CN115152626A - 一种三角梅多倍体种质的创制方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种三角梅多倍体种质的创制方法及其应用，属于植物多倍体诱导技术领域。本发明提供了一种三角梅多倍体种质的创制方法，将秋水仙素溶液滴加在三角梅幼苗的叶腋处进行染色体加倍，经倍性鉴定后得到的多倍体植株即为所述的三角梅多倍体种质。本发明避免了离体组织培养等复杂的技术环节，诱导周期短，只需将秋水仙素溶液处理三角梅幼苗的叶腋处即可，减少了秋水仙素的使用量，通过调整秋水仙素溶液的具体处理方式和条件，实现了三角梅多倍体种质创制，不仅提高了三角梅多倍体种质的诱导效率，而且处理方法简单，容易控制和操作，成本低，便于推广。
Description
技术领域
本发明涉及植物多倍体诱导技术领域，特别是涉及一种三角梅多倍体种质的创制方法及其应用。
背景技术
三角梅(Bougainvillea)，又称勒杜鹃、九重葛、叶子花等，最早发现于南美洲，是紫茉莉科(Nyctaginaceae)三角梅属(Bougainvillea)的一种常见的多年生木本植物，现已经广泛用作观赏园艺植物，种植在世界各地尤其是热带亚热带地区。三角梅品种多样，适应性强，易栽培，花色多，花期长，广泛应用于园林造景、路桥美化、节庆花展、家庭盆栽等，是产业规模最大的热带景观植物之一。
三角梅属分布有18个种，其中具有较高观赏性，应用到园艺栽培中的有光叶三角梅(B.glabra)、毛叶三角梅(B.spectabilis)和秘鲁三角梅(B.peruviana)，均为二倍体物种，是栽培品种的重要基因来源。然而，三角梅种间杂交品种、二倍体(2n＝2×＝34)与四倍体(2n＝2×＝34)杂交得到的三倍体杂种F1(2n＝3×＝51)，都存在高度不育的现象，制约了育种工作的持续性开展。主要原因有：(1)三角梅属不同种间染色体的同源程度低，产生的杂种F1的染色体在减数分裂时不能配对成正常的二价体，低同源性的染色体呈单价体形式存在；(2)种间杂种存在染色体易位、倒位等结构上的变异，形成多价体和单价体；(3)三倍体杂种减数分裂时同源染色体联会紊乱，不能均等分离。这些均能导致杂种配子的形态结构、细胞学变异和高度不育性。建立染色体加倍的技术体系，能够获得更多可育的杂种后代，为三角梅规模化育种扫清障碍。另外多倍化赋予植株茎秆粗壮、花叶巨大、胁迫抗性强等新的优良性状，产生有育种应用价值的优异新种质。
目前已知三角梅的多倍化主要由两种途径产生：(1)自然变异，出现率低，多为嵌合体，不易被发现。(2)离体组织培养诱导产生，周期长、技术步骤繁琐、设施条件依赖性高、只能针对特定品种等，而且现有的三角梅多倍体的诱导效率很低，远远不能满足开展规模化育种对大量可育亲本材料的需求，限制了三角梅的育种研究和发展。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种三角梅多倍体种质的创制方法，以三角梅的幼苗作为诱导材料，能够提高三角梅多倍体种质的诱导效率，同时减少诱导剂的用量，且成本低、简单易行、处理时间短。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种三角梅多倍体种质的创制方法，包括如下步骤：
将秋水仙素溶液滴加在三角梅幼苗的叶腋处进行染色体加倍，经倍性鉴定后得到的多倍体植株即为所述的三角梅多倍体种质；所述秋水仙素溶液的浓度为100-500mg/L，所述秋水仙素溶液的处理时间为1-5天。
优选的，所述秋水仙素溶液中含有1-2％的DMSO。
优选的，所述叶腋为三角梅幼苗的子叶叶腋或真叶未长出时两个子叶中间的生长点。
优选的，所述滴加的次数为每天两次。
优选的，所述倍性鉴定的对象为染色体加倍处理后萌发的枝条。
优选的，得到的多倍体植株进行所述倍性鉴定的次数≥3次。
优选的，所述三角梅幼苗为三角梅自然授粉或亲本杂交、授粉、结实后所得的种子萌发所得。
优选的，所述授粉的花朵为当天开放的花朵。
优选的，所述种子萌发的基质为疏松透气材料。
本发明还提供了上述的方法在三角梅育种中的应用。
本发明提供了一种三角梅多倍体种质的创制方法，以三角梅的幼苗为作为诱导材料，处理方法简单，容易控制和操作。本发明所述方法只需将秋水仙素溶液处理三角梅幼苗的叶腋处即可，减少了秋水仙素的使用量，通过调整秋水仙素溶液的具体处理方式和条件，实现了三角梅多倍体种质创制。经实验证实，本发明所述方法能够提高三角梅多倍体种质的诱导效率，最高能达到46.43％；同时所述方法无需组培操作，不需要无菌环境，操作简单，成本低，便于推广。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的毛叶三角梅B.spectabilis cv.‘Rosa Catalina’(2×)和光叶三角梅B.glabra cv.‘Bixi’(2×)种间杂交F1后代。
图2为本发明实施例1提供的母本B.spectabilis cv.‘Rosa Catalina’(2×)的细胞核DNA流式细胞分析图。
图3为本发明实施例1提供的父本B.glabra cv.‘Bixi’(2×)的细胞核DNA流式细胞分析图。
图4为本发明实施例1提供的染色体加倍后的‘Rosa Catalina’בBixi’子代种子苗四倍体细胞核DNA流式细胞分析图。
图5为本发明实施例1提供的染色体加倍后的‘Rosa Catalina’בBixi’子代种子苗二倍体/四倍体混倍体流式细胞分析图。
图6为本发明实施例1提供的‘Rosa Catalina’בBixi’子代成功加倍后的四倍体植株。
图7为本发明实施例1提供的‘Rosa Catalina’בBixi’子代成功加倍后的2×/4×混倍体植株。
图8为本发明实施例2提供的‘Rosa Catalina’(2×)为母本、‘TetraMiss Manila’(4×)为父本的杂交子代种子苗，经染色体加倍后的六倍体流式细胞分析图。
图9为本发明实施例2提供的‘Rosa Catalina’(2×)为母本、‘TetraMiss Manila’(4×)为父本的杂交子代种子苗，经染色体加倍后的3×/6×混倍体流式细胞分析图。
图10为本发明实施例2提供的‘Rosa Catalina’(2×)为母本、‘TetraMissManila’(4×)为父本成功加倍后的六倍体植株。
具体实施方式
本发明提供了一种三角梅多倍体种质的创制方法，包括如下步骤：
将秋水仙素溶液滴加在三角梅幼苗的叶腋处进行染色体加倍，经倍性鉴定后得到的多倍体植株即为所述的三角梅多倍体种质；所述秋水仙素溶液的浓度为100-500mg/L，所述秋水仙素溶液的处理时间为1-5天。
本发明中，所述秋水仙素溶液的浓度优选为200-400mg/L，更优选为300mg/L；所述秋水仙素溶液的处理时间优选为2-4天，更优选为3天。本发明所述秋水仙素溶液中优选的含有1-2％的DMSO，所述DMSO能够增加渗透作用，提高秋水仙素的诱导效率。
本发明待三角梅种子萌发幼苗长出真叶后，去掉真叶，然后将秋水仙素溶液滴加到叶腋处。本发明中，所述叶腋优选为三角梅幼苗的子叶叶腋或真叶未长出时两个子叶中间的生长点。本发明中，所述滴加的次数优选为每天两次，更优选为每天早晚各一次。本发明对滴加的量并没有特殊限定，只要能够使秋水仙素溶液的液滴包裹腋芽，并且不滑落即可。本发明对所述滴加的方式并没有特殊限定，在本发明的具体实施例中，所述滴加优选的利用移液器进行。
本发明对染色体加倍后的三角梅进行倍性鉴定。本发明中，所述倍性鉴定的对象优选为染色体加倍处理后萌发的枝条，所述倍性鉴定的对象更优选为枝条上新长出的幼嫩叶片。本发明选择幼嫩叶片的原因在于：幼嫩叶片容易切割，制备的细胞核悬液浓度较高，DNA片段较少，流式鉴定时杂峰较少。本发明对所述倍性鉴定的具体方式并没有特别限定，在本发明的具体实施例中，所述倍性鉴定优选的采用流式细胞仪。本发明中，在进行流式细胞仪检测前，优选的将倍性鉴定的对象利用WPB裂解液和DAPI染液进行处理，所述WPB裂解液优选包括如下成分：0.2mol/LTris-HCL、86mmol/LNacl、10mmol/L焦亚硫酸钠、4mmol/LMgCL2·6H2O、2mmol/L EDTA-Na2·2H2O、1％PVP-10、1％(V/V)Triton X-100，pH7.5。本发明中，得到的多倍体植株进行所述倍性鉴定的次数优选≥3次，更优选≥5次，且每次鉴定的结果保持一致。
本发明中，所述三角梅幼苗优选为自然授粉或三角梅亲本杂交、授粉、结实后所得的种子萌发所得。本发明中，所述授粉选取的花朵优选为当天开放的花朵。本发明得到三角梅种子后播种到基质中进行萌发。本发明中，所述种子在播种前优选的剥去果皮，所述基质优选为疏松透气材料，更优选为细泥炭。本发明所述的基质能够保证三角梅种子更好的萌发，从而获得良好的三角梅幼苗，有利于后续诱导的进行。
本发明还提供了上述的方法在三角梅育种中的应用。
本发明中，所用原料、试剂与设备均为已知产品，采用常规市售产品即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.种子获取：以毛叶三角梅B.spectabilis cv.‘Rosa Catalina’(2×)为母本，光叶三角梅B.glabra cv.‘BiXi’(2×)为父本，在花期选择当天开放的花朵进行人工授粉。种子成熟后挑选大小一致、籽粒饱满的种子备用。
2.播种：将剥去果皮的种子播种在盛满细泥炭的32孔穴盘中，每孔1粒，每天浇水，保持泥炭湿润，得到正常的杂交后代幼苗，如图1。
3.染色体加倍：种子萌发长出1片真叶后，去掉真叶，只留子叶及其叶腋处未萌发腋芽。用移液枪将10μL含有2％DMSO的0mg/L、300mg/L、500mg/L的秋水仙素溶液滴在芽点处，使溶液包裹住芽点且溶液不滑落，每天早晚各一次，处理5天。
4.倍性鉴定：2个月后对所有新长出的枝条进行倍性鉴定。选取每个枝条上2个幼嫩叶片进行混合，在WPB裂解液中用锋利的刀片快速将其切碎，用尼龙网过滤后加入DAPI染液，上流式细胞仪进行检测，以确定枝条的倍性。
5.田间管理：对鉴定出的四倍体和二倍体和四倍体混倍体进行重复检测，多次倍性鉴定结果相同的植株确定为多倍体。对于存在多个枝条的植株，抹去未加倍成功的枝条，仅留下加倍成功的枝条。
结果
利用流式细胞仪检测母本B.spectabilis cv.‘Rosa Catalina’(2×)的结果如图2，检测父本B.glabra cv.‘Bixi’(2×)的结果如图3。染色体加倍后的种子苗四倍体流式细胞分析图如图4，染色体加倍后的种子苗二倍体/四倍体混倍体流式细胞分析图如图5。其中，所有对照植株均为正常二倍体。
据本实施例检测结果统计，300mg/L浓度秋水仙素处理后，获得四倍体枝条9个(如图6)，占32.14％；二倍体/四倍体的混倍体4个(如图7)，占14.29％，总体多倍体诱导率为46.43％。500mg/L浓度秋水仙素处理后，获得四倍体枝条11个，占27.50％；二倍体/四倍体的混倍体5个，占12.50％，总体多倍体诱导率为40.00％。
表1三角梅杂交组合Rosa Catalina’בBiXi’的子代加倍结果
实施例2
1.种子获取：以二倍体三角梅品种‘Rosa Catalina’(2×)为母本，四倍体品种‘TetraMiss Manila’(4×)为父本，在花期选择当天开放的花朵进行人工授粉。种子成熟后挑选大小一致、籽粒饱满的种子备用。
2.播种：将剥去花被管的85粒种子播种在盛满细泥炭的32孔穴盘中，每孔1粒，每天浇水，保持泥炭湿润，得到正常的杂交后代F1，如图7。
3.染色体加倍：种子萌发长出2片真叶后，去掉真叶，只留子叶及其叶腋处未萌发腋芽。用移液枪将12μL含有2％DMSO的0mg/L、300mg/L、500mg/L的秋水仙素溶液滴在芽点处，使溶液包裹住芽点且溶液不滑落，每天早晚各一次，处理5天。
4.倍性鉴定：2个月后对所有新长出的枝条进行倍性鉴定。选取每个枝条上3个幼嫩叶片进行混合，在WPB裂解液中用锋利的刀片快速将其切碎，用尼龙网过滤后加入DAPI染液，上流式细胞仪进行检测，以确定枝条的倍性。
5.田间管理：对鉴定出的六倍体和三倍体/六倍体混倍体进行重复检测，多次倍性鉴定结果相同的植株确定为多倍体。对于存在多个枝条的植株，抹去未加倍成功的枝条，仅留下加倍成功的枝条。
结果
染色体加倍后的种子苗六倍体流式细胞分析图如图8，染色体加倍后的种子苗三倍体/六倍体混倍体流式细胞分析图如图9。其中，所有对照植株均为正常三倍体。
本实施例检测结果显示，300mg/L浓度秋水仙素处理后，获得六倍体枝条4个(如图6)，占12.90％；三倍体/六倍体的混倍体7个(如图7)，占22.58％，总体多倍体诱导率为35.48％。500mg/L浓度秋水仙素处理后，获得六倍体枝条6个，占11.11％；三倍体/六倍体的混倍体9个，占16.67％，总体多倍体诱导率为27.78％。
表2三角梅杂交组合‘Rosa Catalina’(2×)בTetra Miss Manila’(4×)的子代加倍结果
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种三角梅多倍体种质的创制方法，其特征在于，包括如下步骤：
将秋水仙素溶液滴加在三角梅幼苗的叶腋处进行染色体加倍，经倍性鉴定后得到的多倍体植株即为所述的三角梅多倍体种质；所述秋水仙素溶液的浓度为100-500mg/L，所述秋水仙素溶液的处理时间为1-5天。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述秋水仙素溶液中含有1-2％的DMSO。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述叶腋为三角梅幼苗的子叶叶腋或真叶未长出时两个子叶中间的生长点。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滴加的次数为每天两次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述倍性鉴定的对象为染色体加倍处理后萌发的枝条。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，得到的多倍体植株进行所述倍性鉴定的次数≥3次。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三角梅幼苗为三角梅自然授粉或亲本杂交、授粉、结实后所得的种子萌发所得。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述授粉的花朵为当天开放的花朵。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子萌发的基质为疏松透气材料。
10.权利要求1-9任意一项所述的方法在三角梅育种中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202211005347.6A Pending CN115152626A (zh) | 2022-08-08 | 2022-08-22 | 一种三角梅多倍体种质的创制方法及其应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN120971712A (zh) * | 2025-08-12 | 2025-11-18 | 深圳科诺医学检验实验室 | 一种流式倍性分析试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102499071A (zh) * | 2011-12-15 | 2012-06-20 | 深圳市仙湖植物园管理处 | 一种簕杜鹃的化学诱变育种方法 |
| CN114667927A (zh) * | 2022-04-24 | 2022-06-28 | 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 | 一种离体诱导三角梅多倍体的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN106035076B (zh) * | 2016-06-20 | 2018-06-15 | 西南林业大学 | 一种通过浸泡法诱导无籽刺梨四倍体产生的方法 |
| CN108990793B (zh) * | 2018-08-15 | 2021-03-19 | 江苏农林职业技术学院 | 一种四倍体矮牵牛的培育方法 |
| US20220117184A1 (en) * | 2020-10-16 | 2022-04-21 | Green Point Research Holdings LLC | Method for Producing Sterile Cannabis Sativa L. Cultivars |
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2022
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- 2022-09-26 NL NL2033132A patent/NL2033132B1/en active
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (5)
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|---|
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| 孙利娜;: "关于我国宝巾花育种的思考" * |
| 杜学林等: "三角梅属研究进展" * |
| 田高飞;焦航;段嵩岚;吴艳芳;陈莹;闫淑君;: "三角梅属(Bougainvillea)研究进展" * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN120971712A (zh) * | 2025-08-12 | 2025-11-18 | 深圳科诺医学检验实验室 | 一种流式倍性分析试剂盒 |
Also Published As
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