CN115166116B - 一种富集净化河豚毒素的磁性分散固相萃取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种富集净化河豚毒素的磁性分散固相萃取方法。本发明将磁性纳米材料与含有河豚毒素的待处理液混合，实现对河豚毒素的分散固相萃取；所述磁性纳米材料包括MWCNT‑COOH和自组装于所述MWCNT‑COOH表面的Fe3O4纳米粒子。在分散固相萃取后可应用于HILIC‑MS/MS分析测定。本发明将一种磁性纳米材料应用于河豚毒素磁性分散固相萃取净化和HILIC‑MS/MS分析测定，具有吸附高效、净化效果好、可重复利用、分离简便、成本经济、绿色环保等优点，适用于生物样品中河豚毒素前处理净化和HILIC‑MS/MS定量分析。

Description

一种富集净化河豚毒素的磁性分散固相萃取方法
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种富集净化河豚毒素的磁性分散固相萃取方法。
背景技术
河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种剧毒性的非蛋白神经毒素，属于杂环有机全氢化喹唑啉型化合物，其分子式为C11H17N3，相对分子质量319.271。该毒素被证实分布于鲀科鱼、织纹螺、双壳贝类、蝾螈等多种海洋生物体内，其毒性机理源于高度选择性地阻断肌肉组织和神经系统中细胞膜钠通道并阻碍肌肉与神经间兴奋传导，从而导致中毒者神经麻痹、呼吸衰竭症状及死亡。TTX化学性质极其稳定，腌制、烟熏、晾晒及普通烹饪方法均不能完全破坏毒素结构，而且TTX的衍生物也具有类似的毒性作用。沿海居民历来有食用河豚鱼和织纹螺等河鲜的习惯，因误食而引起的TTX中毒事件时有发生，临床上针对中毒患者的治疗又缺乏特效解毒药，因此水产动物源食品中TTX灵敏可靠的检测方法一直是研究者关注的热点问题。
目前，水产样品中TTX的提取均是采用酸化的水溶液或有机溶剂(如乙酸水溶液、乙酸酸化甲醇等)进行提取，同时多借助超声波、沸水浴、机械搅拌和加速溶剂萃取等辅助技术。和乙酸水提取溶液相比，酸化甲醇能够使组织蛋白质变性，提取液浓缩处理耗时缩短。由于生物样品含有大量的脂肪和蛋白质等基质干扰成分，为了准确测定TTX的含量，需对样品提取液进行净化。依据固相萃取(SPE)净化机理和模式差异，已报道的TTX样品提取液常用的净化手段主要分为反相、离子交换和免疫亲和固相萃取3种方法。反相和离子交换等传统的SPE只基于分子库仑力吸附原理，净化小柱的吸附容量低、选择性差，对TTX提取液中干扰杂质净化效果不足，LC-MS/MS定量分析时基质抑制干扰仍较强。免疫亲和SPE技术基于抗体-抗原特异性识别作用，能够实现对目标分子的特异性识别捕获，具有高选择性和重现性好的优点；但免疫亲和小柱分析经济成本是使用普通净化小柱的5～10倍，且净化柱重复利用效果不佳。
由于碳纳米管具有较大的比表面积、吸附性能强、性质稳定以及可化学修饰改造等优点，可通过氢键、静电作用、π-π共轭、分子偶极作用力实现与目标化合物的选择性吸附和富集。碳纳米管作为固相萃取净化吸附填料，被研究者广泛应用于动物源食品、环境和生物样品中化学药品、环境污染物及重金属离子的分析测定，但是较少见到被用于生物毒素的富集净化处理和检测。通过引入羟基、羰基、羧基等富氧官能团进行碳纳米管表面修饰，可以解决碳纳米管在极性溶液中溶解度差和分散性低的问题，同时提高修饰碳纳米材料的吸附性能。其中，羧基化碳纳米管对河豚毒素的吸附效果较羟基化碳纳米管具有更好的稳定性。尽管如此，碳纳米管或者经过表面官能团修饰的碳纳米管作为吸附分离材料，只能作为自填装固相萃取填料使用，而无法有效应用于分散固相萃取净化中，且自填装的小柱净化效果重现性不能媲美商品化、工艺化的小柱，净化效果有限，限制了其应用。同时，采用现有技术对河豚毒素进行净化并应用于HILIC-MS/MS时，难以避免基质效应，影响定量检测结果。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一方面提出了一种富集净化河豚毒素的磁性分散固相萃取方法，通过利用特殊的磁性材料对河豚毒素进行吸附，可以很好地实现分散固相萃取，而不需要进行装柱，吸附性能优异、净化效果好，而且可重复利用。
本发明的第二方面是提出一种河豚毒素的测定方法，有效改善了基质效应，提高定量检测的准确性。
本发明的第三方面是提出一种磁性复合纳米吸附材料的应用。
本发明所采取的技术方案是：
根据本发明的第一方面，提出了一种富集净化河豚毒素的磁性分散固相萃取方法，是将磁性纳米材料与含有河豚毒素的待处理液混合，实现对河豚毒素的分散固相萃取；所述磁性纳米材料包括MWCNT-COOH和自组装于所述MWCNT-COOH表面的Fe3O4纳米粒子。
本发明采用包括羧基化碳纳米管和自组装于所述羧基化碳纳米管表面的Fe3O4的特殊磁性纳米材料对河豚毒素进行分散固相萃取，磁性纳米材料可以通过胍基阳离子与羧基阴离子之间存在的静电作用对河豚毒素进行有效吸附，此外磁性纳米材料与河豚毒素的氢键和分子偶极作用力等也对二者间的稳定吸附提供协同作用，因此使得本发明的分散固相萃取方法具有吸附性能优异、净化效果好的优点，而且磁性纳米材料可重复利用。
在本发明的一些实例中，所述MWCNT-COOH与Fe3O4纳米粒子的质量比为0.6～3：1，优选0.6～1.5：1，更优选0.8～1.2：1，包括但不限于0.6：1，0.8：1，1：1，1.2：1，1.5：1，1.8：1，2：1，2.2：1，2.4：1，2.6：1，2.8：1，3：1等。若Fe3O4纳米粒子与MWCNT-COOH的质量比过高，会占用碳纳米管表面的有效吸附位置，使得吸附效率和吸附容量快速下降；而如果Fe3O4纳米粒子与MWCNT-COOH的质量比过低，会使得制备的磁性纳米材料在外磁场分离速率极缓慢，无法稳定聚集在试管底部，不利于样品分散萃取操作。
在本发明的一些实例中，所述待处理液的pH为4～12，优选8～10，更优选8～9，包括但不限于4，5，6，7，8，9，10，11，12等。可以通过添加氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等调节pH。由于TTX在强酸和强碱条件不稳定，会发生脱水和结构降解反应，因此不适合在强酸或强碱体条件下进行分散固相萃取。而在弱碱性体系中，河豚毒素与磁性纳米材料的吸附主要依靠胍基阳离子与羧基阴离子之间存在的静电作用，此外氢键和分子偶极作用力等也对二者间的稳定吸附提供协同作用。
在本发明的一些实例中，所述待处理液以乙酸-水、乙酸-甲醇、乙酸-乙腈中的至少一种为溶剂，优选以乙酸-甲醇溶液为溶剂。所述乙酸-甲醇溶液中，乙酸的体积百分比为0.5％～2％，优选1％～1.5％，包括但不限于0.5％，0.8％，1％，1.5％，1.8％，2％等。
在本发明的一些实例中，所述磁性纳米材料与待处理液的比例为2～20mg:1mL，优选2～10mg:1mL，更优选5～10mg：1mL，包括但不限于2mg：1mL，3mg：1mL，4mg：1mL，5mg：1mL，6mg：1mL，7mg：1mL，8mg：1mL，9mg：1mL，10mg：1mL，12mg：1mL，14mg：1mL，16mg：1mL，18mg：1mL，20mg：1mL等。
在本发明的一些实例中，所述分散固相萃取的温度为0～80℃，优选10～50℃，更优选20～30℃，包括但不限于0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80℃等。
在本发明的一些实例中，所述分散固相萃取的时间可根据体系的规模大小、温度等进行合理确定。作为示例，对于待处理液体积为10～50mL的规模大小，温度为20～30℃，所述分散固相萃取的时间可设置为10～60min，优选10～30min。在分散固相萃取结束后，可通过外磁场对吸附了河豚毒素的磁性纳米材料进行分离。
在本发明的一些实例中，所述磁性纳米材料的制备方法包括如下步骤：将MWCNT-COOH和Fe3O4纳米粒子分散于溶剂中，Fe3O4纳米粒子自发式地分散聚集在MWCNT-COOH的表面进行自组装反应，得到所述磁性纳米材料。
在本发明的一些实例中，所述自组装反应的温度为0～50℃，优选20～30℃，包括但不限于0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50℃等。
在本发明的一些实例中，所述自组装反应的时间为10～60min，优选20～40min，包括但不限于10，20，30，40，50，60min等。在实际操作中，也可以根据反应温度的高低、反应规模的大小对自组装反应的时间进行合理调整。
在本发明的一些实例中，所述溶剂包括乙腈、甲醇的至少一种。
在本发明的一些实例中，在将MWCNT-COOH和Fe3O4纳米粒子分散于溶剂前，还包括对所述MWCNT-COOH进行预处理的步骤，所述预处理方法包括清洗、粉碎、干燥等步骤，通过预处理对MWCNT-COOH进行纯化、去杂质。其中清洗过程可采用水、乙腈等溶剂对MWCNT-COOH进行漂洗、冲洗等，例如可以将MWCNT-COOH按照为1g：10～100mL，优选1g：50～60mL的比例分散在乙腈中，静止悬浮20～30h，除去漂浮杂质成分，然后用水和乙腈进行反复冲洗。
在本发明的一些实例中，所述MWCNT-COOH内径为1～10nm，优选3～5nm；外径5～20nm，优选8～15nm；长度10～100mm，优选40～50mm；纯度>99.9％。
在本发明的一些实例中，所述自组装过程中可辅以搅拌、超声等，促进Fe3O4纳米粒子的自组装。
在本发明的一些实例中，所述Fe3O4纳米粒子的制备方法包括如下步骤：将Fe3+和Fe2+的混合溶液调节至碱性，反应生成Fe3O4纳米粒子。
在本发明的一些实例中，所述Fe3+和Fe2+的混合溶液中，Fe3+和Fe2+的摩尔比值为0.5～2：1，优选1～2：1，更优选1.2～2：1，包括但不限于0.5：1，0.8：1，1：1，1.2：1，1.4：1，1.6：1，1.8：1，2：1等。
在本发明的一些实例中，Fe3O4纳米粒子的制备方法中，反应所处的碱性条件对应的pH值为10～13，优选11～12。可以通过向所述Fe3+和Fe2+的混合溶液添加氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等调节pH。
在本发明的一些实例中，Fe3O4纳米粒子的制备方法中，所述反应的温度为50～90℃，优选70～80℃，包括但不限于50，55，60，65，70，75，80，85，90℃等。
在本发明的一些实例中，Fe3O4纳米粒子的制备方法中，所述反应的时间为10～60min，优选20～40min，包括但不限于10，20，30，40，50，60min等。在实际操作中，也可以根据反应温度的高低、反应规模的大小对反应的时间进行合理调整。
在本发明的一些实例中，Fe3O4纳米粒子的制备方法中，所述反应在非氧化性的气氛中进行。在实际操作中，可向反应体系中通入氮气、氩气等保护气体形成非氧化性的条件，以避免生成杂质。
在本发明的一些实例中，所述Fe3+和Fe2+分别源自水溶性铁盐和水溶性亚铁盐，所述水溶性铁盐包括NH4Fe(SO4)2或其水合物、FeCl3或其水合物、Fe2(SO4)3或其水合物中的任意一种或多种，所述水溶性亚铁盐包括(NH4)2Fe(SO4)2或其水合物、FeCl2或其水合物、FeSO4或其水合物中的任意一种或多种。优选地，所述Fe3+和Fe2+的混合溶液为NH4Fe(SO4)2或其水合物、(NH4)2Fe(SO4)2或其水合物的混合水溶液。优选地，所述Fe3+和Fe2+的混合溶液为(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O和NH4Fe(SO4)2·12H2O的混合水溶液，(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O和NH4Fe(SO4)2·12H2O的质量比为1：0.7～2.5，优选为1：1.4～2。
根据本发明的第二方面，提出了一种河豚毒素的测定方法，包括步骤：
将磁性纳米材料与含有河豚毒素的待处理液混合，实现对河豚毒素的分散固相萃取，得到吸附有河豚毒素的磁性纳米材料；所述磁性纳米材料包括MWCNT-COOH和自组装于所述MWCNT-COOH表面的Fe3O4纳米粒子；将河豚毒素从磁性纳米材料中洗脱下来，得到洗脱液，收集洗脱液用于HILIC-MS/MS测定。
本发明采用磁性纳米材料吸附河豚毒素后，通过简单洗脱即可进行HILIC-MS/MS测定，基质抑制效应明显改善，采用标准曲线上机测定即可以实现河豚毒素的准确校正和定量分析。
其中，所述磁性纳米材料、待处理液如前文内容所述。
在本发明的一些实例中，将河豚毒素从磁性纳米材料中洗脱下来过程所采用的洗脱液为极性酸性溶液。优选地，所述极性酸性溶液为乙腈-水-甲酸溶液。优选地，所述乙腈-水-甲酸溶液中乙腈的体积浓度为10％～70％，优选10％～50％，更优选10％～30％，再优选15％～25％，包括但不限于10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％等；甲酸的体积浓度为0.05％～0.3％，优选0.05％～0.2％，更优选0.1％～0.15％。在极性较大的酸性溶液中，磁性纳米材料表面羧基阴离子电离状态发生变化，与河豚毒素二者间主要的阴阳离子静电作用被破坏，从而实现河豚毒素在磁性纳米材料中的解吸附。同时，测试结果显示，采用乙腈-水-甲酸溶液进行洗脱，河豚毒素的解吸附率可以达到88％～97％之间。
在本发明的一些实例中，所述磁性纳米材料与洗脱液的比例为10～50mg:1mL，优选20～30mg：1mL。
在本发明的一些实例中，在将河豚毒素从磁性纳米材料中洗脱下来过程中，可辅以漩涡震荡、搅拌、超声等手段促进解吸，优选漩涡震荡，使得磁性纳米材料在洗脱液中分散均匀，保证目标物的充分洗脱回收。
在本发明的一些实例中，在将河豚毒素从磁性纳米材料中洗脱下来之前，还包括将吸附有河豚毒素的磁性纳米材料从待处理液中分离、清洗至中性的步骤。其中分离的方法可采用外磁场分离。清洗过程可采用水、乙腈中的至少一种进行淋洗，使用乙腈和水进行淋洗，未发河豚毒素泄露和流出现象，说明磁性纳米材料对河豚毒素的吸附作用稳定。
在本发明的一些实例中，在将河豚毒素从磁性纳米材料中洗脱下来之后，可通过对磁性纳米材料进行清洗至中性、干燥、研磨等处理，然后进行回收利用。其中的清洗可采用水、乙醇等进行淋洗。本发明可将磁性纳米材料进行重复利用，在重复使用5次后，磁性纳米材料对河豚毒素的吸附效率依然大于85％。
根据本发明的第三方面，提出了一种磁性复合纳米吸附材料在富集或测定河豚毒素中的应用，所述磁性纳米材料包括MWCNT-COOH和自组装于所述MWCNT-COOH表面的Fe3O4纳米粒子。
在本发明的一些实例中，所述河豚毒素可来源于生物样品，例如河豚鱼、织纹螺等生物样品。
所述磁性纳米材料如前文内容所述。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明从当前河豚毒素样品前处理技术存在的净化效果不足和LC-MS/MS定量分析的基质抑制效应干扰方面切入，将一种磁性纳米材料应用于河豚毒素的磁性分散固相萃取净化和HILIC-MS/MS分析测定，与传统的固相萃取和改良的QuEChERS净化技术相比，本发明所构建的基于磁性材料的分散萃取技术具有吸附高效、净化效果好、可重复利用、分离简便、成本经济、绿色环保等优点，适用于生物样品中河豚毒素前处理净化和HILIC-MS/MS定量分析。而且，该磁性纳米材料的制备方法过程简单、可操作性强、经济高效。
附图说明
图1是不同MWCNT-COOH与Fe3O4质量比值对TTX吸附效率的影响。
图2是未修饰的MWCNT-COOH与Fe3O4@MWCNT-COOH在不同加入量下对TTX吸附效率对比图。
图3是TTX标准溶液(10.0ng/mL)MRM色谱图。
图4是TTX检测标准工作曲线。
图5是不同pH下的TTX吸附效率。
图6是不同吸附时间下的TTX吸附效率。
图7是乙腈-甲酸-水溶液中不同乙腈体积百分比下的TTX的洗脱回收率。
图8是Fe3O4@MWCNT-COOH重复利用的吸附性能比较。
具体实施方式
以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。以下实施例中所用的原料，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到；所采用的工艺，如无特殊说明，均采用本领域的常规工艺。
实施例1
本实施例制备了Fe3O4@MWCNT-COOH磁性纳米材料，并将其应用于对河豚毒素(TTX)进行磁性分散固相萃取，最后对TTX进行测定，具体步骤如下：
一、制备Fe3O4@MWCNT-COOH磁性纳米材料
(1)MWCNT-COOH预处理：称取MWCNT-COOH(内径3～5nm，外径8～15nm，长度～50mm，纯度>99.9％，市售)10g于1L烧杯中，使用前先用600mL乙腈溶解，室温静止悬浮24h，除去漂浮杂质成分，用适量的超纯水和乙腈反复冲洗，80℃真空干燥12h，研磨粉碎，备用；
(2)磁性Fe3O4纳米粒子制备：分别称取8.5g(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O和12.3g NH4Fe(SO4)2·12H2O于500mL烧杯中，加300mL超纯水充分溶解。溶液转移至圆底烧瓶并加热至80℃，通入高纯度N2，不断滴加25％氨水，控制溶液pH在11～12之间，出现黑褐色沉淀物，待反应30min，采用镍铷磁铁分离磁性Fe3O4纳米粒子，依次用水和乙腈交替淋洗至pH中性，80℃真空干燥过夜，研磨粉碎，备用；
(3)Fe3O4@MWCNT-COOH磁性纳米材料制备：称取5.0g已预处理的MWCNT-COOH和制备收集的Fe3O4纳米粒子置于200mL烧杯，其中MWCNT-COOH和Fe3O4纳米粒子的质量比1：1，用50mL乙腈溶解，置于常温水浴中超声处理，Fe3O4纳米粒子自发式地分散聚集在碳纳米管的表面，待自组装反应30min，用镍铷磁铁分离制备的磁性纳米材料，依次用水和乙醇交替淋洗至pH中性，80℃真空干燥过夜，研磨粉碎，得到Fe3O4@MWCNT-COOH。
二、TTX的磁性分散固相萃取与HILIC-MS/MS测定
(1)样品制备：野生河豚鱼和织纹螺样品，采集自广东汕头。收集整体样品，4℃冷藏保存，运回实验室。解冻的织纹螺样品用水多次清洗，待洗去表面淤泥后，敲碎外壳，取所有的可食组织。用刀切碎，软组织连同体液使用均质仪进行匀浆处理。解冻的河豚鱼样品去皮，只取肌肉部分，用刀切碎，进行均质匀浆处理。所制备的样品使用前于-20℃冷冻保存。
(2)样品提取：称取已完全解冻的河豚鱼和织纹螺样品(各5份)5.0±0.05g于15mL聚丙酰胺离心管中，加入10mL 1％乙酸-甲醇溶液，漩涡振荡混合均匀，水浴超声波辅助提取15min。8000rpm高速冷冻离心5min，转移上清液至50mL离心管。样品残渣重复提取操作，转移提取液到50mL离心管，定容体积至20mL，得到样品提取溶液。
(3)磁性分散固相萃取与HILIC-MS/MS测定：
称取NaCl(4.25g)、Na2HPO4·12H2O(6.45g)和K2HPO4(0.95g)，溶解于500mL超纯水中，混合均匀，得到PBS缓冲溶液备用。
取步骤(2)所得1％乙酸-甲醇的样品提取溶液20mL，加入PBS缓冲溶液5mL，加入25％氨水调节pH为8.0，加入150mg Fe3O4@MWCNT-COOH(6mg/mL)混合均匀，室温条件下静止吸附20min。待反应达到吸附平衡，外磁场分离，倾倒上清液，依次用5mL超纯水和乙腈清洗Fe3O4@MWCNT-COOH。最后用5mL乙腈-水-甲酸溶液(20：80：0.1，v/v/v)旋涡震荡5min，磁性分离，收集解吸附液体直接用于HILIC-MS/MS测定。
(4)重复利用：
将步骤(3)中淋洗后磁性分离得到的Fe3O4@MWCNT-COOH淋洗(水和乙醇)至中性，真空干燥研磨后将其重新应用于步骤(3)进行磁性分散固相萃取。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：在“一、制备Fe3O4@MWCNT-COOH磁性纳米材料”的步骤(3)中，保持MWCNT-COOH的质量不变，将MWCNT-COOH和Fe3O4纳米粒子的质量比值改为0.25：1，0.5：1，2：1或3：1。其他操作与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：在“二、TTX的磁性分散固相萃取与HILIC-MS/MS测定”的步骤(3)中，保持样品提取溶液、PBS缓冲溶液的体积不变，改变Fe3O4@MWCNT-COOH的加入量，使其在溶液中的加入量为2、4、8或10mg/mL。其他操作与实施例1相同。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：在“二、TTX的磁性分散固相萃取与HILIC-MS/MS测定”的步骤(3)中，将pH改为4，5，6，7，9，10，11或12。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：在“二、TTX的磁性分散固相萃取与HILIC-MS/MS测定”的步骤(3)中，将静止吸附时间改为5，10，30，40，50或60min。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于：在“二、TTX的磁性分散固相萃取与HILIC-MS/MS测定”的步骤(3)中，将乙腈-水-甲酸溶液的体积比替换为10：90：0.1，30：70：0.1，40：60：0.1，50：50：0.1，60：40：0.1或70：30：0.1，对应的乙腈体积百分比为10％，30％，40％，50％，60％或70％。
测试结果：
(1)实施例1和实施例2中，不同MWCNT-COOH与Fe3O4的质量比值下，Fe3O4@MWCNT-COOH对TTX的吸附效率如图1所示。图1显示，MWCNT-COOH与Fe3O4的质量比值对TTX的吸附效率具有重要影响，Fe3O4比例过高，会占用纳米管表面的有效吸附位置，使得吸附效率和吸附容量快速下降；Fe3O4与MWCNT-COOH的质量比为1：1时，吸附效率开始呈现饱和趋势。因此，在MWCNT-COOH与Fe3O4的质量比值接近1：1，或在1：1以及大于1：1时，例如0.6～3：1，Fe3O4@MWCNT-COOH对TTX具有高的吸附效率。
不过，Fe3O4比例过低，会使得制备的Fe3O4@MWCNT-COOH在外磁场分离速率极缓慢，无法稳定聚集在试管底部，在实际操作中不利于样品分散萃取操作。因此，在实际中，选择MWCNT-COOH与Fe3O4的质量比值在1：1左右具有最有的吸附效率以及分散萃取效果，例如MWCNT-COOH与Fe3O4的质量比值为0.6～1.5：1，或者0.8～1.2：1。
(2)实施例1和实施例3中，不同Fe3O4@MWCNT-COOH加入量下TTX的吸附效率如图2所示。作为比较，同时采用未磁性修饰的MWCNT-COOH在相同条件下对TTX进行分散固相萃取。图2反映，在Fe3O4@MWCNT-COOH加入量为6mg/mL时，吸附效率开始呈现饱和趋势。而且，同等质量的未磁性修饰的MWCNT-COOH直接应用于上述分散萃取净化步骤，对TTX的吸附效果较差，饱和吸附容量不足Fe3O4@MWCNT-COOH的28.9％。发明人认为，这是由于未磁性修饰的MWCNT-COOH在溶剂中分散性较差，漂浮于液体表面或者团聚于溶液中，与溶液中TTX的吸附面积和结合位点较为有限，因此MWCNT-COOH对TXX的分散吸附效率低。
(3)取TTX标准溶液(10.0ng/mL)进行HILIC-MS/MS测定，得到MRM色谱图如图3所示。将实施例1的HILIC-MS/MS测定谱图与TTX标准溶液的MRM色谱图进行比较，结果显示二者的MRM色谱出峰位置相同，且分析物信号较强，干扰信号很弱，说明方法特异性良好。
采用不同浓度的TTX标准溶液进行HILIC-MS/MS测定，获得TTX检测标准工作曲线(信号强度-TTX浓度)如图4所示，标准曲线方程为y＝56998.6x–2602.7，R2＝0.999728。根据标准工作曲线与实施例1中的野生河豚鱼和织纹螺样品(各5份)的HILIC-MS/MS分析结果，测定结果表明：其中3份样品(1份河豚鱼肉和2份织纹螺)中检出TTX，样品TTX含量为140μg/kg、191μg/kg和328μg/kg。
(4)实施例1和实施例4中，不同pH下TTX的吸附效率如图5所示，图5反映，TTX的吸附率受pH影响较大，在pH为4～12的条件下，Fe3O4@MWCNT-COOH均可以TTX吸附，不过在pH为8～9时吸附效果最好。同时，实施例1和实施例5中，不同吸附时间下TTX的吸附效率如图6所示，图6反映，在Fe3O4@MWCNT-COOH加入量为6mg/mL下，在吸附时间达到20min时候即可达到吸附平衡。结合图2的结果可见，最优实验条件为：Fe3O4@MWCNT-COOH吸附材料的用量为6mg/mL，pH为8.0～9.0，静止吸附20min。此吸附反应条件下TTX的吸附率>95％，满足实验分析要求。
(5)经过进一步比较不同乙腈的体积比的乙腈-水-甲酸溶液作为洗脱液TTX的回收率，实验结果如图7所示，结果显示：使用乙腈-水-甲酸溶液中乙腈的体积百分比在10％～40％时，洗脱后TTX的回收率在70％以上，在乙腈体积百分比为20％(20：80：0.1，v/v/v)时，TTX的回收率>92％。
(6)将实施例1外磁场分离的磁性纳米粒子使用水和乙醇淋洗至pH中性，真空干燥研磨后可重复利用，回收实验结果见图8。结果显示，回收的磁性纳米粒子重复使用5次，对TTX的吸附效率依然大于85％。
可见，采用上述的净化技术和检测策略对河豚鱼和织纹螺样品的净化效果良好，基质抑制效应明显改善，采用溶剂标准曲线上机测定即可以实现TTX的准确校正和定量分析。方法应用和验证结果表明：本发明所构建的磁性分散萃取净化结合HILIC-MS/MS分析方法具有吸附高效、分离简便、成本经济、绿色环保等优点，适用于野生河豚鱼和织纹螺样品中TTX的分析测定。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种富集净化河豚毒素的磁性分散固相萃取方法，其特征在于：是将磁性纳米材料与含有河豚毒素的待处理液混合，实现对河豚毒素的分散固相萃取；所述磁性纳米材料包括MWCNT-COOH和自组装于所述MWCNT-COOH表面的Fe3O4纳米粒子；所述磁性纳米材料的制备方法包括如下步骤：将MWCNT-COOH和Fe3O4纳米粒子分散于溶剂中，Fe3O4纳米粒子自发式地分散聚集在MWCNT-COOH的表面进行自组装反应，得到所述磁性纳米材料；
所述MWCNT-COOH与Fe3O4纳米粒子的质量比为0.6 ~ 3：1；
所述磁性纳米材料与待处理液的比例为2~20 mg:1 mL；
所述待处理液的pH为4 ~ 12。
2.根据权利要求1所述富集净化河豚毒素的磁性分散固相萃取方法，其特征在于：所述分散固相萃取的温度为0 ~ 80℃。
3.一种河豚毒素的测定方法，其特征在于：包括步骤：
将磁性纳米材料与含有河豚毒素的待处理液混合，实现对河豚毒素的分散固相萃取，得到吸附有河豚毒素的磁性纳米材料；所述磁性纳米材料包括MWCNT-COOH和自组装于所述MWCNT-COOH表面的Fe3O4纳米粒子；将河豚毒素从磁性纳米材料中洗脱下来，收集洗脱液用于HILIC-MS/MS测定；
所述磁性纳米材料的制备方法包括如下步骤：将MWCNT-COOH和Fe3O4纳米粒子分散于溶剂中，Fe3O4纳米粒子自发式地分散聚集在MWCNT-COOH的表面进行自组装反应，得到所述磁性纳米材料；
所述MWCNT-COOH与Fe3O4纳米粒子的质量比为0.6 ~ 3：1；
所述磁性纳米材料与待处理液的比例为2~20 mg:1 mL；
所述待处理液的pH为4 ~ 12。
4.根据权利要求3所述河豚毒素的测定方法，其特征在于：将河豚毒素从磁性纳米材料中洗脱下来过程所采用的洗脱液为极性酸性溶液。
5.根据权利要求4所述河豚毒素的测定方法，其特征在于：所述极性酸性溶液为乙腈-水-甲酸溶液。
6.一种磁性纳米材料在富集或测定河豚毒素中的应用，所述磁性纳米材料包括MWCNT-COOH和自组装于所述MWCNT-COOH表面的Fe3O4纳米粒子；
所述磁性纳米材料的制备方法包括如下步骤：将MWCNT-COOH和Fe3O4纳米粒子分散于溶剂中，Fe3O4纳米粒子自发式地分散聚集在MWCNT-COOH的表面进行自组装反应，得到所述磁性纳米材料；
所述MWCNT-COOH与Fe3O4纳米粒子的质量比为0.6 ~ 3：1；
所述磁性纳米材料与待处理液的比例为2~20 mg:1 mL；
所述待处理液的pH为4 ~ 12。
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