CN115475196B - 腹安颗粒浸膏在制备用于治疗手足口病的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了腹安颗粒浸膏在制备用于治疗手足口病的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体而言，涉及腹安颗粒浸膏在制备用于治疗手足口病的药物中的用途。
背景技术
手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒较多，其中肠道病毒71型(EV71)最为常见。手足口病多发生于5岁以下儿童，表现为口痛，厌食，低热，手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿一周左右可自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症，个别重症患儿病情发展快，导致死亡。目前手足口病缺乏有效的治疗药物，临床上主要采取对症治疗。
腹安颗粒是厦门中药厂有限公司的独家品种，具有清热解毒，燥湿止痢的功效，主要成分为仙鹤草、火炭母、铁苋菜、鬼针草和土荆芥，临床上主要用于痢疾、急性胃肠炎、腹泻、腹痛等。
目前临床上尚无腹安颗粒用于手足口病治疗的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种腹安颗粒浸膏的新用途，为手足口病提供一种新的治疗药物。
因此，一方面，本发明提供了腹安颗粒浸膏在制备用于治疗手足口病的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了腹安颗粒浸膏在制备抗肠道病毒71型的药物中的用途。
本发明中，腹安颗粒浸膏是指按照腹安颗粒的中药处方，通过将用于制备腹安颗粒的中药材原料煎煮后得到的提取液经浓缩后得到的浸膏。所述腹安颗粒浸膏可以由厦门中药厂有限公司得到。
本发明中，用于制备腹安颗粒的主要中药材原料成分为仙鹤草、火炭母、铁苋菜、鬼针草和土荆芥，具有清热解毒，燥湿止痢的功效，临床上主要用于痢疾、急性胃肠炎、腹泻、腹痛等。
本发明的药物可以为本领域常规的各种剂型，例如固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液、混悬液、锭剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂和散剂等。所述药物的给药途径可以为注射给药或口服给药。所述注射给药可以包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。
基于质量百分比，所述药物可以包括0.01～99.99％腹安颗粒浸膏，以及99.99～0.01％的药学上可接受的辅料。
所述药学上可接受的辅料例如可以选自赋形剂、填充剂、稀释剂、表面活性剂、粘合剂、抗氧剂、防腐剂、矫味剂、甜味剂、风味剂、香精、吸附剂、润滑剂、包衣剂、缓释剂、促进剂、推进剂、着色剂、颜料、染料等。
本发明中，优选地，所述药物是厦门中药厂有限公司生产的腹安颗粒，国药准字Z35020068。
本发明通过体外细胞实验，发现腹安颗粒浸膏具有显著的抗手足口病毒的作用。
在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本申请文件中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化。
附图说明
图1A和图1B分别为显示正常RD细胞对照和EV71感染24h RD细胞病变(40X)的照片。
图2A为显示利巴韦林对RD细胞的最大无毒浓度的图。
图2B为显示腹安颗粒浸膏对RD细胞的最大无毒浓度的图。
图3为显示药物作用不同时间后EV71感染RD细胞培养上清液中病毒滴度分析的图。其中，**表示与病毒对照组比较p＜0.01；***表示与病毒对照组比较p＜0.001。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1实验材料
1.1药物
(1)腹安颗粒浸膏，由厦门中药厂有限公司提供，批号190701-B，滤过，除菌分装，4℃备用。
(2)利巴韦林颗粒，白色颗粒，由四川百利药业有限责任公司生产，批准文号：国药准字H51023508，50mg/袋，作为本次试验阳性对照药物。
1.2细胞株
RD(横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RD))细胞株购自中国武汉研究所。传代后，由湖南中医药大学医学院生物医学研究室保存细胞株。
1.3病毒株
人新肠道病毒71型(enterovirus 71EV71)ATCC VR784株，购自武汉大学病毒学国家重点实验室。传代后，由本研究室保存。
1.4主要设备与试剂
生物安全柜BHC-1300ⅡA/B3，AIRTECH
CO2培养箱MCO-18AIC，SANYO
倒置显微镜CKX41，OLYMPUS
培养基DMEM，HyClone
胎牛血清 HyClone
胰蛋白酶 Gibco
DMSO Sigma
Cell Counting Kit(CCk8)100T货号40203ES60购于翌圣生物科技(上海)有限公司进口分装。
2实验方法
2.1细胞传代：
对RD进行常规培养，待细胞融合80％～90％时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入PBS，清洗细胞表面，重复三次，去除漂浮的死细胞与残留血清，加1ml 0.025％胰酶消化液，倒置显微镜下观察，待细胞变圆，胞质回缩，细胞之间不再连接成片，加入2ml含10％FBS的完全DMEM培养基终止消化；巴氏吸管轻轻吹打细胞，将细胞悬液吸入离心管，1000r/min离心5min弃去上清，加入6ml含10％FBS的DMEM完全培养基，轻轻混匀，将细胞悬液平均分配在3个培养瓶中，每瓶补足5ml培养基，置37℃，5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
2.2病毒的扩增：
倒置显微镜下观察到RD细胞生长融合80％-90％时，弃去培养液，PBS清洗两遍，除去死细胞和残留血清；将2ml病毒原液加入75cm2细胞培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使病毒液完全覆盖RD细胞表面，37℃病毒吸附1.5h后，弃去病毒液加入15ml含2％FBS的DMEM维持培养液；每天观察细胞病变效应CPE(细胞聚集成团，肿大变圆、脱落乃至细胞裂解等)，待瓶中70％以上细胞出现病变时，将瓶壁未脱落的细胞吹打下来，收集病毒液到50ml离心管中，-80℃冰箱冻存，反复冻融3次，使细胞充分裂解，释放病毒颗粒，4000r/min离心15min，收集病毒上清液，分装冻存管-80℃保存。
2.3TCID50方法测定病毒滴度：
用DMEM培养液将病毒进行10倍递减稀释为每毫升10-1，10-2，10-3……10-10不同稀释度，按序接种长满单层RD细胞的96孔板，每孔100μL，每个稀释度8孔，同时设正常细胞对照组。置37℃，5％CO2细胞孵箱中孵育1h，吸弃病毒液，随即每孔加细胞生长维持液100μL，继续培养。逐日倒置显微镜下观察细胞病变结果，第6-7天判定结果并做好记录。
按Reed-Muench法计算TCID50，判定公式为：
距离比例＝(高于50％病变的百分数-50％)/(高于50％病变的百分数-低于50％病变的百分数)
TCID50的对数＝高于50％病变的病毒最高稀释度对数+距离比例×稀释系数的对数
2.4实验药物的细胞毒作用：
96孔中培养细胞加入100μL配好的系列浓度梯度药物，每个稀释度设4个复孔，同时设置正常细胞对照(加100μL含2％胎牛血清DMEM)和空白对照(不加细胞)，置37℃，5％CO2条件培养48小时，加入CCK8溶液10μL/孔孵育4小时，取出96孔板于酶标仪450nm处检测吸光度(OD值)。计算：药物各稀释度浓度的细胞存活率，找出药物最大无毒浓度。以细胞存活率为50％的药物浓度作为50％细胞毒性浓度(CC50)。
细胞存活率＝[(试验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)]×100％
表1药物稀释度
| 腹安颗粒浸膏(mg/ml) | 100.00 | 50.00 | 25.00 | 12.50 | 6.25 | 3.13 | 1.56 | 0.78 |
| 利巴韦林(μg/ml) | 100.00 | 50.00 | 25.00 | 12.50 | 6.25 | 3.13 | 1.56 | 0.78 |
2.5腹安颗粒浸膏对EV71的抑制作用
(1)直接抑毒实验：取RD细胞接种于无菌96孔培养板，100μL/孔，置于35℃、5％CO2培养箱24h，待细胞长成单层，弃培养液。实验组加入使细胞存活率为80％的腹安颗粒浸膏液+100TCID50 EV71各50μL/孔，阳性对照组加入利巴韦林药液和100TCID 50EV71各50μL/孔混合，各设5个复孔，同时设正常细胞对照、病毒对照。1h后将各孔药液及病毒液吸弃，加入含药细胞维持液100μL(细胞维持液与药液比例1:1)，正常细胞对照、病毒对照孔内换细胞生长维持液100μL，37℃，5％CO2孵育72小时后，每孔加入CCK8溶液10μL，继续培养4h后，取出在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的OD值(光密度)，计算药物对病毒的抑制率。
(2)药物预防EV71入侵细胞的作用：96孔板中长满单层的培养细胞，吸弃培养液，分别按1:1比例加入使细胞存活率为80％的腹安颗粒浸膏液，以及利巴韦林液的细胞生长维持液100μL/孔，同时设不加药物的细胞对照，37℃，5％ CO2培养12h；取出培养细胞吸弃培养液，用PBS洗细胞三次，加入100TCID50 EV71/孔，37℃吸附1h后吸弃未吸附的病毒液，加入含药细胞生长维持液100μL/孔(药与培养基比1:1)，同时将不加药物的细胞对照组又分设为：不加药物不加病毒的空白对照，以及加病毒不加药物的病毒对照，37℃，5％CO2孵育72小时，每孔加入CCK8溶液10μL，继续培养4h后，取出在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的OD值(光密度)，计算药物对病毒的抑制率。
(3)药物对病毒感染细胞治疗作用：长满单层的培养细胞，吸弃培养液，用PBS洗细胞三次，加入100TCID50 EV71/孔，37℃，5％ CO2培养箱吸附1h，吸弃未吸附的病毒液，加入使细胞存活率为80％药液细胞生长维持液100μL/孔，每组5个复孔。利巴韦林为阳性对照药物，同时设细胞对照组(不加病毒不加药)、病毒对照组(加病毒但不加药物的对照组)和空白对照组(无细胞，不加病毒不加药)。37℃，5％CO2孵育72小时后，每孔加入CCK8溶液10μL，继续培养4h后，取出在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的OD值，计算药物对病毒的抑制率。
病毒抑制率％＝(实验组OD值-病毒对照组OD值)/(正常对照组OD值-病毒对照组OD值)×100％
2.6培养细胞中动态观察分析药物对EV71抑制作用
(1)试验分组：
EV71组：病毒(MOI＝1)吸附RD细胞1h后，弃上清加含2％胎牛血清的DMEM维持培养液100μL/孔，收集EV71感染0、4、8、12、24h的RD细胞裂解上清液；
EV71+腹安颗粒浸膏组：病毒(MOI＝1)吸附RD细胞1h后，弃上清加含腹安颗粒浸膏、2％胎牛血清的DMEM维持培养液，收集对应时间点RD细胞裂解上清液；正常细胞对照组加含2％胎牛血清的DMEM维持培养液，EV71+利巴韦林对照组加含利巴韦林、2％胎牛血清的DMEM维持液。
(2)按照TCID50的操作步骤与计算方法计算以上各组RD细胞裂解液的病毒滴度。
3统计方法：
采用SPSS20.0进行统计分析，用Probit回归法计算药物半数细胞毒性浓度。采用Graphpad Prism5软件作图。所有数据以均数±标准差(x±s)表示，两组均数间比较用配对t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析，各实验组与对照组的比较用Dunnett-t检验，P＜0.05为具有统计学意义。
4结果
4.1EV71的TCID50
(1)Reed-Muench法计算TCID50
表2不同稀释度V71感染RD细胞病变孔数
距离比例＝(高于50％病变率的百分数－50％)/(高于50％病变率的百分数－低于50％病变率的百分数)＝(73.3％－50％)/(73.3％－35.7％)＝0.62
lgTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数＝0.62×(－1)+(－6)＝－6.62
TCID50＝10-6.62/100μL
意义：即将该病毒稀释106.62稀释后接种100μL/孔可使50％的细胞发生病变。病毒滴度为107.62TCID50/mL
RD细胞感染EV71继续培养24小时，倒置显微镜下观察到：与正常细胞相比感染细胞变暗、变圆，成团，脱落(见图1A和图1B)。
4.2药物的最大无毒浓度：
分别对利巴韦林注射液和腹安颗粒浸膏进行稀释，检测不同浓度药液对RD细胞的毒性，结果如图2A-图2B所示，根据CCK8测定细胞存活率并结合显微镜镜检结果，可知腹安颗粒浸膏对RD细胞的CC50≥68mg/mL；利巴韦林对RD细胞的CC50≥7.8μg/mL。CC50(半数细胞毒性浓度(half the cytotoxic concentration))从回归曲线获得使细胞存活率≥80％的药物浓度利巴韦林为2.02μg/mL，腹安颗粒浸膏为3.00mg/mL。
4.3腹安颗粒浸膏对EV71的抑制作用：
依据药物对病毒抑制率公式计算出腹安颗粒浸膏、利巴韦林对EV71的抑制率(见表3、表4、表5)。
表3药物对EV71的直接抑杀作用n＝5
| 组别 | OD值(450nm) | 病毒抑制率％ |
| 病毒对照组 | 0.625±0.046 | 0.000 |
| 腹安颗粒浸膏组(3.00mg/mL) | 0.962±0.072*# | 39.276±0.114 |
| 利巴韦林组(2.02mg/mL) | 0.975±0.068*# | 40.671±0.106 |
| 正常细胞对照组 | 1.483±0.081 | 100.000 |
注：F检验：P<0.05；*与病毒对照组比较P<0.05；#与正常细胞对照组比较P<0.05。
从表2可以看出腹安颗粒浸膏组与病毒对照组比较差别有统计学意义P<0.05；与正常细胞对照组比较P<0.05；腹安颗粒浸膏组对EV71直接抑制作用与利巴韦林组比较差别没有统计学意义P＞0.05。
表4药物预防EV71入侵细胞的作用n＝5
| 组别 | OD值(450nm) | 病毒抑制率％ |
| 病毒对照组 | 0.598±0.046 | 0.000 |
| 腹安颗粒浸膏组(3.00mg/mL) | 0.879±0.075*#◆ | 24.364±0.089 |
| 利巴韦林组(2.02mg/mL) | 0.893±0.087*# | 25.682±0.095 |
| 正常细胞对照组 | 1.646±0.103 | 100.000 |
注：F检验：P<0.05；*与病毒对照组比较P<0.05；#与正常细胞对照组比较P<0.05；
◆与利巴韦林组比较P<0.05。
从表4可以看出腹安颗粒浸膏组与病毒对照组比较差别有统计学意义P<0.05；与正常细胞对照组比较P<0.05；腹安颗粒浸膏组预防EV71入侵细胞作用与利巴韦林组比较差别有统计学意义P<0.05。
表5药物对EV71感染细胞治疗作用n＝5
| 组别 | OD值(450nm) | 病毒抑制率％ |
| 病毒对照组 | 0.664±0.102 | 0.000 |
| 腹安颗粒浸膏组(3.00mg/mL) | 1.112±0.105*#◆ | 43.964±0.111 |
| 利巴韦林组(2.02mg/mL) | 1.083±0.109*# | 31.318±0.102 |
| 正常细胞对照组 | 1.683±0.096 | 100.000 |
注：F检验：P<0.05；*与病毒对照组比较P<0.05；#与正常细胞对照组比较P<0.05；
◆与利巴韦林组比较P<0.05。
从表5可以看出腹安颗粒浸膏组与病毒对照组比较差别有统计学意义P<0.05；与正常细胞对照组比较P<0.05；腹安颗粒浸膏组治疗EV71感染细胞作用优于利巴韦林组差别有统计学意义P<0.05。
4.4动态观察分析药物对EV71复制的作用
EV71感染RD细胞1h后，分别加入含腹安颗粒浸膏3.00mg/mL、利巴韦林2.02μg/mL的细胞维持液，收集不同时间点的细胞裂解上清液，TCID50方法计算病毒滴度，腹安颗粒浸膏和阳性对照利巴韦林，与EV71组比较，8h、12h和24h病毒滴度显著降低，差异具有统计学意义P＜0.05，见图3。病毒滴度的下降提示腹安颗粒浸膏可以有效抑制EV71在RD细胞内复制，且体现出时间效应关系。
Claims (8)
1.腹安颗粒浸膏在制备用于治疗手足口病的药物中的用途，其中，所述腹安颗粒由以下中药材原料制备而成：仙鹤草、火炭母、铁苋菜、鬼针草和土荆芥，所述浸膏是将以上中药材原料煎煮后得到的提取液浓缩后得到。
2.腹安颗粒浸膏在制备抗肠道病毒71型的药物中的用途，其中，所述腹安颗粒由以下中药材原料制备而成：仙鹤草、火炭母、铁苋菜、鬼针草和土荆芥，所述浸膏是将以上中药材原料煎煮后得到的提取液浓缩后得到。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述药物为固体、半固体或液体的形式。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述药物为混悬液、锭剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂或散剂。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述药物的给药途径为注射给药或口服给药。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述注射给药包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述药学上可接受的辅料选自填充剂、表面活性剂、粘合剂、抗氧剂、防腐剂、矫味剂、润滑剂、包衣剂、着色剂。
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