CN115176163A - 辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法、生物标志物、试剂盒及装置 - Google Patents

辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法、生物标志物、试剂盒及装置 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种简单地辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法、生物标志物、试剂盒及装置。本发明涉及一种包括以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症的步骤的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法、包括以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的步骤的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法、生物标志物、试剂盒及装置。

Description

辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法、生 物标志物、试剂盒及装置
技术领域
本发明涉及一种辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法、生物标志物、试剂盒及装置。
背景技术
痴呆症是指，正常发展的记忆、学习、判断、计划等脑部的认知功能因后天的脑部的器质性障碍而持续降低从而对日常、社会生活带来不便的疾病的总称。作为痴呆症的原因疾病，已知有阿尔茨海默型痴呆症(AD)、路易体痴呆症(DLB)、额颞叶变性(FTLD)、血管性痴呆症(VaD)等。
阿尔茨海默型痴呆症为最常见的痴呆症的原因疾病，患者数伴随高龄化而急剧增加。认为在阿尔茨海默型痴呆症患者的脑部具有多见以大脑皮质或海马部为中心而β淀粉样蛋白(Aβ)积蓄而成的老年斑或磷酸化tau蛋白积蓄而成的神经原纤维变化的特征，因神经细胞死亡、神经突触减少、乙酰胆碱降低引起而出现痴呆症的症状。
作为阿尔茨海默型痴呆症的诊断方法，报告有使用抗NCAM抗体或抗L1CAM抗体对血液中的来源于神经的细胞外囊泡进行浓缩，以来源于该神经的细胞外囊泡中所包含的Aβ42、Tau、磷酸化Tau等为指标来判定阿尔茨海默型痴呆症的方法(专利文献1、专利文献2、非专利文献1、非专利文献2)。
轻度认知障碍是指，虽然在认知功能的一部分出现障害，但不会对日常生活带来不便的健康与痴呆症的边界的状态。作为轻度认知障碍的诊断方法，可举出简易智力状态检查(MMSE)，在MMSE中，当以30分为满分，27分以下时，猜测被测试者为轻度认知障碍。并且，在MMSE中，当23分以下时，猜测被测试者为痴呆症。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利申请2016-550673
专利文献2：日本专利申请2017-520760
非专利文献
非专利文献1：C.N.Winston et al./Alzheimer’s&Dementia:Diagnosis,Assessment&Disease Monitoring(2016)3:63-72
非专利文献2：Mustapic M et al.Front.Neurosci.(2017)11:278
发明内容
发明要解决的技术课题
但是，以血液中的来源于神经的细胞外囊泡为指标诊断阿尔茨海默型痴呆症的方法需要从被检体对来源于神经的细胞外囊泡进行亲和浓缩的操作，从而操作繁杂。并且，无法直接测定被检体，因此容易产生含量测定之间的误差，从而难以适用于多个被检体测定。
并且，不存在用于诊断轻度痴呆症的有用的生物标志物。
鉴于前述的状况，本发明的课题在于提供一种简单地辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法、生物标志物、试剂盒及装置。
用于解决技术课题的手段
本发明人等对特定的细胞外囊泡是否能够成为用于辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的生物标志物进行了研究。
其结果，本发明人等新发现细胞外囊泡中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的特定的细胞外囊泡成为阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物。
而且，本发明人等发现具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例成为用于辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的指标，从而完成了发明。
本发明涉及一种以下辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法、生物标志物、试剂盒及装置(本发明中的第1发明)。
而且，本发明涉及一种以下辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法、生物标志物、试剂盒及装置(本发明中的第2发明)。
[1]一种辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其包括如下步骤：
测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量或具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；及
以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量或具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
[2]根据[1]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，当具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量或具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为基准值以下时，判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
[3]根据[1]或[2]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症，
所述四次穿膜蛋白选自CD9、CD63及CD81。
[4]根据选自[1]～[3]中的任一个所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量是指，使用对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质来测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
[5]根据[4]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质为含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白的蛋白质。
[6]根据选自[1]～[5]中的任一个所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症，
所述生物试样为血液试样或脑脊髓液。
[7]根据[1]或[2]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症，
所述四次穿膜蛋白为CD9或CD63。
[8]根据选自[1]、[2]及[7]中的任一个所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量是指，使用对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质来测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
测定具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量是指，使用对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质来测定具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
[9]根据[8]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质为含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白的蛋白质。
[10]根据选自[1]、[2]及[7]～[9]中的任一个所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症，
所述生物试样为血液试样或脑脊髓液。
[11]一种辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其包括如下步骤：
测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及具有CD9的细胞外囊泡的量；及
以具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
[12]根据[11]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，当具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例为基准值以下时，判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
[13]根据[11]或[12]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，
具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定是指，使用对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质来测定具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量，
具有所述CD9的细胞外囊泡的量的测定是指，使用对所述CD9具有亲和性的物质来测定具有所述CD9的细胞外囊泡的量。
[14]根据[13]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质为含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白的蛋白质。
[15]根据选自[11]～[14]中的任一个所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，所述生物试样为血液试样或脑脊髓液。
[16]一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用试剂盒，其包含对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质。
[17]一种阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用试剂盒，其包含对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质。
[18]一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物，其包含具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡。
[19]一种阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用生物标志物组，其包含具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡以及具有CD9的细胞外囊泡。
[20]一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用装置，其具有：
测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；及
判定部，以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
[21]一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用装置，其具有：
测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；
运算部，计算具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例；及
判定部，以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
[22]一种辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用装置，其具有：
测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及具有CD9的细胞外囊泡的量；
运算部，计算具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例；及
判定部，以所述生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于所述生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
[23]一种辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其包括如下步骤：
测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；及
以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例的值为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
[24]根据[23]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量是指，使用对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质来测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
测定具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量是指，使用对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质来测定具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量。
[25]根据[24]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质为含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白的蛋白质。
[26]根据选自[23]～[25]中的任一个所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，所述生物试样为血液试样或脑脊髓液。
[27]一种辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其包括如下步骤：
测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及具有CD9的细胞外囊泡的量；及
以具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例的值为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
[28]根据[27]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，当具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例的值为基准值以下时，判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
[29]根据[27]或[28]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，
具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定是指，使用对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质来测定具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量，
具有所述CD9的细胞外囊泡的量的测定是指，使用对所述CD9具有亲和性的物质来测定具有所述CD9的细胞外囊泡的量。
[30]根据[29]所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质为含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白的蛋白质。
[31]根据选自[27]～[30]中的任一个所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，所述生物试样为血液试样或脑脊髓液。
[32]一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用试剂盒，其包含对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质、对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质。
[33]一种阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用试剂盒，其包含对CD9具有亲和性的物质、对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质。
[34]一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物组，其包含具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡。
[35]一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物组，其包含具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、β淀粉样蛋白(1-40)以及β淀粉样蛋白(1-42)。
[36]一种阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用生物标志物组，其包含具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡、具有CD9的细胞外囊泡、β淀粉样蛋白(1-40)以及β淀粉样蛋白(1-42)。
[37]一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用装置，其具有：
测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；
运算部，计算具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例的值；及
判定部，以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例的值为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
[38]一种阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用装置，其具有：
测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及具有CD9的细胞外囊泡的量；
运算部，计算具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例的值；及
判定部，以所述生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于所述生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡的量的比例乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例的值为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
发明效果
根据本发明，能够简单地辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断。
附图说明
图1是以具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的量为指标评价了来源于阿尔茨海默型痴呆症患者的脑脊髓液(CSF)被检体及来源于健康者的CSF被检体的箱线图。
图2是以具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例为指标评价了来源于阿尔茨海默型痴呆症患者的CSF被检体、来源于轻度认知障碍患者的CSF被检体及来源于健康者的CSF被检体的箱线图。
图3是以具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的量为指标评价了来源于阿尔茨海默型痴呆症患者的血浆被检体及来源于健康者的血浆被检体的箱线图。
图4是以具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例为指标评价了来源于阿尔茨海默型痴呆症患者的血浆被检体、来源于轻度认知障碍患者的血浆被检体及来源于健康者的血浆被检体的箱线图。
图5是以对具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例的值为指标评价了来源于阿尔茨海默型痴呆症患者的血浆被检体、来源于轻度认知障碍患者的血浆被检体及来源于健康者的血浆被检体的箱线图。
具体实施方式
在本说明书中，当示出范围的上限及下限时，除非有特别记载，A～B表示A以上且B以下。
细胞外囊泡为来源于细胞的由脂质二重膜构成的小型膜囊泡。通常，该细胞外囊泡可举出具有20nm～1000nm的直径的细胞外囊泡，优选为50nm～800nm，更优选为50nm～500nm，尤其优选为50nm～200nm。作为所述细胞外囊泡，例如，如Nature ReviewsImmunology 9,581-593(August 2009)，“肥满研究”Vol.13No.2 2007主体青木直人等中所记载，可举出根据其产生起源或小型膜囊泡的大小等而分类为多种的细胞外囊泡。具体而言，可举出外泌体、微囊泡、核外颗粒体、膜粒子、外泌体样囊泡、凋亡小体及脂肪体等，优选为外泌体及微囊泡，更优选为外泌体。
所述外泌体为来源于细胞的由脂质二重膜构成的小型膜囊泡，例如可举出具有50nm～200nm的直径的外泌体，优选为50nm～150nm，更优选为50nm～100nm。另外，认为外泌体来源于晚期内体。
所述微囊泡为来源于细胞的由脂质二重膜构成的小型膜囊泡，例如，可举出具有100nm～1000nm的直径的微囊泡，优选为100nm～800nm，更优选为100nm～500nm。另外，认为微囊泡来源于细胞膜。
所述细胞外囊泡可以包含于来源于被测试者的生物试样中，也可以从来源于被测试者的生物试样分离，优选从来源于被测试者的生物试样分离。
作为来源于所述被测试者的生物试样，只要能够包含细胞外囊泡均可，例如，可举出血清、血浆、全血、血沉棕黄层等来源于血液的试样；脑脊髓液、尿、唾液、精液、胸腔渗出液、泪液、痰、粘液、淋巴液、腹水、胸腔积液、羊水、膀胱清洗液及支气管肺泡清洗液等体液试样，优选为来源于血液的试样及脑脊髓液，更优选为血清、血浆及脑脊髓液，进一步优选为血清及血浆，尤其优选为血浆。并且，由于对被测试者的试样采集的负担轻，因此来源于血液的试样更有效。
来源于所述被测试者的生物试样例如可以从被测试者直接采集，也可以是回收、浓缩、提纯、分离、基于缓冲液等的稀释及过滤灭菌等进行了预处理的生物试样。这些预处理按照常规方法适当进行即可。以下，有时将来源于所述被测试者的生物试样简记为“生物试样”。
作为从所述生物试样分离细胞外囊泡的方法，按照常规方法进行即可，并无特别限定。作为从所述生物试样分离细胞外囊泡的方法，例如可举出亲和法(例如，PS亲和法)、分级离心分离法(例如，颗粒沉淀(pellet down)法、蔗糖梯度法、密度梯度离心法等超离心法)、免疫沉淀法、色谱法(例如，离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法)、密度梯度法(例如，蔗糖密度梯度法)、电泳法(例如，细胞器电泳法)、磁分离法(例如，磁激活细胞分选(MACS)法)、超滤浓缩法(例如，纳米膜超滤浓缩法)、Percoll梯度分离法、使用了微流体装置的方法及PEG沉淀法等，从获得高纯度的细胞外囊泡的观点出发，优选为亲和法，或从能够进行理论上没有偏差的回收的观点考虑，优选为分级离心分离法，更优选为亲和法或超离心法，尤其优选为亲和法。亲和法中，优选为对磷脂酰丝氨酸的亲和提纯即PS亲和法。亲和法及分级离心分离法例如遵照WO2016/088689中所记载的方法进行即可。
这些分离方法可以仅使用一种，也可以组合使用两种以上。并且，也可以重复2次以上基于一种分离方法的分离。
作为所述被测试者，并无特别限定，例如可举出根据诊断基准诊断为阿尔茨海默型痴呆症的人或诊断为轻度认知障碍的人、或者根据诊断基准诊断为存在出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险的人或存在出现轻度认知障碍的症状的风险的人、尚未接受阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的人、根据诊断基准未诊断为阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的人、或者根据诊断基准未诊断为存在出现阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的症状的风险的人，优选为根据诊断基准诊断为阿尔茨海默型痴呆症的人或诊断为轻度认知障碍的人、或者根据诊断基准而存在出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险的人或诊断为存在出现轻度认知障碍的症状的风险的人、尚未接受阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的人。
作为所述诊断基准，例如可举出根据问诊、淀粉样蛋白PET诊断等使用了摄像装置的检查、MMSE检查、脑脊髓液中的Aβ42的减少、Tau或磷酸化Tau的上升等与痴呆症疾病治疗指南中推荐的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的生物标志物等相关的检查、与阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的生物标志物的候选物质相关的检查等的结果，诊断为阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍时所使用的诊断基准等。
1.阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助
本发明中的第1发明涉及一种辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法、生物标志物、试剂盒及装置。
在本发明中的第1发明中包含如下情况：使用包含具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的生物标志物，以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症(以下，有时简记为“第1发明-1”)；组合使用包含具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的生物标志物，以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症(以下，有时简记为“第1发明-2”)；组合使用包含具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、β淀粉样蛋白(1-40)以及β淀粉样蛋白(1-42)的生物标志物，以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例乘以所述β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于所述β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))的值为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症(以下，有时简记为“第1发明-3”)。
1-1.第1发明-1
＜阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物＞
第1发明-1中的阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物(以下，有时简记为“AD标志物”)包含具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡。
AD标志物中的细胞外囊泡与所述的内容相同，优选内容也相同。
AD标志物中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡在膜表面具有CD9、CD63、CD81、CD151等中的至少一个四次穿膜蛋白及磷脂即磷脂酰丝氨酸，优选具有选自CD9、CD63及CD81中的至少一个四次穿膜蛋白以及磷脂酰丝氨酸，更优选具有选自CD9及CD63中的至少一个四次穿膜蛋白以及磷脂酰丝氨酸，尤其优选具有CD9及磷脂酰丝氨酸。
＜辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法＞
第1发明-1中的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法(以下有时简记为“AD诊断辅助方法”)包括如下步骤：测定生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；以该生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
AD诊断辅助方法中的生物试样、被测试者及细胞外囊泡分别与所述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡与在AD标志物中前述的内容相同，优选内容也相同。
作为AD诊断辅助方法中的“量”，可举出质量或浓度。并且，所述“量”中还包含与质量或浓度具有相关关系的实测值(例如，吸光度、吸光度变化量、透射光、透射光变化量、荧光强度、荧光强度变化量、发光量、发光量变化量、浊度、浊度变化率、散射光、散射光变化率、反射率、反射率变化量、折射率、折射率变化量等)。
AD诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定中，可以仅将具有一种四次穿膜蛋白及磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的量(例如，仅将具有CD9及磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡)设为测定对象，也可以将具有两种以上四次穿膜蛋白及磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的量(例如，具有CD9及磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡以及具有CD63及磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡)设为测定对象，优选仅将具有一种四次穿膜蛋白及磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的量设为测定对象。
AD诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定只要是通常在该领域中进行的方法，则并无特别限定。该测定例如只要使用使用了对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的免疫学测定方法、质量分析法及组合它们的方法等即可，其中优选为免疫学测定方法。另外，该免疫学测定方法中除了利用免疫反应(抗原抗体反应)的方法以外，例如还包括利用除抗原抗体反应以外的两个分子之间的结合力的方法(遵照免疫学测定方法的方法)。
作为对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质，只要是对四次穿膜蛋白特异性结合的物质即可，例如可举出对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体、对四次穿膜蛋白所具有的糖链特异性结合的外源凝集素等对四次穿膜蛋白特异性结合的蛋白质及对四次穿膜蛋白特异性结合的核酸等，优选为对四次穿膜蛋白特异性结合的蛋白质，更优选为对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体。作为对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体，例如可举出抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体及抗CD151抗体等，优选为抗CD9抗体、抗CD63抗体及抗CD81抗体，更优选为抗CD9抗体及抗CD63抗体，尤其优选为抗CD9抗体。对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质可以仅使用一种，也可以使用两种以上，优选仅使用一种。
作为对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质，只要是对磷脂酰丝氨酸特异性结合的物质即可，例如可举出对磷脂酰丝氨酸特异性结合的蛋白质及对磷脂酰丝氨酸特异性结合的核酸等，优选为对磷脂酰丝氨酸特异性结合的蛋白质。作为对磷脂酰丝氨酸特异性结合的蛋白质，例如可举出对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或磷脂酰丝氨酸亲和性蛋白质，优选为磷脂酰丝氨酸亲和性蛋白质。作为对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体，例如可举出抗磷脂酰丝氨酸抗体1H6(Merck KGaA)等。作为磷脂酰丝氨酸亲和性蛋白质，例如可举出Tim1(含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白结构域的分子1，T-cell immunoglobulin-mucin-domain1)、Tim2(含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白结构域的分子2，T-cell immunoglobulin-mucin-domain 2)、Tim3(含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白结构域的分子3，T-cellimmunoglobulin-mucin-domain 3)、Tim4(含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白结构域的分子4，T-cell immunoglobulin-mucin-domain 4)等Tim蛋白质；Annexin V；MFG-E8等，优选为Tim蛋白质及抗磷脂酰丝氨酸抗体，更优选为Tim蛋白质。并且，作为Tim蛋白质，优选为Tim1及Tim4，更优选为Tim4。
对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以仅使用一种，也可以使用两种以上，优选仅使用一种。
对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以是市售品，也可以通过常规方法适当制备。并且，对所述四次穿膜蛋白特异性结合的抗体或对所述磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体可以是多克隆抗体及单克隆抗体中的任一个，也可以将它们单独使用或将它们适当组合使用。并且，对所述四次穿膜蛋白特异性结合的抗体或对所述磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体不仅可以使用免疫球蛋白分子其本身(intact immunoglobulin：完整免疫球蛋白)，也可以使用其片段且具有向抗原的结合能的片段即Fab、F(ab’)2、F(ab’)等片段抗体或单链抗体(single chain Fv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体等合成抗体等。并且，当制备这些抗体时，例如按照“免疫测定法”(生物化学测定研究会编辑，KODANSHA LTD.，2014)等中所记载的方法进行即可。
对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以以标记物质来标记。作为该标记物质，例如可举出过氧化物酶、微过氧化物酶、碱性磷酸酶等酵素类；99mTc、131I、125I、14C、3H、32P、35S等放射性同位素；荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、4-甲基伞形酮、HiLyte、Alexa、CyDye或若丹明，或者它们的衍生物等荧光物质；荧虫光素、鲁米诺、钌络合物等发光性物质；苯酚、萘酚或蒽，或者它们衍生物等在紫外部具有吸收的物质；4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基等以具有氧基的化合物为代表的具有作为自旋标签化剂的性质的物质；金胶体、量子点等纳米粒子等，优选为酵素类及荧光物质。以该标记物质来标记对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的方法并无特别限制，按照本身公知的标记方法进行即可。这些标记物质的测定按照与标记物质相对应的本身公知的测定方法进行即可。
对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以将它们或其中任一个设为一级亲和性物质而进一步使用对该一级亲和性物质特异性结合的二级亲和性物质(例如，二级抗体)。该二级亲和性物质可以以标记物质来标记，优选为已标记的二级亲和性物质，更优选为以标记物质来标记的二级抗体。并且，该标记物质或标记方法与所述的内容相同，优选内容也相同。
并且，基于标记物质的标记可以使用使抗生物素蛋白类及生物素类中的一个与对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质结合的物质以及使抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个与标记物质结合的物质而利用抗生物素蛋白类与生物素类的结合。作为生物素类，可举出生物素、亚氨生物素、脱硫生物素、生物胞素及生物素亚砜等，优选为生物素。作为抗生物素蛋白类，可举出抗生物素蛋白、Tamavidin、Tamavidin2及链霉抗生物素蛋白等，优选为链霉抗生物素蛋白。使抗生物素蛋白类及生物素类中的一个与对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质结合的方法、使抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个与标记物质结合的方法按照常规方法进行即可。
对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以固定化为固相，优选对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质固定化为固相。
作为所述固相，例如可举出胶乳、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚氯碳酸酯、硅酮树脂、硅橡胶等合成高分子化合物；例如可举出多孔玻璃、磨砂玻璃、陶瓷、氧化铝、硅胶、活性炭、金属氧化物等无机物质等。并且，可以组合使用它们当中的两种以上。
所述固相的形状并无特别限定，例如可举出微孔板(ELISA板)、珠子、软管(微型管)、粒子、多个软管一体成型的专用托盘、盘状片及试验管等。
作为将对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质固定化为所述固相的方法，只要是通常在该领域中使用的方法，则并无特别限定，按照常规方法进行即可。
在AD诊断辅助方法中，对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的组合并无特别限定，但优选为对所述四次穿膜蛋白特异性结合的蛋白质与对所述磷脂酰丝氨酸特异性结合的蛋白质的组合，更优选为对所述四次穿膜蛋白特异性结合的抗体与对所述磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或所述磷脂酰丝氨酸亲和性蛋白质的组合。
作为对该四次穿膜蛋白特异性结合的抗体与对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或磷脂酰丝氨酸亲和性蛋白质的组合，例如可举出对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体与对Tim蛋白质或磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体的组合，优选为抗CD9抗体、抗CD63抗体或抗CD81抗体与Tim蛋白质的组合，更优选为抗CD9抗体或抗CD63抗体与Tim蛋白质的组合，进一步优选为抗CD9抗体或抗CD63抗体与Tim1或Tim4的组合，尤其优选为抗CD9抗体或抗CD63抗体与Tim4的组合，最优选为抗CD9抗体与Tim4的组合。
具体而言，具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定例如可举出酶联免疫吸附测定法(ELISA法)、酶免疫测定法(EIA法)、放射免疫测定法(RIA法)、荧光酶免疫法(FEIA法)、荧光免疫测定法(FIA法)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA法)、化学发光免疫测定法(CLIA法)、电化学发光免疫测定法(ECLIA法)、免疫层析法(ICA法)、Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay(发光氧通道免疫测定)(LOCI法)、Liquid-phase Binding Assay-ElectroKinetic Analyte Transport Assay(液相结合分析-电驱动转运分析)(LBA-EATA法)、外源凝集素电泳法等毛细管电泳法、免疫印迹法、胶乳免疫散射比浊法等免疫散射比浊法(NIA法)、胶乳免疫透射比浊法等免疫透射比浊法(TIA法)、微粒计数免疫凝集测定法(PCIA法)等免疫凝集法、表面等离子共振法(SPR法)等本身公知的免疫学测定法或质量分析法，优选为酶联免疫吸附测定法(ELISA法)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA法)、化学发光免疫测定法(CLIA法)、电化学发光免疫测定法(ECLIA法)及毛细管电泳法，更优选为酶联免疫吸附测定法(ELISA法)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA法)及LBA-EATA法，尤其优选为酶联免疫吸附测定法(ELISA法)。
具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定原理并无特别限定，例如可举出夹心法及竞争法等，优选为夹心法。并且，作为该测定原理，可以使用均质法及异质法等，优选为异质法。
作为遵照所述免疫学测定法的方法，例如可举出使用除对所述四次穿膜蛋白特异性结合的抗体或对所述磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体以外的对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质或对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质而进行所述免疫学测定法的方法等，优选方法也可举出相同的方法。
具体而言，具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定遵照WO2016/088689中所记载的方法进行即可，该公报中的所有记载编入于本说明书中。
具体而言，AD诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定例如可举出包括如下工序的方法作为优选方法：(1)使生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质以及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质接触，而形成包含生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的复合体的工序(以下，有时简记为“复合体形成工序”)；及(2)测定该复合体的量的工序(以下，有时简记为“复合体量测定工序”)。
对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质、对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质及其组合等的具体例、优选例与所述的内容相同。
复合体形成工序中的使对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质、对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质及生物试样接触的顺序并无特别限定，但优选使生物试样与对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质接触之后使对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质接触。
即，复合体形成工序优选包括：第1顺序，使生物试样与对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质接触，而形成由生物试样中的细胞外囊泡及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质构成的第1复合体；及第2顺序，使该第1复合体与对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质接触，而形成由该第1复合体及对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质构成的第2复合体。
具体而言，复合体形成工序例如使固定化为固相的对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质(优选为Tim1或Tim4，更优选为Tim4)与生物试样接触，而形成对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质与生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的第1复合体，使该第1复合体与对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体的第2复合体。
优选在形成复合体之后，至少在复合体量测定工序之前进行清洗操作(B/F分离)。
具体而言，例如，在上述方法中，在形成第1复合体之后和/或形成第2复合体之后进行清洗操作即可，优选在形成第1复合体之后进行清洗操作(B/F分离)，进而在形成第2复合体之后进行清洗操作(B/F分离)。
复合体量测定工序为测定在复合体形成工序中获得的包含具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的复合体的量的工序，只要是能够测定该复合体的量的方法，则可以是任意方法。
更具体而言，复合体量测定工序例如使用(1)以标记物质来标记的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体，或使用(2)对“对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体”特异性结合的以标记物质来标记的标记二级抗体，或使用(3)结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体及结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个的标记物质等，而检测在前述的复合体形成工序中获得的包含固定化为固相的对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质(优选为Tim1或Tim4，更优选为Tim4)、生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体以及标记物质(优选为酵素类及荧光物质)的复合体中的标记物质即可。
在复合体量测定工序中，优选在检测标记物质之前进行清洗操作(B/F分离)。
更具体而言，AD诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定例如使固定化为固相板的对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质(优选为Tim1或Tim4，更优选为Tim4)与生物试样接触，而形成对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质与生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的第1复合体，根据需要，在B/F分离之后，(1)使该第1复合体与以标记物质来标记的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与以标记物质来标记的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体的第2复合体，(2)使所述第1复合体与对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体的第2复合体，根据需要，在B/F分离之后，使该第2复合体与对“对该四次穿膜蛋白特异性结合的抗体”特异性结合的以标记物质来标记的标记二级抗体接触，而形成该第2复合体与该标记二级抗体的第3复合体，或者(3)使所述第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体的第2复合体，根据需要，在B/F分离之后，使该第2复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个的标记物质(优选为酵素类及荧光物质)的第3复合体，在B/F分离之后，检测所获得的第2复合体或第3复合体的标记物质即可。
生物试样的量或生物试样中的蛋白质的量(浓度)、生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(浓度)或粒子数量、与它们反应的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的量(浓度)、标记物质或标记方法等根据生物试样的种类、所要求的测定灵敏度、所使用的测定方法或测定装置等适当设定即可。
并且，生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(浓度)等可以通过使用标准品制作校准曲线来计算。作为该标准品，例如可举出具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡等。
AD诊断辅助方法中的阿尔茨海默型痴呆症的判定包含以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定阿尔茨海默型痴呆症。
作为该阿尔茨海默型痴呆症的判定，例如可举出被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性是否高的判定、有无被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性的判定、被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险是否高的判定、有无被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险的判定，优选为被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性是否高的判定、有无被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性的判定。
AD诊断辅助方法中的阿尔茨海默型痴呆症的判定例如通过将通过前述的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定获得的来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量与预先设定的基准值(截止值)进行比较来进行。
具体而言，当具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为预先设定的基准值以下时，能够判定为被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性高或存在被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性、或者被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险高或存在被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险。
并且，当具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量大于预先设定的基准值时，能够判定为受检者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性低或不存在受检者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性、或者被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险低或不存在被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险。
所述预先设定的基准值(截止值)是为了区别阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者而预先设定的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量。
所述预先设定的基准值的确定方法并无特别限定，例如测定从罹患阿尔茨海默型痴呆症的患者及健康者获取的生物试样中所包含的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，使用所获得的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，并通过ROC分析(Receiver Operating Characteristic analysis：受试者工作特征)等统计分析，能够设定基准值。在所述预先设定的基准值的设定中，优选考虑灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值等。所述预先设定的基准值例如能够设定为灵敏度达到60％以上，优选达到70％以上，更优选达到80％以上，进一步优选到达90％以上，例如能够设定为特异度达到60％以上，优选达到70％以上，更优选达到80％以上，进一步优选达到90％以上。
＜阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用试剂盒＞
第1发明-1中的阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用试剂盒(以下，有时简记为“AD诊断辅助用试剂盒”)包含对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质。
AD诊断辅助用试剂盒中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质分别与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
对该四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对该磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质分别可以是溶液状态，也可以是冷冻状态或干燥状态，还可以是冷冻干燥状态。并且，对该四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对该磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以作为一个试剂包含于试剂盒，也可以作为单独的试剂包含于试剂盒。
AD诊断辅助用试剂盒中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质与对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的组合可举出与在AD诊断辅助方法中前述的组合相同的组合，优选组合也相同。
AD诊断辅助用试剂盒中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以固定化为固相，并且也可以以标记物质来标记。作为该固相或向固相的固定化方法、该标记物质或标记方法，与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用试剂盒还可以包含与对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质特异性结合的二级亲和性物质(例如，二级抗体)。AD诊断辅助用试剂盒中的该二级亲和性物质与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。并且，AD诊断辅助用试剂盒中的二级亲和性物质可以以标记物质来标记，该标记物质或标记方法与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用试剂盒中的对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个，作为该抗生物素蛋白类及生物素类，与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用试剂盒还可以包含结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的标记物质，作为该标记物质或标记方法，与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用试剂盒中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的浓度(量)根据测定方法，在通常在该领域中使用的范围内适当设定即可。对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质例如作为使用时的浓度，当固定化为固相时，通常包含成为10～20000ng/mL的量，优选包含成为100～10000ng/mL的量，当用于检测时，通常包含成为10～5000ng/mL的量，优选包含成为100～500ng/mL的量。并且，对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质例如作为使用时的浓度，当固定化为固相时，通常包含成为10～20000ng/mL的量，优选包含成为100～10000ng/mL的量，当用于检测时，通常包含成为10～5000ng/mL的量，优选包含成为100～500ng/mL的量。
并且，可以使通常在该领域中使用的试剂类例如缓冲剂、反应促进剂、糖类、蛋白质、盐类、表面活性剂等稳定化剂、防腐剂等与对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质共存。它们的浓度及pH也从通常在该领域中使用的范围适当选择即可。
而且，AD诊断辅助用试剂盒除了对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质以外，还可以具备使用了这些亲和性物质的为了测定具有四次穿膜蛋白及磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的量而所需的试剂。作为这种试剂，例如可举出清洗剂、试样稀释液(用于稀释试样的试剂)、用于检测标记物质的试剂、用于使标记物质与这些亲和性物质结合的试剂、用于将这些亲和性物质固定化为固相的试剂、用于使抗生物素蛋白类或生物素类与这些亲和性物质或标记物质结合的试剂等。这些试剂的浓度及pH等也从通常在该领域中使用的范围适当选择即可。
AD诊断辅助用试剂盒可以包含为了关于具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡制作校准曲线而使用的标准品。作为该标准品，例如可举出具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡。该标准品可以是溶液状态，也可以是冷冻状态或干燥状态，还可以是冷冻干燥状态。并且，可以使通常在该领域中使用的试剂类例如缓冲剂、反应促进剂、糖类、蛋白质、盐类、表面活性剂等稳定化剂、防腐剂等与该标准品共存。它们的浓度及pH也从通常在该领域中使用的范围适当选择即可。
在AD诊断辅助用试剂盒中可以包含附件或使用说明书。作为该附件或使用说明书，例如可举出记载有测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的内容和/或以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症的内容的附件或使用说明书等。这些附件或使用说明书可以分为多个部分来记载，也可以汇整为一个部分来记载。
具体而言，AD诊断辅助用试剂盒例如可举出包含对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的任一个固定化为固相的物质、对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的剩余一个与标记物质结合的物质或该剩余一个亲和性物质及用于使其与标记物质间接地结合的成分的试剂盒。
AD诊断辅助用试剂盒可举出包含对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的任一个固定化为固相的物质以及选自下述(1)～(3)中的任一个的试剂盒作为优选试剂盒。
(1)对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的剩余一个与标记物质结合的物质、(2)对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的剩余一个以及对该亲和性物质特异性结合的二级亲和性物质与标记物质结合的物质、(3)对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的剩余一个与抗生物素蛋白类及生物素类中的一个结合的物质以及抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个与标记物质结合的物质
作为AD诊断辅助用试剂盒的优选具体例，例如可举出包含对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体(更优选为抗CD9抗体或抗CD63抗体，尤其优选为抗CD9抗体)或Tim蛋白质(更优选为Tim4或Tim1，尤其优选为Tim4)被固定化的固相板以及选自下述(1)～(3)中的任一个的试剂盒。
(1)包含对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质中的剩余一个与标记物质结合的物质的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)；(2)包含对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质中的剩余一个的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)，以及包含对该亲和性物质特异性结合的二级亲和性物质与标记物质结合的物质的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)；(3)包含结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体(更优选为抗CD9抗体或抗CD63抗体，其优选为抗CD9抗体尤)的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)，以及包含结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个的标记物质的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)。
＜阿尔茨海默型痴呆症诊断辅助用装置＞
第1发明-1中的阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用装置(以下，有时简记为“AD诊断辅助用装置”)具有：测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；及判定部，以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
AD诊断辅助用装置中的生物试样、被测试者及细胞外囊泡分别与所述的内容相同，优选内容也相同。
构成AD诊断辅助用装置的测定部及判定部等可以配置于相同的装置内，也可以分别成为分体。
AD诊断辅助用装置中的测定部为测定导入于装置的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的部位。该测定部的大小或结构并无特别限定。作为该测定部，例如可举出ELISA法中所使用的酶标仪或使用CCD进行拍摄的成像装置、免疫印迹法或利用了微阵列(微型芯片)的方法中所使用的成像装置、质量分析法中所使用的质量分析装置、分子间相互作用分析装置及流式细胞仪中所使用的流式细胞分析仪、HPLC法或毛细管电泳法中所使用的紫外可见光检测器或荧光检测器等。
AD诊断辅助用装置中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、量、具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定方法的测定对象、具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的测定或该测定中所使用的物质与AD诊断辅助方法的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD诊断辅助用装置可以具备运算部。AD诊断辅助用装置中的运算部为将通过所述测定部获得的与生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的质量或浓度具有相关关系的实测值(例如，吸光度、吸光度变化量、透射光、透射光变化量、荧光强度、荧光强度变化量、发光量、发光量变化量、浊度、浊度变化率、散射光、散射光变化率、反射率、反射率变化量、折射率、折射率变化量等)换算为质量或浓度等的部位。
另外，该实测值、通过运算部换算的质量或浓度等可以存储于存储器或设置于硬盘等装置的存储装置等。
AD诊断辅助用装置中的判定部为以通过所述测定部或所述运算部获得的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定阿尔茨海默型痴呆症的部位。
AD诊断辅助用装置中的阿尔茨海默型痴呆症的判定或该判定中所使用的预先设定的基准值、预先设定的基准值的确定方法与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD诊断辅助用装置中的预先设定的基准值可以预先存储于AD诊断辅助用装置，也可以在进行判定时从AD诊断辅助用装置的输入部位输入。
AD诊断辅助用装置可以具备输出部。在输出部中，进行将判定结果显示于显示器等显示装置或输出至打印机等印刷装置等的处理。
1-2.第1发明-2
＜阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物组＞
第1发明-2中的阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物组(以下，有时简记为“AD标志物组”)为包含具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的生物标志物的组合。
根据AD标志物组，例如，能够求出具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例(以下有时简记为“AD标志物(II)”)，该比例能够用作用于判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症的指标。
AD标志物组中的细胞外囊泡与所述细胞外囊泡相同，优选内容也相同。
AD标志物组中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡与AD标志物的内容相同，优选内容也相同。
AD标志物组的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡在膜表面具有CD9、CD63、CD81、CD151等中的至少一个四次穿膜蛋白，优选具有选自CD9、CD63及CD81中的至少一个四次穿膜蛋白，更优选具有选自CD9及CD63中的至少一个四次穿膜蛋白，尤其优选具有CD9。
AD标志物组的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡中的四次穿膜蛋白可以与具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡中的四次穿膜蛋白相同，也可以不同，优选为相同。
＜辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法(II)＞
第1发明-2中的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法(以下，有时简记为“AD诊断辅助方法(II)”)包括如下步骤：测定生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及生物试样中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；计算具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例(AD标志物(II))；以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
AD诊断辅助方法(II)中的生物试样、被测试者及细胞外囊泡分别与前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助方法(II)中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、量、具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定对象、具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定或该测定中所使用的物质与AD诊断辅助方法的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD诊断辅助方法(II)中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡与在AD标志物组中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助方法(II)中的具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡中的四次穿膜蛋白与具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡中的四次穿膜蛋白可以相同，也可以不同，优选为相同。
AD诊断辅助方法(II)中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定可以将具有一种四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(例如，仅将具有CD9的细胞外囊泡)设为测定对象，也可以将两种以上的四次穿膜蛋白细胞外囊泡的量(例如，具有CD9的细胞外囊泡及具有CD63的细胞外囊泡)设为测定对象，优选仅将具有一种四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量设为测定对象。
具有该四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定只要是通常在该领域中使用的方法，则并无特别限定，例如可举出使用对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质的免疫学测定方法、质量分析法及组合了它们的方法，优选为使用对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质的免疫学测定方法。另外，该免疫学测定方法中除了利用免疫反应(抗原抗体反应)的方法以外，还包括利用除抗原抗体反应以外的两个分子之间的结合力的方法(遵照免疫学测定方法的方法)。
作为对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质，可举出与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同的内容，优选为对四次穿膜蛋白特异性结合的蛋白质，更优选为对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体。作为对该四次穿膜蛋白特异性结合的抗体，例如可举出抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体及抗CD151抗体等，优选为抗CD9抗体及抗CD63抗体，更优选为抗CD9抗体。对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质可以仅使用一种，也可以使用两种以上，优选仅使用一种。
对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质可以是市售品，也可以通过常规方法适当制备。并且，对所述四次穿膜蛋白特异性结合的抗体可以是多克隆抗体及单克隆抗体中的任一个，也可以将它们单独使用或将它们适当组合使用。并且，对所述四次穿膜蛋白特异性结合的抗体不仅可以使用免疫球蛋白分子其本身(intact immunoglobulin：完整免疫球蛋白)，也可以使用其片段且具有向抗原的结合能的片段即Fab、F(ab’)2、F(ab’)等片段抗体或单链抗体(single chain Fv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体等合成抗体等。并且，当制备这些抗体时，例如按照“免疫测定法”(生物化学测定研究会编辑，KODANSHA LTD.，2014)等中所记载的方法进行即可。
AD诊断辅助方法(II)中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质可以以标记物质来标记，标记物质或标记方法与AD诊断辅助方法相同，优选内容或具体例也相同。
并且，与AD诊断辅助方法同样地，可以将对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质设为一级亲和性物质，而进一步使用对该一级亲和性物质特异性结合的二级亲和性物质(例如，二级抗体)。该二级亲和性物质可以以标记物质来标记，该标记物质或标记方法与AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
而且，基于标记物质的标记可以使用使抗生物素蛋白类及生物素类中的一个与对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质结合的物质以及使抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个与标记物质结合的物质来利用抗生物素蛋白类与生物素类的结合。使抗生物素蛋白类或生物素类与该抗生物素蛋白类或该生物素类及对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质结合的方法与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD诊断辅助方法(II)中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质可以固定化为固相，该固相或将对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质固定化为固相的方法与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD诊断辅助方法(II)中的为了测定具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡而使用的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和为了测定具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡而使用的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质可以使用对至少一个相同的四次穿膜蛋白具有亲和性的物质(例如，两者的测定中使用至少对CD9具有亲和性的物质)，也可以使用对不同种类的四次穿膜蛋白具有亲和性的物质(例如，一个测定中使用对CD9具有亲和性的物质，剩余一个测定中使用对CD63具有亲和性的物质)，优选使用对至少一个相同的四次穿膜蛋白具有亲和性的物质，更优选仅使用对相同的四次穿膜蛋白具有亲和性的物质(例如，两者的测定中仅使用对CD9具有亲和性的物质)，尤其优选仅使用一种对相同的四次穿膜蛋白具有亲和性的物质(例如，两者的测定中仅使用抗CD9抗体)。
AD诊断辅助方法(II)中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定及测定原理与AD诊断辅助方法的内容相同，优选内容也相同。
具体而言，AD诊断辅助方法(II)中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定例如可举出包括如下工序的方法作为优选方法：(1)使生物试样中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡与对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质接触，形成包含生物试样中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡及对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质的复合体的工序(复合体形成工序)；及(2)测定该复合体的量的工序(复合体量测定工序)。
AD诊断辅助方法(II)的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定中的复合体形成工序优选包括：第1顺序，使生物试样与对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质接触，而形成由生物试样中的细胞外囊泡及对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质构成的第1复合体；及第2顺序，使该第1复合体与对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质接触，而形成由该第1复合体及对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质构成的第2复合体。
形成该第1复合体时所使用的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质与形成该第2复合体时所使用的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质优选为相同。
具体而言，AD诊断辅助方法(II)的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定中的复合体形成工序例如使固定化为固相的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体(优选为抗CD9抗体及抗CD63抗体，更优选为抗CD9抗体)与生物试样接触，而形成对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体与生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的第1复合体，使该第1复合体与对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体(优选为抗CD9抗体及抗CD63抗体，更优选为抗CD9抗体)接触，而形成该第1复合体与对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体的第2复合体。
优选在形成复合体之后，至少在复合体量测定工序之前进行清洗操作(B/F分离)。
具体而言，例如，在上述方法中，在形成第1复合体之后和/或形成第2复合体之后进行清洗操作即可，优选在形成第1复合体之后进行清洗操作(B/F分离)，进而在形成第2复合体之后进行清洗操作(B/F分离)。
AD诊断辅助方法(II)的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定中的复合体量测定工序为测定在复合体形成工序中获得的包含具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡及对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质的复合体的量的工序，只要是能够测定该复合体的量的方法，则可以是任意方法。
更具体而言，该复合体量测定工序例如使用(1)以标记物质来标记的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体，或使用(2)对“对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体”特异性结合的以标记物质来标记的标记二级抗体，或使用(3)结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体及结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个的标记物质等，而检测在前述的复合体形成工序中获得的包含固定化为固相板的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体(优选为抗CD9抗体及抗CD63抗体，更优选为抗CD9抗体)、生物试样中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体(优选为抗CD9抗体及抗CD63抗体，更优选为抗CD9抗体)及标记物质(优选为酵素类及荧光物质)的复合体中的标记物质即可。
在复合体量测定工序中，优选在检测标记物质之前进行清洗操作(B/F分离)。
更具体而言，AD诊断辅助方法(II)中的具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定例如使固定化为固相板的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体(优选为抗CD9抗体及抗CD63抗体，更优选为抗CD9抗体)与生物试样接触，而形成对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体与生物试样中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的第1复合体，根据需要，在B/F分离之后，(1)使该第1复合体与以标记物质来标记的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体(优选为抗CD9抗体及抗CD63抗体，更优选为抗CD9抗体)接触，而形成该第1复合体与以标记物质来标记的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体的第2复合体，(2)使所述第1复合体与对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体(优选为抗CD9抗体及抗CD63抗体，更优选为抗CD9抗体)接触，而形成该第1复合体与对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体的第2复合体，根据需要，在B/F分离之后，使该第2复合体与对“对该四次穿膜蛋白特异性结合的抗体”特异性结合的以标记物质来标记的标记二级抗体接触，而形成该第2复合体与该标记二级抗体的第3复合体，或(3)使所述第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体(优选为抗CD9抗体及抗CD63抗体，更优选为抗CD9抗体)接触，而形成该第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体的第2复合体，根据需要，在B/F分离之后，形成该第2复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个的标记物质(优选为酵素类及荧光物质)的第3复合体，在B/F分离之后，检测所获得的第2复合体或第3复合体的标记物质(优选为酵素类及荧光物质)即可。
生物试样的量或生物试样中的蛋白质的量(浓度)、生物试样中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(浓度)或粒子数量、与它们反应的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质的量(浓度)、标记物质或标记方法等根据生物试样的种类、所要求的测定灵敏度、所使用的测定方法或测定装置等适当设定即可。
并且，生物试样中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(浓度)等可以通过使用标准品制作校准曲线来计算。作为该标准品，例如可举出具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡等。
具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例根据具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(A)除以具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(B)((A)/(B))来计算即可。
AD诊断辅助方法(II)中的阿尔茨海默型痴呆症的判定包含以具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(B)相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(A)的比例((A)/(B))为指标来判定阿尔茨海默型痴呆症。
作为该阿尔茨海默型痴呆症的判定，例如可举出被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性是否高的判定、有无被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性的判定、被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险是否高的判定、有无被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险的判定，优选为被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性是否高的判定、有无被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性的判定。
AD诊断辅助方法中的阿尔茨海默型痴呆症的判定例如通过如下进行：将通过前述的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定以及前述的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定获得的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(B)相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(A)的比例((A)/(B))与预先设定的基准值(截止值)进行比较。
具体而言，当具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(B)相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(A)的比例((A)/(B))为预先设定的基准值以下时，能够判定为被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性高或存在被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性、或者被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险高或存在被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险。
并且，当具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(B)相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(A)的比例((A)/(B))大于预先设定的基准值时，能够判定为受检者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性低或不存在受检者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性、或者被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险低或不存在被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险。
AD诊断辅助方法(II)中的预先设定的基准值(截止值)是为了区别阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者而预先设定的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(B)相对于生物试样中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(A)的比例((A)/(B))。
AD诊断辅助方法(II)中的预先设定的基准值的确定方法并无特别限定，例如，测定从罹患阿尔茨海默型痴呆症的患者及健康者获取的生物试样中所包含的相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(A)的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(B)，分别计算具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(B)相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(A)的比例((A)/(B))，使用所获得的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(B)相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量(A)的比例((A)/(B))，并通过ROC分析(Receiver Operating Characteristic analysis)等统计分析，能够设定基准值。在该预先设定的基准值的设定中，优选考虑灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等。所述预先设定的基准值例如能够设定为灵敏度达到60％以上，优选达到70％以上，更优选达到80％以上，进一步优选到达90％以上，例如能够设定为特异度达到60％以上，优选达到70％以上，更优选达到80％以上，进一步优选达到90％以上。
＜阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用试剂盒(II)＞
第1发明-2中的阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用试剂盒(以下，有时简记为“AD诊断辅助用试剂盒(II)”)包含对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质。
AD诊断辅助用试剂盒(II)中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质、对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质分别与AD诊断辅助方法(II)的内容相同，优选内容也相同。
对该四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对该磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质分别可以是溶液状态，也可以是冷冻状态或干燥状态，还可以是冷冻干燥状态。并且，对该四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对该磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以作为一个试剂包含于试剂盒，也可以作为单独的试剂包含于试剂盒。
AD诊断辅助用试剂盒(II)中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质与对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的组合可举出与在AD诊断辅助方法中前述的组合相同的组合，优选的组合也相同。
AD诊断辅助用试剂盒(II)中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以固定化为固相，并且也可以以标记物质来标记。该固相或向固相的固定化方法、该标记物质或标记方法与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用试剂盒(II)还可以包含与对所述四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质特异性结合的二级亲和性物质(例如，二级抗体)。AD诊断辅助用试剂盒(II)中的该二级亲和性物质与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。并且，AD诊断辅助用试剂盒(II)中的二级亲和性物质可以以标记物质来标记，该标记物质或标记方法与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用试剂盒(II)中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质和/或对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质也可以结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个，作为该抗生物素蛋白类及生物素类，与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用试剂盒(II)可以包含结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的标记物质，作为该标记物质或标记方法，分别可举出与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同的内容，优选内容也相同。
AD诊断辅助用试剂盒(II)中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的浓度(量)根据测定方法，在通常在该领域中使用的范围内适当设定即可。对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质例如作为使用时的浓度，当固定化为固相时，通常包含成为10～20000ng/mL的量，优选包含成为100～10000ng/mL的量，当用于检测时，通常包含成为10～5000ng/mL的量，优选包含成为100～500ng/mL的量。并且，对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质例如作为使用时的浓度，当固定化为固相时，通常包含成为10～20000ng/mL的量，优选包含成为100～10000ng/mL的量，当用于检测时，通常包含成为10～5000ng/mL的量，优选包含成为100～500ng/mL的量。
并且，AD诊断辅助用试剂盒(II)中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以与通常在该领域中使用的试剂类共存，作为该试剂，与AD诊断辅助用试剂盒相同。
而且，AD诊断辅助用试剂盒(II)除了对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质以外，还可以具备使用了这些亲和性物质的为了测定具有四次穿膜蛋白及磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的量和/或具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的量而所需的试剂。作为这种试剂，与AD诊断辅助用试剂盒的内容相同。
AD诊断辅助用试剂盒(II)可以包含为了关于具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡制作校准曲线而使用的标准品，作为该标准品，与AD诊断辅助用试剂盒相同。
并且，AD诊断辅助用试剂盒(II)可以包含为了关于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡制作校准曲线而使用的标准品，作为该标准品，可举出具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡。该标准品可以是溶液状态，也可以是冷冻状态或干燥状态，还可以是冷冻干燥状态。并且，可以使通常在该领域中使用的试剂类例如缓冲剂、反应促进剂、糖类、蛋白质、盐类、表面活性剂等稳定化剂、防腐剂等与该标准品共存。它们的浓度及pH也从通常在该领域中使用的范围适当选择即可。
在AD诊断辅助用试剂盒(II)中可以包含附件或使用说明书。作为该附件或使用说明书，例如可举出记载有测定来源于被测试者的生物试样中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的内容和/或以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症的内容的附件或使用说明书等。这些附件或使用说明书可以分为多个部分来记载，也可以汇整为一个部分来记载。
具体而言，AD诊断辅助用试剂盒(II)例如可举出包含下述(A)及(B)的试剂盒。
(A)对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的任一个固定化为固相的物质、对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的剩余一个与标记物质结合的物质，或该剩余一个亲和性物质及使其与标记物质间接地结合的成分
(B)对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质固定化为固相的物质、对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质与标记物质结合的物质，或该亲和性物质及使其与标记物质间接地结合的成分
AD诊断辅助用试剂盒(II)例如可优选举出包含下述(C)及(D)的试剂盒。
(C)对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的任一个固定化为固相的物质及选自下述(1)～(3)中的任一个
(1)对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的剩余一个与标记物质结合的物质、(2)对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的剩余一个以及对该亲和性物质特异性结合的二级亲和性物质与标记物质结合的物质、(3)对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质中的剩余一个与抗生物素蛋白类及生物素类中的一个结合的物质以及抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个与标记物质结合的物质
(D)对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质固定化为固相的物质及选自下述(4)～(6)中的任一个
(4)对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质与标记物质结合的物质、(5)与对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质特异性结合的二级亲和性物质与标记物质结合的物质、(6)选自对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质与抗生物素蛋白类及生物素类中的一个结合的物质以及抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个与标记物质结合的物质中的任一个
作为AD诊断辅助用试剂盒(II)的优选例，例如可举出以下试剂盒。
例如，可举出包含对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质(更优选为Tim4或Tim1，尤其优选为Tim4)被固定化的固相板、四次穿膜蛋白抗体(更优选为抗CD9抗体或抗CD63抗体，尤其优选为抗CD9抗体)被固定化的固相板及选自下述(1)～(3)中的任一个的试剂盒。
(1)包含四次穿膜蛋白抗体(更优选为抗CD9抗体或抗CD63抗体，尤其优选为抗CD9抗体)与标记物质结合的物质的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)；(2)包含四次穿膜蛋白抗体(更优选为抗CD9抗体或抗CD63抗体，尤其优选为抗CD9抗体)的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)，以及包含对该四次穿膜蛋白抗体特异性结合的二级亲和性物质与标记物质结合的物质的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)；(3)包含结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对四次穿膜蛋白特异性结合的抗体(更优选为抗CD9抗体或抗CD63抗体，尤其优选为抗CD9抗体)的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)，以及包含结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个的标记物质的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)。
＜阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用装置(II)＞
第1发明-2中的阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用装置(以下，有时简记为“AD诊断辅助用装置(II)”)具有：测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；运算部，计算具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例；及判定部，以生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于所述生物试样中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
构成AD诊断辅助用装置(II)的测定部、运算部及判定部等可以配置于相同装置内，也可以分别成为分体。
AD诊断辅助用装置(II)中的所述测定部为测定导入于装置的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的部位。该测定部的大小或结构并无特别限定。
作为该测定部，例如可举出ELISA法中所使用的酶标仪或使用CCD进行拍摄的成像装置、免疫印迹法或利用了微阵列(微型芯片)的方法中所使用的成像装置、质量分析法中所使用的质量分析装置、分子间相互作用分析装置及流式细胞仪中所使用的流式细胞分析仪、HPLC法或毛细管电泳法中所使用的紫外可见光检测器或荧光检测器等。
AD诊断辅助用装置(II)中的被测试者、生物试样及细胞外囊泡分别与前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用装置(II)中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、量、具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定对象与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用装置(II)中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定或该测定中所使用的物质与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容或具体例也相同。
并且，AD诊断辅助用装置(II)中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定对象与在AD诊断辅助方法(II)中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用装置(II)中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定或该测定中所使用的物质与在AD诊断辅助方法(II)中前述的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD诊断辅助用装置(II)中的运算部为根据通过测定部获得的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，计算具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例的部位。该测定部的大小或结构并无特别限定。
AD诊断辅助用装置(II)中的运算部可以在将通过AD诊断辅助用装置中的测定部获得与生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的质量或浓度具有相关关系的实测值(例如，吸光度、吸光度变化量、透射光、透射光变化量、荧光强度、荧光强度变化量、发光量、发光量变化量、浊度、浊度变化率、散射光、散射光变化率、反射率、反射率变化量、折射率、折射率变化量等)换算为质量或浓度等之后，计算具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例。
另外，该实测值、通过运算部换算的质量或浓度等、具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例可以存储于存储器或设置于硬盘等装置的存储装置等。
AD诊断辅助用装置(II)中的判定部为以通过运算部计算出的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定阿尔茨海默型痴呆症的部位。
AD诊断辅助用装置(II)中的阿尔茨海默型痴呆症的判定或该判定中所使用的预先设定的基准值、预先设定的基准值的确定方法与在AD诊断辅助方法(II)中前述的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD诊断辅助用装置(II)中的预先设定的基准值可以预先存储于AD诊断辅助用装置(II)，也可以在进行判定时从AD诊断辅助用装置(II)的输入部位输入。
AD诊断辅助用装置(II)可以具备输出部。在输出部中，进行将所述的判定结果显示于显示器等显示装置或输出至打印机等印刷装置等的处理。
1-3.第1发明-3
＜阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物组＞
第1发明-3中的阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物组(以下，有时简记为“AD标志物组(III)”)为包含具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、β淀粉样蛋白(1-40)以及β淀粉样蛋白(1-42)的生物标志物的组合。即，AD标志物组(III)为包含AD标志物组(II)、β淀粉样蛋白(1-40)及β淀粉样蛋白(1-42)的生物标志物的组合。
根据AD标志物组(III)，例如，能够求出具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例(“AD标志物(II)”)乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(以下，有时简记为“Aβ(1-42)/Aβ(1-40)”)而得的值(以下，有时简记为“AD标志物(III)”)，AD标志物(III)能够用作用于判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症的指标。
AD标志物组(III)中的与AD标志物组(II)相关的所有记载与所述的第1发明-2中的AD标志物组(II)相同，优选内容或具体例也相同。
＜辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法(III)＞
第1发明-3中的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法(以下，有时简记为“AD诊断辅助方法(III)”)包括如下步骤：测定生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及生物试样中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；计算具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例(AD标志物(II))；β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))乘以AD标志物(II)而计算AD标志物(III)；以AD标志物(III)为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
AD诊断辅助方法(III)中的与AD标志物(II)相关的所有记载与所述的第1发明-2中的AD标志物(II)相同，优选内容或具体例也相同。
AD诊断辅助方法(III)还可以包括测定β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的步骤。
β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定只要是通常在该领域中进行的方法，则并无特别限定。β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定遵照具有所述磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定或具有所述四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定而进行即可，例如，使用使用了对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质的免疫学测定方法、质量分析方法及组合了它们的方法等即可，其中优选为免疫学测定方法。另外，该免疫学测定方法中除了利用免疫反应(抗原抗体反应)的方法以外，例如还包括利用除抗原抗体反应外的两个成分之间的结合力的方法(遵照免疫学测定方法的方法)。
作为对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质，例如可举出对β淀粉样蛋白(1-40)特异性结合的抗体，优选为对β淀粉样蛋白(1-40)的C末端区域特异性结合的抗体，具体而言可举出BA27(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)等。作为该β淀粉样蛋白(1-40)的C末端区域，例如可举出β淀粉样蛋白(1-40)的包含第40个C末端氨基酸的C末端区域等，优选为β淀粉样蛋白(1-40)的第40个C末端氨基酸及第39个氨基酸残基、β淀粉样蛋白(1-40)的第40个C末端氨基酸及第38个～第39个氨基酸残基、β淀粉样蛋白(1-40)的第40个C末端氨基酸及第37个～第39个氨基酸残基、β淀粉样蛋白(1-40)的第40个C末端氨基酸及第36个～第39个氨基酸残基。并且，对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质优选不与β淀粉样蛋白(1-42)结合。
作为对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质，例如可举出对β淀粉样蛋白(1-42)特异性结合的抗体，优选为对β淀粉样蛋白(1-42)的C末端区域特异性结合的抗体，具体而言可举出BC05(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)等。作为该β淀粉样蛋白(1-42)的C末端区域，例如可举出β淀粉样蛋白(1-42)的包含第42个C末端氨基酸的C末端区域等，优选为β淀粉样蛋白(1-42)的第42个C末端氨基酸、β淀粉样蛋白(1-42)的第42个C末端氨基酸及第41个氨基酸残基等。并且，对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质优选不与β淀粉样蛋白(1-40)结合。
β淀粉样蛋白(1-40)的量及β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定分别可以仅使用对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质，还可以与对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质组合后使用，优选组合后使用。作为该β淀粉样蛋白的N末端区域，例如可举出β淀粉样蛋白的第1个至第28个氨基酸残基，优选为第1个至第16个氨基酸残基。作为对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质，优选为对该β淀粉样蛋白的N末端区域特异性结合的抗体，具体而言，可举出BAN50(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)、BNT77(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)。
作为对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质与对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质的组合，例如可举出对β淀粉样蛋白(1-40)特异性结合的抗体或对β淀粉样蛋白(1-42)特异性结合的抗体与对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的抗体的组合，具体而言，优选为BA27或BC05与BAN50或BNT77的组合。
β淀粉样蛋白(1-40)的量的测定可以使用市售的试剂盒，例如可举出“HumanβAmyloid(1-40)ELISA Kit WakoII”(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)等。
β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定可以使用市售的试剂盒，例如可举出“HumanβAmyloid(1-42)ELISA Kit Wako,High-Sensitive”(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制)等。
对所述β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质可以是市售品，也可以通过常规方法适当制备。并且，对β淀粉样蛋白(1-40)特异性结合的抗体、对β淀粉样蛋白(1-42)特异性结合的抗体及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的抗体可以是多克隆抗体及单克隆抗体中的任一个，也可以将它们单独使用或将它们适当组合使用，不仅可以使用免疫球蛋白分子其本身(intact immunoglobulin)，还可以使用其片段且具有向抗原的结合能的片段即Fab、F(ab’)2、F(ab’)等片段抗体或单链抗体(single chain Fv)、双链抗体、三链抗体及四链抗体等合成抗体等。并且，当制备这些抗体时，例如按照“免疫测定法”(生物化学测定研究会编辑，KODANSHA LTD.，2014)等中所记载的方法进行即可。
对所述β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质可以以标记物质来标记。作为该标记物质，例如可举出过氧化物酶、微过氧化物酶、碱性磷酸酶等酵素类；99mTc、131I、125I、14C、3H、32P、35S等放射性同位素；荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、4-甲基伞形酮、HiLyte、Alexa、CyDye或若丹明，或者它们的衍生物等荧光物质；荧虫光素、鲁米诺、钌络合物等发光性物质；苯酚、萘酚或蒽，或者它们衍生物等在紫外部具有吸收的物质；4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基等以具有氧基的化合物为代表的具有作为自旋标签化剂的性质的物质；金胶体、量子点等纳米粒子等，优选为酵素类及荧光物质。以该标记物质来标记对所述β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质和/或对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质的方法并无特别限制，按照本身公知的标记方法进行即可。这些标记物质的测定按照与标记物质相对应的本身公知的测定方法进行即可。
对所述β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质和/或对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质可以固定化为固相，优选对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质固定化为固相。
作为所述固相，例如可举出胶乳、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚氯碳酸酯、硅酮树脂、硅橡胶等合成高分子化合物；例如可举出多孔玻璃、磨砂玻璃、陶瓷、氧化铝、硅胶、活性炭、金属氧化物等无机物质等。并且，可以组合使用它们当中的两种以上。
所述固相的形状并无特别限定，例如可举出微孔板(ELISA板)、珠子、软管(微型管)、粒子、多个软管一体成型的专用托盘、盘状片及试验管等。
作为将对所述β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质和/或对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质固定化为所述固相的方法，只要是通常在该领域中使用的方法，则无特别限定，按照常规方法进行即可。
具体而言，所述β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定例如可举出酶联免疫吸附测定法(ELISA法)、酶免疫测定法(EIA法)、放射免疫测定法(RIA法)、荧光酶免疫法(FEIA法)、荧光免疫测定法(FIA法)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA法)、化学发光免疫测定法(CLIA法)、电化学发光免疫测定法(ECLIA法)、免疫层析法(ICA法)、Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay(发光氧通道免疫测定)(LOCI法)、Liquid-phase Binding Assay-ElectroKinetic Analyte Transport Assay(液相结合分析-电驱动转运分析)(LBA-EATA法)、外源凝集素电泳法等毛细管电泳法、免疫印迹法、胶乳免疫散射比浊法等免疫散射比浊法(NIA法)、胶乳免疫透射比浊法等免疫透射比浊法(TIA法)、微粒计数免疫凝集测定法(PCIA法)等免疫凝集法、表面等离子共振法(SPR法)等本身公知的免疫学测定法或质量分析法，优选为酶联免疫吸附测定法(ELISA法)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA法)、化学发光免疫测定法(CLIA法)、电化学发光免疫测定法(ECLIA法)及毛细管电泳法，更优选为酶联免疫吸附测定法(ELISA法)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA法)及LBA-EATA法，尤其优选为酶联免疫吸附测定法(ELISA法)。
所述β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定原理并无特别限定，例如可举出夹心法及竞争法等，优选为夹心法。并且，作为该测定原理，可以使用均质法及异质法等，优选为异质法。
作为遵照所述免疫学测定法的方法，例如可举出使用除对所述β淀粉样蛋白(1-40)特异性结合的抗体以外的对所述β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、除对β淀粉样蛋白(1-42)特异性结合的抗体以外的对所述β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质和/或除对β淀粉样蛋白的N末端区域特异性结合的抗体以外的对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质来进行所述免疫学测定法的方法等，优选方法也可举出相同的方法。
具体而言，所述β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定例如可举出包括如下工序的方法作为优选方法：(1)形成生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)和/或β淀粉样蛋白(1-42)与对所述β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质的复合体的工序(或者，形成生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)或β淀粉样蛋白(1-42)、对所述β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质以及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质的复合体的工序)；及(2)测定在(1)中形成的复合体的量的工序。
具体而言，AD诊断辅助方法(III)中的β淀粉样蛋白(1-40)的量或β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定例如可举出包括如下工序的方法作为优选方法：(1)使生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)或β淀粉样蛋白(1-42)、对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质接触，形成包含对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质、生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)或β淀粉样蛋白(1-42)及对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质的复合体的工序(复合体形成工序)；及(2)测定该复合体的量的工序(复合体量测定工序)。
AD诊断辅助方法(III)的β淀粉样蛋白(1-40)的量或β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定中的复合体形成工序优选包括：第1顺序，使生物试样与对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质接触，而形成由β淀粉样蛋白(1-40)或β淀粉样蛋白(1-42)及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质构成的第1复合体；及第2顺序，使该第1复合体与对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质接触，而形成由该第1复合体及对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质构成的第2复合体。
具体而言，AD诊断辅助方法(III)的β淀粉样蛋白(1-40)的量或β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定中的复合体形成工序例如使固定化为固相的对β淀粉样蛋白的N末端区域特异性结合的抗体与生物试样接触，而形成对β淀粉样蛋白的N末端区域特异性结合的抗体与生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)或β淀粉样蛋白(1-42)的第1复合体，使该第1复合体与对β淀粉样蛋白(1-40)特异性结合的抗体或对β淀粉样蛋白(1-42)特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与对β淀粉样蛋白(1-40)特异性结合的抗体或对β淀粉样蛋白(1-42)特异性结合的抗体的第2复合体。
优选在形成复合体之后，至少在复合体量测定工序之前进行清洗操作(B/F分离)。
具体而言，例如，在上述方法中，在形成第1复合体之后和/或形成第2复合体之后进行清洗操作即可，优选在形成第1复合体之后进行清洗操作(B/F分离)，进而在形成第2复合体之后进行清洗操作(B/F分离)。
AD诊断辅助方法(III)的β淀粉样蛋白(1-40)的量或β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定中的复合体量测定工序为测定在复合体形成工序中获得的包含生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)或β淀粉样蛋白(1-42)、对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质的复合体的量的工序，只要是能够测定该复合体的量的方法，则可以是任意方法。
更具体而言，该复合体量测定工序例如使用(1)以标记物质来标记的对β淀粉样蛋白(1-40)特异性结合的抗体或对β淀粉样蛋白(1-42)特异性结合的抗体，或使用(2)对“对β淀粉样蛋白(1-40)特异性结合的抗体或对β淀粉样蛋白(1-42)特异性结合的抗体”特异性结合的以标记物质来标记的标记二级抗体，或使用(3)结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的“对β淀粉样蛋白(1-40)特异性结合的抗体或对β淀粉样蛋白(1-42)特异性结合的抗体”及结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个的标记物质等，而检测在前述的复合体形成工序中获得的包含固定化为固相板的对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的抗体、生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)或β淀粉样蛋白(1-42)、对β淀粉样蛋白(1-40)特异性结合的抗体或对β淀粉样蛋白(1-42)特异性结合的抗体及标记物质(优选为酵素类及荧光物质)的复合体中的标记物质即可。
在复合体量测定工序中，优选在检测标记物质之前进行清洗操作(B/F分离)。
生物试样的量或生物试样中的蛋白质的量(浓度)、生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量(浓度)、与它们反应的对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质的量(浓度)、标记物质或标记方法等根据生物试样的种类、所要求的测定灵敏度、所使用的测定方法或测定装置等适当设定即可。
并且，生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量等可以通过使用标准品制作校准曲线来计算。作为该标准品，例如可举出β淀粉样蛋白(1-40)及β淀粉样蛋白(1-42)等。
AD诊断辅助方法(III)中的阿尔茨海默型痴呆症的判定包含以AD标志物(III)为指标来判定阿尔茨海默型痴呆症。
作为该阿尔茨海默型痴呆症的判定，例如可举出被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性是否高的判定、有无被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性的判定、被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险是否高的判定、有无被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险的判定，优选为被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性是否高的判定、有无被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性的判定。
AD诊断辅助方法(III)中的阿尔茨海默型痴呆症的判定例如通过将通过所述方法计算出的AD标志物(III)与预先设定的基准值(截止值)进行比较来进行。
具体而言，当AD标志物(III)为预先设定的基准值以下时，能够判定为被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性高或存在被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性、或者被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险高或存在被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险。
并且，当AD标志物(III)大于预先设定的基准值时，能够判定为受检者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性低或不存在受检者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性、或者被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险低或不存在被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险。
AD诊断辅助方法(III)中的预先设定的基准值的确定方法并无特别限定，例如，以从罹患阿尔茨海默型痴呆症的患者及健康者获取的生物试样为基础，计算AD标志物(III)，使用所获得的AD标志物(III)，并通过ROC分析(Receiver Operating Characteristicanalysis)等统计分析，能够设定基准值。在该预先设定的基准值的设定中，优选考虑灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等。所述预先设定的基准值例如能够设定为灵敏度达到60％以上，优选达到70％以上，更优选达到80％以上，进一步优选到达90％以上，例如能够设定为特异度达到60％以上，优选达到70％以上，更优选达到80％以上，进一步优选达到90％以上。
＜阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用试剂盒(III)＞
第1发明-3中的阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用试剂盒(以下，有时简记为“AD诊断辅助用试剂盒(III)”)包含对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质、对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质，根据需要，还包含对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质。
即，AD诊断辅助用试剂盒(III)为包含AD诊断辅助用试剂盒(II)、对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质且根据需要还包含对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质的试剂盒。
AD诊断辅助用试剂盒(III)中的与AD诊断辅助用试剂盒(II)相关的所有记载与所述的第1发明-2中的AD诊断辅助用试剂盒(II)相同，优选内容或具体例也相同。
AD诊断辅助用试剂盒(III)中的对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质分别与AD诊断辅助方法(III)的内容相同，优选内容也相同。
对该β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质分别可以是溶液状态，也可以是冷冻状态或干燥状态，还可以是冷冻干燥状态。并且，对该β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质可以作为一个试剂包含于试剂盒，也可以作为单独试剂包含于试剂盒。
AD诊断辅助用试剂盒(III)中的对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质的组合可举出与AD诊断辅助方法(III)中的组合相同的组合，优选组合也相同。
AD诊断辅助用试剂盒(III)中的对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质和/或对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质可以固定化为固相，并且也可以以标记物质来标记。该固相或向固相的固定化方法、该标记物质或标记方法与AD诊断辅助方法(III)中的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用试剂盒(III)中的对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质的浓度(量)根据测定方法，在通常在该领域中使用的范围内适当设定即可。对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质例如作为使用时的浓度，当固定化固相时，通常包含成为10～20000ng/mL的量，优选成为100～10000ng/mL的量，当用于检测时，通常包含成为10～5000ng/mL的量，优选成为100～500ng/mL的量。
并且，对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质例如作为使用时的浓度，当固定化固相时，通常包含成为10～20000ng/mL的量，优选成为100～10000ng/mL的量，当用于检测时，通常包含成为10～5000ng/mL的量，优选成为100～500ng/mL的量。
并且，AD诊断辅助用试剂盒(III)中的对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以与通常在该领域中使用的试剂类共存，作为该试剂，与AD诊断辅助用试剂盒相同。
而且，AD诊断辅助用试剂盒(III)除了对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质和/或对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质以外，还可以具备为了测定β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量而所需的试剂。作为这种试剂，与AD诊断辅助用试剂盒的内容相同。
AD诊断辅助用试剂盒(III)可以包含为了关于β淀粉样蛋白(1-40)和/或β淀粉样蛋白(1-42)制作校准曲线而使用的标准品，作为该标准品，例如可举出β淀粉样蛋白(1-40)及β淀粉样蛋白(1-42)等。该标准品可以是溶液状态，也可以是冷冻状态或干燥状态，还可以是冷冻干燥状态。并且，可以使通常在该领域中使用的试剂类例如缓冲剂、反应促进剂、糖类、蛋白质、盐类、表面活性剂等稳定化剂、防腐剂等与该标准品共存。它们的浓度及pH也从通常在该领域中使用的范围适当选择即可。
在AD诊断辅助用试剂盒(III)中可以包含附件或使用说明书。作为该附件或使用说明书，例如可举出记载有测定来源于被测试者的生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的内容、计算AD标志物(III)的内容及以AD标志物(III)为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症的内容的附件或使用说明书等。这些附件或使用说明书可以分为多个部分来记载，也可以汇整为一个部分来记载。
具体而言，AD诊断辅助用试剂盒(III)例如可举出包含“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的任一个固定化为固相的物质、“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的剩余一个与标记物质结合的物质，或该剩余一个亲和性物质及用于使其与标记物质间接地结合的成分的试剂盒。
AD诊断辅助用试剂盒(III)可优选举出包含“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的任一个固定化为固相的物质以及选自下述(1)～(3)中的任一个的试剂盒。
(1)“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的剩余一个与标记物质结合的物质；
(2)“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的剩余一个以及对该亲和性物质特异性结合的二级亲和性物质与标记物质结合的物质；
(3)“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的剩余一个与抗生物素蛋白类及生物素类中的一个结合的物质，以及抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个与标记物质结合的物质。
＜阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用装置(III)＞
第1发明-3中的阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用装置(以下，有时简记为“AD诊断辅助用装置(III)”)具有：测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；运算部，具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例(AD标志物(II))乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))而计算AD标志物(III)；及判定部，以AD标志物(III)为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
AD诊断辅助用装置(III)根据需要，可以具有：测定部，测定β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量；输入部，从外部输入β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量或者β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))；及运算部，用于计算β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))。
构成AD诊断辅助用装置(III)的测定部、运算部、输入部及判定部等可以配置于相同装置内，也可以分别成为分体。
AD诊断辅助用装置(III)中的所述测定部为测定导入于装置的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的部位。根据需要，所述测定部也是进一步测定导入于装置的生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的部位。
所述测定部的大小或结构并无特别限定。
作为所述测定部，例如可举出ELISA法中所使用的酶标仪或使用CCD进行拍摄的成像装置、免疫印迹法或利用了微阵列(微型芯片)的方法中所使用的成像装置、质量分析法中所使用的质量分析装置、分子间相互作用分析装置及流式细胞仪中所使用的流式细胞分析仪、HPLC法或毛细管电泳法中所使用的紫外可见光检测器或荧光检测器等。
AD诊断辅助用装置(III)中的被测试者、生物试样及细胞外囊泡分别与前述的内容相同，优选内容也相同。
AD诊断辅助用装置(III)中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、量、具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定对象、具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定或该测定中所使用的物质、具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡、具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定对象、具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定或该测定中所使用的物质与AD诊断辅助方法(II)的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD诊断辅助用装置(III)中的运算部为根据通过测定部获得的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量、具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及通过测定部获得的β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量，或者通过输入部从外部输入的β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量，或者β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))，计算具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例(AD标志物(II))乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))的AD标志物(III)的部位。
所述运算部的大小或结构并无特别限定。
AD诊断辅助用装置(III)中的运算部可以将与测定或所输入的质量或浓度具有相关关系的实测值(例如，吸光度、吸光度变化量、透射光、透射光变化量、荧光强度、荧光强度变化量、发光量、发光量变化量、浊度、浊度变化率、散射光、散射光变化率、反射率、反射率变化量、折射率、折射率变化量等)换算为质量或浓度等之后，计算AD标志物(III)。
另外，该实测值、通过运算部换算的质量或浓度等、AD标志物(II)、β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))及AD标志物(III)可以存储于存储器或设置于硬盘等装置的存储装置等。
AD诊断辅助用装置(III)中的判定部为以通过运算部计算出的AD标志物(III)为指标来判定阿尔茨海默型痴呆症的部位。
AD诊断辅助用装置(III)中的阿尔茨海默型痴呆症的判定或该判定中所使用的预先设定的基准值及预先设定的基准值的确定方法与AD诊断辅助方法(III)的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD诊断辅助用装置(III)中的预先设定的基准值可以预先存储于AD诊断辅助用装置(III)，也可以在进行判定时从AD诊断辅助用装置(III)的输入部位输入。
AD诊断辅助用装置(III)可以具备输出部。在输出部中，进行将所述的判定结果显示于显示器等显示装置或输出至打印机等印刷装置等的处理。
2.阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助
本发明中的第2发明涉及一种辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法、生物标志物、试剂盒及装置。
在本发明中的第2发明中包括如下情况：组合使用包含具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡以及具有CD9的细胞外囊泡的生物标志物，以具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍(以下，有时简记为“第2发明-1”)；
组合使用包含具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡、具有CD9的细胞外囊泡、β淀粉样蛋白(1-40)以及β淀粉样蛋白(1-42)的生物标志物，以具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例乘以所述β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于所述β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))的值为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍(以下，有时简记为“第2发明-2”)。
2-1.第2发明-1
＜阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用生物标志物组＞
第2发明-1中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用生物标志物组(以下，有时简记为“AD/MCI标志物组”)为包含具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡以及具有CD9的细胞外囊泡的生物标志物的组合。
根据AD/MCI标志物组，例如，能够求出具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例(以下有时简记为“AD/MCI标志物”)，该比例能够用作用于判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的指标。
AD/MCI标志物组中的细胞外囊泡与所述细胞外囊泡相同，优选内容也相同。
AD/MCI标志物组中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡在膜表面至少具有磷脂酰丝氨酸及CD9。
并且，AD/MCI标志物组中的具有CD9的细胞外囊泡在膜表面至少具有CD9。
＜辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法＞
第2发明-1中的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法(以下，有时简记为“AD/MCI诊断辅助方法”)包括如下步骤：测定生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡的量；计算具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例；以具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
AD/MCI诊断辅助方法中的生物试样、被测试者及细胞外囊泡分别与前述的内容相同，优选内容也相同。
AD/MCI诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡以及具有CD9的细胞外囊泡与在AD/MCI标志物组中前述的内容相同。
AD/MCI诊断辅助方法中的“量”与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，具体例也相同。
AD/MCI诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定只要是通常在该领域中进行的方法，则并无特别限定。该测定例如作为对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质使用对CD9具有亲和性的物质，而以与AD诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定相同的方式进行即可。
AD/MCI诊断辅助方法中的具有CD9的细胞外囊泡的量的测定只要是通常在该领域中进行的方法，则并无特别限定。该测定例如作为对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质使用对CD9具有亲和性的物质，而以与AD诊断辅助方法(II)中的具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的测定相同的方式进行即可。
作为AD/MCI诊断辅助方法中的对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质，与AD诊断辅助方法的内容相同，优选内容也相同。
作为AD/MCI诊断辅助方法中的对CD9具有亲和性的物质，只要是对CD9特异性结合的物质即可，例如可举出对CD9特异性结合的抗体或对与CD9结合的糖链特异性结合的外源凝集素等对CD9特异性结合的蛋白质及对CD9特异性结合的核酸，其中优选为对CD9特异性结合的蛋白质，更优选为对CD9特异性结合的抗体。对CD9特异性结合的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。对所述CD9具有亲和性的物质可以仅使用一种，也可以使用两种以上，优选仅使用一种。
AD/MCI诊断辅助方法中的与对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质及对CD9具有亲和性的物质相关的标记物质或标记方法、二级亲和性物质、抗生物素蛋白类与生物素类的结合、固相、固定化方法作为对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质使用对CD9具有亲和性的物质，而以与AD诊断辅助方法(II)相同的方式进行即可。
AD/MCI诊断辅助方法中的复合体形成工序、复合体量测定工序及清洗操作(B/F分离)将对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质作为对CD9具有亲和性的物质，而以与AD诊断辅助方法(II)相同的方式进行即可，具体例或优选例也与AD诊断辅助方法(II)相同。
具体而言，AD/MCI诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定例如使固定化为固相的对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质(优选为Tim或Tim4，更优选为Tim4)与生物试样接触，而形成对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质与生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的第1复合体，使该第1复合体与对CD9特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体、对CD9特异性结合的抗体及标记物质的第2复合体，并检测该第2复合体的标记物质(优选为酵素类及荧光物质)即可。
形成该第1复合体时所使用的对CD9具有亲和性的物质与形成该第2复合体时所使用的对CD9具有亲和性的物质优选为相同。
更具体而言，AD/MCI诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定例如使固定化为固相板的对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质(优选为Tim或Tim4，更优选为Tim4)与生物试样接触，而形成对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质与生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的第1复合体，根据需要，在B/F分离之后，(1)使该第1复合体与以标记物质来标记的对CD9特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与以标记物质来标记的对CD9特异性结合的抗体的第2复合体，(2)使所述第1复合体与对CD9特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与对CD9特异性结合的抗体的第2复合体，根据需要，在B/F分离之后，使该第2复合体与对“对该CD9特异性结合的抗体”特异性结合的以标记物质来标记的标记二级抗体接触，形成该第2复合体与该标记二级抗体的第3复合体，或者(3)使所述第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对CD9特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对CD9特异性结合的抗体的第2复合体，根据需要，在B/F分离之后，使该第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对CD9特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对CD9特异性结合的抗体的第2复合体，而形成该第2复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个的标记物质(优选为酵素类及荧光物质)的第3复合体，在B/F分离之后，检测所获得的第2复合体或第3复合体的标记物质即可。
具体而言，AD/MCI诊断辅助方法中的具有CD9的细胞外囊泡的量的测定例如使固定化为固相的对CD9特异性结合的抗体与生物试样接触，而形成对CD9特异性结合的抗体与生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡的第1复合体，使该第1复合体与对CD9特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体、对CD9特异性结合的抗体及标记物质的第2复合体，并检测该第2复合体的标记物质(优选为酵素类及荧光物质)即可。
更具体而言，AD/MCI诊断辅助方法中的具有CD9的细胞外囊泡的量的测定例如使固定化为固相板的对CD9特异性结合的抗体与生物试样接触，而形成对CD9特异性结合的抗体与生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡的第1复合体，根据需要，在B/F分离之后，(1)使该第1复合体与以标记物质来标记的对CD9特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与以标记物质来标记的对CD9特异性结合的抗体的第2复合体，(2)使所述第1复合体与对CD9特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与对CD9特异性结合的抗体的第2复合体，根据需要，在B/F分离之后，使该第2复合体与对“对该CD9特异性结合的抗体”特异性结合的以标记物质来标记的标记二级抗体接触，形成该第2复合体与该标记二级抗体的第3复合体，或者(3)使所述第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对CD9特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对CD9特异性结合的抗体的第2复合体，根据需要，在B/F分离之后，使该第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对CD9特异性结合的抗体接触，而形成该第1复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的对CD9特异性结合的抗体的第2复合体，而形成该第2复合体与结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个的标记物质(优选为酵素类及荧光物质)的第3复合体，在B/F分离之后，检测所获得的第2复合体或第3复合体的标记物质即可。
生物试样的量或生物试样中的蛋白质的量(浓度)、生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量(浓度)或粒子数量、与它们反应的对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的量(浓度)、标记物质或标记方法等根据生物试样的种类、所要求的测定灵敏度、所使用的测定方法或测定装置等适当设定即可。
具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例通过具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量(A)除以具有所述CD9的细胞外囊泡的量(B)((A)/(B))来计算即可。
AD/MCI诊断辅助方法中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定包含以具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量(B)相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量(A)的比例((A)/(B))为指标来判定阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
作为该阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定，例如可举出被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的可能性是否高的判定、有无被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的可能性的判定、被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的症状的风险是否高的判定及有无被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的症状的风险的判定，优选为被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的可能性是否高的判定、有无被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的可能性的判定。
AD/MCI诊断辅助方法中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定例如通过将具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))与预先设定的基准值(截止值)进行比较来进行。
例如，若使用为了区别健康者与阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍而预先设定的基准值(截止值，以下有时简记为“健康/AD-MCI基准值”)，则能够区别判定健康者与阿尔茨海默型痴呆症患者或轻度认知障碍患者。
即，例如，使用来源于根据诊断基准诊断为阿尔茨海默型痴呆症的被测试者的生物试样或来源于根据诊断基准诊断为存在出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险的被测试者的生物试样，将通过前述的AD/MCI诊断辅助方法中的具有CD9的细胞外囊泡的量的测定及前述的AD/MCI诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定而获得的来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))与预先设定的健康/AD-MCI基准值进行比较，由此能够区别判定健康者与阿尔茨海默型痴呆症患者。
具体而言，当具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))为预先设定的健康/AD-MCI基准值以下时，能够判定为被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性高或存在被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性、或者被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险高或存在被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险。
另一方面，当具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))大于预先设定的健康/AD-MCI基准值时，能够判定为受检者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性低或不存在受检者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性、或者被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险低或不存在被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险。
并且，例如，使用来源于根据诊断基准诊断为轻度认知障碍的被测试者的生物试样或来源于根据诊断基准诊断为存在出现轻度认知障碍的症状的风险的被测试者的生物试样，将通过前述的AD/MCI诊断辅助方法中的具有CD9的细胞外囊泡的量的测定及前述的AD/MCI诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定而获得的来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))与预先设定的健康/AD-MCI基准值进行比较，由此能够区别判定健康者与轻度认知障碍患者。
具体而言，当具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))为预先设定的健康/AD-MCI基准值以下时，能够判定为被测试者罹患轻度认知障碍的可能性高或存在被测试者罹患轻度认知障碍的可能性、或者被测试者出现轻度认知障碍的症状的风险高或存在被测试者出现轻度认知障碍的症状的风险。
另一方面，当具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))大于预先设定的健康/AD-MCI基准值时，能够判定为受检者罹患轻度认知障碍的可能性低或不存在受检者罹患轻度认知障碍的可能性，或者被测试者出现轻度认知障碍的症状的风险低或不存在被测试者出现轻度认知障碍的症状的风险。
并且，例如，使用来源于尚未接受阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的被测试者的生物试样、来源于根据诊断基准未诊断为阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的被测试者的生物试样或来源于根据诊断基准未诊断为存在出现阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的症状的风险的被测试者的生物试样，而将通过前述的AD/MCI诊断辅助方法中的具有CD9的细胞外囊泡的量的测定以及前述的AD/MCI诊断辅助方法中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定而获得的来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))与预先设定的健康/AD-MCI基准值进行比较，由此能够区别判定健康者与阿尔茨海默型痴呆症患者及轻度认知障碍患者。
具体而言，当具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))为预先设定的健康/AD-MCI基准值以下时，能够判定为被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的可能性高或存在被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的可能性、或者被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的症状的风险高或存在被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的症状的风险。
另一方面，当具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))大于预先设定的健康/AD-MCI基准值时，能够判定为受检者罹患阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的可能性低、不存在受检者罹患阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的可能性、或者被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的症状的风险低或不存在被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的症状的风险。
在AD/MCI诊断辅助方法中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定中，可以使用多个基准值(截止值)。
在AD/MCI诊断辅助方法中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定中，通过使用多个基准值(截止值)，例如通过使用健康/AD-MCI基准值及为了区别AD与MCI而预先设定的基准值(AD/MCI基准值)，不仅能够判定被测试者是健康者还是阿尔茨海默型痴呆症患者或轻度认知障碍患者，并且还能够将被测试者区别判定为健康者、阿尔茨海默型痴呆症患者或轻度认知障碍患者这三个。
作为所述阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定，可举出被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性是否高的判定、有无被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性的判定、被测试者罹患轻度认知障碍的可能性是否高的判定、有无被测试者罹患轻度认知障碍的可能性的判定、被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险是否高的判定、有无被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险的判定、被测试者出现轻度认知障碍的症状的风险是否高的判定及有无被测试者出现轻度认知障碍的症状的风险的判定，优选为被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性是否高的判定、有无被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性的判定、被测试者罹患轻度认知障碍的可能性是否高的判定及有无被测试者罹患轻度认知障碍的可能性的判定。
具体而言，当具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))为AD/MCI基准值以下时，能够判定为被测试者罹患阿尔茨海默型痴呆症的可能性高或被测试者出现阿尔茨海默型痴呆症的症状的风险高；当该比例((A)/(B))大于AD/MCI基准值且为健康/AD-MCI基准值以下时，能够判定为被测试者罹患轻度认知障碍的可能性高或被测试者出现轻度认知障碍的症状的风险高；当该比例((A)/(B))大于健康/AD-MCI基准值时，能够判定为受检者为健康者的可能性高(是阿尔茨海默型痴呆症及轻度认知障碍的可能性低)或受检者出现阿尔茨海默型痴呆症及轻度认知障碍的症状的风险低。
健康/AD-MCI基准值是为了区别阿尔茨海默型痴呆症患者和/或轻度认知障碍患者与健康者而预先设定的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))。
健康/AD-MCI基准值的确定方法只要是在该领域中使用的方法，则并无特别限定，例如，测定从阿尔茨海默型痴呆症患者和/或轻度认知障碍患者以及健康者获取的生物试样中所包含的具有CD9的细胞外囊泡的量以及具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量，根据测定结果计算具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))，使用所获得的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))，并通过ROC分析(Receiver OperatingCharacteristic analysis)等统计分析，能够设定健康/AD-MCI基准值。在健康/AD-MCI基准值的设定中，优选考虑灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值等。健康/AD-MCI基准值例如能够设定为灵敏度达到60％以上，优选达到70％以上，更优选达到80％以上，尤其优选到达90％以上，例如能够设定为特异度达到60％以上，优选达到70％以上，更优选达到80％以上，进一步优选达到90％以上。
AD/MCI基准值是为了区别阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度认知障碍患者而预先设定的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))。
AD/MCI基准值的确定方法并无特别限定，例如，测定从罹患阿尔茨海默型痴呆症的患者及罹患轻度认知障碍的患者获取的生物试样中所包含的具有CD9的细胞外囊泡的量以及具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量，根据测定结果计算来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))，使用所获得的来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))，并通过ROC分析(Receiver Operating Characteristic analysis)等统计分析，能够设定AD/MCI基准值。在AD/MCI基准值的设定中，优选考虑灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值等。AD/MCI基准值例如能够设定为灵敏度达到60％以上，优选达到70％以上，更优选达到80％以上，尤其优选到达90％以上，例如能够设定为特异度达到60％以上，优选达到70％以上，更优选达到80％以上，进一步优选达到90％以上。
＜阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用试剂盒＞
第2发明-1中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用试剂盒(以下，有时简记为“AD/MCI诊断辅助用试剂盒”)包含对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒例如作为对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质使用对CD9具有亲和性的物质，除此以外，构成为与AD诊断辅助用试剂盒(II)相同即可。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒中的对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质分别与在AD/MCI诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒中的对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质分别可以是溶液状态，也可以是冷冻状态或干燥状态，还可以是冷冻干燥状态。并且，对该CD9具有亲和性的物质及对该磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以作为一个试剂包含于试剂盒，也可以作为单独的试剂包含于试剂盒。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒中的对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以固定化为固相，并且也可以以标记物质来标记。作为该固相或向固相的固定化方法、该标记物质或标记方法，与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒还可以包含与对所述CD9具有亲和性的物质和/或对所述磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质特异性结合的二级亲和性物质。AD/MCI诊断辅助用试剂盒中的该二级亲和性物质、标记物质及标记方法分别可举出与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同内容，优选内容也相同。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒中的对CD9具有亲和性的物质和/或对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个，作为该抗生物素蛋白类及生物素类，与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒可以包含结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的标记物质，作为标记物质或标记方法，与在AD诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒中的对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的浓度(量)根据测定方法，在通常在该领域中使用的范围内适当设定即可。
对CD9具有亲和性的物质例如作为使用时的浓度，当固定化为固相时，通常包含成为10～20000ng/mL的量，优选包含成为100～10000ng/mL的量，当用于检测时，通常包含成为10～5000ng/mL的量，优选包含成为100～500ng/mL的量。并且，对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质例如作为使用时的浓度，当固定化为固相时，通常包含成为10～20000ng/mL的量，优选包含成为100～10000ng/mL的量，当用于检测时，通常包含成为10～5000ng/mL的量，优选包含成为100～500ng/mL的量。
并且，AD/MCI诊断辅助用试剂盒中的对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质可以与通常在该领域中使用的试剂类共存，作为该试剂，与在AD诊断辅助用试剂盒中前述的内容相同。
而且，AD/MCI诊断辅助用试剂盒除了对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质以外，还可以具备为了测定使用了这些亲和性物质的具有CD9及磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的量和/或具有CD9的细胞外囊泡的量而所需的试剂。作为这种试剂，与在AD诊断辅助用试剂盒(II)中前述的内容相同。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒可以包含为了关于具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡制作校准曲线而使用的标准品，作为该标准品，可举出与在AD诊断辅助用试剂盒(II)中前述的内容相同的内容。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒可以包含为了关于具有CD9的细胞外囊泡制作校准曲线而使用的标准品，作为该标准品，可举出具有CD9的细胞外囊泡，状态或可以共存的试剂类与在AD诊断辅助用试剂盒(II)中前述的内容相同。
在AD/MCI诊断辅助用试剂盒中可以包含附件或使用说明书。作为该附件或使用说明书，例如可举出记载有测定来源于被测试者的生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡的量以及具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的内容和/或以具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的内容的附件或使用说明书等。这些附件或使用说明书可以分为多个部分来记载，也可以汇整为一个部分来记载。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒的具体例作为对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质使用对CD9具有亲和性的物质，除此以外，可举出与在AD诊断辅助用试剂盒(II)中前述的内容相同的内容，优选内容也相同。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒例如优选举出包含对磷脂酰丝氨酸特异性结合的抗体或Tim蛋白质(更优选为Tim4或Tim1，尤其优选为Tim4)固定化的固相板、抗CD9抗体被固定化的固相板及选自下述(1)～(3)中的任一个的试剂盒。
(1)包含抗CD9抗体与标记物质结合的物质的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)；(2)包含抗CD9抗体的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)，以及包含对该抗CD9抗体特异性结合的二级亲和性物质与标记物质结合的物质的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)；(3)包含结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的一个的抗CD9抗体的溶液(通常为10～5000，更优选为100～500(ng/mL))，以及包含结合有抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个的标记物质的溶液(通常为10～5000ng/mL，优选为100～500ng/mL)。
＜阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用装置＞
第2发明-1中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用装置(以下，有时简记为“AD/MCI诊断辅助用装置”)具有：测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及具有CD9的细胞外囊泡的量；运算部，计算来源于所述被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于来源于所述被测试者的生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡的量的比例；及判定部，以来源于所述被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
AD/MCI诊断辅助用装置中的被测试者、生物试样及细胞外囊泡分别与所述的内容相同，优选内容也相同。AD/MCI诊断辅助用装置中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡、量及具有CD9的细胞外囊泡与在AD/MCI诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容也相同。
构成AD/MCI诊断辅助用装置的测定部、运算部及判定部等可以配置于相同装置内，也可以分别成为分体。
AD/MCI诊断辅助用装置中的所述测定部为测定导入于装置的来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及具有CD9的细胞外囊泡的量的部位。该测定部的大小或结构并无特别限定。
作为该测定部，例如可举出ELISA法中所使用的酶标仪或使用CCD进行拍摄的成像装置、免疫印迹法或利用了微阵列(微型芯片)的方法中所使用的成像装置、质量分析法中所使用的质量分析装置、分子间相互作用分析装置及流式细胞仪中所使用的流式细胞分析仪、HPLC法或毛细管电泳法中所使用的紫外可见光检测器或荧光检测器等。
AD/MCI诊断辅助用装置中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定以及具有CD9的细胞外囊泡的量的测定与在AD/MCI诊断辅助方法中前述的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD/MCI诊断辅助用装置中的运算部为计算来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于来源于被测试者的生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡的量的比例的部位。该测定部的大小或结构并无特别限定。
来源于所述被测试者的生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡的量及来源于所述被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量可以在将通过AD/MCI诊断辅助用装置中的测定部获得的与来源于被测试者的生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡及来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的质量或浓度具有相关关系的实测值(例如，吸光度、吸光度变化量、透射光、透射光变化量、荧光强度、荧光强度变化量、发光量、发光量变化量、浊度、浊度变化率、散射光、散射光变化率、反射率、反射率变化量、折射率、折射率变化量等)换算为质量或浓度等之后，计算具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例。
另外，该实测值、通过运算部换算的质量或浓度等、具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例可以存储于存储器或设置于硬盘等装置的存储装置等。
AD/MCI诊断辅助用装置中的判定部为以通过运算部获得的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的部位。
AD/MCI诊断辅助用装置中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定与AD/MCI诊断辅助方法中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定相同，优选内容或具体例也相同。
AD/MCI诊断辅助用装置中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定例如通过将通过所述运算部获得的来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例((A)/(B))与预先设定的基准值(截止值，以下有时简记为“健康/AD-MCI基准值”)进行比较来进行。该预先设定的基准值可以预先存储于AD/MCI诊断辅助用装置，也可以在进行判定时从AD/MCI诊断辅助用装置的输入部位输入。
在AD/MCI诊断辅助用装置中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定中，可以使用多个基准值(截止值)。
在AD/MCI诊断辅助用装置中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定中，使用多个基准值(截止值)时的判定也与AD/MCI诊断辅助方法中的判定相同，优选内容或具体例也相同。
AD/MCI诊断辅助用装置中的健康/AD-MCI基准值、健康/AD-MCI基准值的确定方法、AD/MCI基准值及AD/MCI基准值的确定方法也与AD/MCI诊断辅助方法中所记载的内容相同，优选内容也相同。
AD/MCI诊断辅助用装置可以具备输出部。在输出部中，进行将所述的判定结果显示于显示器等显示装置或输出至打印机等印刷装置等的处理。
2-2.第2发明-2
＜阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用生物标志物组＞
第2发明-2中的阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物组(以下，有时简记为“AD/MCI标志物组(II)”)为包含具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡、具有CD9的细胞外囊泡、β淀粉样蛋白(1-40)及β淀粉样蛋白(1-42)的生物标志物的组合。即，AD/MCI标志物组(II)为包含AD/MCI标志物组、β淀粉样蛋白(1-40)及β淀粉样蛋白(1-42)的生物标志物的组合。
根据AD/MCI标志物组(II)，例如，能够求出具有所述磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有所述CD9的细胞外囊泡的量的比例(AD/MCI标志物)乘以所述β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于所述β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(以下，有时简记为“Aβ(1-42)/Aβ(1-40)”)而得的值(以下，有时简记为“AD/MCI标志物(II)”)，AD/MCI标志物(II)能够用作用于判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的指标。
AD/MCI标志物组(II)中的与AD/MCI标志物组相关的所有记载与所述第2发明-1的AD/MCI标志物组相同，优选内容或具体例也相同。
＜辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法＞
第2发明-2中的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法(以下，有时简记为“AD/MCI诊断辅助方法(II)”)包括如下步骤：测定生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡的量；计算具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例(AD/MCI标志物)；以具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))的值(AD/MCI标志物(II))为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
AD/MCI诊断辅助方法(II)中的与AD/MCI标志物相关的所有记载与所述的第2发明-1中的AD/MCI标志物相同，优选内容或具体例也相同。
AD/MCI诊断辅助方法(II)还可以包括测定β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的步骤。
与β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定相关的所有记载与所述第1发明-3中的β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的测定相同，优选内容或具体例也相同。
AD/MCI诊断辅助方法(II)中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定包含以AD/MCI标志物(II)为指标来判定阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
作为该阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定，以AD/MCI标志物(II)为指标，遵照所述第2发明-1中的AD/MCI诊断辅助方法(以AD/MCI标志物为指标的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定)进行即可，优选内容或具体例也相同。
＜阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用试剂盒(II)＞
第2发明-2中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用试剂盒(以下，有时简记为“AD/MCI诊断辅助用试剂盒(II)”)包含对CD9具有亲和性的物质、对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质及对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质，根据需要，还包含对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质。
即，AD/MCI诊断辅助用试剂盒(II)为包含AD/MCI诊断辅助用试剂盒、对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质并且根据需要还包含对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质的试剂盒。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒(II)中的与AD/MCI诊断辅助用试剂盒相关的所有记载与所述的第2发明-1中的AD/MCI诊断辅助用试剂盒相同，优选内容或具体例也相同。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒(II)中的对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质或具有这些亲和性的物质的组合等分别与AD诊断辅助用试剂盒(III)的内容相同，优选内容也相同。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒(II)中的对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质的浓度(量)根据测定方法，在通常在该领域中使用的范围内适当设定即可。对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质例如作为使用时的浓度，当固定化固相时，通常包含成为10～20000ng/mL的量，优选成为100～10000ng/mL的量，当用于检测时，通常包含成为10～5000ng/mL的量，优选成为100～500ng/mL的量。
并且，对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质例如作为使用时的浓度，当固定化固相时，通常包含成为10～20000ng/mL的量，优选成为100～10000ng/mL的量，当用于检测时，通常包含成为10～5000ng/mL的量，优选成为100～500ng/mL的量。
而且，AD/MCI诊断辅助用试剂盒(II)除了AD/MCI诊断辅助用试剂盒、对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质、对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质和/或对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质以外，还可以具备为了测定β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量而所需的试剂。作为这种试剂，与AD诊断辅助用试剂盒的内容相同。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒(II)可以包含为了关于β淀粉样蛋白(1-40)和/或β淀粉样蛋白(1-42)制作校准曲线而使用的标准品，作为该标准品，例如可举出β淀粉样蛋白(1-40)及β淀粉样蛋白(1-42)等。该标准品可以是溶液状态，也可以是冷冻状态或干燥状态，还可以是冷冻干燥状态。并且，可以使通常在该领域中使用的试剂类例如缓冲剂、反应促进剂、糖类、蛋白质、盐类、表面活性剂等稳定化剂、防腐剂等与该标准品共存。它们的浓度及pH也从通常在该领域中使用的范围适当选择即可。
在AD/MCI诊断辅助用试剂盒(II)中可以包含附件或使用说明书。作为该附件或使用说明书，例如可举出记载有测定来源于被测试者的生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的内容、计算AD/MCI标志物(II)的内容及以AD/MCI标志物(II)为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的内容的附件或使用说明书等。这些附件或使用说明书可以分为多个部分来记载，也可以汇整为一个部分来记载。
具体而言，AD/MCI诊断辅助用试剂盒(II)例如可举出包含“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的任一个固定化为固相的物质、“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的剩余一个与标记物质结合的物质，或该剩余一个亲和性物质及用于使其与标记物质间接地结合的成分的试剂盒。
AD/MCI诊断辅助用试剂盒(II)可优选举出包含“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的任一个固定化为固相的物质以及选自下述(1)～(3)中的任一个的试剂盒。
(1)“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的剩余一个与标记物质结合的物质；
(2)“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的剩余一个以及对该亲和性物质特异性结合的二级亲和性物质与标记物质结合的物质；
(3)“对β淀粉样蛋白(1-40)具有亲和性的物质或对β淀粉样蛋白(1-42)具有亲和性的物质”及对β淀粉样蛋白的N末端区域具有亲和性的物质中的剩余一个与抗生物素蛋白类及生物素类中的一个结合的物质，以及抗生物素蛋白类及生物素类中的剩余一个与标记物质结合的物质。
＜阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用装置(II)＞
第2发明-2中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用装置(以下，有时简记为“AD/MCI诊断辅助用装置(II)”)具有：测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及具有CD9的细胞外囊泡的量；运算部，具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例(AD/MCI标志物)乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))而计算AD/MCI标志物(II)；及判定部，以AD/MCI标志物(II)为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
AD/MCI诊断辅助用装置(II)根据需要，可以具有：测定部，测定β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量；输入部，从外部输入β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量或者β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))；及运算部，用于计算β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))。
构成AD/MCI诊断辅助用装置(II)的测定部、运算部、输入部及判定部等可以配置于相同装置内，也可以分别成为分体。
AD/MCI诊断辅助用装置(II)中的所述测定部为测定导入于装置的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及具有CD9的细胞外囊泡的量的部位。根据需要，所述测定部也是进一步测定导入于装置的生物试样中的β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量的部位。
所述测定部的大小或结构并无特别限定。
作为所述测定部，例如可举出ELISA法中所使用的酶标仪或使用CCD进行拍摄的成像装置、免疫印迹法或利用了微阵列(微型芯片)的方法中所使用的成像装置、质量分析法中所使用的质量分析装置、分子间相互作用分析装置及流式细胞仪中所使用的流式细胞分析仪、HPLC法或毛细管电泳法中所使用的紫外可见光检测器或荧光检测器等。
AD/MCI诊断辅助用装置(II)中的被测试者、生物试样及细胞外囊泡分别与前述的内容相同，优选内容也相同。
AD/MCI诊断辅助用装置(II)中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡、量、具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定对象、具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定或该测定中所使用的物质、具有CD9的细胞外囊泡、具有CD9的细胞外囊泡的量的测定对象、具有CD9的细胞外囊泡的量的测定或该测定中所使用的物质与AD/MCI诊断辅助方法(II)的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD/MCI诊断辅助用装置(II)中的运算部为根据通过测定部获得的具有CD9的细胞外囊泡的量、具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及通过测定部测定的β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量或者通过输入部从外部输入的β淀粉样蛋白(1-40)的量和/或β淀粉样蛋白(1-42)的量或者β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))，计算具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于具有CD9的细胞外囊泡的量的比例(AD/MCI标志物)乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))的AD/MCI标志物(II)的部位。
所述运算部的大小或结构并无特别限定。
AD/MCI诊断辅助用装置(II)中的运算部可以将与测定或所输入的质量或浓度具有相关关系的实测值(例如，吸光度、吸光度变化量、透射光、透射光变化量、荧光强度、荧光强度变化量、发光量、发光量变化量、浊度、浊度变化率、散射光、散射光变化率、反射率、反射率变化量、折射率、折射率变化量等)换算为质量或浓度等之后，计算AD/MCI标志物(II)。
另外，该实测值、通过运算部换算的质量或浓度等、AD/MCI标志物、β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(Aβ(1-42)/Aβ(1-40))及AD/MCI标志物(II)可以存储于存储器或设置于硬盘等装置的存储装置等。
AD/MCI诊断辅助用装置(II)中的判定部为以通过运算部计算出的AD/MCI标志物(II)为指标来判定阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的部位。
AD/MCI诊断辅助用装置(II)中的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的判定或该判定中所使用的预先设定的基准值及预先设定的基准值的确定方法与AD/MCI诊断辅助用方法(II)的内容相同，优选内容或具体例也相同。
AD/MCI诊断辅助用装置(II)中的预先设定的基准值可以预先存储于AD/MCI诊断辅助用装置(II)，也可以在进行判定时从AD/MCI诊断辅助用装置(II)的输入部位输入。
AD/MCI诊断辅助用装置(II)可以具备输出部。在输出部中，进行将所述的判定结果显示于显示器等显示装置或输出至打印机等印刷装置等的处理。
根据本发明，可获得用于辅助由医生进行的与被测试者的阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍相关的诊断的数据(判定结果)。
当根据本发明被测试者被判定为阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍时，医生例如可以进一步进行问诊、淀粉样蛋白PET诊断等使用摄像装置的诊断方法、MMSE检查例如脑脊髓液中的Aβ42的减少、Tau或磷酸化Tau的上升等在痴呆症疾病治疗指南中推荐的与阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的生物标志物等相关的检查、使用了阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的生物标志物的候选物质的检查，考虑这些结果等，能够进行被测试者的与阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍相关的诊断。
并且，当根据本发明被测试者被判定为阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍时，可以使其服用抗胆碱酯酶药等延缓阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍发展的药或治疗药，或进行手术。
产业上的可利用性
本发明的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法、生物标志物、试剂盒及装置能够辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断，因此在临床检查的领域中有效。根据本发明，能够以高准确度来辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断。
实施例
以下，根据实施例及比较例对本发明进行具体说明，但本发明并不受这些例子的任何限定。
实施例1.将具有PS及CD9的外泌体的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
通过Tim蛋白质-抗CD9抗体的夹心ELISA法进行外泌体的测定，计算出AUC及p值。
(1)校准品的制备
使用MagCapture(注册商标)Exosome Isolation Kit PS(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制，以下设为“A试剂盒”)，按照附属于该试剂盒的使用说明书，从COLO201细胞培养上清液分离外泌体，使用附属于该试剂盒的溶出液，溶出了外泌体。使用蛋白质含量测定BCA试剂盒(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)，通过BCA法(二辛可宁酸法)测定了所获得的外泌体溶液中的蛋白质浓度。
接着，以通过BCA法测定的蛋白质浓度为基础，使用附属于PS Capture ExosomeELISA Kit，Streptavidin HRP(PS Capture外泌体ELISA试剂盒，链霉亲和素HRP)(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制，以下设为“B试剂盒”)的ReactionBuffer(反应缓冲液)，以分别成为0.156、0.313、0.625、1.25、2.50、5.00、10.0、20.0ng/mL的方式稀释所获得的外泌体溶液，获得了由8种浓度构成的来源于COLO201细胞培养上清液的外泌体稀释系列(以下，设为“校准品”)。
(2)测定用被检体的预处理
将从PrecisionMed公司购入的8个阿尔茨海默型痴呆症(AD)患者被检体、7个健康者被检体的脑脊髓液(CSF)分别以10,000g离心分离20分钟之后，回收了上清液。使用附属于所述A试剂盒的Reaction Buffer，将所获得的上清液分别稀释100倍，并设为“测定用被检体稀释液”。
(3)基于ELISA法的测定
通过将Tim4蛋白质固定化为固相并且将抗CD9抗体设为检测用抗体的Tim4蛋白质-抗CD9抗体的夹心ELISA法测定了在(2)中制备出的测定用被检体稀释液。具体而言，用1.6mM DTT对抗CD9小鼠单克隆抗体(1K，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)进行还原之后，在37℃下使其与Biotin-PEAC5-maleimide(DOJINDO LABORATORIES制)反应1.5个小时，制作了生物素标记抗CD9小鼠单克隆抗体。除了检测用抗体以外，使用了附属于所述B试剂盒的试剂。
首先，将附属于B试剂盒的Washing Buffer(10×)用纯净水(蒸馏水)稀释10倍之后，将附属于B试剂盒的Exosome Binding Enhancer(100×)对所获得的稀释液添加了1/100量。将所获得的溶液设为“清洗液(1×)”。接着，用清洗液(1×)300～350μL分别清洗了3次附属于B试剂盒的“Tim4蛋白质固定化为固相的96孔板”的各孔。
接着，将在(2)中制备出的测定用被检体稀释液(8个被检体n＝2，16孔)、在(2)中制备出的校准品(8种量n＝2，16孔)及作为空白培养基的附属于B试剂盒的ReactionBuffer(n＝2，2孔)各以100μL分注于板的各孔。接着，对板粘贴封板条，一边使用微孔板振荡器以约500rpm来搅拌一边在室温下反应了2个小时。反应后，丢弃反应液，用清洗液(1×)300～350μL对各孔清洗了3次。
接着，使用附属于B试剂盒的Reaction Buffer，将生物素标记抗CD9小鼠单克隆抗体稀释成终浓度成为250ng/mL，获得了生物素标记抗体反应液。将所获得的生物素标记抗体反应液各以100μL分注于各孔，粘贴封板条，一边使用微孔板振荡器以约500rpm来搅拌一边在室温下反应了1个小时。反应后，丢弃反应液，用清洗液(1×)300～350μL对各孔清洗了3次。
对附属于B试剂盒的Reaction Buffer添加1/100量的HRP-conjugatedStreptavidin(100×)，充分混合，将制备出的HRP标记链霉抗生物素蛋白反应液(1×)各以100μL分注于各孔，粘贴封板条，一边使用微孔板振荡器以约500rpm来搅拌一边在室温下反应了2个小时。反应结束后，丢弃反应液，用清洗液(1×)300～350μL对各孔清洗了5次。
接着，将恢复为室温的附属于B试剂盒的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)Solution各以100μL分注于各孔，使用微孔板振荡器搅拌约1分钟之后，粘贴封板条，在室温(20～25℃)下进行了30分钟静置反应。然后，将恢复为室温的附属于B试剂盒的Stop Solution各以100μL添加于各孔，使用微孔板振荡器搅拌约5秒钟之后，立即使用96孔酶标仪(Tecan公司，Safire2)分别测定了450nm的吸光度及副波长620nm的吸光度。将从450nm吸光度值减去副波长620nm吸光度值的值设为“吸光度值”，将从测定用被检体稀释液的吸光度值减去空白培养基的吸光度值的值设为“校正后被检体吸光度值”，而分别进行了计算。然后，根据从来源于COLO201细胞培养上清液的外泌体稀释系列(校准品)的吸光度值减去了空白培养基的吸光度值的值及校准品的蛋白质浓度制作了标准曲线。使用标准曲线，将校正后被检体吸光度值换算为蛋白质浓度，将所获得的换算值乘以被检体稀释率的值设为“被检体测定值”[ng/mL]。
(4)AUC的算出
以在(3)中获得的被检体测定值为基础，使用JMP(注册商标)11(SAS InstituteInc.,Cary,NC,USA)，并根据Wilcoxon/Kruskal-Wallis的检验(秩和)，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，并计算出p值。并且，以在(3)中获得的被检体测定值为基础，使用JMP(注册商标)11(SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA)进行逻辑回归分析，根据所获得的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算出曲线下面积值(AUC)。
将所获得的结果示于下述表1中。并且，将以被检体测定值为基础制作的箱线图示于图1中。图中，纵轴表示被检体测定值、横轴的Control表示健康者的结果，AD表示阿尔茨海默型痴呆症患者的结果。
比较例1.将具有CD9的外泌体的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
代替Tim4蛋白质，将抗CD9抗体固定化为固相，除此以外，通过与实施例1相同的方法，并通过抗CD9抗体-抗CD9抗体的夹心ELISA法测定外泌体，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
通过以下方法制备了抗CD9抗体固定为固相的板。用50mM MOPS(pH7.5)将抗CD9小鼠单克隆抗体(1K)(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制)稀释为10μg/mL的浓度，对96孔微孔板(Nunc公司)的孔添加100μL，在冷藏条件下培养了一夜。用TBST(TrisBuffered Saline，pH7.4)对孔清洗3次之后，添加300μL含有10mg/mL Block Ace的TBS(Tris Buffered Saline，pH7.4)，并将在冷藏条件下培养一夜的物质分别用作抗体固相化板。
检测抗体的抗CD9抗体使用了通过与实施例1相同的方法进行生物素标记的抗体。
将所获得的结果示于下述表1中。
实施例2.将具有PS及CD63的外泌体的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
作为检测抗体代替抗CD9抗体而使用了抗CD63抗体，除此以外，通过与实施例1相同的方法，并通过Tim蛋白质-抗CD63抗体的夹心ELISA法测定外泌体，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
检测抗体的抗CD63抗体使用了附属于PS Capture Exosome ELISA Kit,Streptavidin HRP(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制，上述“B试剂盒”)的已进行生物素标记的抗CD63抗体。
将所获得的结果示于下述表1中。
比较例2.将CD63设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
代替抗CD9抗体而将抗CD63小鼠单克隆抗体(3-13)(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation)固定化为固相，并且用作检测抗体，除此以外，通过与比较例1相同的方法，并通过抗CD63抗体-抗CD63抗体的夹心ELISA法测定外泌体，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
通过与比较例1相同的方法制备了将抗CD63抗体固定为固相的板。检测抗体的抗CD63抗体使用了附属于PS Capture Exosome ELISA Kit,Streptavidin HRP(FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation制，上述“B试剂盒”)的已进行生物素标记的抗CD63抗体。
将所获得的结果示于下述表1中。
实施例3.将具有PS及CD81的外泌体的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
作为检测抗体代替抗CD9抗体而使用了抗CD81小鼠单克隆抗体(17B1)(FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation制)，除此以外，通过与实施例1相同的方法，并通过Tim蛋白质-抗CD81抗体的夹心ELISA法测定外泌体，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
检测抗体的抗CD81抗体使用了通过与实施例1相同的方法进行生物素标记的抗体。
将所获得的结果示于下述表1中。
比较例3.将具有CD81的外泌体的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
代替抗CD9抗体而将抗CD81小鼠单克隆抗体(17B1)(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation制)固定化为固相，并且用作检测抗体，除此以外，通过与实施例1相同的方法，并通过抗CD81抗体-抗CD81抗体的夹心ELISA法测定外泌体，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
通过与比较例1相同的方法制备了将抗CD81抗体固定为固相的板。
检测抗体的抗CD81抗体使用了通过与实施例1相同的方法进行生物素标记的抗体。
将所获得的结果示于下述表1中。
实施例4.将具有PS及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的外泌体的量的比例设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
通过在实施例1(Tim蛋白质-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”(值(A))除以在比较例1(抗CD9抗体-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”(值(B))，获得了(A)/(B)(以下，设为“校正后被检体测定值”)。
根据所获得的校正后被检体测定值，通过与实施例1(4)相同的方法，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表1中。并且，将以校正后被检体测定值为基础制作出的箱线图对应于实施例6及实施例7的结果示于图2中。图中，纵轴表示校正后被检体测定值((A)/(B))，横轴的Control表示健康者的结果，MCI表示轻度认知障碍患者的结果，AD表示阿尔茨海默型痴呆症患者的结果。
实施例5.将具有PS及CD63的外泌体的量相对于具有CD63的外泌体的量的比例设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
通过(A)在实施例2(Tim蛋白质-抗CD63抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”除以(B)在比较例2(抗CD63抗体-抗CD63抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”，获得了(A)/(B)(校正后被检体测定值)。
根据所获得的校正后被检体测定值，通过与实施例1(4)相同的方法，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表1中。
[表1]
Figure BDA0003771864830000791
比较例4.将具有PS及CD9的外泌体的量设为指标的轻度认知障碍被检体的评价
代替阿尔茨海默型痴呆症(AD)患者被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的7个轻度认知障碍(MCI)患者被检体的脑脊髓液，除此以外，通过与实施例1相同的方法，并通过Tim蛋白质-抗CD9抗体的夹心ELISA法测定外泌体，进行轻度认知障碍患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表2中。
比较例5.将具有CD9的外泌体的量设为指标的轻度认知障碍被检体的评价
代替阿尔茨海默型痴呆症(AD)患者被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的7个轻度认知障碍(MCI)患者被检体的脑脊髓液，除此以外，通过与比较例1相同的方法，并通过抗CD9抗体-抗CD9抗体的夹心ELISA法测定外泌体，进行轻度认知障碍患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表2中。
实施例6.将具有PS及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的外泌体的量的比例设为指标的轻度认知障碍被检体的评价
通过在比较例4(Tim蛋白质-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”除以在比较例5(抗CD9抗体-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”，获得了(A)/(B)(校正后被检体测定值)。
根据所获得的校正后被检体测定值，通过与实施例1(4)相同的方法，进行轻度认知障碍患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表2中。并且，将以校正后被检体测定值为基础制作出的箱线图对应于实施例4及实施例7的结果示于图2中。图中，纵轴表示校正后被检体测定值((A)/(B))，横轴的Control表示健康者的结果，MCI表示轻度认知障碍患者的结果，AD表示阿尔茨海默型痴呆症患者的结果。
[表2]
Figure BDA0003771864830000801
比较例6.将具有PS及CD9的外泌体的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体及轻度认知障碍被检体的评价
代替健康者被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的7个轻度认知障碍(MCI)患者被检体的脑脊髓液，除此以外，通过与实施例1相同的方法，并通过Tim蛋白质-抗CD9抗体的夹心ELISA法测定外泌体，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度认知障碍患者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表3中。
比较例7.将具有CD9的外泌体的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体及轻度认知障碍被检体的评价
代替健康者被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的7个轻度认知障碍(MCI)患者被检体的脑脊髓液，除此以外，通过与比较例1相同的方法，并通过抗CD9抗体-抗CD9抗体的夹心ELISA法测定外泌体，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度认知障碍患者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表3中。
实施例7.将具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的外泌体的量的比例设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体及轻度认知障碍被检体的评价
通过(A)在比较例6(Tim蛋白质-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”除以(B)在比较例7(抗CD9抗体-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”，获得了(A)/(B)(校正后被检体测定值)。
根据所获得的校正后被检体测定值，通过与实施例1(4)相同的方法，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度认知障碍患者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表3中。并且，将以校正后被检体测定值为基础制作出的箱线图对应于实施例4及实施例6的结果示于图2中。图中，纵轴表示校正后被检体测定值((A)/(B))，横轴的Control表示健康者的结果，MCI表示轻度认知障碍患者的结果，AD表示阿尔茨海默型痴呆症患者的结果。
[表3]
Figure BDA0003771864830000811
由表1可知，当将来源于阿尔茨海默型痴呆症患者及健康者的CSF分别设为试样，并且以具有CD9、CD63或CD81的四次穿膜蛋白的外泌体的量为指标评价了阿尔茨海默型痴呆症时，AUC分别为0.589、0.741、0.714。并且，计算了阿尔茨海默型痴呆症的检查方法即MMSE(简易智力状态检查)与具有CD9的外泌体的量之间的相关系数R，其结果，所获得的相关系数R是小于判断为存在相关关系的0.2的0.048，也未观察到相关关系。
另一方面，当将来源于阿尔茨海默型痴呆症患者及健康者的CSF设为试样，并且以CD9、CD63或CD81的四次穿膜蛋白及Tim蛋白质结合的具有磷脂酰丝氨酸的外泌体的量为指标评价了阿尔茨海默型痴呆症时，AUC分别为0.839、0.839、0.857，可知均能够以高准确度来检测阿尔茨海默型痴呆症。并且，计算了MMSE与具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的量之间的相关系数R，其结果，所获得的相关系数R是超过了判断为存在相关关系的0.2的0.363，观察到相关关系。
并且，当以通过具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的被检体测定值(A)除以具有CD9的外泌体的被检体测定值(B)而获得的校正后被检体测定值((A)/(B))为指标评价了阿尔茨海默型痴呆症时，AUC为0.964，可知能够以极高准确度来检测阿尔茨海默型痴呆症。
而且，根据表2，当将来源于轻度认知障碍者及健康者的CSF设为试样，并且以通过具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的被检体测定值(A)除以具有CD9的外泌体的被检体测定值(B)而获得的校正后被检体测定值((A)/(B))为指标评价了轻度认知障碍时，AUC为0.857，可知能够以高准确度来检测轻度认知障碍。并且，根据表3，当将阿尔茨海默型痴呆症患者及轻度认知障碍者的CSF设为试样，并且以该校正后被检体测定值为指标评价了阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍时，AUC为0.875，可知能够以高准确度来区别检测阿尔茨海默型痴呆症与轻度认知障碍。
并且，MMSE与通过具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的被检体测定值(A)除以具有CD9的外泌体的被检体测定值(B)而获得的校正后被检体测定值((A)/(B))之间的相关系数R为0.561，观察到相关关系。
实施例8-10.将具有PS及四次穿膜蛋白的外泌体的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
代替阿尔茨海默型痴呆症患者脑脊髓液被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的18个阿尔茨海默病(AD)患者EDTA血浆被检体，并且代替健康者脑脊髓液被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的37个健康者EDTA血浆被检体，除此以外，通过与实施例1-3相同的方法，并通过下述表4中所记载的Tim蛋白质-抗四次穿膜蛋白抗体的夹心ELISA法分别测定外泌体，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表4中。并且，将以被检体测定值为基础制作的箱线图示于图3中。图中，纵轴表示被检体测定值、横轴的Control表示健康者的结果，AD表示阿尔茨海默型痴呆症患者的结果。
比较例8-10.将具有四次穿膜蛋白的外泌体的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
代替阿尔茨海默型痴呆症患者脑脊髓液被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的18个阿尔茨海默病(AD)患者EDTA血浆被检体，并且代替健康者脑脊髓液被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的37个健康者EDTA血浆被检体，除此以外，通过与比较例1-3相同的方法，并通过抗CD9抗体-抗CD9抗体的夹心ELISA法、抗CD63抗体-抗CD63抗体的夹心ELISA法及抗CD81抗体-抗CD81抗体的夹心ELISA法分别测定外泌体，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表4中。
实施例11.将具有PS及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的外泌体的量的比例设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
通过在实施例8(Tim蛋白质-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”(值(A))除以在比较例8(抗CD9抗体-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”(值(B))，获得了(A)/(B)(校正后被检体测定值)。
根据所获得的校正后被检体测定值，通过与实施例1(4)相同的方法，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表4中。并且，将以校正后被检体测定值为基础制作出的箱线图对应于实施例13及实施例14的结果示于图4中。图中，纵轴表示校正后被检体测定值((A)/(B))，横轴的Control表示健康者的结果，MCI表示轻度认知障碍患者的结果，AD表示阿尔茨海默型痴呆症患者的结果。
实施例12.将具有PS及CD63的外泌体的量相对于具有CD63的外泌体的量的比例设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体及轻度认知障碍被检体的评价
通过在实施例9(Tim蛋白质-抗CD63抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”(值(A))除以在比较例9(抗CD63抗体-抗CD63抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”(值(B))，获得了(A)/(B)(校正后被检体测定值)。
根据所获得的校正后被检体测定值，通过与实施例1(4)相同的方法，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表4中。
[表4]
Figure BDA0003771864830000841
比较例11-12.将具有PS及四次穿膜蛋白的外泌体的量设为指标的轻度认知障碍被检体的评价
代替阿尔茨海默型痴呆症(AD)患者脑脊髓液被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的18个轻度痴呆症(MCI)患者EDTA血浆被检体，并且作为健康者脑脊髓液被检体使用了从PrecisionMed公司购入的37个健康者EDTA血浆被检体，除此以外，通过与实施例1相同的方法，并通过下述表5中所记载的Tim蛋白质-抗四次穿膜蛋白抗体的夹心ELISA法测定外泌体，进行轻度痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表5中。
比较例13-14.将具有四次穿膜蛋白的外泌体的量设为指标的轻度认知障碍被检体的评价
代替阿尔茨海默型痴呆症(AD)患者脑脊髓液被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的18个轻度痴呆症(MCI)患者EDTA血浆被检体，并且作为健康者脑脊髓液被检体使用了从PrecisionMed公司购入的37个健康者EDTA血浆被检体，除此以外，通过与比较例1相同的方法，并通过下述表5中所记载的抗四次穿膜蛋白抗体-抗四次穿膜蛋白抗体的夹心ELISA法进行外泌体的测定，进行轻度痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表5中。
实施例13.将具有PS及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的外泌体的量的比例设为指标的轻度认知障碍被检体的评价
通过在比较例11(Tim蛋白质-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”(值(A))除以在比较例13(抗CD9抗体-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的“被检体测定值”(值(B))，获得了(A)/(B)(校正后被检体测定值)。
根据所获得的校正后被检体测定值，通过与实施例1(4)相同的方法，进行轻度痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表5中。并且，将以校正后被检体测定值为基础制作出的箱线图对应于实施例11及实施例14的结果示于图4中。图中，纵轴表示校正后被检体测定值((A)/(B))，横轴的Control表示健康者的结果，MCI表示轻度认知障碍患者的结果，AD表示阿尔茨海默型痴呆症患者的结果。
[表5]
Figure BDA0003771864830000851
比较例15-16.将具有PS及四次穿膜蛋白的外泌体的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体及轻度认知障碍被检体的评价
代替阿尔茨海默型痴呆症(AD)患者脑脊髓液被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的18个阿尔茨海默病(AD)患者EDTA血浆被检体，并且代替健康者被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的18个轻度认知障碍(MCI)患者EDTA血浆被检体，除此以外，通过与实施例1相同的方法，并通过Tim蛋白质-抗四次穿膜蛋白抗体的夹心ELISA法进行外泌体的测定，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度痴呆症患者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表6中。
比较例17-18.将具有四次穿膜蛋白的外泌体的量设为指标的轻度认知障碍被检体的评价
代替阿尔茨海默型痴呆症(AD)患者脑脊髓液被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的18个阿尔茨海默病(AD)患者EDTA血浆被检体，并且代替健康者被检体，使用了从PrecisionMed公司购入的18个轻度认知障碍(MCI)患者被检体的脑脊髓液，除此以外，通过与比较例1相同的方法，并通过下述表6中所记载的抗四次穿膜蛋白抗体-抗四次穿膜蛋白抗体的夹心ELISA法测定外泌体，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度痴呆症患者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表6中。
实施例14.将具有PS及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的外泌体的量的比例设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体及轻度认知障碍被检体的评价
通过在比较例15(Tim蛋白质-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的阿尔茨海默型痴呆症患者的“被检体测定值”(值(A))除以在比较例17(抗CD9抗体-抗CD9抗体的夹心ELISA法)中获得的阿尔茨海默型痴呆症患者的“被检体测定值”(值(B))，获得了(A)/(B)(校正后被检体测定值)。
根据所获得的校正后被检体测定值，通过与实施例1(4)相同的方法，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度痴呆症患者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表6中。并且，将以校正后被检体测定值为基础制作出的箱线图对应于实施例11及实施例13的结果示于图4中。图中，纵轴表示校正后被检体测定值((A)/(B))，横轴的Control表示健康者的结果，MCI表示轻度认知障碍患者的结果，AD表示阿尔茨海默型痴呆症患者的结果。
[表6]
Figure BDA0003771864830000871
由表4可知，当将来源于阿尔茨海默型痴呆症患者及健康者的血浆分别设为试样，并且以具有CD9、CD63或CD81的四次穿膜蛋白的外泌体的量为指标评价了阿尔茨海默型痴呆症时，AUC分别为0.671、0.485、0.554。并且，计算了阿尔茨海默型痴呆症的检查方法即MMSE与具有CD9的外泌体的量之间的相关系数R，其结果，所获得的相关系数R为0.206，几乎未观察到相关关系。
另一方面，当将来源于阿尔茨海默型痴呆症患者及健康者的血浆设为试样，并且以CD9、CD63或CD81的四次穿膜蛋白及Tim蛋白质结合的具有磷脂酰丝氨酸的外泌体的量为指标评价了阿尔茨海默型痴呆症时，AUC分别为0.775、0.704、0.711均超过0.7，可知能够检查阿尔茨海默型痴呆症。并且，计算了MMSE与具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的量之间的相关系数R，其结果，所获得的相关系数R是超过了判断为存在相关关系的0.2的0.326，观察到相关关系。
并且，若使用通过具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的被检体测定值(A)除以具有CD9的外泌体的被检体测定值(B)而获得的校正后被检体测定值((A)/(B))，则AUC为0.871，可知能够以高准确度来检测阿尔茨海默型痴呆症。
而且，根据表5，当将来源于轻度认知障碍者及健康者的血浆设为试样，并且以通过具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的被检体测定值(A)除以具有CD9的外泌体的被检体测定值(B)而获得的校正后被检体测定值((A)/(B))为指标评价了轻度认知障碍时，AUC为0.766，可知能够检查轻度认知障碍。并且，根据表6，当将阿尔茨海默型痴呆症患者及轻度认知障碍者的血浆设为试样，并且以该校正后被检体测定值为指标评价了阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍时，AUC为0.745，可知能够区别检测阿尔茨海默型痴呆症与轻度认知障碍。
并且，MMSE与通过具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体的被检体测定值(A)除以具有CD9的外泌体的被检体测定值(B)而获得的校正后被检体测定值之间的相关系数R为0.635，观察到相关关系。
只要是具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的外泌体，则均能够检查阿尔茨海默型痴呆症和/或轻度认知障碍，但尤其根据具有磷脂酰丝氨酸及CD9的外泌体，不依赖于试样的种类而能够以高准确度来检测阿尔茨海默型痴呆症。
比较例19.将β淀粉样蛋白(1-40)的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
(1)校准品的制备
以分别成为1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0pmol/L的方式，用附属于C试剂盒的基准稀释液稀释附属于“HumanβAmyloid(1-40)ELISA Kit WakoII”(FUJIFILM WakoPure Chemical Corporation制，以下设为“C试剂盒”)的基准溶液(人β淀粉样蛋白(1-40)，100pmol/L)，获得了由7种浓度构成的基准稀释系列(以下，设为“校准品”)。
(2)测定用被检体的制备
将从PrecisionMed公司购入的18个阿尔茨海默病(AD)患者EDTA血浆被检体、18个轻度痴呆症(MCI)患者EDTA血浆被检体及37个健康者EDTA血浆被检体用附属于C试剂盒的基准稀释液稀释4.44倍，并设为“测定用被检体稀释液”。
(3)基于ELISA法的测定
使用C试剂盒测定了在(2)中制备出的测定用被检体稀释液。具体而言，首先，制备将附属于C试剂盒的清洗液(20×)用纯净水(蒸馏水)稀释20倍的溶液，并设为“清洗液(1×)”。接着，将在(1)中制备出的校准品、在(2)中制备出的测定用被检体稀释液及作为空白培养基的附属于C试剂盒的基准稀释液各以95μL且以n＝2来分注于附属于C试剂盒的抗体(BAN50)固相化微孔板的各孔。接着，对板粘贴封板条，在冷藏条件下反应了一夜。反应后，丢弃反应液，用清洗液(1×)300～350μL对各孔清洗了4次。
接着，将附属于C试剂盒的HRP标记抗体(BA27)溶液各以100μL分注于各孔，粘贴封板条，在冷藏条件下反应了2个小时。反应后，丢弃反应液，用清洗液(1×)300～350μL对各孔清洗了5次。
接着，将恢复为室温的附属于C试剂盒的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液各以100μL分注于各孔，使用微孔板振荡器搅拌约1分钟之后，粘贴封板条，在室温(20～25℃)下进行了30分钟静置反应。然后，将恢复为室温的附属于C试剂盒的停止液各以100μL添加于各孔，使用微孔板振荡器搅拌约5秒钟之后，立即使用96孔酶标仪(Tecan公司，SPARK)分别测定了450nm的吸光度及副波长620nm的吸光度。将从450nm吸光度值减去副波长620nm吸光度值的值设为“吸光度值”，将从测定用被检体稀释液的吸光度值减去空白培养基的吸光度值的值设为“校正后被检体吸光度值”，而分别进行了计算。然后，根据从基准稀释系列(校准品)的吸光度值减去空白培养基的吸光度值的值及校准品的浓度制作了标准曲线。使用标准曲线，将校正后被检体吸光度值换算为蛋白质浓度，将所获得的换算值乘以被检体稀释率的值设为“被检体测定值”[pmol/L]。
(4)AUC的算出
根据在(3)中获得的被检体测定值，通过与实施例1相同的方法，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者、阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度痴呆症患者及轻度痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表7中。
比较例20.将β淀粉样蛋白(1-42)的量设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
(1)校准品的制备
以分别成为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0pmol/L的方式，用附属于D试剂的基准稀释液稀释附属于“HumanβAmyloid(1-42)ELISA Kit Wako,High-Sensitive”(FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation制，以下设为“D试剂盒”)的基准溶液(人β淀粉样蛋白(1-42)，20pmol/L)，获得了由7种浓度构成的基准稀释系列(以下，设为“校准品”)。
(2)测定用被检体的制备
将从PrecisionMed公司购入的18个阿尔茨海默病(AD)患者EDTA血浆被检体、18个轻度痴呆症(MCI)患者EDTA血浆被检体及37个健康者EDTA血浆被检体用附属于D试剂的基准稀释液稀释4.44倍，并设为“测定用被检体稀释液”。
(3)基于ELISA法的测定
使用D试剂盒测定了在(2)中制备出的测定用被检体稀释液。具体而言，首先，制备将附属于D试剂盒的清洗液(20×)用纯净水(蒸馏水)稀释20倍的溶液，并设为“清洗液(1×)”。接着，将在(1)中制备出的校准品、在(2)中制备出的测定用被检体稀释液及作为空白培养基的附属于D试剂盒的基准稀释液各以95μL且以n＝2来分注于附属于D试剂盒的抗体(BAN50)固相化微孔板的各孔。接着，对板粘贴封板条，在冷藏条件下反应了一夜。反应后，丢弃反应液，用清洗液(1×)300～350μL对各孔清洗了4次。
接着，将附属于D试剂盒的HRP标记抗体(BC05)溶液各以100μL分注于各孔，粘贴封板条，在冷藏条件下反应了2个小时。反应后，丢弃反应液，用清洗液(1×)300～350μL对各孔清洗了5次。
接着，将恢复为室温的附属于D试剂盒的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液各以100μL分注于各孔，使用微孔板振荡器搅拌约1分钟之后，粘贴封板条，在室温(20～25℃)下进行了30分钟静置反应。然后，将恢复为室温的附属于D试剂盒的停止液各以100μL添加于各孔，使用微孔板振荡器搅拌约5秒钟之后，立即使用96孔酶标仪(Tecan公司，SPARK)分别测定了450nm的吸光度及副波长620nm的吸光度。将从450nm吸光度值减去副波长620nm吸光度值的值设为“吸光度值”，将从测定用被检体稀释液的吸光度值减去空白培养基的吸光度值的值设为“校正后被检体吸光度值”，而分别进行了计算。然后，根据从基准稀释系列(校准品)的吸光度值减去空白培养基的吸光度值的值及校准品的浓度制作了标准曲线。使用标准曲线，将校正后被检体吸光度值换算为蛋白质浓度，将所获得的换算值乘以被检体稀释率的值设为“被检体测定值”[pmol/L]。
(4)AUC的算出
根据在(3)中获得的被检体测定值，通过与实施例1相同的方法，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者、阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度痴呆症患者及轻度痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表7中。
比较例21.将β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
在通过在比较例19中获得的β淀粉样蛋白(1-42)的“被检体测定值”(值(D))除以在比较例20中获得的β淀粉样蛋白(1-40)“被检体测定值”(值(C))，获得了(D)/(C)(以下，设为“校正后被检体测定值”)。
根据所获得的校正后被检体测定值，通过与实施例1相同的方法，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者、阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度痴呆症患者及轻度痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表7中。
实施例15.将具有PS及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的外泌体的量的比例乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例的值设为指标的阿尔茨海默型痴呆症被检体的评价
求出了通过在实施例11中获得的具有PS及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的外泌体的量的比例(校正后被检体测定值((A)/(B)))乘以在比较例21中获得的β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(校正后被检体测定值((D)/(C)))计算出的乘积。
根据所求出的乘积的值，通过与实施例1相同的方法，进行阿尔茨海默型痴呆症患者与健康者、阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度痴呆症患者及轻度痴呆症患者与健康者的差异显著性检验，计算出AUC及p值。
将所获得的结果示于下述表7中。并且，将以校正后被检体测定值为基础制作出的箱线图示于图5中。图中，纵轴表示实施例11的校正后被检体测定值((A)/(B))×比较例21的校正后被检体测定值((D)/(C))，横轴的Control表示健康者的结果，MCI表示轻度认知障碍患者的结果，AD表示阿尔茨海默型痴呆症患者的结果。
[表7]
Figure BDA0003771864830000921
由表7可知，当将来源于阿尔茨海默型痴呆症患者、轻度痴呆症患者及健康者的血浆分别设为试样，并且以比较例21的校正后被检体测定值(D)/(C)为指标评价了阿尔茨海默型痴呆症及轻度痴呆症时，AUC分别在健康者-阿尔茨海默型痴呆症患者之间为0.878，在健康者-轻度痴呆症患者之间为0.824，在阿尔茨海默型痴呆症患者-轻度痴呆症患者之间为0.686。
并且，计算了阿尔茨海默型痴呆症的检查方法即MMSE与校正后被检体测定值(A)/(B)之间的相关系数R，其结果，所获得的相关系数R为0.5781。
由表7可知，当以实施例11的校正后被检体测定值((A)/(B))乘以比较例21的校正后被检体测定值((D)/(C))的值为指标评价了阿尔茨海默型痴呆症及轻度痴呆症时，AUC分别在健康者-阿尔茨海默型痴呆症患者之间为0.923，在健康者-轻度痴呆症患者之间为0.833，在阿尔茨海默型痴呆症患者-轻度痴呆症患者之间为0.804。
并且，计算了阿尔茨海默型痴呆症的检查方法即MMSE与校正后被检体测定值(A)/(B)之间的相关系数R，其结果，所获得的相关系数R为0.7023。
通过将具有PS及CD9的外泌体的量相对于具有CD9的外泌体的量的比例(实施例11的校正后被检体测定值((A)/(B)))乘以β淀粉样蛋白(1-42)的量相对于β淀粉样蛋白(1-40)的量的比例(比较例21的校正后被检体测定值((D)/(C)))的值设为指标，能够以更高准确度来检测阿尔茨海默型痴呆症和/或轻度认知障碍。并且，可知，通过使用该值，尤其能够以更高准确度来区别检测健康者与阿尔茨海默型痴呆症患者及阿尔茨海默型痴呆症患者与轻度痴呆症患者。

Claims (22)

1.一种辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其包括如下步骤：
测定来源于被测试者的生物试样中的、具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量、或者具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；及
以所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量、或者所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于所述具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
2.根据权利要求1所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，当所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量、或者所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于所述具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为基准值以下时，判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
3.根据权利要求1所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症，
所述四次穿膜蛋白选自CD9、CD63及CD81。
4.根据权利要求1所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
测定所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量是指，使用对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质来测定所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
5.根据权利要求4所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质为含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白的蛋白质。
6.根据权利要求1所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症，
所述生物试样为血液试样或脑脊髓液。
7.根据权利要求1所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于所述具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症，
所述四次穿膜蛋白为CD9或CD63。
8.根据权利要求1所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
测定所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量是指，使用对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质来测定所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
测定所述具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量是指，使用所述对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质来测定所述具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于所述具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
9.根据权利要求8所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质为含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白的蛋白质。
10.根据权利要求1所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症的诊断的方法，其中，
所述细胞外囊泡的量的测定是指，测定所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于所述具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症，
所述生物试样为血液试样或脑脊髓液。
11.一种辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其包括如下步骤：
测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及具有CD9的细胞外囊泡的量；及
以所述具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于所述具有CD9的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
12.根据权利要求11所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，
所述阿尔茨海默型痴呆症的判定是指，当所述具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于所述具有CD9的细胞外囊泡的量的比例为基准值以下时，判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
13.根据权利要求11所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，
所述具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量的测定是指，使用对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质来测定所述具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量，
所述具有CD9的细胞外囊泡的量的测定是指，使用所述对CD9具有亲和性的物质来测定所述具有CD9的细胞外囊泡的量。
14.根据权利要求13所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，
所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质为含T细胞免疫球蛋白·粘蛋白的蛋白质。
15.根据权利要求11所述的辅助阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断的方法，其中，
所述生物试样为血液试样或脑脊髓液。
16.一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用试剂盒，其包含对四次穿膜蛋白具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质。
17.一种阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用试剂盒，其包含对CD9具有亲和性的物质及对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质。
18.一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用生物标志物，其包含具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡。
19.一种阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用生物标志物组，其包含具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡以及具有CD9的细胞外囊泡。
20.一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用装置，其具有：
测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；及
判定部，以所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
21.一种阿尔茨海默型痴呆症的诊断辅助用装置，其具有：
测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量以及具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量；
运算部，计算所述具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于所述具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例；及
判定部，以具有磷脂酰丝氨酸及四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量相对于所述具有四次穿膜蛋白的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症。
22.一种阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍的诊断辅助用装置，其具有：
测定部，测定来源于被测试者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量以及具有CD9的细胞外囊泡的量的测定；
运算部，计算所述具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于所述具有CD9的细胞外囊泡的量的比例；及
判定部，以所述生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及CD9的细胞外囊泡的量相对于所述生物试样中的具有CD9的细胞外囊泡的量的比例为指标来判定被测试者是阿尔茨海默型痴呆症或轻度认知障碍。
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