（2）US组，（3）RuO/BTO组，（4）RuNP/BTO组、（5）RuNC/BTO组和（6）RuNC+US组（2.5 W cm-2，5 min）。以10mg kg-1的浓度瘤内注射纳米制剂；每2天测量一次肿瘤大小。肿瘤体积=长度×宽度2/2。在局部注射生物催化材料后4小时，用US照射（1 MHz，2.5 W cm-2，5分钟，30%占空比）治疗肿瘤（图27）。
本发明中，所有动物实验均按照中国成都四川大学华西医院动物伦理委员会的动物伦理标准进行：指定批准文号为2021200A。
2）检测结果：
在治疗期间（15天），小鼠体重没有明显下降（图28）。
治疗后，每两天用数字卡尺监测各组小鼠的肿瘤生长。与RuO/BTO和RuNP/BTO组相比，RuNC/BTO组具有更高的肿瘤抑制效率，并且RuNC/BTO+US组的肿瘤生长在15天时表现出最高的抑制（图29a）。还通过免疫组织化学染色，如苏木精和伊红（H&E）和CD31染色，分析了抗肿瘤效果；与RuO/BTO和RuNP/BTO组相比，RuNC/BTO+US组的H&E染色结果显示肿瘤细胞严重受损和坏死（图29b）。类似地，RuNC/BTO和RuNC/BTO+US组的CD31染色结果显示，与RuO/BTO和RuNP/BTO组相比，存在小的棕色区域（图29c）。随后，分析免疫荧光染色以揭示治疗机制。
肿瘤切片的TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色结果显示，与RuO/BTO和RuNP/BTO组相比，RuNC/BTO组中的凋亡细胞多得多，并且当与US照射结合时，凋亡细胞的数量进一步增加（图29d）。Ki-67抗体染色结果显示，与RuO/BTO和RuNP/BTO组相比，RuNC/BTO组的肿瘤细胞增殖活性受到抑制，而对照组的细胞增殖几乎没有明显的不良影响。此外，RuNC/BTO+US组具有最高的抑制增殖活性（图29e）。钙网蛋白（CRT）是一种存在于内质网内腔的Ca2+结合伴侣蛋白，在健康细胞内质网内正确折叠蛋白质的过程中起着至关重要的作用。近年来，在抗肿瘤治疗过程中，CRT转移到死亡细胞的细胞膜已被证明是免疫原性细胞死亡的主要损伤相关分子模式。CRT染色结果显示，RuNC/BTO和RuNC/BTO+US组的荧光强度高于RuO/BTO和RuNP/BTO组，而对照组几乎没有显著荧光（图29f）。这可能意味着RuNC/BTO可以激活免疫系统以增强抗肿瘤功效。结果表明，RuNC/BTO比RuO/BTO和RuNP/BTO基团具有更高的抗肿瘤效果，并且US可以进一步有效地增强RuNC/BPO的抗肿瘤作用。

Claims (10)

1.一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，其特征在于，所述人造酶材料由负载了钌团簇的钛酸钡纳米颗粒通过热处理制得。
2.根据权利要求1所述的一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，其特征在于，所述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料中钌团簇的粒径为1～3nm。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，其特征在于，所述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料具有过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性和卤素过氧化物酶活性。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，其特征在于，所述热处理条件为：300～500℃热处理2～4h，热处理在惰性气体氛围中进行。
5.根据权利要求1或2所述的一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，其特征在于，所述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料的TON值为63.29×10-3 s-1。
6.根据权利要求1或2所述的一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，其特征在于，所述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料的Vmax=0.320μΜ s-1。
7.根据权利要求1或2所述的一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料，其特征在于，所述负载了钌团簇的钛酸钡纳米颗粒采用下述方法制得：先将RuCl3·xH2O和钛酸钡在去离子水中搅拌混匀，再在反应釜中于100～200℃热处理12～30h；然后进行分离过滤得产物，所得产物经洗涤和干燥即得所述负载了钌团簇的钛酸钡纳米颗粒；其中，所述RuCl3·xH2O和钛酸钡的摩尔比为：1：30～1：5。
8.权利要求1～7任一项所述的一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将负载了钌团簇的钛酸钡纳米颗粒在惰性气体氛围中于300～500℃热处理2～4h。
9.权利要求1～7任一项所述的一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料在生物催化剂、抗肿瘤，抗菌或生物传感器中的用途。
10.根据权利要求9所述的一种基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料在生物催化剂、抗肿瘤，抗菌或生物传感器中的用途，其特征在于，所述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料用于制备抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物的活性中心为所述基于钛酸钡负载钌团簇的人造酶材料。
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