CN114903996B - Hedgehog通路的特异性抑制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了Hedgehog通路的特异性抑制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的应用。本发明经过试验发现在IUA小鼠上使用Hedgehog通路抑制剂‑维莫德吉(Vismodegib),可以明显抑制IUA小鼠子宫组织中Hedgehog通路的激活,同时抑制子宫内膜纤维化的发生,明显提升子宫内膜的容受性和IUA小鼠着床率/妊娠率。中重度宫腔粘连临床治疗后反复复发且复发率高,目前尚无有效治疗方法。因此Hedgehog通路抑制剂‑维莫德吉(Vismodegib)为临床上IUA患者的治疗提供了一种新的治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,特别涉及Hedgehog通路的特异性抑制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的应用。
背景技术
子宫内膜是受激素调控的组织,在没有怀孕的情况下,每个月会周期性地脱落,之后会快速地进行自我修复而不会产生疤痕或者是丧失功能。然而,当子宫内膜受到创伤或感染无法完成自我修复时,就会导致宫腔粘连(Intrauterine adhesion,IUA),即宫腔内发生粘连或者内宫颈发生粘连,造成子宫内膜基质细胞发生纤维化,导致子宫腔部分或完全闭合,伴随而来的是月经量变少、闭经、妊娠失败和胎盘异位等症状。妊娠期的子宫内膜基底层很容易受到创伤而导致宫腔粘连的发生,有报道,90%的IUA病例都是由于怀孕相关的刮宫手术导致的。
对于宫腔粘连的治疗,目前临床上主要使用宫腔镜下解粘连术,术后放置机械屏障以及激素等作为辅来治疗。但使用这些方法仅对轻度IUA治疗有效,中重度IUA术后极易复发,复发率高达62.5%。寻求中重度IUA的有效治疗方法一直是临床上亟待解决的问题。IUA是因为子宫内膜上皮再生受阻,而基质部分发生大量纤维化覆盖了正常组织,使得子宫内膜的再生修复进一步受阻。因此,目前迫切需要阐明IUA的子宫内膜纤维化发生的分子机制,寻找到新的靶向药物来治疗IUA患者。
然而关于IUA发生的确切分子机制仍然不是十分清楚。Hedgehog(Hh)信号通路是一种高度调节的、由细胞外配体、受体蛋白、细胞质信号分子和转录因子、共调节分子和靶基因组成的协同级联信号通路。Hh通路各组分的相互作用也受到时间和空间上的调节,以确保Hh通路只在恰当的细胞和组织背景下激活。Hedgehog(Hh)信号通路调控着多个至关重要的生物学过程,在成人中,受控的Hedgehog信号转导对伤口愈合、组织再生、维持机体自稳至关重要。然而,Hedgehog通路的异位激活可以导致多种肿瘤发生、发展、转移和抗药性,包括基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)、成神经管母细胞瘤(medulloblastoma,MB)和许多其他实体肿瘤和血液肿瘤。
因此,急需开发一种用于治疗宫腔粘连的药物。
发明内容
本发明目的是提供Hedgehog通路的特异性抑制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的应用,本发明经过试验发现在IUA小鼠上使用Hedgehog通路抑制剂-维莫德吉(Vismodegib),可以明显抑制IUA小鼠子宫组织中Hedgehog通路的激活,同时抑制子宫内膜纤维化的发生,明显提升子宫内膜的容受性和IUA小鼠着床率/妊娠率。
为实现所述目的,本发明采用如下技术方案:
在本发明的第一方面,提供了Hedgehog通路的特异性抑制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的应用。
进一步地,所述抑制剂包括Vismodegib。
在本发明的第二方面,提供了Ihh抑制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的应用。
在本发明的第三方面,提供了Ihh作为分子标志物在制备子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病检测试剂盒中的应用。
进一步地,所述子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病包括:宫腔粘连或子宫内膜疤痕化或由此导致的子宫性不孕、反复流产及胎盘植入的疾病中的至少一种。
进一步地,所述检测试剂盒包括Ihh检测引物,所述的引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
本发明实施例中的一个或多个技术方案,至少具有如下技术效果或优点:
本发明提供Hedgehog通路的特异性抑制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的应用,
本发明经过试验发现在IUA小鼠上使用Hedgehog通路抑制剂-维莫德吉(Vismodegib),可以明显抑制IUA小鼠子宫组织中Hedgehog通路的激活,同时抑制子宫内膜纤维化的发生,明显提升子宫内膜的容受性和IUA小鼠着床率/妊娠率。中重度宫腔粘连临床治疗后反复复发且复发率高,目前尚无有效治疗方法。因此Hedgehog通路抑制剂-维莫德吉(Vismodegib)为临床上IUA患者的治疗提供了一种新的治疗药物。
同时,本申请发现Ihh在小鼠子宫内膜损伤组与正常组存在表达量差异,在小鼠子宫内膜损伤组中高表达,Ihh通路在IUA组织异常激活,表明Ihh可以作为分子标志物在制备子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病检测试剂盒中进行应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是损伤组小鼠与假手术对照组小鼠的子宫内膜Masson染色形态图(IUA小鼠建模);
图2是假手术对照组小鼠、损伤组小鼠与损伤+Vismodegib处理组小鼠的子宫内膜Masson染色形态图;
图3是假手术对照组、损伤组与损伤+Vismodegib处理组各组小鼠的子宫内膜Ihh通路分子的mRNA表达;
图4是假手术对照组、损伤组与损伤+Vismodegib处理组各组小鼠的子宫内膜纤维化分子的mRNA表达;
图5是假手术对照组、损伤组与损伤+Vismodegib处理组各组小鼠的子宫内膜容受性分子的mRNA表达;
图6是假手术对照组、损伤组与损伤+Vismodegib处理组各组小鼠妊娠试验结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等,均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的Hedgehog通路的特异性抑制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的应用进行详细说明。
实施例1、Hedgehog通路的特异性抑制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的应用
一、IUA小鼠的模型构建
(1)将7-8周龄C57BL/6雌鼠置于超净工作台中,用2%戊巴比妥钠通过腹腔注射的方式进行麻醉。确认其麻醉后,将小鼠四肢固定好,置于无菌纱布上。
(2)小鼠腹部用75%酒精进行消毒,并剪去腹部的毛发。从尿道口上沿用剪刀逐渐剪开小鼠皮肤,进入腹腔。之后再找到膀胱,沿着膀胱上行可找到粉红色的V型子宫,用镊子将子宫拉出小鼠体外,在子宫角汇合处剪开一侧子宫角的小口,用27号无菌针头从缺口进入,由近端向远端刮子宫腔5次。另一侧子宫角作为对照,不做任何处理。
(3)用无菌可吸收性外科缝线缝合小鼠的腹部伤口,移回动物房,使用青霉素注射液一周,防止术后感染。
(4)术后7天断颈处死IUA小鼠,对小鼠进行解剖,找到两侧子宫角,剪去损伤侧和对照侧的子宫角中段1cm,用4%多聚甲醛固定过夜,用于后续形态学检查。
(5)损伤侧和对照侧的子宫角经脱水包埋后制成石蜡切片,通过Masson三色染色来观察小鼠子宫腔的结构变化,以此确定成功构建IUA小鼠。
二、IUA小鼠模型的Masson三色染色
(1)将小鼠子宫组织固定于10%的福尔马林中,常规脱水包埋。
(2)切片厚4μm,常规脱蜡至水。
(3)切片入媒染液浸染(加盖),于室温作用一晚或置入57℃-60℃的温箱内1h进行媒染,然后流水冲洗10min。
(4)天青石蓝染色液滴染2~3min,水洗2次,每次10-15s。
(5)Mayer苏木素染色液滴染2~3min,蒸馏水洗2次,每次10-15s。
(6)酸性乙醇分化液分化数秒至组织完全变红,水洗终止分化,蒸馏水冲洗10min。
(7)丽春红品红染色液滴染10min,蒸馏水洗2次,每次10-15s。
(8)磷钼酸溶液处理约10min。
(9)倾去上液,切片不用水洗,直接滴加苯胺蓝染色液染5min。
(10)用弱酸溶液洗去苯胺蓝溶液后,继续滴加弱酸工作液覆盖切片处理2min。
(11)95%的乙醇脱水30s。无水乙醇脱水2次,第一次30s,第二次1min。
(12)二甲苯透明2次,每次1-2min。中性树胶封固。
通过Masson三色染色可以观察到(图1),与假手术组小鼠子宫完整的内膜结构相比,损伤组小鼠子宫的基质部分发生明显的纤维化(蓝色胶原纤维沉积),子宫内膜腔体上皮细胞大量丢失及子宫内膜结构被破坏,表明IUA小鼠建模成功。
三、抑制剂Vismodegib处理IUA小鼠
(1)将9只小鼠随机分为3组,即假手术对照组;损伤组;损伤+Vismodegib。Vismodegib的小鼠给药剂量根据文献确定为90mg/kg。在小鼠开始手术前6小时,通过灌胃的方式喂给相应组别的小鼠。之后再按照前述方法进行小鼠IUA模型的构建。
(2)术后7天断颈处死各组小鼠,收集小鼠两侧子宫角,进行组织固定及RNA提取,用于后续实验分析。
四、抑制剂Vismodegib处理IUA各组小鼠的Masson三色染色
(1)将小鼠子宫组织固定于10%的福尔马林中,常规脱水包埋。
(2)切片厚4μm,常规脱蜡至水。
(3)切片入媒染液浸染(加盖),于室温作用一晚或置入57℃-60℃的温箱内1h进行媒染,然后流水冲洗10min。
(4)天青石蓝染色液滴染2~3min,水洗2次,每次10-15s。
(5)Mayer苏木素染色液滴染2~3min,蒸馏水洗2次,每次10-15s。
(6)酸性乙醇分化液分化数秒至组织完全变红,水洗终止分化,蒸馏水冲洗10min。
(7)丽春红品红染色液滴染10min,蒸馏水洗2次,每次10-15s。
(8)磷钼酸溶液处理约10min。
(9)倾去上液,切片不用水洗,直接滴加苯胺蓝染色液染5min。
(10)用弱酸溶液洗去苯胺蓝溶液后,继续滴加弱酸工作液覆盖切片处理2min。
(11)95%的乙醇脱水30s。无水乙醇脱水2次,第一次30s,第二次1min。
(12)二甲苯透明2次,每次1-2min。中性树胶封固。
从Masson三色染色可以看出(图2),损伤组的子宫内膜上皮发生大量丢失并且基质部分发生大面积纤维化;损伤组小鼠用Vismodegib处理后,子宫内膜纤维化程度有明显的改善。
五、抑制剂Vismodegib处理IUA小鼠后关键分子的表达分析
a、RNA的提取
(1)将小鼠子宫组织取出来后置于装有1mLTrizol的1.5mL EP管中,之后进行组织破碎,破碎充分后4℃,12000rpm离心10分钟,取上层液体到一个新的1.5mL EP管中,立即进行下一步操作。
(2)加入1/5体积(200μL)的氯仿进行抽提,充分震荡混匀后置于冰上静置10分钟,可观察到液体分层。
(3)4℃,12000rpm离心15分钟,吸取上清400μL溶液,将其转移至一个新的1.5mLEP管中。
(4)加入400μL的分析纯异丙醇,轻轻地充分混匀至液体均质,冰上静置10分钟。
(5)4℃,12000rpm离心10分钟,轻轻倒掉上清,切不可用力过猛。注意观察管底的白色沉淀,将EP管倒扣在一张吸水纸上,扣干。
(6)加入1mL的75%乙醇(用RNase-free水配制,现配现用),轻轻将沉淀吹起来,切不可吹散。
(7)4℃,12000rpm离心5分钟,弃掉上清,用小枪头吸干沉淀周围的液体,倒扣在吸水纸上,晾干至沉淀周围没有多余的液体。
(8)用DEPC水溶解沉淀(视沉淀体积大小加入适当量的DEPC水),充分混匀后用Nanodrop测定RNA的浓度及质量(A260/A280),并做好记录。
b、逆转录反应
(1)反应体系配制
在无RNA酶EP管中配制如下混合液:
表1
用移液器轻轻吹打混匀,短暂离心收集至管底。
(2)反应程序
表2
50℃ 15min
85℃ 5sec
c、实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)
(1)在qPCR管中配制如下混合液
表3
(2)按下列条件进行qPCR反应
表4
反应结束后分析扩增曲线和熔解曲线,导出Excel结果并计算分析,最后用Graphpad Prism 9.0作图。
d、所用到的引物见表5
表5引物清单
为了进一步分析验证Vismodegib对IUA小鼠子宫内膜组织Ihh通路的作用,我们对各组小鼠子宫组织的Ihh、Ptch1和Gli1的mRNA表达进行了qRT-PCR检测(图3)。结果发现,损伤组小鼠组织组织中的这些基因表达明显上调,而经Vismodegib处理后,Ihh基因的mRNA水平显著低于损伤组(P<0.01),由于Vismodegib可以阻断Hh配体与Ptch1的结合,因此Ihh不能够和Ptch1受体结合,也不能激活下游转录因子Gli1,最终表现为Ptch1和Gli1的mRNA水平也下降,差异具有统计学意义。表明使用Vismodegib可以抑制小鼠子宫内膜损伤诱导的Ihh通路的活性。
接着,我们检测了Vimentin、Tgfb-1、Col1a1和Fibronectin这四种纤维化标记分子(图4),来分析Vismodegib的处理是否能缓解小鼠子宫内膜的纤维化。结果发现,与损伤组相比,经过Vismodegib处理的IUA小鼠的这几种纤维化分子表达下调,具有统计学差异,而损伤+Vismodegib处理组跟假手术对照组相比没有统计学差异。表明抑制Hedgehog通路活性的同时也能缓解子宫内膜纤维化。
整合素β3(Integrin beta 3,Itgb3)和白血病抑制因子(Leukemia inhibitoryfactor,LIF)是目前常用的两种子宫内膜容受性标记分子,于是我们检测了各组小鼠的Itgb3和LIF的mRNA水平(图5)。结果发现,与假手术组相比,损伤组的Itgb3和LIF表达显著下调(P<0.001),说明损伤组小鼠的子宫内膜容受性较差,这也很好地解释了为什么临床上IUA患者经常发生流产或不孕不育。使用Vismodegib处理IUA小鼠后,Itgb3和LIF表达水平相比于损伤组明显提高(统计学差异分别为P<0.01,P<0.001),基本恢复至假手术组水平。表明使用Vismodegib有助于提升IUA小鼠的子宫内膜容受性。
六、抑制剂Vismodegib处理IUA小鼠后可以提升妊娠率
(1)将上述三组小鼠,每组各7只,在术后第三个动情周期(14天),按照雌:雄小鼠=1:1的比例进行合笼,次日检查各组小鼠阴道栓,发现阴道栓后计为妊娠第1天,做好观察与记录。
(2)在各组小鼠妊娠14~21天,断颈处死各组实验小鼠,检查胚胎着床情况与数量,并进行数据的统计学处理。
妊娠试验结果表明(图6),IUA小鼠经过Vismodegib处理后其妊娠率相较于IUA小鼠得到了显著提升,IUA小鼠妊娠率为35.71%,Vismodegib处理组的妊娠率为71.43%,差异具有统计学意义(p<0.01)。表明Vismodegib处理IUA小鼠不仅可以促进损伤的小鼠子宫内膜的形态恢复,从而恢复小鼠子宫内膜的功能,明显提高小鼠妊娠率。
综上可知,本发明经过试验发现在IUA小鼠上使用Hedgehog通路抑制剂-维莫德吉(Vismodegib),可以明显抑制IUA小鼠子宫组织中Hedgehog通路的激活,同时抑制子宫内膜纤维化的发生,明显提升子宫内膜的容受性和IUA小鼠着床率/妊娠率,因此Hedgehog通路抑制剂-维莫德吉(Vismodegib)为临床上IUA患者的治疗提供了一种新的治疗药物。
实施例2、Ihh作为分子标志物用于制备子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病检测试剂盒
1、Ihh在小鼠子宫内膜损伤组中高表达。具体地:
采用实施例1的方法进行RNA的提取、逆转录-定量PCR分析
采用β-actin作为内参使用2-ΔΔCq方法计算数据计算RNA相对表达量,引物由擎科生物有限公司合成,引物序列见表5。
结果如图3,图4所示,表明Ihh在子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病组、正常组(子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病)中含量有差异:与正常组相比,子宫内膜损伤导致纤维化的损伤组的Ihh及其下游Hedghod通路信号分子表达量显著提高,包括Ihh分子、Ptch1、Gli1。
2、子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病检测试剂盒
由上可知,Ihh可以作为分子标志物用于制备子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病检测试剂盒;
作为一种可选的实施方式,子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病检测试剂盒包括:
Ihh检测引物,所述的引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
还包括:用于均一化的内参引物、阳性对照模板、阴性对照模板和qPCR反应常规试剂(所述qPCR反应常规试剂本发明实施例具体采用Taq Pro Universal SYBR qPCR MasterMix(Vazyme,Inc.,Cat#Q712-02)。
采用实时荧光定量PCR试剂盒用于检测上述分子标记物的方法,包括以下步骤:
以逆转录获得的cDNA为模板,采用所述实时荧光定量PCR试剂盒配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线;所述扩增反应体系包括:SYBR-Green I Premix ExTaq10μL、如SEQ ID NO:1所示的引物(2μM)0.4μL、如SEQ ID NO:2所示的引物(2μM)0.4μL、RNase-free water 7.2μL、cDNA 2μL。所述扩增程序为:95℃5min,95℃10sec,55℃10sec,72℃20sec,除第一步外,其余共计40个循环,获得Ct Ihh;
同时用β-actin作为均一化参照引物对逆转录合成待检测样本cDNA进行qPCR扩增,获得Ct β-actin;β-actin的引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示
Ct值是指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数,反映了样本所含的起始拷贝数。起始拷贝数越少,Ct越大,反之则越小。通过计算Ct Ihh-Ctβ-actin,得出ΔCt。
对ΔCt进行分析判断原则为:
将待测样本的ΔCt值与样本的ΔCt值进行比较,并进行统计学分析获得P值,以P<0.05为差异有统计学意义。
若P<0.05,待测样本诊断为子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病;
若P≥0.05,待测样本不诊断为子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病。
本发明的检测引物检测Ihh的水平可用于诊断子宫内膜损伤导致纤维化的相关疾病。
最后,还需要说明的是,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉大学中南医院
<120> Hedgehog通路的特异性抑制剂在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacgaggaga acacgggtg 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggccctca tagtgtaaag a 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgacgttga catccgtaaa ga 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccggactca tcgtactcc 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttcaatacg tcagacattc ggg 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtaacgccag gaattgttgc ta 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctcctctta ggggccact 19
<210> 8
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1.Hedgehog通路的特异性抑制剂Vismodegib在制备用于治疗宫腔粘连的药物中的应用。
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---|---|---|---|---|
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WO2014022117A1 (en) * | 2012-07-28 | 2014-02-06 | Calitor Sciences, Llc | Substituted pyrazolone compounds and methods of use |
CN106138050A (zh) * | 2015-03-26 | 2016-11-23 | 中国医学科学院肿瘤医院 | Shh信号通路抑制剂的新用途 |
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子宫内膜息肉的宫腔镜手术及术后管理;陈雨柔等;实用妇产科杂志(第11期);1-3 * |
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