CN115078564B - 一种超快速定量尿液中胺类物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对尿液样本中胺类物质分析方法。体内中胺类物质包括氨基酸和生物胺，如多胺和杂环胺等。是一类具有重要生理作用的内源性物质，在细胞增殖、蛋白质与核酸合成等方面起着重要作用。可以作为癌症标记物应用于癌症的诊断与治疗。目前当采用GC‑MS分析体内胺类物质，需先进行衍生化反应，但是大多数GC‑MS衍生化反应操步骤繁琐，反应条件苛刻且反应时间长，并且在样品前处理中有机溶剂消耗大。本发明提供一种简化的，超快速、高灵敏度的胺类物质分析的方法，为临床癌症诊断与治疗提供了依据。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，一种超快速定量尿液中胺类物质的方法，更确切地说是一种应用“原位萃取衍生化”策略对尿液中20种胺类物质同时进行高灵敏地定量分析的方法。
背景技术
胺类物质，包括氨基酸和生物胺，在生物体内广泛存在，参与细胞增殖和分化，蛋白质核酸等的生物合成，大量研究表明体液中的胺类物质的含量与癌症的发生发展密切相关，可作为癌症的诊断标志物。
GC-MS成本低廉，普及度高，并且具有较高的分辨率和检测灵敏度以及完善的标准谱库。在应用于体内代谢物如胺类物质分析时，需先对代谢物进性衍生化以提高其挥发性和热稳定性。但是目前大多数GC-MS衍生化反应操步骤繁琐，反应条件苛刻且反应时间长。例如硅烷化反应需要在严格无水条件下高温反应30min以上。并且在样品前处理中有机溶剂消耗大。因此，与GC-MS相匹配的超快速，高灵敏度的生物样本前处理技术是目前研究的难点。
近年来，固相微萃取技术由于其不用有机溶剂，且集采样、净化和进样为一体在和GC-MS联用分析生物样品中体内代谢物方面得到了广泛应用。但有限和高昂的商品化纤维涂层以及较慢的萃取和衍生化速度仍是需要解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种“原位萃取衍生化”的策略，即将碳纤维上生长碳纳米纤维(CNFs/CFs)作为萃取基底，将碳纳米纤维/碳纤维的纳米孔限域溶剂丙酮，在纳米孔隙内依据纳米限域效应可以实现超快速萃取和衍生化操作。并建立一种超快速分析尿液中20种胺类物质的GC-MS分析方法，通过建立的分析方法测定了健康人和肺癌、乳腺癌和结直肠癌患者尿液中的20种胺类物质的浓度，并通过独立样本t-检验、PLS-DA、单因素和多因素ROC分析筛选出了不同癌症的诊断生物标记物。该方法有机溶剂消耗少，且材料的耐用性较强，在体内代谢物分析方面体现了较强的优势。
具体方案如下：
一种超快速定量尿液中胺类物质的方法，具体包括以下步骤：
S1、“原位萃取衍生化”策略：
a、将尿液和内标溶液等体积混合，将一定量CNFs/CFs插入汉密尔顿微量注射器(250μL)针尖内，将一定量丙酮用蠕动泵以一定的速度通过所述针尖，后将一定量所述混合后的尿液样本用蠕动泵以一定的速度通过所述针尖；
b、将所述针尖插入到一定量五氟丙酸酐中，使五氟丙酸酐在室温下用蠕动泵以一定的速度通过针尖；
c、将所述针尖插入GC手动进样口，进样口温度280℃，然后通过针管向进样口中推进一定量空气完成进样过程；
S2、气相分离：
选取HP-5MS为GC色谱柱，采用程序升温，并控制载气流速；
S3、MS测定：
Agilent 5977B四极杆质谱，采用电子轰击电离源(EI)，选择离子监测模式；
S4、数据处理：
通过独立样本T检验、PLS-DA筛选癌症的诊断生物标志物，并通过多因素ROC曲线评价其诊断能力。
优选地，步骤S1所述的a操作中，所述CNFs/CFs的用量为1.0～3.0mg。
优选地，步骤S1所述的a操作中，所述丙酮的用量为10μL～100μL，所述蠕动泵推进所述丙酮的速度为0.1～0.6μL s-1。
优选地，步骤S1所述的a操作中，所述混合后尿液样本的用量为10μL～100μL，所述蠕动泵推进所述混合尿液样本的速度为0.1～0.6μL s-1。
优选地，步骤S1所述的b操作中，所述五氟丙酸酐的用量为10μL～100μL，所述蠕动泵推进所述五氟丙酸酐的速度为0.1～0.6μL s-1。
优选地，步骤S1所述的c操作中，通过所述针管向所述进样口中推进空气的量为50μL～300μL。
优选地，步骤S2中，所述程序升温为：柱温由50℃上升到280℃所用时间≤30min。
优选地，步骤S1所述的c操作中，所述针尖插入GC手动进样口时间为20s～60s。
优选地，步骤S2中，所述载气流速为0.6～1.0ml·min-1。
优选地，步骤S3中，电离电子能量为70eV。
优选地，步骤S4中，所述癌症为肺癌、结直肠癌和/或乳腺癌。
本发明的有益效果为：
本发明通过直接热解析进样方式不仅简化了前处理步骤，相比于溶剂洗脱联合自动进样方式，这种完全进样方式显著提升了物质的检测限，如表1所示。
表1:原位萃取衍生化方法与溶剂洗脱方法的灵敏度对比
附图说明
图1为“原位萃取衍生化”策略的样品处理过程。
图2为肺癌的胺类物质生物标志物的PLS-DAscore图。
图3为结直肠癌的胺类物质生物标志物的PLS-DAscore图。
图4为乳腺癌的胺类物质生物标志物的PLS-DAscore图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
S1、“纤维内衍生化”策略：
a、将尿液和内标溶液等体积混合。将2.5mgCNFs/CFs插入汉密尔顿微量注射器(250μL)针尖内，将10μL丙酮用蠕动泵以0.3μLs-1的速度通过针尖。后将20μL混合后的尿液样本用蠕动泵以0.2μLs-1的速度通过针尖。
b、将针尖插入到10μL五氟丙酸酐中，使五氟丙酸酐在室温下用蠕动泵以0.06μLs-1的速度通过针尖。
c、将针尖插入GC手动进样口20s，进样口温度280℃。然后通过针管向进样口中推进50μL空气完成进样过程。
S2、气相分离：色谱柱：HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；载气流速：1.0ml·min-1；GC-MS接口温度：280℃；程序升温过程见表2。
表2程序升温过程
S3、MS测定：采用电子轰击电离源(EI)，电离电子能量：70eV，选择离子监测模式。其他参数与待测物离子通道见表3。
表320种胺类物质GC-MS参数
S4、数据处理：首先通过独立样本T检验、PLS-DA筛选癌症的诊断生物标志物，并通过多因素ROC曲线评价其诊断能力。最终确定肺癌的生物标志物为DAP，SPD，SPM，PUT，CAD；结直肠癌的生物标志物为SPM，DAP，PUT，SPD，Ala；乳腺癌的生物标志物为DAP，PUT，Thr，Val。
实施例2
S1、“纤维内衍生化”策略：
a.将尿液和内标溶液等体积混合。将2.0mg CNFs/CFs插入汉密尔顿微量注射器(250μL)针尖内，将10μL丙酮用蠕动泵以0.3μL s-1的速度通过针尖。后将20μL混合后的尿液样本用蠕动泵以0.2μL s-1的速度通过针尖。
b.将针尖插入到10μL五氟丙酸酐中，使五氟丙酸酐在室温下用蠕动泵以0.06μLs-1的速度通过针尖。
c.将针尖插入GC手动进样口20s，进样口温度280℃。然后通过针管向进样口中推进50μL空气完成进样过程。
S2、气相分离：色谱柱：HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；载气流速：1.0ml·min-1；GC-MS接口温度：280℃，程序升温过程见表4。
表4程序升温过程
步骤S3和S4与实施例1相同
实施例3
S1、“纤维内衍生化”策略：
a.将尿液和内标溶液等体积混合。将2.5mg CNFs/CFs插入汉密尔顿微量注射器(250μL)针尖内，将20μL丙酮用蠕动泵以0.5μL s-1的速度通过针尖。后将20μL混合后的尿液样本用蠕动泵以0.2μL s-1的速度通过针尖。
b.将针尖插入到10μL五氟丙酸酐中，使五氟丙酸酐在室温下用蠕动泵以0.06μLs-1的速度通过针尖。
c.将针尖插入GC手动进样口20s，进样口温度280℃。然后通过针管向进样口中推进50μL空气完成进样过程。
S2、气相分离：色谱柱：HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；载气流速：1.0ml·min-1；GC-MS接口温度：280℃，程序升温过程见表2。
步骤S3和S4与实施例1相同。
实施例4
S1、“纤维内衍生化”策略：
a.将尿液和内标溶液等体积混合。将2.5mg CNFs/CFs插入汉密尔顿微量注射器(250μL)针尖内，将10μL丙酮用蠕动泵以0.3μL s-1的速度通过针尖。后将50μL混合后的尿液样本用蠕动泵以0.5μL s-1的速度通过针尖。
b.将针尖插入到10μL五氟丙酸酐中，使五氟丙酸酐在室温下用蠕动泵以0.06μLs-1的速度通过针尖。
c.将针尖插入GC手动进样口20s，进样口温度280℃。然后通过针管向进样口中推进50μL空气完成进样过程。
S2、气相分离：色谱柱：HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；载气流速：1.0ml·min-1；GC-MS接口温度：280℃，程序升温过程见表2。
步骤S3和S4与实施例1相同。
实施例5
S1、“纤维内衍生化”策略：
a.将尿液和内标溶液等体积混合。将2.5mg CNFs/CFs插入汉密尔顿微量注射器(250μL)针尖内，将10μL丙酮用蠕动泵以0.3μL s-1的速度通过针尖。后将20μL混合后的尿液样本用蠕动泵以0.2μL s-1的速度通过针尖。
b.将针尖插入到30μL五氟丙酸酐中，使五氟丙酸酐在室温下用蠕动泵以0.1μL s-1的速度通过针尖。
c.将针尖插入GC手动进样口20s，进样口温度280℃。然后通过针管向进样口中推进50μL空气完成进样过程。
S2、气相分离：色谱柱：HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；载气流速：1.0ml·min-1；GC-MS接口温度：280℃，程序升温过程见表2。
步骤S3和S4与实施例1相同。
实施例6
S1、“纤维内衍生化”策略：
a.将尿液和内标溶液等体积混合。将2.5mg CNFs/CFs插入汉密尔顿微量注射器(250μL)针尖内，将10μL丙酮用蠕动泵以0.3μL s-1的速度通过针尖。后将20μL混合后的尿液样本用蠕动泵以0.2μL s-1的速度通过针尖。
b.将针尖插入到10μL五氟丙酸酐中，使五氟丙酸酐在室温下用蠕动泵以0.06μLs-1的速度通过针尖。
c.将针尖插入GC手动进样口20s，进样口温度280℃。然后通过针管向进样口中推进200μL空气完成进样过程。
S2、气相分离：色谱柱：HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；载气流速：1.0ml·min-1；GC-MS接口温度：280℃，程序升温过程见表2。
步骤S3和S4与实施例1相同。
实施例7
S1、“纤维内衍生化”策略：
a.将尿液和内标溶液等体积混合。将2.5mg CNFs/CFs插入汉密尔顿微量注射器(250μL)针尖内，将10μL丙酮用蠕动泵以0.1μL s-1的速度通过针尖。后将10μL混合后的尿液样本用蠕动泵以0.1μL s-1的速度通过针尖。
b.将针尖插入到10μL五氟丙酸酐中，使五氟丙酸酐在室温下用蠕动泵以0.2μL s-1的速度通过针尖。
c.将针尖插入GC手动进样口50s，进样口温度280℃。然后通过针管向进样口中推进100μL空气完成进样过程。
S2、气相分离：色谱柱：HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；载气流速：0.6ml·min-1；GC-MS接口温度：280℃，程序升温过程见表2。
步骤S3和S4与实施例1相同。
实施例8
S1、“纤维内衍生化”策略：
a.将尿液和内标溶液等体积混合。将2.5mg CNFs/CFs插入汉密尔顿微量注射器(250μL)针尖内，将100μL丙酮用蠕动泵以0.6μL s-1的速度通过针尖。后将100μL混合后的尿液样本用蠕动泵以0.6μL s-1的速度通过针尖。
b.将针尖插入到100μL五氟丙酸酐中，使五氟丙酸酐在室温下用蠕动泵以0.5μLs-1的速度通过针尖。
c.将针尖插入GC手动进样口20s，进样口温度280℃。然后通过针管向进样口中推进300μL空气完成进样过程。
S2、气相分离：色谱柱：HP-5MS(30m×250μm×0.25μm)；载气流速：0.8ml·min-1；GC-MS接口温度：280℃，程序升温过程见表2。
步骤S3和S4与实施例1相同。
Claims (8)
1.一种超快速定量尿液中胺类物质的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、“原位萃取衍生化”策略：
a、将尿液和1，6-二氨基己烷内标溶液等体积混合，将一定量CNFs/CFs插入汉密尔顿微量注射器针尖内，将一定量丙酮用蠕动泵以一定的速度通过所述针尖，后将一定量所述混合后的尿液样本用蠕动泵以一定的速度通过所述针尖；
b、将所述针尖插入到一定量五氟丙酸酐中，使五氟丙酸酐在室温下用蠕动泵以一定的速度通过针尖；
c、将所述针尖插入GC手动进样口20s～60s，进样口温度280℃，然后通过针管向进样口中推进一定量空气完成进样过程；
S2、气相分离：
选取HP-5MS为GC色谱柱，采用程序升温，并控制载气流速；
S3、MS测定：
Agilent 5977B四极杆质谱，采用电子轰击电离源(EI)，选择离子监测模式；
所述胺类物质为乙醇胺、多巴胺、肌氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-蛋氨酸、1，3-二氨基丙烷、腐胺、尸胺、L-赖氨酸、章鱼胺、3，4-二羟基苯乙酸、L-Dopa、间肾上腺素、亚精胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和精胺；
所属步骤S2中，所述程序升温为：柱温由50℃上升到280℃所用时间≤30min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述的a操作中，所述CNFs/CFs的用量为1.0～3.0mg。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述的a操作中，所述丙酮的用量为10μL～100μL，所述蠕动泵推进所述丙酮的速度为0.1～0.6μL s-1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述的a操作中，所述混合后尿液样本的用量为10μL～100μL，所述蠕动泵推进所述混合尿液样本的速度为0.1～0.6μL s-1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述的b操作中，所述五氟丙酸酐的用量为10μL～100μL，所述蠕动泵推进所述五氟丙酸酐的速度为0.05～0.5μL s-1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述的c操作中，通过所述针管向所述进样口中推进空气的量为50μL～300μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述的c操作中，所述针尖插入GC手动进样口时间为20s～60s。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述载气流速为0.6～1.0ml·min-1；步骤S3中，电离电子能量为70eV。
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