CN115530153A - 玻璃化冷冻载体及冷冻保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种玻璃化冷冻载体及冷冻保存方法，该玻璃化冷冻载体包括载杆、载片及密封片，载片设于载杆的一端，载片上具有凹槽；密封片用于与载片贴合，以密封凹槽。该玻璃化冷冻载体，其载片的凹槽用于放置卵母细胞或胚胎样本，可避免载片晃动出现掉卵或掉胚现象，且在去除样本多余的液体时，凹槽内的卵母细胞或胚胎样本不会发生移位，使得操作过程更简便稳定，转移卵母细胞或胚胎样本的效率更高。而在样本转移至凹槽内后且在转移至液氮中之前，采用密封片与载片贴合以密封凹槽，进而使得样本中的卵母细胞和/或胚胎在玻璃化冻存过程中不直接与液氮接触，避免潜在污染物通过液氮造成其他样本的交叉污染的问题，提高了玻璃化冷冻的可靠性。

Description

玻璃化冷冻载体及冷冻保存方法

技术领域

本发明涉及医疗器械技术领域，特别是涉及一种玻璃化冷冻载体及冷冻保存方法。

背景技术

近年来，随着环境污染、生育年龄推迟、生活压力等原因，不孕不育成为了现代社会育龄夫妇的常见疾病。人类辅助生殖技术作为生殖医学最具代表性的技术，经过多年的发展，已成为治疗不孕不育症的一种有效的，甚至近乎无可替代的临床手段。卵母细胞或胚胎的低温保存是保留女性生殖力的一种方法，也是辅助生殖技术的重要环节。

目前，玻璃化是临床上冷冻保存卵母细胞或胚胎的首选方法，一方面是因为玻璃化是利用高浓度的玻璃化冷冻液，在极快的降温速率下使样本从液体状态下直接转变为玻璃态的过程，该过程最大限度地降低了对细胞的冰晶损伤；另一方面相较于程序化冷冻，玻璃化冷冻效率高，成本低。传统的玻璃化冷冻载体的设计过于简单，存在操作不便、多个样本在液氮中保存的交叉污染等问题。

发明内容

基于此，有必要提供一种操作简便且能够避免交叉污染问题的玻璃化冷冻载体及冷冻保存方法。

一种玻璃化冷冻载体，包括：

载杆；

载片，设于所述载杆的一端，所述载片上具有凹槽；及

密封片，用于与所述载片贴合，以密封所述凹槽。

在其中的一些实施例中，所述载片包括片材本体区和凹槽区，所述凹槽设于所述凹槽区；

所述载片在所述凹槽区的厚度小于在所述片材本体区的厚度。

在其中的一些实施例中，所述载片在所述凹槽区的厚度为50μm～200μm；所述载片在所述片材本体区的厚度为200μm～500μm。

在其中的一些实施例中，所述凹槽的槽口径向尺寸为100μm～200μm；和/或

所述凹槽的深度为150μm～200μm。

在其中的一些实施例中，所述凹槽为圆柱形或棱柱形；和/或

所述凹槽的底壁为平面或凹弧面。

在其中的一些实施例中，所述载片上的所述凹槽为多个，所述密封片用于密封所述载片上的各所述凹槽。

在其中的一些实施例中，所述密封片为透明密封片；和/或

所述密封片的厚度为50μm～100μm。

在其中的一些实施例中，所述载杆包括握持段和与所述握持段连接的标记段，所述载杆以所述握持段所在一端与所述载片连接，所述标记段用于标记样本信息。

在其中的一些实施例中，所述标记段上设有用于储存样本信息的信息标识电子标签。

在其中的一些实施例中，所述信息标识电子标签包括条形码、二维码和电子芯片标签中的至少一种。

在其中的一些实施例中，所述载杆的所述握持段的长度可调节。

在其中的一些实施例中，所述载杆的所述握持段设置有防滑纹理。

在其中的一些实施例中，所述载片的材质为聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚醚砜树脂、苯乙烯系热塑性弹性体、苯乙烯及聚对苯二甲酸乙二醇-1,4-环己烷二甲醇酯中的至少一种。

一种玻璃化冷冻保存方法，采用上述任一项所述的玻璃化冷冻载体，包括如下步骤：

将经过玻璃化冷冻液处理后的样本转移至所述载片的所述凹槽中，吸除所述凹槽内多余的液体；

将所述密封片放置于已配置样本的载片上，并使所述密封片与所述载片贴合，以密封所述凹槽；

握持于所述载杆，将已配置样本的所述玻璃化冷冻载体转移至液氮中保存。

在其中的一些实施例中，所述玻璃化冷冻液包括第一冷冻液和第二冷冻液；

所述第一冷冻液包括基础液和渗透性保护剂，所述第二冷冻液包括基础液、渗透性保护剂及非渗透性保护剂；

其中，所述渗透性保护剂包括乙二醇和二甲基亚砜，所述非渗透性保护剂包括蔗糖；所述基础液包括TCM199、10mM～20mM的HEPES及0.1％～0.5％(w/w)人血清白蛋白，或，DMEM、10mM～20mM的HEPES及0.1％～0.5％(w/w)人血清白蛋白。

在其中的一些实施例中，所述第一冷冻液包括5％～8％(v/v)乙二醇、5％～8％(v/v)二甲基亚砜及84％～90％(v/v)基础液；

所述第二冷冻液包括12％～20％(v/v)乙二醇、12％～20％(v/v)二甲基亚砜、0.5M～1.5M蔗糖及60％～76％(v/v)基础液。

在其中的一些实施例中，采用所述第一冷冻液和所述第二冷冻液依次对所述样本进行处理，所述样本在所述第一冷冻液和所述第二冷冻液中的平衡时间分别为3min～5min和30s～60s。

本发明提供的玻璃化冷冻载体，其载片上具有凹槽，用于放置卵母细胞或胚胎样本，可避免载片晃动出现掉卵或掉胚现象，同时在去除样本多余的液体时，凹槽内的卵母细胞或胚胎样本不会发生移位，使得操作过程更简便稳定，转移卵母细胞或胚胎样本的效率更高。同时，在样本转移至凹槽内后且在转移至液氮中之前，采用密封片与载片贴合以密封凹槽内的样本，进而使得样本中的卵母细胞和/或胚胎在玻璃化冻存过程中不直接与液氮接触，避免潜在污染物通过液氮造成其他样本的交叉污染的问题，故而有效解决了交叉污染问题，提高了玻璃化冷冻的可靠性。

附图说明

图1为本发明一实施方式的玻璃化冷冻载体的结构示意图；

图2为图1所示的玻璃化冷冻载体的载片的结构示意图；

图3为图1所示的玻璃化冷冻载体的载片和密封片的结构示意图；

图4为图2所示的载片的截面结构示意图；

图5为本发明另一实施方式的载片的截面结构示意图；

图6为本发明一实施方式的载杆的结构示意图；

图7为图1所示的玻璃化冷冻载体的载杆的结构示意图；

图8为本发明又一实施方式的载杆的结构示意图；

图9为对照产品的结构示意图；

图10为本发明的冷冻载体和对照产品在使用过程中的降温速率结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“厚度”、“上”、“下”、“顶”、“底”、“内”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

请参阅图1，本发明一实施方式提供了一种玻璃化冷冻载体10，包括载片100、载杆200及密封片300(如图3所示)。

载片100设于载杆200的一端。请参阅图2，载片100上具有凹槽101。

请参阅图3，密封片300用于与载片100贴合，以密封凹槽101。

传统的玻璃化冷冻载体10的载片100通常是平薄片或小弧度的薄片，卵母细胞或胚胎等样本的转移操作非常难，极易出现掉卵或掉胚现象。传统的技术是直接将经过玻璃化冷冻液处理过的卵母细胞或胚胎等样本加载于载片100上，吸除样本多余的液体，然后快速插入液氮中保存。这种方法由于在保存过程中样本与液氮直接接触，故而在玻璃化冻存过程中存在多个样本的交叉污染的风险。

基于此，本发明提供的玻璃化冷冻载体10，其载片100上具有凹槽101，用于放置卵母细胞或胚胎样本，可避免载片100晃动出现掉卵或掉胚现象，同时在去除样本多余的液体时，凹槽101内的卵母细胞或胚胎样本不会发生移位，使得操作过程更简便稳定，转移卵母细胞或胚胎样本的效率更高。同时，在样本转移至凹槽101内后且在转移至液氮中之前，采用密封片300与载片100贴合以密封凹槽101内的样本，进而使得样本中的卵母细胞和/或胚胎在玻璃化冻存过程中不直接与液氮接触，避免潜在污染物通过液氮造成其他样本的交叉污染的问题，故而有效解决了交叉污染问题，提高了玻璃化冷冻的可靠性。

请继续参阅图2，在其中的一些实施例中，载片100包括片材本体区110和凹槽区120，凹槽101设于该凹槽区120。请参阅图4和图5，载片100在凹槽区120的厚度小于载片100在片材本体区110的厚度，即载片100凹槽101处的内底面(即凹槽101底壁)及与之相背的另一个表面(即外底面)之间的厚度小于载片100在片材本体区110的厚度。如此通过载片100的较厚的片材本体区110提供足够的承载力，而减小凹槽区120的厚度，以凹槽101局部较薄的结构尽可能地大幅度提高降温速率，使密封的凹槽101内的样本达到更优的低温保存效果，同时又不影响整个载片100的承载能力。

可理解，载杆200用于握持操作和样本信息的标记；载片100用于承载卵母细胞和/或胚胎等样本。载杆200和载片100之间可以是一体结构，也可以是可拆卸式结构。考虑到简化生产工艺和降低制造成本，优选可拆卸式结构，例如卡扣或螺纹连接，以防止载杆200和载片100在操作或储存过程中出现脱落、滑动等现象。

进一步地，密封片300与载片100之间可通过热压或粘接等方式进行贴合。

在其中的一些实施例中，载片100在凹槽区120的厚度为50μm～200μm；载片100在片材本体区110的厚度为200μm～500μm。

进一步地，载片100在凹槽区120的厚度为80μm～100μm。进一步地，载片100在片材本体区110的厚度为250μm～400μm。

考虑载片100所需的承载力、生物相容性和较高的降温速率，载片100的材质优选为食品级或医用级高抗冲高分子材料。进一步地，载片100的材质优选为透明材质。

进一步地，载片100的材质为PP(聚丙烯)、PS(聚苯乙烯)、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PES(聚醚砜树脂)、SBS(苯乙烯系热塑性弹性体)、SBC(苯乙烯)及PCTG(聚对苯二甲酸乙二醇-1,4-环己烷二甲醇酯)等中的至少一种。

进一步地，载片100在片材本体区110和凹槽区120的材质可以相同或不同。

在其中的一些实施例中，凹槽101的槽口径向尺寸为100μm～200μm。在其中的一些实施例中，凹槽101为圆柱形或棱柱形，凹槽101的侧壁形状为圆柱形侧面或棱柱形侧面，但不限于此。例如凹槽101为圆柱形槽口径向尺寸则是槽口的圆直径。在其中的一些实施例中，凹槽101的底壁为平面(如图4所示)或凹弧面(如图5所示)。

进一步地，凹槽101的外底面与片材本体区110的表面平齐，这样可在保证承载力的前提下尽量能减小凹槽101的底壁厚度。特别地，载片100凹槽101处的内底面及与之相背的另一个表面(即外底面)，均为平面，从而便于加工生产加工，即本申请的载片，可直接在平板状的PP(聚丙烯)、PS(聚苯乙烯)、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PES(聚醚砜树脂)、SBS(苯乙烯系热塑性弹性体)、SBC(苯乙烯)及PCTG(聚对苯二甲酸乙二醇-1,4-环己烷二甲醇酯)上开出所述凹槽101实现。

在其中的一些实施例中，凹槽101的深度为150μm～200μm，在这些实施例中，凹槽101的深度可以大于片材本体区110的厚度，如通过拉深载片100或者在熔融状态下向下压载片100的凹槽区形成各凹槽101。通过对凹槽101的径向尺寸和/或深度优选，可进一步提高操作过程的稳定性。

在其中的一些实施例中，载片100上的凹槽101为多个，密封片300用于同时密封载片100上的各凹槽101。通过一个密封片300实现对各凹槽101的密封，简单便捷。

进一步地，多个凹槽101在载片100上呈阵列分布。具体地，多个凹槽101在相互垂直的两个方向上呈多行多列分布。

在其中的一些实施例中，密封片300为透明密封片300。透明密封片300便于观察。

在其中的一些实施例中，密封片300的厚度为50μm～100μm。

在其中的一些实施例中，密封片300的材质可与载片100的材质相同。

请继续参阅图1，在其中的一些实施例中，载杆200包括握持段210和与握持段210连接的标记段220，载杆200以握持段210所在一端与载片100连接，标记段220用于标记样本信息。

握持段210和标记段220之间可以是一体结构，也可以是可拆卸式结构，例如卡扣或螺纹连接，也可以采用其他方式连接。

可理解，样本信息包括患者信息等。目前卵母细胞或胚胎冻存时，将样本信息通过贴纸的方式粘附在载杆200的标记段220或用记号笔手写在标记段220，这种方式操作简单，但在冷冻过程中容易出现信息遗漏或错误，比如标签脱落、人为摩擦导致信息模糊，不利于样本信息的可追溯性；同时，在液氮中或液氮气化环境中，无法看清具体的样本信息，需要逐一取出样本确认，增加了样本的复融风险，无法做到样本库中的批量化存储和管理。

故而，优选在标记段220上设有用于储存样本信息的信息标识电子标签，可以做到无接触获取信息标识电子标签中的样本信息。进一步地，信息标识电子标签包括条形码、二维码和电子芯片标签中的至少一种。

进一步地，优选信息标识电子标签采用电子芯片标签，更优选为射频识别(RFID)电子芯片标签，能够通过射频技术读取或写入样本信息，且电子芯片标签可内嵌或安装在载杆200上，故而可以在液氮下长期储存，进出液氮环境时不会受到热胀冷缩的影响而损坏；此外其在液氮中或液氮气化环境中，仍可精准式获取样本信息，不影响其他样本的质量。

传统的载杆200的握持段210多为光面，操作时容易滑动，难控制。请参阅图6，故而在本发明的一些实施例中，优选在载杆200的握持段210设置有防滑纹理211。进一步地，防滑纹理211的长度至少占整个握持段210的2/3。

传统的载杆200的长度固定，使用不便。在玻璃化冷冻载体10的使用过程中，需要适配不同场合使用的便捷性和安全性，比如在显微镜下加载样本时要求载杆200的握持段210长度适中，便于手柄的稳定控制和样本的准确加载；在插入液氮进行玻璃化冷冻时要求载杆200的握持段210长度伸长，以防操作不慎冻伤手部；在细胞库中储存和管理时要求载杆200的握持段210长度缩短，以节省液氮罐中的存储空间。因此，在本发明的一些实施例中，优选载杆200的握持段210设置为长度可调节的结构。

在一些具体示例中，载杆200的握持段210为套筒伸缩杆(如图7所示)或波纹伸缩杆(如图8所示)。

请参阅图7，进一步地，套筒伸缩杆包括多个套杆212，多个套杆212依次套设且相连的两个套杆212在一端连接。位于端部的两个套杆212分别与载片100和标记段220连接。

请参阅图8，进一步地，波纹伸缩杆包括波纹伸缩部213及设于波纹伸缩部213的两端的固定部214，两个固定部214分别与载片100和标记段220连接。

本发明一实施方式提供了一种玻璃化冷冻保存方法，采用上述任一项的玻璃化冷冻载体，包括如下步骤S10～S30：

S10：将经过玻璃化冷冻液处理后的样本转移至载片的凹槽中，吸除凹槽内多余的液体；

S20：将密封片放置于已配置样本的载片上，并使密封片与载片贴合，以密封凹槽；

S30：握持载杆，将已配置样本的玻璃化冷冻载体转移至液氮中保存。

该玻璃化冷冻保存方法，采用上述任一项的玻璃化冷冻载体，操作过程更简便稳定，转移卵母细胞或胚胎样本的效率更高，有效解决了多个样本在液氮中保存的交叉污染问题，提高了玻璃化冷冻的可靠性。

在其中的一些实施例中，在转移样本至凹槽中的步骤之前，还包括如下步骤：将样本信息预先设置到信息标识电子标签中。

在其中的一些实施例中，在握持于载杆将已配置样本的玻璃化冷冻载体转移至液氮中保存的步骤之前，还包括如下步骤：调节载杆的握持段的长度。

为了减小细胞在玻璃化冷冻液中的渗透损伤和毒性损伤，目前多采用分步法加载玻璃化冷冻液，但转移步数并非越多越好，因为多次的转移容易导致卵母细胞和/或胚胎的丢失。目前市面上基本采用三步法加载，这样的操作一方面操作复杂，增加了细胞丢失的风险，另一方面细胞在溶液中超长的平衡时间，不利于临床上卵母细胞或胚胎等样本的批量化处理。同时玻璃化冷冻液的配方过于简单，不能很好地减轻细胞的冷冻损伤，达到很好的低温保存效果。

在本发明的一些实施例中，玻璃化冷冻液包括第一冷冻液和第二冷冻液；第一冷冻液包括基础液和渗透性保护剂，第二冷冻液包括基础液、渗透性保护剂及非渗透性保护剂。

进一步地，第一冷冻液和第二冷冻液中的渗透性保护剂包括乙二醇和二甲基亚砜；非渗透性保护剂包括蔗糖。第一冷冻液和第二冷冻液中的基础液包括TCM199、10mM～20mM的HEPES及0.1％～0.5％(w/w)人血清白蛋白，或，DMEM、10mM～20mM的HEPES及0.1％～0.5％(w/w)人血清白蛋白。

进一步地，第一冷冻液包括5％～8％(v/v)乙二醇(EG)、5％～8％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)及84％～90％(v/v)基础液。

进一步地，第二冷冻液包括12％～20％(v/v)乙二醇(EG)、12％～20％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)、0.5M～1.5M蔗糖及60％～76％(v/v)基础液。

进一步地，采用第一冷冻液和第二冷冻液依次对样本进行处理，样本在第一冷冻液和第二冷冻液中的平衡时间分别为3min～5min和30s～60s。

本发明通过优化玻璃化冷冻液的组成，并通过第一冷冻液和第二冷冻液的联用，在缩短平衡时间的同时能够最大限度地减少胞内水分，从而提高玻璃化保存的效果。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加简洁明了，本发明用以下具体实施例进行说明，但本发明绝非仅限于这些实施例。以下所描述的实施例仅为本发明较好的实施例，可用于描述本发明，不能理解为对本发明的范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下文将本发明的冷冻载体与对照产品进行降温速率性能测试和玻璃化冻存效果测试。

(一)降温速率性能测试

按照文献《冷冻载体Cryotop降温速率的测量及系统优化》(2013年)中提到的方法，对本发明图1中的冷冻载体和对照产品，即某进口产品(型号规格为

其结构如图9所示)在使用过程中的降温速率进行测量，结果如图10所示。从图10中可以看出，本发明中冷冻载体的降温速率明显高于对照产品，说明与胚胎接触部分(凹槽)处的载片100厚度减小可以显著提高降温速率，更有利于胚胎的玻璃化保存。

(二)玻璃化冻存效果测试

实施例1

采用图1所示的玻璃化冷冻载体和如下的第一冷冻液和第二冷冻液进行小鼠细胞胚胎的玻璃化冷冻保存。

第一冷冻液包括7.5％(v/v)乙二醇(EG)、7.5％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)及85％(v/v)基础液。

第二冷冻液包括15％(v/v)乙二醇(EG)、15％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)、1.0M蔗糖及70％(v/v)基础液。

其中，基础液包括TCM199培养基或DMEM培养基、10mM～20mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)及0.1％～0.5％(w/w)人血清白蛋白(HSA)。

取小鼠1-细胞胚胎和2-细胞胚胎(2-细胞胚胎为1-细胞胚胎生长过程中的后一时期的细胞胚胎，这两个时期是冷冻过程中细胞相对容易受伤的阶段)，小鼠细胞胚胎的玻璃化冷冻保存的具体操作方法如下：

(1)将小鼠胚胎的样本信息嵌入到标记段220的射频识别(RFID)电子芯片标签；

(2)将标记段220、握持段210和载片100三部分连接成载杆载片整体，调节握持段210(套筒伸缩杆)的长度适中，放入液氮预冷备用；

(3)取小鼠1-细胞胚胎和2-细胞胚胎清洗后转移至第一冷冻液中，平衡3-5min；然后转移至第二冷冻液中，平衡30-60s；

(4)将未安装密封片300的玻璃化载体(载杆载片整体)放置在显微镜下，并将平衡后的1-细胞胚胎转移放置在载片100上的凹槽101中，每个凹槽101至少保证有且只有一个细胞，吸取多余的液体，但不吸干；

(5)将密封片300放置在已配置细胞的载片100上，通过热压的方式将凹槽101密封；

(6)调节握持段210的长度，并手握握持段210，将装有1-细胞胚胎的玻璃化冷冻载体10迅速插入液氮中；

(7)调节握持段210的长度，将已经玻璃化冷冻的玻璃化冷冻载体10固定在专用架上，于液氮中长期储存。

空白对照组

空白组是指胚胎不做任何处理，即不经过玻璃化冷冻液/解冻液处理、及液氮冻存。

对比例1

对比例1与实施例1的玻璃化冷冻方法基本相同，区别仅在于：将实施例1中的玻璃化冷冻载体替换成了某进口产品，型号规格为

具体结构见下图，胚胎冷冻面为平板型，对操作者要求较高，容易出现细胞滑落或液体遗留量大等问题，效率低。

进一步地，按照实施例1和对比例1的方法对胚胎玻璃化冷冻保存一周，然后对冻存的胚胎进行解冻、保护剂洗脱、再培养，观察其最终的囊胚率。具体结果见表1所示。从表中可以看出，实施例1中1-细胞囊胚率和2-细胞囊胚率要显著高于对比例1，说明本申请中的冷冻载体和冷冻液套装对胚胎的玻璃化冻存效果优势明显。

表1

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (17)

1.一种玻璃化冷冻载体，其特征在于，包括：

载杆；

载片，设于所述载杆的一端，所述载片上具有凹槽；及

密封片，用于与所述载片贴合，以密封所述凹槽。

2.如权利要求1所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述载片包括片材本体区和凹槽区，所述凹槽设于所述凹槽区；

所述载片在所述凹槽区的厚度小于在所述片材本体区的厚度。

3.如权利要求2所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述载片在所述凹槽区的厚度为50μm～200μm；所述载片在所述片材本体区的厚度为200μm～500μm。

4.如权利要求1所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述凹槽的槽口径向尺寸为100μm～200μm；和/或

所述凹槽的深度为150μm～200μm。

5.如权利要求1所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述凹槽为圆柱形或棱柱形；和/或

所述凹槽的底壁为平面或凹弧面。

6.如权利要求1所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述载片上的所述凹槽为多个，所述密封片用于密封所述载片上的各所述凹槽。

7.如权利要求1所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述密封片为透明密封片；和/或

所述密封片的厚度为50μm～100μm。

8.如权利要求1至7任一项所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述载杆包括握持段和与所述握持段连接的标记段，所述载杆以所述握持段所在一端与所述载片连接，所述标记段用于标记样本信息。

9.如权利要求8所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述标记段上设有用于储存样本信息的信息标识电子标签。

10.如权利要求9所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述信息标识电子标签包括条形码、二维码和电子芯片标签中的至少一种。

11.如权利要求8所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述载杆的所述握持段的长度可调节。

12.如权利要求8所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述载杆的所述握持段设置有防滑纹理。

13.如权利要求1至7任一项所述的玻璃化冷冻载体，其特征在于，所述载片的材质为聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚醚砜树脂、苯乙烯系热塑性弹性体、苯乙烯及聚对苯二甲酸乙二醇-1,4-环己烷二甲醇酯中的至少一种。

14.一种玻璃化冷冻保存方法，其特征在于，采用如权利要求1至13任一项所述的玻璃化冷冻载体，包括如下步骤：

将经过玻璃化冷冻液处理后的样本转移至所述载片的所述凹槽中，吸除所述凹槽内多余的液体；

将所述密封片放置于已配置样本的载片上，并使所述密封片与所述载片贴合，以密封所述凹槽；

握持于所述载杆，将已配置样本的所述玻璃化冷冻载体转移至液氮中保存。

15.如权利要求14所述的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于，所述玻璃化冷冻液包括第一冷冻液和第二冷冻液；

所述第一冷冻液包括基础液和渗透性保护剂，所述第二冷冻液包括基础液、渗透性保护剂及非渗透性保护剂；

其中，所述渗透性保护剂包括乙二醇和二甲基亚砜，所述非渗透性保护剂包括蔗糖；

所述基础液包括TCM199、10mM～20mM的HEPES及0.1％～0.5％(w/w)人血清白蛋白，或，DMEM、10mM～20mM的HEPES及0.1％～0.5％(w/w)人血清白蛋白。

16.如权利要求15所述的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于，所述第一冷冻液包括5％～8％(v/v)乙二醇、5％～8％(v/v)二甲基亚砜及84％～90％(v/v)基础液；

所述第二冷冻液包括12％～20％(v/v)乙二醇、12％～20％(v/v)二甲基亚砜、0.5M～1.5M蔗糖及60％～76％(v/v)基础液。

17.如权利要求15或16所述的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于，采用所述第一冷冻液和所述第二冷冻液依次对所述样本进行处理，所述样本在所述第一冷冻液和所述第二冷冻液中的平衡时间分别为3min～5min和30s～60s。

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