CN115161193A - 用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肠器官芯片技术领域，提出了一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，本发明中在第一层结构和第二层结构上均开设通道，通道通过硅胶毛细管连接有注射泵，流量和机械拉伸由注射泵控制，克服了目前肠器官芯片上肠管没有优化体外仿生条件的缺点；优化得到了一种双通道、机械可伸展的肠道芯片；同时，三电极传感器阵列和银‑氯化银电极分别集成在芯片的不同位置，可以实现实时、非侵入性监测跨膜电阻和吸收汞离子的变化。

Description

用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法
技术领域
本发明属于肠器官芯片技术领域，尤其涉及一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法。
背景技术
汞离子(Hg2+)即使在超低浓度，比如在浓度为5μM的情况下也会在体内不可降解地积聚，这会损害心脏、肾脏、肠道和中枢神经系统。Hg2+的吸收主要发生在小肠；因此，合理的肠道模型对探讨Hg2+进入靶细胞的转运和吸收机制具有重要意义，可以有效地为治疗Hg2+转运的毒理学效应提供全面的信息。
发明人发现，近年来，器官芯片可以在微流控培养装置中复制人体器官的复杂结构和生理功能。肠器官芯片可以通过对上皮细胞单层施加机械刺激来诱导Caco-2细胞形成绒毛状突起，同时会产生吸收细胞、粘液分泌细胞、肠道内分泌细胞和潘氏细胞四种类型的细胞，部分完成肠道的分泌和免疫功能；肠器官芯片在药物筛选、疾病建模、毒理学和个性化医学方面取得了很大进展。随着肠器官芯片中生物复杂性要求的不断提高，通过集成传感器实现微环境中物理化学参数的在线检测越来越受到人们的关注，例如，Ingber团队利用氧敏感荧光探针连续监测芯片内的氧浓度梯度变化；此外通过荧光探针，如荧光团、共轭聚合物、脱氧核酶和量子点等探针对其他反应包括屏障完整性和炎症反应(如细胞因子分泌)也进行原位检测；但是，荧光团漂白、使用寿命和外部环境干扰的问题限制了它们在肠器官芯片中的应用，并且，目前的肠器官芯片没有优化体外仿生条件，比如优化生理运动和流体流动的问题。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提出了一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，本发明优化得到了一种双通道、机械可伸展的肠道芯片，三电极传感器阵列和银-氯化银(Ag/AgCl)电极分别集成在芯片的不同位置，可以实现实时、非侵入性监测跨膜电阻和吸收汞离子的变化。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提出了一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，采用如下技术方案：
一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，包括：
制作包括第一层结构和第二层结构的肠器官芯片，所述第一层结构和所述第二层结构上均设置有通道；通道通过硅胶毛细管连接有注射泵；
将第一层结构中通道的一侧外壁去掉；将肠器官芯片固定在固定有三电极传感器阵列的玻璃片上，第一层结构靠近通道去掉外壁的一侧与玻璃片固定，三电极传感器的测试端位于第一层结构的通道中；
在所述肠器官芯片两侧，分别开设与通道平行且贯通的通孔，所述通孔内插入银-氯化银电极。
进一步的，肠器官芯片的制作包括：
将预设比例的基料与固化剂混合，在真空中脱气第一预设时长；
将脱气后的基料与固化剂混合料分别浇筑在预设有多个通道图案的第一模具和第二模具上；在预设温度下热固第二预设时长；脱模得到具有通道的第一层结构和第二层结构；
在所述第一层结构上打孔；对打孔后的第一层结构、第二层结构和多孔膜进行氧等离子体清洗，清洗时长为第三预设时长；
将清洗后的第一层结构和第二层结构进行粘合，所述多孔膜位于所述第一层结构上的通道和所述第二层结构上的通道之间；
每个通道连通硅胶毛细管；硅胶毛细管连接有注射泵。
进一步的，基料与固化剂的预设比例为重量比是10：1；第一预设时间为30分钟；第二预设时长为4小时；第三预设时长为120秒。
进一步的，所述基料为聚二甲基硅氧烷基料。
进一步的，将肠器官芯片固定在固定有三电极传感器阵列的玻璃片上时，先将肠器官芯片和装有三电极传感器的玻璃片进行氧等离子体清洗。
进一步的，肠器官芯片和装有三电极传感器的玻璃片进行氧等离子体清洗的清洗时间为120秒。
进一步的，将肠器官芯片固定在装有三电极传感器的玻璃片上后，用半固态聚二甲基硅氧烷对肠器官芯片周围进行密封；通孔内插入银-氯化银电极后，用半固态聚二甲基硅氧烷对通孔处进行密封。
进一步的，银-氯化银电极包括第一银-氯化银电极和第二银-氯化银电极；所述第一银-氯化银电极位于和第一层结构的通道贯通的通孔内，所述第二银-氯化银电极位于和第二层结构的通道贯通的通孔内。
进一步的，所述第一银-氯化银电极和所述第二银-氯化银电极连接有电化学工作站。
为了实现上述目的，第二方面，本发明还提出了一种用于探索汞离子的肠器官芯片，采用如下技术方案：
一种用于探索汞离子的肠器官芯片，使用第一方面中所述的用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法得到，包括：
开设有通道的第一层结构和第二层结构；
多孔膜，位于第一层结构和第二层结构之间；多孔膜将第一层结构上的通道和第二层结构上的通道隔开；
装有三电极传感器的玻璃片，与第一层结构固定，三电极传感器的测试端位于第一层结构的通道内；
第一银-氯化银电极和第二银-氯化银电极，分别通过预设的通孔设置在肠器官芯片两侧，两侧的通孔分别与第一层结构上的通道和第二层结构上的通道贯通。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明中，在第一层结构和第二层结构上均开设通道，通道通过硅胶毛细管连接有注射泵，流量和机械拉伸由注射泵控制，克服了目前肠器官芯片上肠管没有优化体外仿生条件的缺点；优化得到了一种双通道、机械可伸展的肠道芯片；同时，三电极传感器阵列和银-氯化银电极分别集成在芯片的不同位置，可以实现实时、非侵入性监测跨膜电阻和吸收汞离子的变化。
附图说明
构成本实施例的一部分的说明书附图用来提供对本实施例的进一步理解，本实施例的示意性实施例及其说明用于解释本实施例，并不构成对本实施例的不当限定。
图1为本发明实施例1的局部放大结构示意图；
图2为本发明实施例1的结构示意图；
图3为本发明实施例1的实物效果示意图；
图4为本发明实施例1的仿真结果示意图；
图5为本发明实施例1的验证结果分析；
图6为本发明实施例1的变形量分析；
图7为本发明实施例1的孔直径变化分析；
图8为本发明实施例1的杨氏模量漂移分析；
图9为本发明实施例1的三电极传感器修饰AuNPs和检测Hg2+的步骤；
图10为本发明实施例1的峰电流分析；
图11为本发明实施例1的氧化峰电流之差和Hg2+的对数浓度分析；
图12为本发明实施例1的Hg2+浓度分析；
图13为本发明实施例1的Hg2+的转运渗透率分析。
具体实施方式：
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例中提供了一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，包括：
制作包括第一层结构和第二层结构的肠器官芯片，所述第一层结构和所述第二层结构上均设置有通道；
将第一层结构中通道的一侧外壁去掉，目的在于后续中，当第一层结构固定在玻璃片上时，三电极传感器的测试端可以位于通道内；将肠器官芯片固定在固定有三电极传感器阵列的玻璃片上，第一层结构靠近通道去掉外壁的一侧与玻璃片固定，三电极传感器的测试端位于第一层结构的通道中；三电极传感器可以通过黏贴的方式固定在玻璃片上，三电极传感器阵列可以包括3个三电极传感器；
在所述肠器官芯片两侧，分别开设与通道平行且贯通的通孔，所述通孔内插入银-氯化银电极。
本实施例中，优化肠器官芯片时，主要可分为肠器官芯片的制造、电化学传感器集成和TEER传感器集成三部分，具体为：
肠器官芯片的制作包括：将预设比例的基料与固化剂混合，在真空中脱气第一预设时长；将脱气后的基料与固化剂混合料分别浇筑在预设有多个通道图案的第一模具和第二模具上；在预设温度下热固第二预设时长；脱模得到具有通道的第一层结构和第二层结构，当第一层结构和第二层结构相同时，第一模具和第二模具可以设置为一个，当第一层结构和第二层结构不同时，第一模具和第二模具不同；在所述第一层结构上打孔；对打孔后的第一层结构、第二层结构和多孔膜进行氧等离子体清洗，清洗时长为第三预设时长；将清洗后的第一层结构和第二层结构进行粘合，所述多孔膜位于所述第一层结构上的通道和所述第二层结构上的通道之间；每个通道连通硅胶毛细管；硅胶毛细管连接有注射泵。其中，基料与固化剂的预设比例可以为重量比是10：1；第一预设时间可以为30分钟；第二预设时长可以为4小时；第三预设时长可以为120秒；所述基料可以为聚二甲基硅氧烷基料。具体的，可以采用软刻技术并使用柔性透明的聚二甲基硅氧烷(PDMS；184Silicone Elastomer，DowCorning Co.，Midland，MI，USA)制作肠器官芯片；肠器官芯片由三部分组成：顶层微通道、底层微通道和中间的多孔膜，可以将第一层结构定义为顶层，第二层结构定义为底层，微通道的尺寸可以设置为宽2.0mm×高0.25mm；多孔膜的厚度可以设置为20μm，孔径可以设置为5μm。所述多孔膜将顶层和底层的通道隔开，起到构建组织界面的作用。首先，将重量比例为10：1(wt/wt)的PDMS基料与固化剂混合，在真空中脱气30min，然后浇注在含有微通道图案的模具上，在70℃下热固化4h后，脱模形成了具有微通道的顶层和底层，用打孔器在顶层打孔，将硅胶软管与器官芯片的通道连接；然后，将上下微通道和多孔膜放入氧等离子体清洗机中清洗120s，所述等离子体清洗机可以为CY-P2L-B，CY Scientific InstrumentCO.，Ltd，China，将顶层和底层们粘合在一起，并用半固态PDMS密封和固化周边缝隙；最后，用不锈钢细管将硅胶毛细管连接到每个通道，流量和机械拉伸由高精度注射泵控制，所述高精度注射泵可以为LSP02-1B，Baoding Ditron Electronic Technology CO.，Ltd，China。图1所示，展示了肠器官芯片的实物图片。
电化学传感器集成时，首先，可使用外科刀片沿着微通道边缘切割肠器官芯片的底层，保证底层黏贴到玻璃片后，三电极传感器的测试端可以位于通道内；将固定有三电极传感器阵列的玻璃片和肠器官芯片放入氧等离子体清洗机清洗120s后取出；然后，肠器官芯片的底层被牢固地粘合在玻璃片上，并用半固态PDMS密封在传感器周围；最后，放入75℃的烘干箱中固化2小时后完成。
TEER传感器集时，首先，可以使用打孔针在肠器官芯片的两侧制作出两个圆形通孔，通孔与上下通道相贯通并平行；然后，将两个直径为0.2mm的Ag/AgCl电极插入相应的通孔，用半固态PDMS密封；最后，两个Ag/AgCl电极位于多孔膜的两侧并连接到电化学工作站(PGSTAT302N，Herisau，Switzerland)，测量多孔膜上下两侧的阻抗变化，可以理解的为，银-氯化银电极包括第一银-氯化银电极和第二银-氯化银电极；所述第一银-氯化银电极位于和第一层结构的通道贯通的通孔内，所述第二银-氯化银电极位于和第二层结构的通道贯通的通孔内。
本实施例中，对肠器官芯片内部参数进行了理论计算与仿真模拟，包括：
肠器官芯片中灌注流量和拉伸应变的标定，为了验证仿真结果的准确性与定量物理参数之间的关系，根据有限元分析(FEA)的结果，对肠器官芯片中的物理参数进行了实验验证；流量可以在10μL/h～400μL/h范围内用注射泵和2ml无菌注射器校准；用注射泵和1ml无菌注射器校准多孔膜的拉伸应变。
细胞培养，人结肠腺癌细胞系Caco-2(RuYao Biotechnology，Zhejiang，China)在DMEM(Gibco，Waltham，MA，USA)、10％胎牛血清(FBS；A3160801，Gibco，USA)和1％青霉素/链霉素(MA0110，Meilunbio，China)的T25培养瓶上培养；所有实验均采用第5～10代之间的Caco-2细胞；对细胞进行了支原体污染的常规检测，结果为阴性；细胞培养可以采用常规或现有技术实现，在此不再详述。
上皮屏障功能的检测，通过共聚焦免疫荧光显微镜对紧密连接蛋白ZO-1的染色和通过测量跨上皮电阻(TEER)来评估人类肠上皮细胞单层的完整性。用Autolab电化学工作站(PGSTAT302N，Herisau，Switzerland)与Ag/AgCl电极线耦合，测量了培养在肠器官芯片和Transwell中的Caco-2单层的TEER。TEER值使用以下公式计算：
TEER＝(R1-R0)·S
其中，R1为实际测量值；R0是在没有细胞的情况下测量的基值电阻；S是细胞培养的表面积。
暴露在不同浓度汞离子中细胞活性检测，为研究不同浓度Hg2+对Caco-2细胞活性的影响，采用活/死细胞染色试剂盒(MA0361，Dalian Meilun Biotechnology Co.，Ltd，China)进行图像分析；1mMHg2+在无血清培养基中稀释为0.5μM、1μM、10μM、30μM、50μM、100μM和200μM，每个浓度分别作用5h、12h和24h。200μL活/死细胞染色试剂盒孵育3min后，用胰蛋白酶/EDTA(0.25％，25200-056，USA)处理Caco-2细胞。用倒置荧光显微镜(Nikon EclipseTI2)分别在495nm和652nm处记录活细胞(绿色荧光)和死亡细胞(红色荧光)的荧光图像；使用ImageJ软件(National Institutes of Health)对活/死细胞进行计数，计算细胞存活率。
为了建立体外肠道微环境，克服目前芯片上肠管没有优化体外仿生条件(如生理运动和流体流动)的缺点，本实施例提供了一种双通道、机械可伸展的肠道芯片。三电极电化学传感器阵列和Ag/AgCl电极分别集成在芯片多孔膜的底沟道表面、顶面和底面；传感器用于实时、非侵入性监测TEER和吸收Hg2+的变化，如图1到图3所示。通过有限元分析(FEA，COMSOL MultiPhysical 5.5，试用版)对肠器官芯片内部物理参数的仿生条件进行了模拟，确定了合适的灌注流量和拉伸应变，物理参数可以为流体剪应力、拉应力和应变，灌注流量可以设置为160μL/h；0.02dyne/cm2，拉伸应变可以设置为1％，如图4所示。当灌注流量为40～360μL/h时，培养液的剪应力范围为0.005dyne/cm2-0.05dyne/cm2，并流场模拟、理论计算和实验进行了交叉验证，如图5所示。通过有限元分析和实验验证，证明了当吸气压力从0kPa增加到20kPa时，多孔膜和细胞团的变形量都可以从0％线性增加到5.5％，如图6所示，从而使上皮细胞单层产生有节奏的机械变形(类似于人体肠道的蠕动运动)。为了确定多孔膜在长期拉伸下是否会发生疲劳破坏，本实施例中测量了1.4×105循环拉伸(10days)下多孔膜的孔径和杨氏模量的变化。孔直径由5.19±0.10μm略微增大至5.28±0.25μm，如图7所示，杨氏模量由2.54±0.06MPa漂移至2.54±0.05MPa，如图8所示。因此，在一定应变范围内的长期机械拉伸对多孔膜的孔径和杨氏模量的物理性能没有显著改变。
如图1和图2所示，上下微通道由中间多孔膜隔开，细胞接种于其表面，形成生物层界面。三电极传感器和Ag/AgCl电极同时集成，用于原位检测Hg2+和TEER；图3为集成传感器的肠器官芯片照片；图4为微通道有限元分析(流速、剪应力、拉应力和应变)；图5为流场模拟、理论计算和实验的交叉验证；图6为多孔膜拉伸应变的量化。可以得到，通过机械模拟和实验验证，证明随着吸入压力从0增加到20kPa，多孔膜和细胞团的变形从0％线性增加到5.5％(n＝3)；如图7所示，在1％拉伸应变下10天内多孔膜的孔径变化。RSD＝1.81％(n＝3)；如图8所示，多孔膜在1％拉伸应变下10天内杨氏模量的变化。RSD＝0.07％(n＝3)。
肠器官芯片对吸收汞离子的原位和实时检测，为了实现小肠上皮细胞对Hg2+吸收的实时检测，本实施例在芯片上肠底通道中集成了一个检测Hg2+的三电极传感器阵列；三电极传感器主要由四部分组成：玻璃衬底、10nm厚的Gr层、200nm厚的Au层和金纳米颗粒(AuNPs)层。如图9所示，展示了检测系统的照片以及三电极传感器修饰AuNPs和检测Hg2+的步骤。检测基于Hg2+的氧化还原反应原理。
在最佳条件下，研究了三电极传感器测定Hg2+的校准曲线。Hg2+的峰电流出现在0.02V，在1nM-10μM浓度范围内，峰电流从0.5μA持续增加到7.8μA，如图10所示，。汞离子的拟合曲线为Δi＝0.16976+1.78083lgC(R2＝0.983)。其中Δi为氧化峰电流之差，lgC为Hg2+的对数浓度，如图11所示，。计算出对Hg2+的灵敏度为1.78μA/nM，检出限为0.1nM。
接下来，本实施例在180min内原位检测了Transwell和肠器官芯片中肠上皮细胞对Hg2+的吸收。在180min的检测过程中，Transwell和芯片上的肠上皮细胞对Hg2+的吸附浓度分别为2.3μM和1.8μM，吸收率分别为22％和17.8％(顶室/通道的初始Hg2+浓度为10μM)，如图12所示，。此外，通过计算两种培养方法对Hg2+的转运渗透率(Papp)，得出Transwell的Papp值是肠器官芯片的4倍，如图13所示，。这是因为单层细胞在机械刺激下形成更高的紧密连接。
Hg2+的吸收率<15.0％，低于Caco-2细胞实验的吸收率(17.8％)。应该考虑到，活体研究的特点是存在管腔因素(胆盐、食物成分等)。这在体外模型中没有发现，可能会影响Hg2+在肠上皮细胞间的转运。因此，该肠道模型能真实反映人体肠道对Hg2+的吸收情况。
如图9到图10所示，为上皮细胞对汞离子的吸收；其中，如图9所示，为检测装置实物图和三电极传感器检测Hg2+示意图；如图10所示，为三电极传感器在1nM至10μM不同Hg2+浓度下的DPV响应；如图11所示，为ΔI(峰值电流与背景电流之差)与Hg2+浓度的拟合结果；ΔI＝0.16976+1.78083lgC(R2＝0.983)；如图12所示，为Transwell和肠器官芯片培养180分钟的Hg2+吸收变化曲线。在180分钟的检测过程中，Transwell和芯片中肠上皮细胞吸收的Hg2+浓度分别为2.3μM和1.8μM，吸收率分别为22％和17.8％，加入的初始浓度为10μM，n＝3；如图13所示，为Transwell和肠器官芯片吸收Hg2+的Papp值比较。Transwell的Papp值是肠器官芯片的4倍(n＝3)。
实施例2：
本实施例提供了一种用于探索汞离子的肠器官芯片，使用实施例1中所述的用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法得到，包括：
开设有通道的第一层结构和第二层结构；
多孔膜，位于第一层结构和第二层结构之间；多孔膜将第一层结构上的通道和第二层结构上的通道隔开；
装有三电极传感器的玻璃片，与第一层结构固定，三电极传感器的测试端位于第一层结构的通道内；
第一银-氯化银电极和第二银-氯化银电极，分别通过预设的通孔设置在肠器官芯片两侧，两侧的通孔分别与第一层结构上的通道和第二层结构上的通道贯通。
以上所述仅为本实施例的优选实施例而已，并不用于限制本实施例，对于本领域的技术人员来说，本实施例可以有各种更改和变化。凡在本实施例的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实施例的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，其特征在于，包括：
制作包括第一层结构和第二层结构的肠器官芯片，所述第一层结构和所述第二层结构上均设置有通道；通道通过硅胶毛细管连接有注射泵；
将第一层结构中通道的一侧外壁去掉；将肠器官芯片固定在固定有三电极传感器阵列的玻璃片上，第一层结构靠近通道去掉外壁的一侧与玻璃片固定，三电极传感器的测试端位于第一层结构的通道中；
在所述肠器官芯片两侧，分别开设与通道平行且贯通的通孔，所述通孔内插入银-氯化银电极。
2.如权利要求1所述的一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，其特征在于，肠器官芯片的制作包括：
将预设比例的基料与固化剂混合，在真空中脱气第一预设时长；
将脱气后的基料与固化剂混合料分别浇筑在预设有多个通道图案的第一模具和第二模具上；在预设温度下热固第二预设时长；脱模得到具有通道的第一层结构和第二层结构；
在所述第一层结构上打孔；对打孔后的第一层结构、第二层结构和多孔膜进行氧等离子体清洗，清洗时长为第三预设时长；
将清洗后的第一层结构和第二层结构进行粘合，所述多孔膜位于所述第一层结构上的通道和所述第二层结构上的通道之间；
每个通道连通硅胶毛细管；硅胶毛细管连接有注射泵。
3.如权利要求2所述的一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，其特征在于，基料与固化剂的预设比例为重量比是10：1；第一预设时间为30分钟；第二预设时长为4小时；第三预设时长为120秒。
4.如权利要求2所述的一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，其特征在于，所述基料为聚二甲基硅氧烷基料。
5.如权利要求1所述的一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，其特征在于，将肠器官芯片固定在固定有三电极传感器阵列的玻璃片上时，先将肠器官芯片和装有三电极传感器的玻璃片进行氧等离子体清洗。
6.如权利要求5所述的一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，其特征在于，肠器官芯片和装有三电极传感器的玻璃片进行氧等离子体清洗的清洗时间为120秒。
7.如权利要求1所述的一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，其特征在于，将肠器官芯片固定在装有三电极传感器的玻璃片上后，用半固态聚二甲基硅氧烷对肠器官芯片周围进行密封；通孔内插入银-氯化银电极后，用半固态聚二甲基硅氧烷对通孔处进行密封。
8.如权利要求1所述的一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，其特征在于，银-氯化银电极包括第一银-氯化银电极和第二银-氯化银电极；所述第一银-氯化银电极位于和第一层结构的通道贯通的通孔内，所述第二银-氯化银电极位于和第二层结构的通道贯通的通孔内。
9.如权利要求8所述的一种用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法，其特征在于，所述第一银-氯化银电极和所述第二银-氯化银电极连接有电化学工作站。
10.一种用于探索汞离子的肠器官芯片，其特征在于，使用权利要求1-9任一项所述的用于探索汞离子的肠器官芯片制备的优化方法得到，包括：
开设有通道的第一层结构和第二层结构；
多孔膜，位于第一层结构和第二层结构之间；多孔膜将第一层结构上的通道和第二层结构上的通道隔开；
装有三电极传感器的玻璃片，与第一层结构固定，三电极传感器的测试端位于第一层结构的通道内；
第一银-氯化银电极和第二银-氯化银电极，分别通过预设的通孔设置在肠器官芯片两侧，两侧的通孔分别与第一层结构上的通道和第二层结构上的通道贯通。
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