CN115557613B - 一种基于四膜虫的生物治理蓝藻水华方法 - Google Patents

一种基于四膜虫的生物治理蓝藻水华方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于四膜虫的生物治理蓝藻水华方法，属于水环境污染治理及控制领域。本发明首次发现四膜虫(Tetrahymena sp.)能够高效吞噬微囊藻以防治蓝藻水华大规模爆发，同时其环境耐受性好，生长发育不受制于藻毒素等次生代谢产物影响。本发明通过分离得到能吞噬微囊藻的四膜虫，其作为模式生物易驯化培养，生存繁殖能力强，培养成本低，短时间内可以获得大量个体；利用四膜虫吞噬水华藻治理蓝藻水华，其可在较短时间内大量吞噬水华藻，除藻效率高，可达95％以上，清除水华藻后其仍可以作为其他水生动物的营养来源，可以高效应用于早期治理蓝藻水华。

Description

一种基于四膜虫的生物治理蓝藻水华方法
技术领域
本发明属于水环境污染治理及控制领域，具体涉及一种基于四膜虫的生物治理蓝藻水华方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
随着全球气候变暖及和水体富营养化的加剧，有害蓝藻水华(Harmfulcyanobacterial blooms)爆发频繁出现，在世界各地湖泊水库等地都有发生，其中我国是世界上蓝藻水华暴发最严重、分布最广泛的国家之一。每年夏季，在我国太湖、滇池会爆发大面积的蓝藻水华。铜绿微囊藻(M.aeruginosa)是引起蓝藻水华的优势藻种之一，其产生的微囊藻毒素(microcystins,MCs)具有强烈的促癌(原发性肝癌)作用，对生物多样性和水生生态系统的平衡造成破坏，严重威胁人类的生命健康安全。因此，实现对蓝藻水华的有效控制和治理显得尤为迫切。
当前，生物控藻以高效、环境友好等优点对控制以铜绿微囊藻为优势物种的蓝藻水华而言具有广阔应用前景，因此，陆续开展了一些降解菌、噬藻体、浮游动物(水蚤Daphnia)及原生生物(变形虫Amoeba,鞭毛虫Flagellate,和混合营养金藻Mixotrophicgolden algae)等在控制蓝藻生物量及清除藻毒素等方面的研究。如中国专利CN 1432538A公开了利用浮游动物中的大型溞治理水域蓝绿藻污染，但现阶段浮游动物大型溞常受制于藻毒素的毒害影响其生长繁殖，从而应用效果受限。中国专利CN 111269855 A公开了溶藻菌在蓝藻水华中的应用，但其存在环境耐受性差，效果不稳定等缺点。同时一些原生动物在蓝藻水华中的应用，存在大规模培养技术欠缺以及吞噬效率低的问题。目前，许多研究记录的一些原生动物的最大摄食率，其中包括三毛虫Collodictyon triciliatum的最大摄食率为6.2cells predator-1h-1、双鞭毛虫Diphylleia rotans的最大摄食率为0.56cellspredator-1h-1、棕鞭藻Ochromonas sp.的最大摄食率为2.21cells predator-1h-1、金藻Poterioochromonas sp.的最大摄食率为3.3cells predator-1h-1，其摄食效率仍未达到较高水平。
因此，亟需寻找一种基于生物防治能够高效吞噬微囊藻进而控制蓝藻水华的新方法。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于四膜虫的生物治理蓝藻水华方法。本发明首次发现四膜虫(Tetrahymena sp.)能够安全、高效、快速地吞噬铜绿微囊藻，能在受蓝藻水华污染的水体中稳定生长繁殖，从而达到控制蓝藻水华污染、实现水体自净的目的。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种基于四膜虫的生物防治蓝藻水华方法，包括以下步骤：
(1)分离纯化得到四膜虫，并进行18S rDNA鉴定；
(2)培养四膜虫；
(3)四膜虫饥饿处理：将培养完的四膜虫加入用于饥饿处理的液体中，饥饿处理24h以上；
(4)吞噬培养：向蓝藻中加入经过饥饿处理的四膜虫，四膜虫吞噬蓝藻达到有效减少其生物量的目的。
本发明的有益效果为：
本发明首次发现四膜虫(Tetrahymena sp.)能够高效吞噬微囊藻以防治蓝藻水华大规模爆发，同时其环境耐受性好，生长发育不受制于藻毒素等次生代谢产物影响。本发明通过分离得到一种能吞噬微囊藻的四膜虫，其作为模式生物易驯化培养，生存繁殖能力强，培养成本低，短时间内可以获得大量个体；同时，其可在较短时间内大量吞噬水华藻，除藻效率高，可达95％以上，清除水华藻后其仍可以作为其他水生动物的营养来源；其次，其繁殖能力不受藻毒素等次生代谢产物的影响，能在受蓝藻水华污染的水体中稳定生长繁殖，能够短时间内消化微囊藻，促进自身种群数量增长，并进行重复摄食，除藻效率高。
本发明利用四膜虫吞噬水华藻治理蓝藻水华的方法具有生态安全性高,易实施，经济高效的优点,可以高效应用于早期治理蓝藻水华。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1-3四膜虫(Tetrahymena mobilis)进行吞噬实验前后的实物变化；
图2为本发明实施例1中四膜虫及四膜虫吞噬微囊藻的显微镜100x倍镜下图片；
图3为实施例1-3中四膜虫的生长曲线；
图4为实施例1-3中四膜虫的特定生长率(Specific growth rate,h-1)；
图5为实施例1-3中四膜虫的摄食率(Ingestion rate,cells predator-1h-1)；
图6为实施例1-3中四膜虫对铜绿微囊藻的抑制率(Inhibition rate,％)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于目前采用生物控藻方法控制和治理蓝藻水华中存在的藻毒素的毒害影响生物生长繁殖，生物摄食率不高等问题，本发明提出了一种基于四膜虫的生物治理蓝藻水华方法。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种基于四膜虫的生物防治蓝藻水华方法，包括以下步骤：
(1)分离纯化得到四膜虫，并进行18S rDNA鉴定；
(2)培养四膜虫；
(3)四膜虫饥饿处理：将培养完的四膜虫加入用于饥饿处理的液体中，饥饿处理24h以上；
(4)吞噬培养：向蓝藻中加入经过饥饿处理的四膜虫，四膜虫吞噬蓝藻达到有效减少其生物量的目的。
该实施方式的一些实施例中，所述四膜虫为四膜虫种Tetrahymena sp.，经18SrDNA鉴定为Tetrahymena mobilis，从污染的铜绿微囊藻培养物中分离纯化所得，外观呈椭圆长梨状，体长约50μm，身体前端具有口器，全身布满数百根长约4-6μm长的纤毛。
该实施方式的一些实施例中，所述培养四膜虫的培养条件为：Neff培养基，温度20-30℃，优选为24-28℃；光照20-40μmol m-2s-1，优选为25-35μmol m-2s-1；光暗比15-18h：6-9h，优选为16h：8h；培养2-4D。
该实施方式的一些实施例中，所述Neff培养基的配制方法为：牛肉膏蛋白胨(BPM)5-8g、三氯化铁储备液1mL，经1L蒸馏水溶解后在121℃、30min下进行高压灭菌，4℃保存。
该实施方式的一些实施例中，用于饥饿处理的液体包括无菌水、藻类BG11培养基中的一种。
该实施方式的一些实施例中，所述饥饿处理的培养条件与四膜虫的培养条件一致。
该实施方式的一些实施例中，所述蓝藻为铜绿微囊藻。
该实施方式的一些实施例中，所述吞噬培养中，细胞密度为1.1×107cells mL-1的蓝藻中加入的四膜虫密度保证为1x104cells mL-1及以上。
该实施方式的一些实施例中，所示吞噬培养的培养条件为：向蓝藻中加入经饥饿处理的四膜虫，并将其置于温度20-25℃，优选为23-25℃；光照25-30μmol m-2s-1，优选为28-30μmol m-2s-1；光暗比16h：8h的条件下进行吞噬培养。
该实施方式的一些实施例中，所述吞噬培养过程中每天对培养容器摇匀4-5次，使四膜虫与蓝藻混合均匀，充分接触。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一种基于四膜虫的生物治理蓝藻水华方法：
(1)从污染的铜绿微囊藻培养物中分离纯化得到四膜虫，经18S rDNA鉴定为Tetrahymena mobilis，该四膜虫为四膜虫种Tetrahymena sp.，外观呈椭圆长梨状，体长约50μm，身体前端具有口器，全身布满数百根长约4-6μm长的纤毛；
(2)培养四膜虫；Neff培养基，温度24-28℃，光照25-35μmol m-2s-1，光暗比16h：8h；培养2-4D。
Neff培养基的配制方法为：牛肉膏蛋白胨(BPM)5-8g、三氯化铁储备液1mL，经1L蒸馏水溶解后在121℃、30min下进行高压灭菌，4℃保存。
(3)四膜虫饥饿处理：将培养完成的四膜虫在3000-3500rpm下低速离心5min以上，倒掉上清液后加入BG11培养基进行饥饿处理，饥饿处理时间保证为24h以上。培养条件：温度24-28℃，光照25-35μmol m-2s-1，光暗比16h：8h。
(4)吞噬培养：向细胞密度为1.1×107cells mL-1的铜绿微囊藻中加入1x104cellsmL-1的经饥饿处理的四膜虫进行吞噬培养，饥饿处理提前1-2D进行。
控制实验培养体系为70ml，置于温度23-25℃，光照28-30μmol m-2s-1，光暗比16h：8h的条件下进行吞噬实验。
同时细胞密度为1.1×107cells mL-1铜绿微囊藻(未加入四膜虫)作为对照。
吞噬情况观察：每隔4～24h定期取样镜检并进行计数，监测铜绿微囊藻及四膜虫细胞密度的变化，同时观察其生长状态以及四膜虫的吞噬铜绿微囊藻情况。
四膜虫及藻细胞计数：以开始培养的时间为初始时间点，每隔4～24h定期进行取样、观察、计数，每个样本重复计数3次以上，计数前加入1％的卢戈氏液进行固定，实时监测四膜虫生长趋势及微囊藻的消耗情况。
实施例2
一种基于四膜虫的生物治理蓝藻水华方法：
向细胞密度为1.1×107cells mL-1的铜绿微囊藻中加入2x104cells mL-1的经饥饿处理的四膜虫进行吞噬培养，其他操作同实施例1保持一致。
实施例3
一种基于四膜虫的生物治理蓝藻水华方法：
向细胞密度为1.1×107cells mL-1的铜绿微囊藻中加入5x104cells mL-1的经饥饿处理的四膜虫进行吞噬培养，其他操作同实施例1保持一致。
检测：
对实施例1-3中四膜虫吞噬实验过程中相关生长指标的计算，其中包括四膜虫的特定生长速率(Specific growth rate,h-1)、对微囊藻的抑制率(Inhibition rate，％)、摄食率(Ingestion rate,cells predator-1h-1)。
特定生长速率(Specific growth rate,h-l)＝ln(Mtt/Mt0)/Δt，其中Mtt和Mt0分别表示实验结束时铜绿微囊藻的密度、实验开始时铜绿微囊藻的密度；t表示实验持续时间。
抑制率(Inhibition rate，％)＝(1-Mt/Mc)×100％，其中Mt表示实验结束时处理组铜绿微囊藻的密度，Mc表示实验结束时对照组铜绿微囊藻的密度；t表示实验持续时间。
摄食率(Ingestion rate,cells predator-1h-1)＝(Mt0-Mtt)/Δt/Mm，其中Mt0和Mtt分别表示实验开始时铜绿微囊藻的密度、实验结束时铜绿微囊藻的密度；t表示实验持续时间；Mm表示这一时间段内四膜虫平均密度。
图1A、图1B为实施例1-3及实施例1中设置的对照四膜虫(Tetrahymena mobilis)进行吞噬实验前后培养液颜色变化情况，从图1B中，可以清楚的确定实施例1-3中的铜绿微囊藻已经被四膜虫吞噬，培养液由绿色变为澄清。
图2A、图2B为四膜虫及吞噬铜绿微囊藻的四膜虫显微镜图，图2A可以充分的观察到四膜虫的形态，外观呈椭圆长梨状，体长约35μm，宽约20μm，身体前端具有口器，全身布满数百根长约4-6μm长的纤毛。图2B为100x倍镜下的四膜虫吞噬铜绿微囊藻，可以清楚地观察到四膜虫体内存在大量绿色藻体，绿色藻体为微囊藻，表明四膜虫对铜绿微囊藻具有吞噬能力，且四膜虫吞噬铜绿微囊藻能力非常强。
图3为实施例1-3中四膜虫(Tetrahymena mobilis)的生长曲线，实施例1、2、3中的四膜虫均在48h达到数量最高值，可见在不同的起始密度下四膜虫的种群数量增长均处于较高水平，48h后增长为初始密度的1.4-2.5倍以上
图4为实施例1-3中四膜虫的特定生长率(Specific growth rate，h-l)。其中实施例3中四膜虫的特定生长率最高，约0.065h-1，实施例1中的最低，约为0.055h-1，可见四膜虫在短时间内大量繁殖，环境耐受性强，种群数量增长快。
图5为实施例1-3中四膜虫的摄食率(Ingestion rate，cells predator-1h-1)，其中实施例1中的四膜虫的摄食率最高，约为9.8cells predator-1h-1，高于许多研究记录的一些原生动物的最大摄食率，处于较高水平。实施例3的摄食率最低，约为4.0cellspredator-1h-1，因后期微囊藻的数量逐渐变少，不足够四膜虫吞噬，可见后期其具有巨大的持续摄食的潜力，侧面验证了本发明中四膜虫处于较高的摄食水平，利于除藻。
图6为实施例1-3中四膜虫对铜绿微囊藻的抑制率(Inhibition rate，％)。可知，培养48h后，对铜绿微囊藻的抑制率达到最高值，可达92％-96％。由此可见在较短时间内其可以实现对微囊藻较为彻底地清除，除藻效率高，可以高效应用于早期治理蓝藻水华。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于四膜虫的生物防治蓝藻水华方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离纯化得到四膜虫，并进行18S rDNA鉴定；
(2)培养四膜虫；
(3)四膜虫饥饿处理：将培养完的四膜虫加入用于饥饿处理的液体中，饥饿处理24h以上；
(4)吞噬培养：向蓝藻中加入经过饥饿处理的四膜虫，四膜虫吞噬蓝藻达到有效减少其生物量的目的；
所述四膜虫为四膜虫种Tetrahymena sp.，经18S rDNA鉴定为Tetrahymena mobilis，从污染的铜绿微囊藻培养物中分离纯化所得，外观呈椭圆长梨状，体长约50μm，身体前端具有口器，全身布满数百根长约4-6μm长的纤毛；
所述培养四膜虫的培养条件为：Neff培养基，温度24-28℃；光照25-35μmol m-2s-1；光暗比16h：8h；培养2-4D；
所述Neff培养基的配制方法为：牛肉膏蛋白胨(BPM)5-8g、三氯化铁储备液1mL，经1L蒸馏水溶解后在121℃、30min下进行高压灭菌，4℃保存。
2.根据权利要求1所述的基于四膜虫的生物防治蓝藻水华方法，其特征在于，用于饥饿处理的液体包括无菌水、藻类BG11培养基中的一种。
3.根据权利要求1所述的基于四膜虫的生物防治蓝藻水华方法，其特征在于，所述饥饿处理的培养条件与四膜虫的培养条件一致。
4.根据权利要求1所述的基于四膜虫的生物防治蓝藻水华方法，其特征在于，所述蓝藻为铜绿微囊藻。
5.根据权利要求1所述的基于四膜虫的生物防治蓝藻水华方法，其特征在于，所述吞噬培养中，细胞密度为1.1×107cells mL-1的蓝藻中加入的四膜虫密度保证为1x104 cellsmL-1及以上。
6.根据权利要求1所述的基于四膜虫的生物防治蓝藻水华方法，其特征在于，所示吞噬培养的培养条件为：向蓝藻中加入经饥饿处理的四膜虫，并将其置于温度20-25℃；光照25-30μmol m-2s-1；光暗比16h：8h的条件下进行吞噬培养。
7.根据权利要求6所述的基于四膜虫的生物防治蓝藻水华方法，其特征在于，所示吞噬培养的培养条件为：向蓝藻中加入经饥饿处理的四膜虫，并将其置于温度23-25℃；光照28-30μmol m-2s-1。
8.根据权利要求1所述的基于四膜虫的生物防治蓝藻水华方法，其特征在于，所述吞噬培养过程中每天对培养容器摇匀4-5次，使四膜虫与蓝藻混合均匀，充分接触。
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