CN115591021A - 一种含细胞骨组织工程支架及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含细胞骨组织工程支架及制备方法，分别制备油包水复合乳液墨水A和含细胞生物墨水B，将油包水复合乳液墨水A和含细胞生物墨水B转移到双喷头3D打印机中的打印喷头1和打印喷头2，由打印喷头1和打印喷头2交替打印并进行紫外光固化，得到含细胞骨组织工程支架。本发明打印条件温和，制备的含细胞骨组织工程支架具有多级微孔仿生结构和良好的力学性能，成骨多肽可大量原位负载，大量干细胞可原位负载且保持活性。
Description
技术领域
本发明涉及3D打印、生物材料、再生医学技术领域，特别涉及一种含细胞骨组织工程支架的制备方法。
背景技术
3D打印骨组织工程支架被用于诱导骨再生以及作为体外干细胞成骨分化的研究模型。随着骨组织工程支架的体积增大及结构复杂度日渐增加，目前常采用打印无细胞支架并进行细胞种植的策略存在以下缺陷：细胞难以达到支架中心区域、细胞分布不均匀、大量细胞沉降至培养皿底板造成细胞浪费。而采用负载干细胞的水凝胶进行3Ddayin构建的骨组织工程支架又存在强度低、结构放生度不高等缺点。综上所述，现有的3D打印骨组织工程支架难以同时达成以下有益于骨再生的特征：(1)支架力学强度优异；(2)含有能够促进细胞迁移和黏附的多级微孔结构；(3)具有原位递送生长因子并缓释的能力；(4)具有原位负载细胞能力。
目前也有采用双喷头3D打印技术构建含细胞骨组织工程支架的工艺。已有学者采用聚己内酯(PCL)为原料，通过熔融沉积成型(FDM)3D打印技术构建可降解PCL支架，并在PCL线条间隙填充含细胞水凝胶并进行紫外光固化，获得了力学性能优异含细胞的3D打印骨组织工程材料，但该方法有以下缺陷：(1)该方法打印过程需高温熔融墨水原料，限制了原料的使用种类；(2)虽然PCL熔融温度仅有60℃，但生长因子在高温环境下失活，因此无法在PCL支架原位负载生长因子；(3)PCL支架表面没有次级微孔，不利于细胞黏附；(4)细胞长时间被固定在固化后的水凝胶内导致细胞形态延迟。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明的目的提供是一种含细胞骨组织工程支架及其制备方法，用于取代现有FDM型双喷头混合3D打印工艺，制备可原位负载细胞、生长因子，具有多级微孔结构和良好力学性能的含细胞骨组织工程支架。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
第一方面，一种含细胞骨组织工程支架的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)油溶性高分子材料和油性溶剂进行灭菌后混合均匀并搅拌，得到无菌油溶性高分子材料/油性溶剂溶液，往无菌油溶性高分子材料/油性溶剂溶液加入生物陶瓷粉体，再次混合均匀，得到油溶性高分子材料/生物陶瓷粉体/油性溶剂溶液；
(2)水溶性生物活性材料和乳化剂进行灭菌后，将水溶性生物活性材料和乳化剂溶于水中，得到生物活性材料/乳化剂/水溶液；
(3)在无菌条件下将步骤(1)得到的油溶性高分子材料/生物陶瓷粉体/油性溶剂溶液和步骤(2)得到的生物活性材料/乳化剂/水溶液混合并进行搅拌，得到油包水复合乳液墨水A，并将油包水复合乳液墨水A转移至无菌注射器1；
(4)水凝胶、光引发剂和细胞培养基灭菌，将水凝胶和光引发剂加入细胞培养基，然后避光磁力搅拌，得到水凝胶/光引发剂/细胞培养基溶液；
(5)在无菌条件下往水凝胶/光引发剂/细胞培养基中加入细胞，得到含细胞生物墨水B，用移液枪吹打含细胞生物墨水B使其混合均匀后，将其转移至无菌注射器2并放置冷却；
(6)将无菌注射器1和无菌注射器2转移至具有洁净气流和空间内的双喷头3D打印机，无菌注射器1转移至打印喷头1，无菌注射器2转移至打印喷头2，进行打印喷头1和打印喷头2的交替打印，得到含细胞骨组织工程支架。
优选地，步骤(1)中，所述油溶性高分子材料为聚(乳酸-羟基乙酸)，所述油性溶剂为二氯甲烷，所述生物陶瓷粉体为β-磷酸三钙。
优选地，步骤(1)中，按照重量份数计，所述油溶性高分子材料1～5份，所述油性溶剂8～20份，所述生物陶瓷粉体1～5份。
优选地，步骤(1)中，通过磁力搅拌24小时将油溶性高分子材料和油性溶剂混合均匀，加入生物陶瓷粉体后，通过在冰浴下超声震荡10分钟再次混合均匀。
优选地，步骤(2)中，所述水溶性生物活性材料为成骨多肽，所述乳化剂为聚乙烯醇，所述水为去离子水。
优选地，步骤(2)中，按照重量份数计，所述水溶性生物活性材料0.001～0.1份，所述乳化剂0.005～0.05份，所述水0.1～3份。
优选地，步骤(3)中，搅拌为手动搅拌，搅拌时间为20分钟。
优选地，步骤(4)中，所述水凝胶为明胶、甲基丙烯酰胺化海藻酸钠、甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)、甲基丙烯酰胺化透明质酸(HAMA)中的至少一种，所述光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)、Irgacure2959中的至少一种，所述细胞为干细胞、成骨细胞、成骨前体细胞中的至少一种。
优选地，步骤(4)中，按照重量份数计，所述水凝胶0.02～3份，其中明胶0.01～1份，甲基丙烯酸酐化明胶0.01～2份，所述光引发剂0.001～0.05份，所述细胞培养基8～11份，所述细胞0.0001～0.05份。
优选地，步骤(4)中，磁力搅拌时间为30分钟，搅拌温度为50℃。
优选地，步骤(5)中，加入细胞的温度为37℃，冷却的温度为4℃，放置时间为3分钟。
优选地，步骤(6)中，交替打印的方法为：设置打印温度为0～5℃，打印喷头1的运动速度为0.1～20mm/s，气压为0.5～5bar，喷头内直径为0.1～0.6mm，打印线条间隔0.4～2mm，打印喷头2的运动速度为0.1～20mm/s，气压为0.05～0.5bar，喷头内直径为0.4～2mm；使用打印喷头1打印第一层，得到含油包水复合乳液线条，打印第一层含油包水复合乳液线条停顿后0.1～10分钟，待含油包水复合乳液线条内有机溶剂挥发后，更换打印喷头2，在含油包水复合乳液线条的间隙填充细胞生物墨水B，本层填充完成后进行0.1～5分钟、波长为365～405nm、光照强度为20～1000mW的紫外光固化，紫外光固化完成后进行第二层打印喷头1和打印喷头2的打印，第二层含油包水复合乳液线条的线条角度相比第一层转动30～180度，打印方法与第一层相同，依照打印方法用打印喷头1和打印喷头2交替打印4～300层。
优选地，步骤(6)中，含细胞骨组织工程支架的培养方法为：将含细胞骨组织工程支架转移至无菌培养基中，并在含5％二氧化碳的细胞培养器中培养后换液，换液中间间隔2小时，换液三次后进行长期培养，1～2天更换培养基。
第二方面，一种由以上制备方法制备得到的含细胞骨组织工程支架。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述的一种含细胞骨组织工程支架的制备方法打印条件温和，明胶-甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶极大地减小了二氯甲烷对细胞的毒性，细胞在5℃的打印温度下内部不会因为低温产生冰晶造成损伤，从而使细胞在打印过程中维持良好活性。
(2)本发明所述的一种含细胞骨组织工程支架具有多级微孔仿生结构，同时实现了良好的力学性能，成骨多肽大量原位负载、大量干细胞的原位负载及活性保持效果。
(3)本发明所述的一种含细胞骨组织工程支架经过培养，可使干细胞从光固化明胶-甲基丙烯酸酐明胶水凝胶中逐渐释放，并向附近的成骨多肽/β-磷酸三钙/聚(乳酸-羟基乙酸)支架表面迁移、黏附及铺展，支架释放的成骨多肽能促进黏附在成骨多肽/β-磷酸三钙/聚(乳酸-羟基乙酸)支架柱体表面的干细胞增殖及成骨分化。
附图说明
图1为本发明提供的含细胞骨组织工程支架的制备方法流程图；
图2中(a)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架的影像顶视图，(b)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架的影像侧视图，(c)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架的影像斜视图；
图3中(a)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架的SEM顶视图，(b)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架截面的低倍SEM图，(c)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架截面的高倍SEM图；
图4中(a)为本发明实施例1、对比例1～2制备得到的不同工程支架的应力——应变曲线图，(b)为本发明实施例1、对比例1～2制备得到的不同工程支架的压缩模量图，(c)为本发明实施例1、对比例1～2制备得到的不同工程支架的压缩强度图，“GG”为本发明对比例1制备得到的明胶-甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶工程支架，“OTP”为本发明对比例2制备得到的成骨多肽/β-磷酸三钙/聚(乳酸-羟基乙酸)工程支架，“GGOTP”为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架；
图5中(a)为本发明对比例3制备得到的无成骨多肽的含细胞工程支架的低倍细胞死活染色效果图，(b)为本发明实施例1制备得到的含细胞工程支架的低倍细胞死活染色效果图，(c)为本发明对比例3制备得到的无成骨多肽的含细胞工程支架的高倍细胞死活染色效果图，(d)为本发明实施例1制备得到的含细胞工程支架的高倍细胞死活染色效果图；
图6中(a)为本发明对比例4制备得到的培养3天的无成骨多肽的含细胞工程支架的低倍染色细胞死活染色效果图，(b)为本发明实施例2制备得到的含细胞骨组织工程支架培养3天的低倍细胞死活染色效果图，(c)为本发明对比例4制备得到的培养3天的无成骨多肽的含细胞工程支架的染色高倍细胞死活染色效果图，(d)为本发明实施例2制备得到的含细胞骨组织工程支架培养3天的高倍细胞死活染色效果图；
图7中(a)为本发明对比例5制备得到的培养3天的细胞后种植工程支架的低倍细胞死活染色效果图，(b)为本发明实施例2制备得到的含细胞骨组织工程支架培养3天的低倍细胞死活染色效果图，(c)为本发明对比例5制备得到的培养3天的细胞后种植工程支架的高倍细胞死活染色效果图，(d)为本发明实施例2制备得到的含细胞骨组织工程支架培养3天的高倍细胞死活染色效果图；
图8中(a)为本发明对比例6制备得到的培养7天的细胞后种植工程支架的低倍细胞死活染色效果图，(b)为本发明实施例3制备得到的培养7天的含细胞骨组织工程支架的低倍细胞死活染色效果图，(c)为本发明对比例4制备得到的培养3天的无成骨多肽的含细胞工程支架的高倍细胞死活染色效果图，(d)为本发明实施例3制备得到的培养7天的含细胞骨组织工程支架的高倍细胞死活染色效果图；
图9中(a)为实施例2～3、对比例5～6制备得到的培养不同时间的制备步骤不同的工程支架的细胞密度对比图，(b)为实施例2～3、对比例5～6制备得到的培养不同时间的制备步骤不同的工程支架的的细胞分布均匀度对比图，“Cell seeding”为本发明对比例5～6制备得到的细胞后种植工程支架，“Cell printing”为本发明实施例2～3制备得到的含细胞骨组织工程支架。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
一种含细胞骨组织工程支架的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称量3g聚(乳酸-羟基乙酸)和10mL二氯甲烷，进行灭菌后，将聚(乳酸-羟基乙酸)溶解于二氯甲烷，磁力搅拌24小时至溶解均匀，得到聚(乳酸-羟基乙酸)/二氯甲烷溶液；再称量3gβ-磷酸三钙，灭菌后将其加入聚(乳酸-羟基乙酸)/二氯甲烷溶液,在冰浴下超声震荡10分钟，得到聚(乳酸-羟基乙酸)/β-磷酸三钙/二氯甲烷溶液；
(2)称量1mg成骨多肽、50mg聚乙烯醇和1.8mL去离子水进行灭菌，将成骨多肽和聚乙烯醇溶于去离子水中，得到复合油包水乳液；
(3)在无菌条件下将步骤(1)得到的聚(乳酸-羟基乙酸)/β-磷酸三钙/二氯甲烷溶液和步骤(2)得到的复合油包水乳液混合，手动搅拌20分钟，得到油包水复合乳液墨水A，并将油包水复合乳液墨水A转移至无菌注射器1；
(4)称量0.5g明胶、0.5g甲基丙烯酰胺化明胶和25μL苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐和10mL细胞培养基，进行灭菌，将明胶、甲基丙烯酸酐化明胶和苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐加入细胞培养基，在50℃、避光条件下磁力搅拌30分钟，得到水凝胶/光引发剂/细胞培养基溶液；
(5)在无菌条件下往水凝胶/光引发剂/细胞培养基溶液中加入干细胞，调节溶液中干细胞浓度为2×106mol/mL，得到含细胞生物墨水B，用移液枪吹打含细胞生物墨水B使其混合均匀后，将其转移至无菌注射器2并放置冷却至4℃，放置3分钟；
(6)将无菌注射器1和无菌注射器2转移至具有洁净气流和空间内的双喷头3D打印机，无菌注射器1转移至打印喷头1，无菌注射器2转移至打印喷头2，设置打印温度为5℃，打印喷头1的运动速度为10mm/s，气压为0.8bar，喷头内直径为0.4mm，打印线条间隔0.5mm，打印喷头2的运动速度为10mm/s，气压为0.1bar，喷头内直径为0.5mm，使用打印喷头1打印第一层，得到含油包水复合乳液线条，打印第一层后停顿1分钟，待含油包水复合乳液线条挥发后，更换打印喷头2，在含油包水复合乳液线条的间隙填充细胞生物墨水B，本层填充完成后进行20秒波长为405nm、光照强度为20mW的紫外光固化，紫外光固化完成后进行第二层打印喷头1和打印喷头2的打印，第二层含油包水复合乳液线条的线条角度相比第一层转动90度，打印方法与第一层相同，依照打印方法用打印喷头1和打印喷头2交替打印8层，得到含细胞骨组织工程支架。
实施例2
实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于：实施例2对实施例1制备得到的含细胞骨工程支架进行培养，将含细胞骨组织工程支架转移至无菌培养基中，并在含5％二氧化碳的细胞培养器中培养后换液，换液中间间隔2小时，换液三次后进行长期培养，1～2天更换培养基，培养3天后得到培养3天的含细胞骨组织工程支架。
实施例3
实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于：实施例3对实施例1制备得到的含细胞骨工程支架进行培养，将含细胞骨组织工程支架转移至无菌培养基中，并在含5％二氧化碳的细胞培养器中培养后换液，换液中间间隔2小时，换液三次后进行长期培养，1～2天更换培养基，培养7天后得到培养7天的含细胞骨组织工程支架。
图1为含细胞骨组织工程支架的制备方法流程图。
图2中(a)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架的影像顶视图，(b)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架的影像侧视图，(c)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架的影像斜视图。由图2可观察到含细胞骨组织工程支架由浅色部分的成骨多肽/β-磷酸三钙/聚(乳酸-羟基乙酸)柱体和深色部分的细胞/明胶-甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶柱体组成，具有均匀的两相结构。其中该含细胞骨组织工程支架干燥状态下的神色部分柱体呈现蜂窝网状结构，而干燥状态下的浅色部分柱体呈现相对致密结构，且柱体表面和内部存在大量次级微孔。
本发明对实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架进行扫描电镜表征，结果如图3所示，图3中(a)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架的SEM顶视图，(b)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架截面的低倍SEM图，(c)为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架截面的高倍SEM图。由图3(a)可以看出含细胞骨组织工程支架有可控的一级结构和次级结构，同时含细胞骨组织工程支架负载大量生物陶瓷粉体和成骨多肽；由图3(b)和图3(c)可以观察到该含细胞骨组织工程支架具有200～400微米大孔和1～50微米柱体表面次级微孔的多级微孔仿生结构。
对比例1
一种明胶-甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶工程支架的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称量0.5g明胶、0.5g甲基丙烯酰胺化明胶和25μL苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐和10mL细胞培养基，进行灭菌，将明胶、甲基丙烯酸酐化明胶和苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐加入细胞培养基，在50℃、避光条件下磁力搅拌30分钟，得到水凝胶/光引发剂/细胞培养基溶液；
(2)在无菌条件下往水凝胶/光引发剂/细胞培养基溶液中加入干细胞，调节溶液中干细胞浓度为2×106mol/mL，得到含细胞生物墨水B，用移液枪吹打含细胞生物墨水B使其混合均匀后，将其转移至无菌注射器并放置冷却至4℃，放置3分钟；
(3)将无菌注射器转移至具有洁净气流和空间内的双喷头3D打印机的打印喷头2，设置打印温度为5℃，打印喷头2的运动速度为10mm/s，气压为0.1bar，喷头内直径为0.5mm，进行第一层含细胞生物墨水B线条打印，本层打印完成后进行20秒波长为405nm、光照强度为20mW的紫外光固化，紫外光固化完成后进行第二层打印喷头2的打印，第二层含细胞生物墨水B线条的线条角度相比第一层转动90度，打印方法与第一层相同，打印喷头2打印8层，得到明胶-甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶工程支架。
对比例2
一种成骨多肽/β-磷酸三钙/聚(乳酸-羟基乙酸)工程支架的制备，方法所述方法包括以下步骤：
(1)称量3g聚(乳酸-羟基乙酸)和10mL二氯甲烷，进行灭菌后，将聚(乳酸-羟基乙酸)溶解于二氯甲烷，磁力搅拌24小时至溶解均匀，得到聚(乳酸-羟基乙酸)/二氯甲烷溶液；再称量3gβ-磷酸三钙，灭菌后将其加入聚(乳酸-羟基乙酸)/二氯甲烷溶液,在冰浴下超声震荡10分钟，得到聚(乳酸-羟基乙酸)/β-磷酸三钙/二氯甲烷溶液；
(2)称量1mg成骨多肽、50mg聚乙烯醇和1.8mL去离子水进行灭菌，将成骨多肽和聚乙烯醇溶于去离子水中，得到复合油包水乳液；
(3)在无菌条件下将步骤(1)得到的聚(乳酸-羟基乙酸)/β-磷酸三钙/二氯甲烷溶液和步骤(2)得到的复合油包水乳液混合，手动搅拌20分钟，得到油包水复合乳液墨水A；
(4)将无菌注射器转移至具有洁净气流和空间内的双喷头3D打印机的打印喷头1，设置打印温度为5℃，打印喷头1的运动速度为10mm/s，气压为0.8bar，喷头内直径为0.4mm，打印线条间隔0.5mm，使用打印喷头1打印第一层，得到含油包水复合乳液线条，打印第一层后停顿1分钟，待含油包水复合乳液线条中的二氯甲烷挥发后，进行第二层打印喷头1的打印，第二层含油包水复合乳液线条线条角度相比第一层转动90度，打印方法与第一层相同，依照打印方法用打印喷头1打印8层后，冷冻干燥，得到成骨多肽/β-磷酸三钙/聚(乳酸-羟基乙酸)工程支架。
力学性能测试
将实施例1、对比例1～2制备得到的工程支架进行力学性能测试，结果如图4所示，图4中(a)为本发明实施例1、对比例1～2制备得到的不同工程支架的应力——应变曲线图，(b)为本发明实施例1、对比例1～2制备得到的不同工程支架的压缩模量图，(c)为本发明实施例1、对比例1～2制备得到的不同工程支架的压缩强度图，“GG”为本发明对比例1制备得到的明胶-甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶工程支架，“OTP”为本发明对比例2制备得到的成骨多肽/β-磷酸三钙/聚(乳酸-羟基乙酸)工程支架，“GGOTP”为本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架；
由图4可以看出本发明实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架兼具对比例1制备得到的明胶-甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶工程支架和对比例2制备得到的成骨多肽/β-磷酸三钙/聚(乳酸-羟基乙酸)工程支架的力学性能。
对比例3
对比例3与实施例1基本相同，不同之处在于：对比例3不添加成骨多肽，得到无成骨多肽的含细胞骨组织工程支架。
对比例4
对比例4与对比例3基本相同，不同之处在于：对比例4对实施例3制备得到的无成骨多肽的含细胞骨组织工程支架进行培养，将无成骨多肽的含细胞骨组织工程支架转移至无菌培养基中，并在含5％二氧化碳的细胞培养器中培养后换液，换液中间间隔2小时，换液三次后进行长期培养，1～2天更换培养基，培养3天后得到培养3天的无成骨多肽的含细胞骨组织工程支架。
对比例5
一种细胞后种植工程支架的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称量3g聚(乳酸-羟基乙酸)和10mL二氯甲烷，进行灭菌后，将聚(乳酸-羟基乙酸)溶解于二氯甲烷，磁力搅拌24小时至溶解均匀，得到聚(乳酸-羟基乙酸)/二氯甲烷溶液；再称量3gβ-磷酸三钙，灭菌后将其加入聚(乳酸-羟基乙酸)/二氯甲烷溶液,在冰浴下超声震荡10分钟，得到聚(乳酸-羟基乙酸)/β-磷酸三钙/二氯甲烷溶液；
(2)称量1mg成骨多肽、50mg聚乙烯醇和1.8mL去离子水进行灭菌，将成骨多肽和聚乙烯醇溶于去离子水中，得到复合油包水乳液；
(3)在无菌条件下将步骤(1)得到的聚(乳酸-羟基乙酸)/β-磷酸三钙/二氯甲烷溶液和步骤(2)得到的复合油包水乳液混合，手动搅拌20分钟，得到油包水复合乳液墨水A，并将油包水复合乳液墨水A转移至无菌注射器1；
(4)称量0.25g明胶、0.25g甲基丙烯酰胺化明胶和12.5μL苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、5mL细胞培养基和5mL去离子水，进行灭菌，将明胶、甲基丙烯酸酐化明胶和苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐加入细胞培养基和去离子水，在50℃、避光条件下磁力搅拌30分钟，得到墨水B，将其转移至无菌注射器2并放置冷却至4℃，放置3分钟；
(5)将无菌注射器1和无菌注射器2转移至具有洁净气流和空间内的双喷头3D打印机，无菌注射器1转移至打印喷头1，无菌注射器2转移至打印喷头2，设置打印温度为5℃，打印喷头1的运动速度为10mm/s，气压为0.8bar，喷头内直径为0.4mm，打印线条间隔0.5mm，打印喷头2的运动速度为10mm/s，气压为0.1bar，喷头内直径为0.5mm，使用打印喷头1打印第一层，得到含油包水复合乳液线条，打印第一层后停顿1分钟，待含油包水复合乳液线条干燥后，更换打印喷头2，在含油包水复合乳液线条的间隙填充墨水B，本层填充完成后进行20秒波长为405nm、光照强度为20mW的紫外光固化，紫外光固化完成后进行第二层打印喷头1和打印喷头2的打印，第二层含油包水复合乳液线条的线条角度相比第一层转动90度，打印方法与第一层相同，依照打印方法用打印喷头1和打印喷头2交替打印8层，得到工程支架；
(6)制备浓度为4×106mol/mL的干细胞悬液；
(7)将工程支架干燥并用伽马射线消毒后放入培养皿，在工程支架表面滴加5mL干细胞悬液，待细胞悬液被工程支架吸收，细胞贴附在工程支架表面，得到细胞后种植工程支架；
(8)将制备得到的细胞后种植的工程支架进行培养，将细胞后种植的工程支架转移至无菌培养基中，并在含5％二氧化碳的细胞培养器中培养后换液，换液中间间隔2小时，换液三次后进行长期培养，1～2天更换培养基，培养3天后得到培养3天的细胞后种植工程支架。
对比例5与实施例1基本相同，不同之处在于：对比例5的工程支架不添加干细胞，制备得到工程支架后再进行细胞后种植。
对比例6
对比例6与对比例5基本相同，不同之处在于：对比例6的细胞后种植的工程支架培养时间为7天，得到培养7天的细胞后种植工程支架。
生物活性测试
本发明对实施例1制备得到的含细胞骨组织工程支架和对比例3制备得到的无成骨多肽的含细胞骨组织工程支架进行细胞死活染色实验，结果如图5所示，图5中(a)为本发明对比例3制备得到的无成骨多肽的含细胞工程支架的低倍细胞死活染色效果图，(b)为本发明实施例1制备得到的含细胞工程支架的低倍细胞死活染色效果图，(c)为本发明对比例3制备得到的无成骨多肽的含细胞工程支架的高倍细胞死活染色效果图，(d)为本发明实施例1制备得到的含细胞工程支架的高倍细胞死活染色效果图。白色部分为细胞，图中可观察到白色部分呈圆点状，说明刚打印完成的含细胞工程支架中绝大部分细胞为活细胞。图5中细胞密度相似，说明成骨多肽对刚打印完成的含细胞工程支架中细胞形态和活性无明显影响。
本发明将实施例2制备得到的培养3天的含细胞骨组织工程支架和对比例4制备得到的培养3天的无成骨多肽的含细胞骨组织工程支架进行细胞死活染色实验，结果如图6所示；图6中(a)为本发明对比例4制备得到的培养3天的无成骨多肽的含细胞工程支架的低倍染色细胞死活染色效果图，(b)为本发明实施例2制备得到的含细胞骨组织工程支架培养3天的低倍细胞死活染色效果图，(c)为本发明对比例4制备得到的培养3天的无成骨多肽的含细胞工程支架的染色高倍细胞死活染色效果图，(d)为本发明实施例2制备得到的含细胞骨组织工程支架培养3天的高倍细胞死活染色效果图。图中白色部分为细胞，从图中可观察到图中的白色部分呈现梭形，说明说明所有细胞从水凝胶柱体中释放出来并迁移到柱体表面并黏附、铺展。和图6(c)对比，图6(d)中细胞密度更大，说明细胞在含有成骨多肽的柱体释放、迁移、黏附、铺展的过程中依然保持了较高的活性。
本发明将实施例2～3、对比例5～6进行细胞死活染色实验，结果如图7～9所示。图7中(a)为本发明对比例5制备得到的培养3天的细胞后种植工程支架的低倍细胞死活染色效果图，(b)为本发明实施例2制备得到的含细胞骨组织工程支架培养3天的低倍细胞死活染色效果图，(c)为本发明对比例5制备得到的培养3天的细胞后种植工程支架的高倍细胞死活染色效果图，(d)为本发明实施例2制备得到的含细胞骨组织工程支架培养3天的高倍细胞死活染色效果图；图8中(a)为本发明对比例6制备得到的培养7天的细胞后种植工程支架的低倍细胞死活染色效果图，(b)为本发明实施例3制备得到的培养7天的含细胞骨组织工程支架的低倍细胞死活染色效果图，(c)为本发明对比例4制备得到的培养3天的无成骨多肽的含细胞工程支架的高倍细胞死活染色效果图，(d)为本发明实施例3制备得到的培养7天的含细胞骨组织工程支架的高倍细胞死活染色效果图；图9中(a)为实施例2～3、对比例5～6制备得到的培养不同时间的制备步骤不同的工程支架的细胞密度对比图，(b)为实施例2～3、对比例5～6制备得到的培养不同时间的制备步骤不同的工程支架的的细胞分布均匀度对比图，“Cell seeding”为本发明对比例5～6制备得到的细胞后种植工程支架，“Cellprinting”为本发明实施例2～3制备得到的含细胞骨组织工程支架。由图7～8可以看出，含细胞骨组织工程支架在培养3天和培养7天的情况下细胞密度比细胞后种植工程支架高，由图9(a)可以看出本发明所制备的含细胞骨组织工程支架细胞密度更高，由图9(b)可以看出本发明所制备的含细胞骨组织工程支架细胞分布均匀度更高，以上结果充分体现了含细胞骨组织工程支架的制备方法相比于打印支架后进行细胞后种植的培养方法更有利于干细胞增殖及成骨分化。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种含细胞骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)油溶性高分子材料和油性溶剂进行灭菌后混合均匀，得到无菌油溶性高分子材料/油性溶剂溶液，往无菌油溶性高分子材料/油性溶剂溶液加入生物陶瓷粉体，再次混合均匀，得到油溶性高分子材料/生物陶瓷粉体/油性溶剂溶液；
(2)水溶性生物活性材料和乳化剂进行灭菌后，将水溶性生物活性材料和乳化剂溶于水中，得到生物活性材料/乳化剂/水溶液；
(3)在无菌条件下将步骤(1)得到的油溶性高分子材料/生物陶瓷粉体/油性溶剂溶液和步骤(2)得到的生物活性材料/乳化剂/水溶液混合并进行搅拌，得到油包水复合乳液墨水A，并将油包水复合乳液墨水A转移至无菌注射器1；
(4)水凝胶、光引发剂和细胞培养基灭菌，将水凝胶和光引发剂加入细胞培养基，然后避光磁力搅拌，得到水凝胶/光引发剂/细胞培养基溶液；
(5)在无菌条件下往水凝胶/光引发剂/细胞培养基中加入细胞，得到含细胞生物墨水B，用移液枪吹打含细胞生物墨水B使其混合均匀后，将其转移至无菌注射器2并放置冷却；
(6)将无菌注射器1和无菌注射器2转移至具有洁净气流和空间内的双喷头3D打印机，无菌注射器1转移至打印喷头1，无菌注射器2转移至打印喷头2，进行打印喷头1和打印喷头2的交替打印，得到含细胞骨组织工程支架。
2.根据权利要求1所述的含细胞骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述油溶性高分子材料为聚(乳酸-羟基乙酸)，所述油性溶剂为二氯甲烷，所述生物陶瓷粉体为β-磷酸三钙，所述水溶性生物活性材料为成骨多肽，所述乳化剂为聚乙烯醇，所述水为去离子水，所述水凝胶为明胶、甲基丙烯酰胺化海藻酸钠、甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)、甲基丙烯酰胺化透明质酸(HAMA)中的至少一种，所述光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)、Irgacure2959中的至少一种，所述细胞为干细胞、成骨细胞、成骨前体细胞中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的含细胞骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，按照重量份数计，所述油溶性高分子材料1～5份，所述油性溶剂8～20份，所述生物陶瓷粉体1～5份，所述油性溶剂50～100份，所述水溶性生物活性材料0.001～0.1份，所述乳化剂0.005～0.05份，所述水0.1～3份，所述光引发剂0.001～0.05份，所述细胞培养基8～11份，所述细胞0.0001～0.05份，所述水凝胶0.02～3份。
4.根据权利要求1所述的含细胞骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，通过磁力搅拌24小时将油溶性高分子材料和油性溶剂混合均匀，加入生物陶瓷粉体后，通过在冰浴下超声震荡10分钟再次混合均匀。
5.根据权利要求1所述的含细胞骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，搅拌为手动搅拌，搅拌时间为20分钟。
6.根据权利要求1所述的含细胞骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，磁力搅拌时间为30分钟，搅拌温度为50℃。
7.根据权利要求1所述的含细胞骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，加入细胞的温度为37℃，冷却的温度为4℃，放置时间为3分钟。
8.根据权利要求1所述的含细胞骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，交替打印的方法为，设置打印温度为0～5℃，打印喷头1的运动速度为0.1～20mm/s，气压为0.5～5bar，喷头内直径为0.1～0.6mm，打印线条间隔0.4～2mm，打印喷头2的运动速度为0.1～20mm/s，气压为0.05～0.5bar，喷头内直径为0.4～2mm；使用打印喷头1打印第一层，得到含油包水复合乳液线条，打印第一层含油包水复合乳液线条停顿后0.1～10分钟，待含油包水复合乳液线条内有机溶剂挥发后，更换打印喷头2，在含油包水复合乳液线条的间隙填充细胞生物墨水B，本层填充完成后进行0.1～5分钟、波长为365～405nm、光照强度为20～1000mW的紫外光固化，紫外光固化完成后进行第二层打印喷头1和打印喷头2的打印，第二层含油包水复合乳液线条的线条角度相比第一层转动30～180度，打印方法与第一层相同，依照打印方法用打印喷头1和打印喷头2交替打印4～300层。
9.根据权利要求1所述的含细胞骨组织工程支架的培养方法，其特征在于，将含细胞骨组织工程支架转移至无菌培养基中，并在含5％二氧化碳的细胞培养器中培养后换液，换液中间间隔2小时，换液三次后进行长期培养，1～2天更换培养基，得到含经过细胞培养的细胞骨组织工程支架。
10.一种根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备得到的含细胞骨组织工程支架。
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| CN202211300352.XA CN115591021A (zh) | 2022-10-24 | 2022-10-24 | 一种含细胞骨组织工程支架及制备方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN109364302A (zh) * | 2018-09-21 | 2019-02-22 | 王翀 | 一种骨软骨修复材料及组织工程支架的制备方法 |
| CN109999226A (zh) * | 2018-11-27 | 2019-07-12 | 王翀 | 一种打印材料、负载干细胞的骨组织工程支架及制备方法 |
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