CN115361967A - 来自乙酰胆碱酯酶的c-末端的环肽用于皮肤障碍的处理和用于美容用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及皮肤，并且涉及用于处理、预防或改善各种皮肤状况的新颖的组合物、处理法和方法。本发明还延伸到化妆品和药物组合物，以及在皮肤上使用它们处理各种状况的方法。

Description

来自乙酰胆碱酯酶的C-末端的环肽用于皮肤障碍的处理和用 于美容用途

本发明涉及皮肤，并且涉及用于处理、预防或改善各种皮肤状况的新颖的组合物、处理法和方法。本发明还延伸到化妆品和药物组合物，以及在皮肤上使用它们处理各种状况，如湿疹、银屑病、黑色素瘤、皮炎、以及痤疮、或作为皮肤增白剂、或用于减少瘢痕形成的方法。

乙酰胆碱酯酶(AChE)在发育的不同阶段表达为各种形式，所有的形式都有相同的催化酶促活性，但是各种形式都具有不同的分子组分。“有尾”(T-AChE-SEQ ID NO：1)在突触处表达，并且发明人之前已经鉴定了两种肽，可以从T-AChE的C-末端切割这两种肽，一种是称为“T14”(SEQ ID NO：3)的14个氨基酸长的肽，其在内的另一种是称为“T30”(SEQ IDNO：2)的30个氨基酸长的肽。AChE C-末端肽“T14”已经被鉴定为是AChE分子的显著部分，负责非水解作用的其范围。

合成的类似物(即，“T14”)以及随后它被嵌入到其中的更大、经验上更易处理、和更有效力的氨基酸序列(即，“T30”)展示了与报道的“非胆碱能的”AChE的作用相似的作用，而T30序列内的惰性15个氨基酸长的肽(即，“T15”-SEQ ID NO：4)没有作用(Bond et al2009 PLoS one Vol:4 Issue:3 e4846)。T14肽结合α7烟碱性受体上的变构位点，其中它自己没有作用。然而，在初级配体(如，乙酰胆碱或膳食胆碱)存在的情况下，T14增强了由这些初级试剂诱导的钙流入。过量的钙可以被吸收到线粒体中，其中它损害氧化磷酸化，并且引起电子泄漏。因此，形成自由基，然后该自由基使细胞膜不稳定，然后细胞死亡(Day&Greenfield 2004 Exp Brain Res 155：500–508)。

皮肤的表皮层是在成熟的成年人中连续更新过程的几个实例之一。细胞周期过程由作为T14(Greenfield et al.，2004)的靶的α-7受体(Arreondo et al.2002 J CellBiol.159(2)：325-36)的激活驱动。在许多常见的皮肤疾病中，如在银屑病中，与更新过程相关的角质形成细胞增殖(其在表皮内包含约90％的细胞)的底层的控制机制出错。在这种情况下，角质形成细胞进入增殖的替代途径，其特征在于过度生长速率、对生长因子的异常应答、缺陷分化和增加的转移能力。

因此，需要鉴定减少或预防角质形成细胞增殖的试剂，这些试剂可用于皮肤状况的处理。

发明人研究了衍生自乙酰胆碱酯酶的C-末端的环肽对角质形成细胞系的作用，并且发现T30(SEQ ID NO：2)(包含T14序列(SEQ ID NO：3)的序列)刺激细胞内钙流入到皮肤细胞中，并且诱导细胞增殖。发明人还出人意料地示出衍生自乙酰胆碱酯酶的C-末端的环肽(称为“NBP-14”)抑制T30诱导的细胞内钙流入到角质形成细胞中。因此，发明人认为NBP-14可以用作处理剂，以处理、预防或改善与细胞增殖相关的皮肤状况，例如银屑病和癌症。

因此，在本发明的第一方面，提供了一种环状多肽、其衍生物或类似物，其包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-末端的氨基酸序列，或其截短段，用于处理、预防或改善皮肤疾病。

在第二方面，提供了一种处理、改善或预防皮肤疾病的方法，该方法包括向需要这种处理的受试者施用、或已经施用处理有效量的包含氨基酸序列的环状多肽、其衍生物或类似物，该氨基酸序列衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-末端，或其截短段。

如实施例中所描述，发明人在角质形成细胞系HaCaTs上进行细胞内钙成像和细胞增殖测定，HaCaTs是人角质形成细胞的广泛使用和表征的模型。发明人已经出人意料地示出线性肽(T30)能够在HaCaT中诱导细胞内钙流入，这与细胞增殖的刺激相关。发明人的进一步的工作已经示出，出人意料地，衍生自乙酰胆碱酯酶的C-末端的环肽(称为“NBP-14”)抑制T30诱导的细胞内钙流入到角质形成细胞中，表明衍生自乙酰胆碱酯酶的C-末端的环肽可以用于处理与异常的角质形成细胞增殖相关的皮肤状况。

环状多肽、其衍生物或类似物可以靶向存在于表皮的深层(例如，基底层、棘层(stratum spinsosum)和/或颗粒层(stratum granlulosum))中的细胞。优选地，环状多肽、其衍生物或类似物靶向基底层中的细胞。

所处理的皮肤状况优选地是与异常的角质形成细胞增殖相关的皮肤状况。优选地，所处理的皮肤状况可以选自由以下各项组成的组：湿疹、银屑病、黑色素瘤、皮炎、以及痤疮。

环状多肽、其衍生物或类似物也可以用作皮肤增白剂。

因此，在第三方面，提供了根据第一方面的环状多肽、其衍生物或类似物，用作皮肤增白剂。

环状多肽是肽链，其N-末端和C-末端本身与形成氨基酸的环状链的肽键连接在一起。

术语“其衍生物或类似物”可以意指一种多肽，其中氨基酸残基被具有相似侧链或肽主链特性的残基(不论是天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸模拟物)置换。此外，这种肽的末端可以由具有与乙酰基或酰胺基团类似特性的N-和/或C-末端保护基团保护。

根据本发明的肽的衍生物和类似物还可以包括增加肽在体内半衰期的那些。例如，本发明的肽的衍生物或类似物可以包括肽的类肽和反类肽衍生物、肽-类肽杂交体以及肽的D-氨基酸衍生物。

类肽，或聚-N-取代的甘氨酸，是一类肽模拟物，其侧链附接到肽主链的氮原子，而不是α-碳，如同它们是在氨基酸中。可以从肽结构的知识容易地设计本发明的肽的类肽衍生物。反类肽(其中所有氨基酸被反向顺序的类肽残基置换)也是根据本发明的合适的衍生物。与肽或含有一个类肽残基的类肽-肽杂合体相比，预期反类肽在相反方向上结合在配体结合沟槽中。因此，类肽残基的侧链能够指向与原始肽中的侧链相同的方向。

术语“衍生自”可以意指氨基酸序列，该氨基酸序列是AChE的C-末端或其一部分中存在的或者形成AChE的C-末端或其一部分的氨基酸序列的衍生物或者修饰。

术语“其截短段”可以意指衍生自AChE的环状多肽通过氨基酸的移除而减小了大小。在环化成本发明的环状多肽之前，通过从肽的C-和/或N-末端移除残基可以实现氨基酸的减少，或者在环化之前，通过从肽核心内缺失一个或多个氨基酸也可以实现氨基酸的减少。

乙酰胆碱酯酶是一种水解乙酰胆碱的丝氨酸蛋白酶，并且将是技术人员熟知的。在大脑中发现的乙酰胆碱酯酶的主要形式被称为有尾的乙酰胆碱酯酶(T-AChE)。人类有尾的乙酰胆碱酯酶的一个实施方式的蛋白质序列(Gen Bank：AAA68151.1)在长度上是614个氨基酸，并且在此被提供为SEQ ID No：1，如下：

应当理解，SEQ ID NO：1的前31个氨基酸残基被移除，同时蛋白被释放，从而留下583个氨基酸序列。因此，优选的是环状多肽、其衍生物或类似物包含氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列衍生自乙酰胆碱酯酶的C-末端，或其截短段，其中乙酰胆碱酯酶包含基本上如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，优选地排除在N-末端的31个氨基酸。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物包含氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列衍生自形成乙酰胆碱酯酶的C-末端的最后300、200、100或50个氨基酸，或其截短段，最优选地，其中乙酰胆碱酯酶包含氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列基本上如SEQ ID NO：1中所示。环状多肽、其衍生物或类似物优选地包含氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列衍生自形成乙酰胆碱酯酶的C-末端的最后40个氨基酸、或其截短段。环状多肽、其衍生物或类似物优选地包含氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列衍生自形成乙酰胆碱酯酶的C-末端的最后30个氨基酸，或其截短段。

环状多肽、其衍生物或类似物可以包含4与50个之间的氨基酸，优选地8与40个之间的氨基酸残基，优选地10与30个之间的氨基酸，更优选地9与20个之间的氨基酸，并且最优选地10与16个之间的氨基酸，或由其组成。更优选地，环状多肽、其衍生物或类似物可以包含13与15个之间的氨基酸残基，或由其组成。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物包含4与50个之间的氨基酸残基、4与40个之间的氨基酸残基、4与35个之间的氨基酸残基、4与32个之间的氨基酸残基、4与30个之间的氨基酸残基、4与25个之间的氨基酸残基、4与20个之间的氨基酸残基、或4与15个之间的氨基酸残基。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物包含5与50个之间的氨基酸残基、5与40个之间的氨基酸残基、5与35个之间的氨基酸残基、5与32个之间的氨基酸残基、5与30个之间的氨基酸残基、5与25个之间的氨基酸残基、5与20个之间的氨基酸残基、或5与15个之间的氨基酸残基。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物包含6与50个之间的氨基酸残基、6与40个之间的氨基酸残基、6与35个之间的氨基酸残基、6与32个之间的氨基酸残基、6与30个之间的氨基酸残基、6与25个之间的氨基酸残基、6与20个之间的氨基酸残基、或6与15个之间的氨基酸残基。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物包含8与50个之间的氨基酸残基、8与40个之间的氨基酸残基、8与35个之间的氨基酸残基、8与30个之间的氨基酸残基、8与30个之间的氨基酸残基、8与25个之间的氨基酸残基、8与20个之间的氨基酸残基、或8与15个之间的氨基酸残基。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物包含9与50个之间的氨基酸残基、9与40个之间的氨基酸残基、9与35个之间的氨基酸残基、9与30个之间的氨基酸残基、9与25个之间的氨基酸残基、9与20个之间的氨基酸残基、或9与15个之间的氨基酸残基。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物包含10与50个之间的氨基酸残基、10与40个之间的氨基酸残基、10与35个之间的氨基酸残基、10与30个之间的氨基酸残基、10与25个之间的氨基酸残基、10与20个之间的氨基酸残基、或10与15个之间的氨基酸残基。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物包含11与50个之间的氨基酸残基、11与40个之间的氨基酸残基、11与35个之间的氨基酸残基、11与30个之间的氨基酸残基、11与25个之间的氨基酸残基、11与20个之间的氨基酸残基、或11与15个之间的氨基酸残基。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物包含12与50个之间的氨基酸残基、12与40个之间的氨基酸残基、12与35个之间的氨基酸残基、12与30个之间的氨基酸残基、12与25个之间的氨基酸残基、12与20个之间的氨基酸残基、或12与15个之间的氨基酸残基。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物包含13与50个之间的氨基酸残基、13与40个之间的氨基酸残基、13与35个之间的氨基酸残基、13与30个之间的氨基酸残基、13与25个之间的氨基酸残基、13与20个之间的氨基酸残基、或13与15个之间的氨基酸残基。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物包含14与50个之间的氨基酸残基、14与40个之间的氨基酸残基、14与35个之间的氨基酸残基、14与30个之间的氨基酸残基、14与25个之间的氨基酸残基、14与20个之间的氨基酸残基、或14与15个之间的氨基酸残基。

发明人已制备了衍生自AChE的C-末端的三个肽序列，并且它们在此称为T30、T14和T15，其中数字对应于氨基酸数目。

T30的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO：1的最后30个氨基酸残基)在此被提供为SEQID NO：2，如下：

KAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL

[SEQ ID NO：2]

T14的氨基酸序列(对应于朝向SEQ ID NO：1的末端定位的14个氨基酸残基，并且缺少在T30中发现的最后15个氨基酸)在此被提供为SEQ ID NO：3，如下：

AEFHRWSSYMVHWK

[SEQ ID NO：3]

T15的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO：1的最后15个氨基酸残基)在此被提供为SEQID NO：4，如下：

NQFDHYSKQDRCSDL

[SEQ ID NO：4]

应当理解，可以使用本领域技术人员通常已知的标准肽合成方法，从头合成在此所描述的任何多肽或肽，并且因此，然后可以用于在此所述的任何化妆品/处理应用中。因此，通过在此提供的序列的相邻氨基酸之间形成肽键可以产生任何肽，以建立全序列长度，即，提供第一氨基酸，第二氨基酸连接于第一氨基酸，以此类推，直到所希望的肽长度。因此，不必以全部的乙酰胆碱酯酶序列或其较短的截短段开始，并且通过从N-末端和/或C-末端移除氨基酸直到达到所希望的肽长度来减少多肽的长度。实际上，为了速度、方便和成本，优选的是使用从头肽合成方法，产生多肽。

应当理解，表示为SEQ ID NO：2-4的任何序列可以容易地被环化(或环形化)以形成第一方面的环状多肽。例如，通过侧链至侧链、侧链至主链、或头至尾(C-末端至N-末端)的环化技术可以实现肽的环化。在一个优选实施方式中，头至尾环化是通过其生产环状多肽的优选方法。使用经典溶液相的线性肽环化或基于树脂的环化，可以合成环状多肽。实施例中描述了用于环化的优选方法。在另一个优选的实施方式中，使用环化切割方法产生多肽，其中在逐步线性肽合成之后，通过环化，合成环状多肽。这种方法的优点是不需要锚定侧链，使得该方法更通用。优选地，在使用之前，通过MALDI-TOF MS可以分析所得的环肽样品。

因此，根据本发明的优选多肽包含环状SEQ ID NO：2、3或4，或者其功能变体或片段，或者由其组成。

发明人发现，环化的SEQ ID No：3(即，在此称为“环化的T14”、“CT14”或“NBP-14”)出人意料地抑制了T30诱导的角质形成细胞中的细胞内钙流入。

因此，在此描述的本发明中使用的最优选的环状多肽包含环状SEQ ID No：3或其功能变体或片段，或者由其组成。

应当理解，根据本发明的环状多肽可以用于药物中，该药物可以用作单一处理法(即，环状多肽、其衍生物或类似物的单独使用)，用于处理、改善或预防皮肤状况。可替代地，根据本发明的环状多肽、其衍生物或类似物可以用作用于处理、改善或预防皮肤状况的已知处理法的辅助物或与其组合。

根据本发明的环状多肽、其衍生物或类似物可以组合在具有大量不同形式的组合物中，特别地取决于组合物待使用的方式。因此，例如，组合物可以是以下形式：粉末、片剂、胶囊、液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、气溶胶、喷雾、胶束溶液、透皮贴剂、脂质体悬浮液或可以施用给需要处理的人或动物的任何其他合适的形式。应当理解，根据本发明的药物的载体应该是施用它的受试者良好耐受的载体，并且优选地使得环状多肽能够递送至皮肤。

根据本发明的环状多肽还可以结合在缓慢释放或延迟释放装置中，例如逐层组装的绷带中。这样的装置可以例如被插入在皮肤上或皮肤下，并且药物可以被释放数周或甚至数月。至少邻近处理部位可以定位装置。当需要用根据本发明的使用的环状多肽长期处理时，并且正常地需要频繁施用(例如，至少每天注射)，这样的装置可以是特别地有利的。

在优选实施方式中，根据本发明的药物可以局部地被施用于皮肤，优选地直接在需要处理的部位施用。

应当理解，所需的环状多肽的量由其生物活性和生物利用度决定，这接着取决于施用模式，环状多肽的生理化学性质以及其是用作单一处理法还是用于联合处理法。施用的频率还将受正在处理的受试者体内的环状多肽的半衰期影响。待施用的最佳剂量可以由本领域技术人员确定，并且将随使用的特定环状多肽、药物组合物的强度和施用模式而变化。取决于所处理的特定受试者的另外的因素将导致需要调整剂量，包括受试者年龄、体重、性别、饮食、以及施用时间。

通常，取决于所使用的环状多肽，在0.001μg/kg体重与10mg/kg体重之间、或在0.01μg/kg体重与1mg/kg体重之间的根据本发明的环状多肽的每日剂量可以用于处理、改善或预防皮肤状况。

可以在皮肤状况发作之前、期间或之后施用环状多肽。每日剂量可以作为单次施用(即，单次每日施用)。可替代地，在一天期间，环状多肽可能需要施用两次或更多次。作为实施例，环状多肽可以作为0.07μg与700mg(即，假定体重为70kg)之间的两次(或更多次，取决于正在处理的皮肤状况的严重性)每日剂量施用。接受处理的患者在醒来时可以施用第一剂量，并且然后在晚上，或在此之后以3小时或4小时的间隔，施用第二剂量(如果涉及两次剂量方案)。可替代地，可以使用缓释装置来向患者提供根据本发明的环状多肽的最佳剂量，而无需施用重复剂量。

已知的程序，例如制药工业常规地采用的那些(例如，体内实验、临床试验等)，可以用于形成根据本发明的环状多肽的特定制剂以及精确的处理方案(例如，试剂的每日剂量以及施用的频率)。发明人认为，基于本发明的环状多肽的用途，他们是最先建议皮肤状况处理的组合物。

因此，在本发明的第四方面，提供了皮肤状况处理的药物组合物，该药物组合物包含处理有效量的环状多肽、其衍生物或类似物以及药物学上可接受的载体，该环状多肽、其衍生物或类似物包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-端的氨基酸序列，或其截短段。

在第五方面，本发明还提供了用于制备根据该第四方面的皮肤状况处理的组合物的方法，该方法包括将处理有效量的环状多肽、其衍生物或类似物与药物学上可接受的载体组合，该环状多肽、其衍生物或类似物包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-端的氨基酸序列，或其截短段。

环状多肽、其衍生物或类似物优选地包含在此所公开的环状T14(即，NBP-14)，即，SEQ ID NO：3，或由其组成。

发明人的发现，衍生自乙酰胆碱酯酶的C-末端的环肽可以减少角质形成细胞增殖，表明环肽还可以有利地用于减少瘢痕形成，并且因此用于美容目的。在一些实施例中，抗瘢痕形成的活性可以是治疗性的。

因此，在本发明的第六方面，提供用于减少、预防或抑制瘢痕形成的环状多肽、其衍生物或类似物，该环状多肽、其衍生物或类似物包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-端的氨基酸序列，或其截短段。

在第七方面，提供了减少、抑制或预防瘢痕形成的方法，该方法包括向需要这种处理的受试者施用、或已经施用处理有效量的环状多肽、其衍生物或类似物，该环状多肽、其衍生物或类似物包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-末端的氨基酸序列，或其截短段。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物是如在第一方面中所定义。

然而，在其他实施方式中，抗瘢痕形成的活性可以是美容性的。

因此，在本发明的第八方面，提供了用于皮肤的美容处理方法，该方法包括向皮肤施用环状多肽或其衍生物或类似物，该环状多肽或其衍生物或类似物包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-末端的氨基酸序列，或其截短段。

优选地，环状多肽、其衍生物或类似物是如在第一方面中所定义。

皮肤的美容处理可以包括减少、预防或抑制瘢痕形成。

在本发明的第九方面，提供了环状多肽、或其衍生物或类似物用于皮肤的美容处理的用途，该环状多肽、或其衍生物或类似物包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-末端的氨基酸序列，或其截短段。

本发明还延伸到化妆品组合物。

因此，在本发明的第十方面，提供了化妆品组合物，该组合物包含化妆品上有效量的环状多肽、其衍生物或类似物以及化妆品上可接受的载体，该环状多肽、或其衍生物或类似物包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-末端的氨基酸序列，或其截短段。

本发明在第十一方面还提供了用于制备根据第十方面的化妆品组合物的方法，该方法包括将化妆品上有效量的环状多肽、其衍生物或类似物与化妆品上可接受的载体组合，该环状多肽、或其衍生物或类似物包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-末端的氨基酸序列，或其截短段。

瘢痕形成的预防、减少或抑制

在本发明的情况下瘢痕形成的预防、减少或抑制应理解为与对照处理或未处理的伤口的愈合时发生的瘢痕形成的水平相比，涵盖在所处理的伤口愈合时所实现的瘢痕形成中的任何程度的预防、减少或抑制。在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则通常提及瘢痕形成的“预防”、“减少”或“抑制”代表基本上等同的活性，涉及由本发明的多肽介导的等效机制。

瘢痕形成的评估

为了实现处理效果可能需要的瘢痕形成的抑制程度对于负责患者护理的临床医师而言将是显而易见的，并且可以容易地由负责患者护理的临床医师确定。临床医师可以对已经实现的瘢痕形成的抑制程度进行适当的确定，以便评估处理效果是否已经实现或正在实现。这样的评估可以，但不一定参照在此所述的建议的测量方法进行。

参照这种活性剂在用本发明的方法或药物处理的人类患者中可以实现的效果，可以评估在伤口闭合之后实现瘢痕形成的抑制的程度。可替代地，可以参照使用合适的体外或体内模型的实验研究来评估可以实现的瘢痕形成的抑制。在评估本发明的环肽的处理效果中，或在建立处理有效量的这种多肽中，可以特别地优选的是使用试验模型来研究瘢痕形成的抑制。

伤口愈合和瘢痕形成的动物模型代表优选的实验模型，用于体内评估使用本发明的药物或方法可以实现的瘢痕抑制程度。出于说明性目的，下文描述这种模型的实施例。在此所描述的瘢痕形成的模型和用于评估瘢痕形成的方法可以用于确定处理有效的多肽。

使用本发明的环肽对瘢痕形成的抑制可以在迄今为止研究的任何身体部位和任何组织或器官中实现。为了说明的目的，本发明的环肽的瘢痕抑制活性和方法将主要参照可能在皮肤(身体的最大器官)中产生的瘢痕形成的抑制来描述。然而，技术人员将立即理解，当考虑皮肤中的瘢痕形成的抑制时，相关的许多因素也与其他器官或组织中的瘢痕形成的抑制相关。因此，技术人员将认识到，除非上下文另外要求，以下关于皮肤的瘢痕考虑的参数和评估还可以适用于除皮肤之外的组织中的瘢痕形成。技术人员将认识到，以上内容同样适用于上皮再形成和伤口愈合速率的情况，并且不限于瘢痕形成的评估。

在皮肤中，伤口的处理可以改善当这些伤口闭合时出现的瘢痕的宏观和微观外观；宏观上瘢痕可能不太可见，并且与周围皮肤混合，微观上瘢痕内的胶原纤维可以具有与周围皮肤中的那些更相似的形态和各向异性组织。

与通过没有多肽处理的伤口闭合所形成的瘢痕的外观比较，参照通过伤口处理以促进闭合而产生的瘢痕的微观或宏观外观，可以评估和/或测量使用本发明的方法和环肽实现的瘢痕形成的抑制。还可以参照所处理的瘢痕的宏观和微观外观两者来适当地评估瘢痕形成的抑制。

在考虑由所处理的伤口引起的瘢痕的宏观外观时，可以参照多个参数中的任何参数来评估瘢痕形成的程度，并且因此评估所实现的任何瘢痕形成的抑制的幅度。最优选地，通过独立的专家组评估宏观照片、通过独立的外行组评估或临床上通过患者自身的临床医师的宏观评估，进行瘢痕的整体评估。借助于VAS(视觉模拟量表)或分类量表来采集评估。

可以被客观地评估的瘢痕的宏观特征包括：

i)瘢痕的颜色。瘢痕可以典型地相对于周围皮肤着色不足或着色过度。当处理的瘢痕的色素沉着比未处理的瘢痕的色素沉着，更紧密地接近无瘢痕的皮肤的色素沉着时，可以证实瘢痕形成的抑制。类似地，瘢痕可以比周围皮肤更红。在这种情况下，当与未处理的瘢痕相比，处理的瘢痕的发红更早地、或更完全地、或更接近地类似于周围皮肤的外观时，可以证实瘢痕形成的抑制。存在许多非侵入性的比色装置，这些装置能够提供关于瘢痕和无瘢痕的皮肤的色素沉着以及皮肤发红(这可以是存在于瘢痕或皮肤中的血管分布程度的指示)的数据。这种装置的实施例包括X-rite SP-62分光光度计、Minolta ChronometerCR-200/300；Labscan 600；Dr.Lange Micro Colour；Derma分光计；激光-多普勒流量计；和分光光度皮内分析(SIA)镜。ii)瘢痕的高度。与周围皮肤相比，瘢痕可以典型地凸起或凹陷。当处理的瘢痕的高度比未处理的瘢痕的高度，更紧密地接近无瘢痕的皮肤的高度时(即，既不凸起也不凹陷)，可以证实瘢痕形成的抑制。瘢痕的高度可以通过轮廓测定法在患者上直接测量，或者通过从瘢痕取得的模具的轮廓测定法间接测量。iii)瘢痕的表面纹理。瘢痕可以具有比周围皮肤相对更光滑的表面(引起具有“闪亮”外观的瘢痕)或比周围皮肤更粗糙的表面。当处理的瘢痕的表面纹理比未处理的瘢痕的表面纹理，更紧密地接近无瘢痕的皮肤的表面纹理时，可以证实瘢痕形成的抑制。表面纹理可以通过轮廓测定法在患者身上直接测量，或者通过从瘢痕取得的模具的轮廓测定法间接测量。iv)瘢痕的硬度。瘢痕的异常组成和结构意味着它们通常比瘢痕周围的未损伤的皮肤更硬。在这种情况下，当处理的瘢痕的硬度比未处理的瘢痕的硬度，更紧密地接近无瘢痕的皮肤的硬度时，可以证实瘢痕形成的抑制。

处理的瘢痕将优选地表现出瘢痕形成的抑制，如参照本说明书中所阐述的用于宏观评估的参数中的至少一个参数所评估的。更优选地，参照至少两个参数，甚至更优选地至少三个参数，以及最优选地至少四个这些参数(例如，以上阐述的所有四个参数)，处理的瘢痕可以证实抑制的瘢痕形成。上文描述的参数可以用在用于瘢痕形成的宏观评估的视觉模拟量表(VAS)的研发中。下面描述关于VAS的实现的细节。

微观评估还可以提供一种合适的方法，通过该方法可以比较处理的和未处理的或对照瘢痕的质量。典型地使用瘢痕的组织学切片可以进行瘢痕质量的微观评估。

用于瘢痕的微观评估的合适参数可以包括：

i)细胞外基质(ECM)纤维的厚度。当与在未处理的瘢痕中发现的纤维的厚度相比，在处理的瘢痕中的ECM纤维的厚度更紧密地接近在无瘢痕的皮肤中发现的ECM纤维的厚度时，可以证实瘢痕形成的抑制。ii)ECM纤维的取向。在瘢痕中发现的ECM纤维倾向于表现出比在无瘢痕的皮肤中发现的那些(它们具有随机取向，通常被称为“篮式编织”)更大程度的彼此对齐。因此，当处理的瘢痕中的ECM纤维的取向比在未处理的瘢痕中发现的这种纤维的取向，更紧密地接近在无瘢痕的皮肤中发现的ECM纤维的取向时，可以证实瘢痕形成的抑制。iii)瘢痕的ECM组成。存在于瘢痕中的ECM分子的组成显示出与正常皮肤中发现的差异，其中存在于瘢痕的ECM中的弹性蛋白的量减少。因此，在处理的瘢痕的真皮中的ECM纤维的组成比在未处理的瘢痕中发现的组成，更紧密地接近在无瘢痕的皮肤中发现的这种纤维的组成时，可以证明瘢痕形成的抑制。iv)瘢痕的细胞构成。瘢痕倾向于含有比无瘢痕的皮肤相对少的细胞。因此，应当理解，当处理的瘢痕的细胞构成比未处理的瘢痕的细胞构成，更紧密地接近无瘢痕的皮肤的细胞构成时，可以证实瘢痕形成的抑制。v)附件。瘢痕不包含附件结构，如腺体或毛囊。在处理皮肤中这些的存在将指示已经发生了功能组织再生，而不是瘢痕形成。

在评估瘢痕的微观质量时可被考虑的其他特征包括瘢痕相对于周围的无瘢痕的皮肤的凸起或凹陷，以及在无瘢痕的皮肤的界面处的瘢痕的隆起或可见性。

上文描述的参数可以用于生成VAS以用于瘢痕形成的微观评估。这种VAS可以考虑胶原组织，以及在乳头状真皮和网状真皮中的丰度还可以提供瘢痕质量的有用的指数。当处理的瘢痕的质量比未处理的或对照的瘢痕的质量更接近无瘢痕的皮肤的质量时，可以指示瘢痕形成的抑制。

出人意料的是注意到瘢痕(如皮肤的那些)的总体外观几乎不受瘢痕的表皮覆盖的影响，即使这是观察者看到的瘢痕的一部分。代替地，发明人发现，存在于瘢痕内的结缔组织(如，构成真皮、或新真皮)的特性对瘢痕形成程度的感知以及对瘢痕形成组织的功能具有更大影响。因此，可以证明与结缔组织，如真皮，而不是表皮相关的标准的评估在确定瘢痕形成的抑制中是最有用的。

ECM纤维的厚度和ECM纤维的取向可以是有利的参数，用于评估瘢痕形成的抑制。处理的瘢痕可以优选地具有改进的ECM取向(即，与未处理的瘢痕中的取向相比，更类似无瘢痕的皮肤的取向)。

如参照以上所阐述的用于微观评估的参数中的至少一个参数所评估的，处理的瘢痕将优选地证实瘢痕形成的抑制。更优选地，参照参数中的至少两个、甚至更优选地参数中的至少三个、甚至更优选地参数中的至少四个、以及最优选地这些参数中的所有五个，处理的瘢痕可以证实瘢痕形成的抑制。

应当理解，使用本发明的环肽或方法实现的瘢痕形成的抑制可以通过从不同评估方案组合的一个或多个合适的参数的改进来指示(例如，参照在宏观评估中使用的至少一个参数和在微观评估中使用的至少一个参数所评估的抑制)。

基于各种测量或评估，包括Duncan et al.(2006),Beausang et al.(1998)和vanZuijlen et al(2002)描述的那些，可以选择用于瘢痕的临床测量和评估的合适参数的其他实施例。除非上下文另外要求，否则许多以下参数可以应用于瘢痕形成的宏观和/或微观评估。用于评估皮肤中瘢痕的合适的参数的实施例可以包括：

1.关于视觉模拟量表(VAS)的瘢痕评分的评估。

当与对照瘢痕相比时，通过处理瘢痕的VAS评分的减少，可以证实瘢痕形成的预防、减少或抑制。用于评估瘢痕的合适的VAS可以基于由Duncan et al.(2006)或由Beausang et al.(1998)描述的方法。这典型地是10cm的线，其中0cm被认为是不可感知的瘢痕，并且10cm是非常差的增生性瘢痕。

2.关于分类量表的评估。

通过基于文本描述，例如“几乎不明显”、“与正常皮肤很好地混合”、“与正常皮肤不同”等，将瘢痕分配给不同的类别，通过比较处理的瘢痕与未处理的或对照的瘢痕，注意这些之间的任何差异，并且将差异分配至所选择的类别(其合适的实例可以是“轻度差异”、“中度差异”、“主要差异”等)，可以确定瘢痕形成的预防、减少或抑制。可以由患者、研究者、独立的组或临床医师进行这种评估，并且可以直接对患者或者对从患者拍摄的照片或模具进行这种评估。当评估指示处理的瘢痕通常被分配到比未处理的或对照瘢痕更有利的类别时，可以证实瘢痕形成的抑制。

3.瘢痕高度、瘢痕宽度、瘢痕周长、瘢痕面积或瘢痕体积。

可以直接在受试者身上测量瘢痕的高度和宽度，例如通过使用手动测量装置(如卡尺)，或通过使用轮廓测定仪自动测量。可以直接在受试者上，通过瘢痕的照片的图像分析，通过瘢痕的硅树脂模具印痕的分析，或通过由这种印痕制成的阳铸型的分析，测量瘢痕宽度、周长和面积。技术人员还将知道可以用于研究合适的参数的另外的非侵入性方法和装置，包括硅酮模制、超声、光学三维轮廓测定法以及高分辨率磁共振成像。通过与未经处理的瘢痕比较，处理的瘢痕的高度、宽度、面积、周长或体积、或其任何组合的减少，可以证实瘢痕形成的抑制。

4.瘢痕变形和机械性能

可通过瘢痕与无瘢痕的皮肤的视觉比较，可以评估瘢痕变形。合适的比较可以将所选择的瘢痕分类为不引起变形、轻度变形、中度变形或严重变形。

使用基于抽吸、压力、扭转、张力和声学的许多非侵入性方法和装置，可以评估瘢痕的机械性能。能够在评估瘢痕的机械性能中使用的装置的合适的实施例包括压痕硬度计(Indentometer)、Cutometer、Reviscometer、粘弹性皮肤分析仪、Dermaflex、Durometer、皮肤测定仪(Dermal Torque Meter)以及弾力计(Elastometer)。

通过处理瘢痕引起的变形与未处理瘢痕引起的变形相比的减少，可以证实瘢痕形成的抑制。还应当理解，通过与未处理的瘢痕相比，无瘢痕的皮肤的机械性能更类似于处理的瘢痕的机械性能，可以证实瘢痕形成的抑制。

独立的外行组的照片评估

使用瘢痕的标准化和校准的照片，可以由独立的外行组评估员执行处理的和未处理的瘢痕的照片评估。可以由独立的外行组评估瘢痕，以提供分类排名数据(例如，当与未处理的瘢痕相比时，给定的处理的瘢痕是“更好的”、“更差的”或“没有不同的”)和基于由Duncan et al.(2006)和Beausang et al.(1998)描述的方法，使用视觉模拟量表(VAS)的定量数据。

专家组

使用待评估的瘢痕的标准化和校准的照片，和/或硅酮模具的阳铸型，由专家组的评估员可替换地或额外地执行处理的和未处理的瘢痕的照片评估。专家组可以优选地由本领域技术人员组成，其合适的例子包括具有相关技术背景的整形外科医生、皮肤科医生或科学家。

临床评估

临床医师或独立的临床医师组可以使用上述参数中的任何参数，例如VAS、颜色、分类量表等来评估患者身上的瘢痕。合适的临床医师可以是负责护理患者的临床医师，或者可以是调查用于瘢痕形成的抑制的处理的功效的临床医师。

患者评估

患者可以通过结构化调查表，评估他们自己的瘢痕和/或比较瘢痕。合适的调查表可以测量参数，如：患者对他们的瘢痕的满意度；瘢痕与无瘢痕的皮肤混合的多么好；以及瘢痕对他们的日常生活的影响(合适的问题可以考虑患者是否使用衣服来隐藏瘢痕，或以其他方式避免暴露瘢痕)和/或瘢痕症状(其例子可以包括瘙痒、疼痛或感觉异常)。瘢痕形成的抑制可通过以下来指示：与未处理的瘢痕相比，处理的瘢痕接收来自患者的更积极的评级，和/或引起患者更少的问题，和/或引起更少或更几乎没有的瘢痕症状，和/或患者满意度的增加。除了分类数据之外，使用图像分析结合合适的可视化技术，可以生成定量数据(优选地与上述参数有关)。可以用于评估瘢痕质量的合适的可视化技术的例子是特定的组织学染色或免疫标记，其中通过图像分析可以定量地确定存在的染色或标记的程度。

关于以下参数，可以有用地并且容易地产生定量数据：

1.瘢痕的宽度、高度、凸起、体积和面积。

2.胶原组织、胶原纤维厚度、胶原纤维密度。

3.成纤维细胞的数目和取向。

4.其他ECM分子，例如弹性蛋白、纤连蛋白的量和取向。

通过以上考虑的任何参数的变化，可以证实瘢痕形成的预防、减少或抑制，使得处理的瘢痕比对照或未处理的瘢痕(或其他合适的比较物)更接近地类似于无瘢痕的皮肤。

在动物或人类中，与对照、安慰剂或标准护理处理相比，以上讨论的评估和参数适合于评估多肽对瘢痕形成的作用。应当理解，这些评估和参数可以用于确定处理上有效的多肽，该处理上有效的多肽可以用于瘢痕的预防、减少或抑制；并且用于确定处理上有效量的本发明的多肽，如AXL。可以使用适合的统计检验来分析从不同处理生成的数据集，以便调查结果的显著性。

参照所讨论的器官，可以确定其他参数，该其它参数可以用于除皮肤之外的器官中的瘢痕形成的评估。例如，通过测量角膜的不透明度或透射/难治疗的特性以及角膜曲率的测量，可以评估角膜的瘢痕形成。例如，使用体内共聚焦显微术和/或镜面反射显微术或角膜地形图，可以进行这种评估。

通过恢复用本发明的药物或方法处理的组织的功能，可以指示腱或韧带中瘢痕形成的成功抑制。合适的功能指标可以包括腱或韧带承受重量、拉伸、弯曲等的能力。例如，使用电生理反射检查、表面肌电记术、超声波检查、超声/MRI扫描、以及自我报告的症状和疼痛调查表来，可以进行这种评估。

血管中发生的瘢痕形成的程度可以直接测量，例如使用超声，或通过血流间接测量。使用本发明的药物或方法实现的瘢痕形成的抑制可以导致血管管腔变窄的减少，并且允许更正常的血流。

伤口部位

伤口可以存在于任何身体部位，以及伤口可以发生的任何组织或器官中。皮肤代表了预防、减少或抑制瘢痕形成的优选部位。发明人认为本发明的环肽可以有益地减少在所有类型的上皮伤口中的瘢痕形成。其中可以看到本发明的作用的特定伤口的例子包括选自由以下各项组成的组的伤口：皮肤伤口(例如烧伤、切口伤口、压力溃疡)、肺伤口、眼睛伤口(包括由眼睛手术，例如LASIK手术、LASEK手术、PRK手术、青光眼过滤手术、白内障手术或其中晶状体囊可以经受瘢痕形成的手术，所引起的瘢痕形成的抑制)，例如引起角膜结疤的那些；经受囊收缩的伤口(其通常是围绕乳房的植入物)；口腔的伤口，包括唇和腭(例如，抑制由于唇或腭裂的处理引起的瘢痕形成或促进闭合或口腔溃疡)；内部器官，如消化组织和生殖组织的伤口；体腔如腹腔、骨盆腔和胸腔的伤口(其中抑制瘢痕形成可以减少粘连形成的发生次数和/或形成的粘连的大小)；和手术伤口(特别地与美容手术相关的伤口，如用于毛发移植手术的条状移植物的瘢痕修正或分离)。特别优选的是本发明的环肽用于预防、减少或抑制与皮肤伤口相关的瘢痕形成。

切口伤口是产生瘢痕形成的优选的伤口组，该瘢痕形成可以被本发明的多肽抑制。手术切口伤口可以构成特别优选的伤口组，就该伤口组而言，使用本发明的药物和方法，可以抑制瘢痕形成。

本发明的环肽可以用于抑制与整形或美容手术相关的瘢痕形成。由于大量的整形或美容手术由选择性手术程序组成，在手术之前和/或在大约伤口闭合时(例如，在施用缝合线之前或之后)，可以容易地施用本发明的多肽，并且这种用途代表了本发明的特别地优选的实施方式。

通常，在手术程序中，可以施用本发明的环肽的优选途径是经由局部注射(如，皮内注射)。这种注射可以形成升高的水泡，这些水泡然后可以作为手术程序的一部分被切开，或可替代地，例如，通过缝合线，已经闭合伤口之后，通过注射伤口边缘可以升高水泡。可替代地，环肽可以按乳膏制剂或绷带施用，或可以涂覆在用于切口闭合的缝合线上。

瘢痕修正是手术程序，其中“修正”现有瘢痕(例如，通过切除或重新对齐)以便减少由现有瘢痕引起的美容和/或机械破坏。可能这些中最佳已知的是“Z成形术”，其中两个V形皮肤瓣片被转位以允许张力线的旋转。本发明的环肽在与瘢痕修正相关的程序中的用途代表根据本发明的优选用途。

应认识到，由烧伤损伤引起的伤口(出于本发明的目的，该烧伤损伤可以被认为包括暴露于加热的气体或固体，连同涉及热液体的烫伤损伤；由暴露于极端低温引起的“冷冻烧伤”损伤；辐射烧伤；以及化学烧伤，如由苛性试剂引起的那些)可以在如此受折磨的个体的大面积上延伸。因此，烧伤可导致覆盖大比例患者身体的瘢痕形成。这种大范围的覆盖增加了所形成的瘢痕将覆盖化妆品重要性提高的区域(如，面部、颈部、手臂或手)或机械重要性的区域(特别地覆盖关节或围绕关节的区域)的风险。儿童经常遭受由热液体引起的烧伤损伤(例如，由于平锅、水壶等的倾覆)，并且由于儿童的相对较小的身体大小，特别可能在高比例的身体面积上引起广泛损害。因此，与烧伤后的瘢痕形成相关的美容和机械损伤的风险升高。在大烧伤之后，用皮肤移植作处理。本发明可以与皮肤移植联合使用，以促进上皮细胞从移植物迁移至未覆盖的伤口，以在皮肤的非移植区域中快速建立屏障。

“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，根据本发明的药物和化妆品可以用于处理任何哺乳动物，例如家畜(例如马)、宠物，或可以用于其他兽医应用中。然而，最优选地，受试者是人类。

环状多肽的“处理有效量”是任何量，该任何量是当给受试者施用时，处理皮肤状况或产生所希望的效果所需的活性剂的量。环状多肽、其衍生物或类似物可以用作用于处理不同皮肤状况(例如湿疹、银屑病、黑色素瘤、皮炎以及痤疮)的佐剂。这意味着将需要较低剂量的其他处理。

环状多肽的“化妆品上有效量”是任何量，该任何量是当给受试者施用时，产生所希望的化妆品效果所需的活性剂的量。

例如，所使用的环状多肽的处理上或化妆品上有效量可以是从约0.001mg至约800mg、并且优选地从约0.01mg至约500mg。

如在此提及的“药物学上可接受的载体”是本领域技术人员已知的在配制药物组合物中有用的任何已知的化合物或已知化合物的组合。

如在此提及的“化妆品上可接受的载体”是本领域技术人员已知的在配制化妆品组合物中有用的任何已知的化合物或已知化合物的组合。

在一个实施方式中，药物学上或化妆品上可接受的载体可以是固体，并且组合物可以处于粉末或片剂的形式。然而，药物或化妆品载体可以是液体，并且化妆品或药物组合物处于溶液的形式。液体药物或化妆品组合物是无菌溶液或悬浮液，可以通过例如肌内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内，并且特别地皮下注射来利用。

本发明的环状多肽和组合物可以按无菌溶液或悬浮液的形式口服施用，该无菌溶液或悬浮液含有其他溶质或悬浮剂(例如，足以使溶液等渗的盐水或葡萄糖)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨醇的油酸酯及其与环氧乙烷共聚的酸酐)等。根据本发明使用的环状多肽还可以以液体或固体组合物形式口服施用。适合于口服施用的组合物包括固体形式，如丸剂、胶囊、颗粒、片剂、以及粉末，以及液体形式，如溶液、糖浆、酏剂以及悬浮液。可用于肠胃外施用的形式包括无菌溶液、乳液和悬浮液。

优选地，本发明的环状多肽和组合物可以以乳膏、凝胶、洗液、软膏、皮肤溶液、悬浮液、喷雾、泡沫、沐浴添加剂、火棉胶、浸渍敷料或药用膏药的形式局部地施用。乳膏可以是水包油型或油包水型。本发明的环状多肽和组合物可以与乳化剂，如烷基硫酸盐、烷基胺、烷基嘧啶化合物等局部地被施用。用于乳膏制剂的可接受的油包括：白矿脂、石蜡、鲸蜡硬脂醇、椰油甘油酯、鲸蜡醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸鲸蜡酯、可可脂(butyrum cacao)、向日葵油(oleum helianthi)、白蜂蜡、羊毛脂、棕榈酸异丙酯、硬脂酸、硬脂酸镁。为了制备凝胶，可以使用以下凝胶形成的添加剂：纤维素胶(羧甲基纤维素)、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟基纤维素或锂皂石。

优选地，本发明的环状多肽和组合物可以与防腐剂、抗氧化剂、络合剂、溶剂、香料、杀细菌剂、气味吸收剂、维生素、保湿剂、自晒褐色化合物和抗皱活性剂一起局部地施用。

本发明的组合物可以含有化妆品上可接受的添加剂或佐剂以及化妆品或皮肤的活性剂。代表性的添加剂和佐剂包括，例如油溶性或油混溶性溶剂或共溶剂。添加剂和佐剂的合适实施例包括但不限于脂肪醇、脂肪酰胺、碳酸亚烃酯、乙二醇、低级醇(例如，乙醇、丙二醇)、分散增强剂、聚合物、增稠剂、稳定剂、保湿剂、润湿剂、着色剂、填料、螯合剂、抗氧化剂(例如，BHT、生育酚)、精油、香料、染料、中和剂或pH调节剂(例如，柠檬酸、三乙胺(TEA)和氢氧化钠)、防腐剂、杀菌剂、调理剂或软化剂(例如，泛酰醇和尿囊素)、提取物(如，植物提取物)或用于这种类型的应用的化妆品中常用的任何其他成分。添加剂和佐剂在组合物中的存在量通常范围可以为约0.01％至约10％的重量。化妆品活性剂或皮肤活性剂的实施例包括自由基清除剂、维生素(例如，维生素E及其衍生物)、抗弹性蛋白酶和抗胶原酶的试剂、肽、脂肪酸衍生物、类固醇、痕量元素、藻类和浮游生物的提取物、酶和辅酶、类黄酮和神经酰胺、羟基酸及其混合物以及增强剂。这些成分在组合物中存在的油相中可以是可溶的或可分散的。

本发明的环状多肽和组合物可以以无菌溶液或悬浮液施用，该无菌溶液或悬浮液含有其他溶质或悬浮剂(例如，足以使溶液等渗的盐水或葡萄糖)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨醇的油酸酯及其与环氧乙烷共聚的酸酐)等。根据本发明使用的环状多肽还可以以液体或固体组合物形式口服施用。适合于口服施用的组合物包括固体形式，如丸剂、胶囊、颗粒、片剂、以及粉末，以及液体形式，如溶液、糖浆、酏剂以及悬浮液。可用于肠胃外施用的形式包括无菌溶液、乳液和悬浮液。

应当理解，本发明延伸至任何核酸或肽或其变体、衍生物或类似物，其基本上包含在此提及的任何序列的氨基酸或核酸序列，包括其功能变体或功能片段。术语“基本上氨基酸/核苷酸/肽序列”、“功能变体”和“功能片段”可以是与在此提及的任何一种序列的氨基酸/核苷酸/肽序列具有至少40％序列同一性的序列，例如与被鉴定为SEQ ID NO：1-4的序列具有40％同一性的序列，等等。

还设想了与所提及的任何序列具有大于65％、更优选地大于70％、甚至更优选地大于75％、并且还更优选地大于80％序列同一性的序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列。优选地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列与在此提及的任何序列具有至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，甚至更优选地至少92％同一性，甚至更优选地至少95％同一性，甚至更优选地至少97％同一性，甚至更优选地至少98％同一性，并且最优选地至少99％同一性。

技术人员将理解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性。为了计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性，必须首先准备两个序列的比对，随后计算序列同一性值。两个序列的百分比同一性可以取不同的值，这取决于：(i)用于比对序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(在不同的程序中实施)，或来自3D比较的结构比对；和(ii)比对方法使用的参数，例如，局部比对对整体比对，使用的对记分矩阵(例如，BLOSμM62、PAM250、Gonnet等)，以及空位罚分，例如，函数形式和常数。

在进行比对后，存在计算两个序列之间的百分比同一性的许多不同方式。例如，可以将同一性的数除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数；或(v)排除突出端的等效位置的数。此外，应当理解，百分比同一性也强烈依赖于长度。因此，一对序列越短，可以预期偶然发生的序列同一性越高。

因此，应当理解，蛋白质或DNA序列的准确比对是复杂的过程。流行的多重比对程序ClustalW(Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research，22，4673-4680；Thompson等人，1997，Nucleic Acids Research，24，4876-4882)是用于产生根据本发明的蛋白质或DNA的多重比对的优选方式。ClustalW的适合的参数可以如下：对于DNA比对：空位开放罚分＝15.0，空位延伸罚分＝6.66，并且矩阵＝同一性。对于蛋白质比对：空位开放罚分＝10.0，空位延伸罚分＝0.2，并且矩阵＝Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP＝-1，并且GAPDIST＝4。本领域技术人员将意识到，可能需要改变这些和其他参数，以用于最佳序列比对。

优选地，两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性的计算然后可以从如(N/T)*100的比对来计算，其中N是序列共享相同残基的位置的数，并且T是比较的位置的总数，包括空位，并且包括或排除突出端。优选地，在计算中包括突出端。因此，用于计算两个序列之间的百分比同一性的最优选的方法包括：(i)使用ClustalW程序，使用合适的参数集合，准备序列比对，例如，如上所述；以及(ii)将N和T的值插入下式：序列同一性＝(N/T)*100。

用于鉴定类似序列的替代方法是本领域技术人员已知的。例如，基本上相似的核苷酸序列将由在严格条件下与DNA序列或其互补序列杂交的序列编码。通过严格条件，我们意指在约45℃下在3x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与过滤结合的DNA或RNA杂交，随后在约20-65℃下在0.2xSSC/0.1％SDS中进行至少一次洗涤的核苷酸。可替代地，基本上相似的多肽可以与SEQ ID NO：1至4中示出的序列相差至少1、但少于5、10、20、50或100个氨基酸。

由于遗传密码的简并性，清楚的是在此所描述的任何核酸序列可以变化或改变而基本上不影响由其编码的蛋白质的序列，以提供其功能变体。合适的核苷酸变体是具有通过编码序列内的相同氨基酸的不同密码子的取代而改变的序列，从而产生沉默变化的那些。其他合适的变体是具有同源核苷酸序列，但包含全部或部分序列的变体，所述序列通过编码氨基酸的不同密码子的取代而改变，所述氨基酸具有与其取代的氨基酸类似的生物物理特性的侧链，以产生保守改变。例如，小的非极性疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，应当理解，哪些氨基酸可以被具有相似生物物理特性的氨基酸替换，并且本领域技术人员将知道编码这些氨基酸的核苷酸序列。

在此所描述的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以通过任何组合方式与任何上述方面组合，除了这样的特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合之外。

为了更好地理解本发明，并且示出可以如何实施本发明的实施方式，现在将通过实施例的方式参照附图，在附图中：

图1A示出了NBP-14的序列(SEQ ID NO：3)，其中NBP-14的末端丙氨酸(A)和赖氨酸(K)残基形成环化位点。图1B示出了环状NBP-14肽，其中末端丙氨酸和赖氨酸残基连接在一起；

图2示出了环肽(NBP-14)抑制角质形成细胞中T30诱导的细胞内钙流入的能力。

图3示出了A)用线性肽T30和T15以及环肽NBP-14处理的角质形成细胞系的细胞生存力的程度；以及B)用线性肽T30和T15处理的角质形成细胞系的细胞增殖。

实施例

基本原理

发明人已经基于乙酰胆碱酯酶的C-末端产生了大量线性肽和环肽，称为T15、T30和NBP-140肽，并且评估了它们在角质形成细胞系中的作用。应注意，SEQ ID No：3在此被称为“环化的T14”、“CT14”或“NBP-14”，并且是具有衍生自有尾的乙酰胆碱酯酶的C-末端的氨基酸序列的环肽。

材料和方法

肽的环化

使用三种技术来实现在此描述的线性肽的环化，即侧链至侧链、侧链至主链、以及头至尾(C-末端至N-末端)环化。头至尾环化已经被广泛研究，并且可以涉及定向Cys-Cys二硫化物环化(每分子多达两个)。小心监测反应确保了100％的环化。将两种通用方法用于合成：(1)在高稀释条件下经典溶液相的线性肽环化；以及(2)基于树脂的环化。在固相合成中使用两种不同的方案(1)：

(a)进行经由侧链官能团(例如，咪唑、3’酸、4’胺或醇)，锚定的肽的树脂上环化。肽在C-末端作为酯被正交地保护，然后通过常规Boc或Fmoc合成，随后皂化、环化和切割来组装肽。

(b)所使用的另一个方案是环化切割方法，其中在逐步线性肽合成之后，通过环化合成环肽。该方法的一个优点在于无需锚定侧链，使得该方法比(a)更通用。(ChristopherJ.White和Andrei K)。Yudin(2011)Nature Chemistry 3；Valero et al(1999)J PeptideRes.53，76-67；Lihu Yang and Greg Morriello(1999)Tetrahedron Letters 40，8197-8200；Parvesh Wadhwani et al(2006)J.Org.Chem.71，55-61)。

实施例1-环T14(即，“NBP-14”)

“有尾”的乙酰胆碱酯酶(T-AChE)在突触处表达，并且本发明人之前已经鉴定了可以从其C-末端切割的两种肽，一种称为“T14”(14个氨基酸长)，其在内的另一种称为“T30”(30个氨基酸长)。线性肽的氨基酸序列T14是AEFHRWSSYMVHWK[SEQ ID NO：3]。线性肽的氨基酸序列T30是KAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL[SEQ ID NO：2]。另一种称为“T15”的肽对应于SEQ ID NO：1的最后15个氨基酸残基，即，NQFDHYSKQDRCSDL[SEQ ID No：4]。

AChE C-末端肽“T14”已经被鉴定为AChE分子的显著部分，负责其非水解作用的范围。合成的14氨基酸肽类似物(即，“T14”)以及随后它被嵌入到其中的更大、更稳定、和更有效的氨基酸序列(即，“T30”)展示了与报道的“非胆碱能的”AChE的作用相似的作用。

首先参照图1A，示出了14个氨基酸长的环状T14肽(即，“NBP-14”)。环肽，NBP-14，已经经由末端丙氨酸(A)和赖氨酸(K)残基进行环化，并且在图1B中示出。可以通过几种不同的手段实现环化。例如，Genosphere Biotechnologies(法国)通过将线性肽转化成N-末端至C-末端内酰胺来进行T14的环化。产生环状NBP-14的T14的环化将两个末端，即，HWK-AEF连接在一起。。

实施例2-乙酰胆碱酯酶衍生的肽对角质形成细胞系HaCaTs细胞系中的细胞内钙 的作用

发明人检查了乙酰胆碱酯酶衍生的线性肽T30和T15以及环肽NBP-14诱导细胞内钙流入到角质形成细胞系中的能力，并且结果示于图2中。T30的应用诱导角质形成细胞系中细胞内钙的增加，而惰性T15肽的应用不诱导细胞系中细胞内钙的增加。NBP-14令人惊讶地能够显著地抑制T30的作用。

实施例3-乙酰胆碱酯酶衍生的肽对角质形成细胞系HaCaTs细胞系的增殖的作用

本发明人接下来检查了乙酰胆碱酯酶衍生的肽T30和T15诱导HaCaT细胞系增殖的能力，并且还测试了细胞生存力以确定NBP-14、T15和T30对HaCaT细胞系的细胞毒性。结果显示在图3中。参照图3B，当与未处理的对照(无肽)相比时，T30显著地诱导HaCaT细胞的增殖。相反，T15不改变细胞增殖。NBP-14、T15和T30在细胞系中不显示诱导的显著细胞毒性效应，如图3A所示。

结论

发明人研究了衍生自乙酰胆碱酯酶的C-末端的环肽对角质形成细胞系的作用，并且发现T30(包含T14序列的序列)刺激细胞内钙流入到皮肤细胞中，并且诱导细胞增殖。发明人还示出了衍生自乙酰胆碱酯酶的C-末端的环肽(称为“NBP-14”)抑制T30诱导的细胞内钙流入到角质形成细胞中，但是无毒。因此，发明人认为NBP-14可用作处理剂，以处理、预防或改善与细胞增殖相关的皮肤状况，如银屑病和癌症(例如，黑色素瘤)，并且还用于预防、减少和抑制瘢痕形成。

SEQUENCE LISTING

<110> 神经生物有限公司

<120> 来自乙酰胆碱酯酶的C-末端的环肽用于皮肤障碍的处理和用于美容用途

<130> GBA1V220007443

<150> 2004803.9

<151> 2020-04-01

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 614

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Arg Pro Pro Gln Cys Leu Leu His Thr Pro Ser Leu Ala Ser Pro

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Leu Leu Gly Gly Gly Val Gly Ala Glu

20 25 30

Gly Arg Glu Asp Ala Glu Leu Leu Val Thr Val Arg Gly Gly Arg Leu

35 40 45

Arg Gly Ile Arg Leu Lys Thr Pro Gly Gly Pro Val Ser Ala Phe Leu

50 55 60

Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro Met Gly Pro Arg Arg Phe Leu Pro

65 70 75 80

Pro Glu Pro Lys Gln Pro Trp Ser Gly Val Val Asp Ala Thr Thr Phe

85 90 95

Gln Ser Val Cys Tyr Gln Tyr Val Asp Thr Leu Tyr Pro Gly Phe Glu

100 105 110

Gly Thr Glu Met Trp Asn Pro Asn Arg Glu Leu Ser Glu Asp Cys Leu

115 120 125

Tyr Leu Asn Val Trp Thr Pro Tyr Pro Arg Pro Thr Ser Pro Thr Pro

130 135 140

Val Leu Val Trp Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Gly Ala Ser Ser

145 150 155 160

Leu Asp Val Tyr Asp Gly Arg Phe Leu Val Gln Ala Glu Arg Thr Val

165 170 175

Leu Val Ser Met Asn Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu Ala Leu

180 185 190

Pro Gly Ser Arg Glu Ala Pro Gly Asn Val Gly Leu Leu Asp Gln Arg

195 200 205

Leu Ala Leu Gln Trp Val Gln Glu Asn Val Ala Ala Phe Gly Gly Asp

210 215 220

Pro Thr Ser Val Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Val

225 230 235 240

Gly Met His Leu Leu Ser Pro Pro Ser Arg Gly Leu Phe His Arg Ala

245 250 255

Val Leu Gln Ser Gly Ala Pro Asn Gly Pro Trp Ala Thr Val Gly Met

260 265 270

Gly Glu Ala Arg Arg Arg Ala Thr Gln Leu Ala His Leu Val Gly Cys

275 280 285

Pro Pro Gly Gly Thr Gly Gly Asn Asp Thr Glu Leu Val Ala Cys Leu

290 295 300

Arg Thr Arg Pro Ala Gln Val Leu Val Asn His Glu Trp His Val Leu

305 310 315 320

Pro Gln Glu Ser Val Phe Arg Phe Ser Phe Val Pro Val Val Asp Gly

325 330 335

Asp Phe Leu Ser Asp Thr Pro Glu Ala Leu Ile Asn Ala Gly Asp Phe

340 345 350

His Gly Leu Gln Val Leu Val Gly Val Val Lys Asp Glu Gly Ser Tyr

355 360 365

Phe Leu Val Tyr Gly Ala Pro Gly Phe Ser Lys Asp Asn Glu Ser Leu

370 375 380

Ile Ser Arg Ala Glu Phe Leu Ala Gly Val Arg Val Gly Val Pro Gln

385 390 395 400

Val Ser Asp Leu Ala Ala Glu Ala Val Val Leu His Tyr Thr Asp Trp

405 410 415

Leu His Pro Glu Asp Pro Ala Arg Leu Arg Glu Ala Leu Ser Asp Val

420 425 430

Val Gly Asp His Asn Val Val Cys Pro Val Ala Gln Leu Ala Gly Arg

435 440 445

Leu Ala Ala Gln Gly Ala Arg Val Tyr Ala Tyr Val Phe Glu His Arg

450 455 460

Ala Ser Thr Leu Ser Trp Pro Leu Trp Met Gly Val Pro His Gly Tyr

465 470 475 480

Glu Ile Glu Phe Ile Phe Gly Ile Pro Leu Asp Pro Ser Arg Asn Tyr

485 490 495

Thr Ala Glu Glu Lys Ile Phe Ala Gln Arg Leu Met Arg Tyr Trp Ala

500 505 510

Asn Phe Ala Arg Thr Gly Asp Pro Asn Glu Pro Arg Asp Pro Lys Ala

515 520 525

Pro Gln Trp Pro Pro Tyr Thr Ala Gly Ala Gln Gln Tyr Val Ser Leu

530 535 540

Asp Leu Arg Pro Leu Glu Val Arg Arg Gly Leu Arg Ala Gln Ala Cys

545 550 555 560

Ala Phe Trp Asn Arg Phe Leu Pro Lys Leu Leu Ser Ala Thr Asp Thr

565 570 575

Leu Asp Glu Ala Glu Arg Gln Trp Lys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser

580 585 590

Ser Tyr Met Val His Trp Lys Asn Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln

595 600 605

Asp Arg Cys Ser Asp Leu

610

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Lys Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys Asn

1 5 10 15

Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln Asp Arg Cys Ser Asp Leu

20 25 30

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ala Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Val His Trp Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asn Gln Phe Asp His Tyr Ser Lys Gln Asp Arg Cys Ser Asp Leu

1 5 10 15

Claims (20)

1.一种环状多肽、其衍生物或类似物，其包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-末端的氨基酸序列，或其截短段，用于处理、预防或改善皮肤疾病。

2.根据权利要求1所述用于的环状多肽、其衍生物或类似物，其中，被处理的皮肤状况是与异常角质形成细胞增殖相关的皮肤状况。

3.根据权利要求1或2所述用于的环状多肽、其衍生物或类似物，其中，被处理的皮肤状况选自由以下组成的组：湿疹、银屑病、黑色素瘤、皮炎和痤疮。

4.根据权利要求1至3中任一项所述用于的环状多肽、其衍生物或类似物，其中，乙酰胆碱酯酶包含基本上如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，或者其变体或片段。

5.根据权利要求1至4中任一项所述用于的环状多肽、其衍生物或类似物，其中，环状多肽、其衍生物或类似物包含：

(i)4与50个之间的氨基酸残基，或8与40个之间的氨基酸；或

(ii)6与20个之间的氨基酸，或6与15个之间的氨基酸。

6.根据权利要求1至5中任一项所述用于的环状多肽、其衍生物或类似物，其中，环状多肽、其衍生物或类似物包含环状SEQ ID NO：2，或者其功能变体或片段。

7.根据权利要求1至5中任一项所述用于的环状多肽、其衍生物或类似物，其中，环状多肽、其衍生物或类似物包含环状SEQ ID NO：3，或者其功能变体或片段。

8.根据权利要求1至5中任一项所述用于的环状多肽、其衍生物或类似物，其中，环状多肽、其衍生物或类似物包含环状SEQ ID NO：4，或者其功能变体或片段。

9.根据前述权利要求中任一项所述用于的环状多肽、其衍生物或类似物，其中，使用从头肽合成方法，产生多肽、其衍生物或类似物。

10.一种皮肤状况处理的药物组合物，包含处理有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的环状多肽、其衍生物或类似物、以及药物学上可接受的载体。

11.一种用于制造根据权利要求10所述的皮肤状况处理的组合物的方法，所述方法包括将处理有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的环状多肽、其衍生物或类似物与药物学上可接受的载体组合。

12.一种环状多肽、其衍生物或类似物，其包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-末端的氨基酸序列，或其截短段，用于减少、预防或抑制瘢痕形成。

13.一种根据权利要求12所述用于的环状多肽、其衍生物或类似物，其中，环状多肽、其衍生物或类似物如在权利要求1至9中任一项中所定义。

14.一种用于皮肤的美容处理方法，包括向皮肤施用环状多肽、或其衍生物或类似物，所述环状多肽、或其衍生物或类似物包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-末端的氨基酸序列，或其截短段。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，环状多肽、其衍生物或类似物如在权利要求1至9中任一项中所定义。

16.环状多肽、或其衍生物或类似物用于皮肤的美容处理的用途，所述环状多肽、或其衍生物或类似物包含衍生自乙酰胆碱酯酶(AChE)的C-末端的氨基酸序列，或其截短段。

17.根据权利要求16所述的用途，其中，环状多肽、其衍生物或类似物如在权利要求1至9中任一项中所定义。

18.一种化妆品组合物，其包含化妆品上有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的环状多肽、其衍生物或类似物，以及化妆品上可接受的载体。

19.一种用于制造根据权利要求18所述的化妆品组合物的方法，所述方法包括将化妆品上有效量的根据权利要求1至1中任一项所述的环状多肽、其衍生物或类似物与化妆品上可接受的载体组合。

20.根据权利要求1至9中任一项所述的环状多肽、其衍生物或类似物作为皮肤增白剂的用途。

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