CN114878524A - 生物孔板成像装置及应用其的成像方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种生物孔板成像装置，用于采集一生物孔板的光学形貌特征，所述生物孔板成像装置包括：载物组件，包括载物台，所述载物台用于承载生物孔板并带动生物孔板发生位移；光学组件，所述光学组件包括传导单元、照明单元以及生物相机，所述照明单元朝向生物孔板设置并至少用于发出白光及荧光激发光以照射设置于所述载物台上的生物孔板，所述传导单元用于采集生物孔板内的样品受所述照明单元所发出的白光或荧光激发光照射后反馈的光学信号，所述生物相机用于接收所述传导单元采集的所述光学信号。本申请还提供生物孔板的成像方法。

Description

生物孔板成像装置及应用其的成像方法

技术领域

本申请涉及生命科学领域，尤其涉及生物孔板成像装置及应用其的成像方法。

背景技术

生物孔板作为生物化学实验中最常用的样品存放及检测载体，在细胞培养，新药品开发，核酸蛋白浓度测定等方面具有广泛的应用。一整块板由多个相互独立的单孔组成，孔与孔之间相互独立，互不影响，利用一整块板可进行不同浓度，不同类型的样品检测。但是普通生物孔板由于加工工艺的限制，整个生物孔板的平整度较差，在用于显微成像时，孔与孔之间切换需要重新寻找焦面。完成生物孔板的全部拍摄费事费力，无法高效快速的获取孔内样品的形貌信息和荧光信息。

现有仪器对生物孔板的拍照主要集中在样品形貌信息的获取，无法同时获取样品的荧光信息，且存在整板对焦失败率高，拍照时间较长。例如，检测仪器通常照射整板，收集装置采用光电倍增管或者雪崩二极管收集整个孔的发光总亮度，其孔内样品作为一个整体被检测，并不会区分单个孔内样品与样品之间的区别；现有技术也存在对生物孔板单孔成像的仪器，但选用的生物孔多为高内涵生物孔板，整体造价比较高，且仪器单孔拍照时间过长，整个生物孔板拍摄时间约为2小时。

如何解决现有检测仪器及检测方法拍照时间过长、对焦成功率低、可拓展性差的问题，是本领域技术人员需要考虑的。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种生物孔板成像装置，用于采集一生物孔板的光学形貌特征，所述生物孔板成像装置包括：

载物组件，包括载物台，所述载物台用于承载生物孔板并带动生物孔板发生位移；以及

光学组件，所述光学组件包括传导单元、照明单元以及生物相机，所述照明单元朝向生物孔板设置并至少用于发出白光及荧光激发光以照射设置于所述载物台上的生物孔板，所述传导单元用于采集生物孔板内的样品受所述照明单元所发出的白光或荧光激发光照射后反馈的光学信号，所述生物相机用于接收所述传导单元采集的所述光学信号。

在一种可能的实施方式中，所述照明单元设于所述载物台远离所述传导单元一侧，所述照明单元交替地发出白光及荧光激发光，所述照明单元耦合有白光光源及LED光源，所述白光光源发出白光，所述LED光源发出可激发荧光的预定波段光线以作为所述荧光激发光。

在一种可能的实施方式中，所述照明单元包括间隔设置的白光照明单元及荧光激发单元，所述白光照明单元设置于所述载物台远离所述传导单元一侧，所述白光照明单元照射所述生物孔板并使所述传导单元接收所述生物孔板内样品反馈的所述光学信息中的形貌信息，所述荧光激发单元设置于所述载物台远离所述白光照明单元一侧，所述荧光激发单元照射所述生物孔板并激发所述生物孔板内的样品发出荧光以使所述传导单元获取所述生物孔板内样品反馈的所述光学信息中的荧光信息。

本申请还提供一种生物孔板的成像方法，应用前述的生物孔板成像装置，包括如下步骤：

步骤S101：所述载物组件带动设于所述载物台上的所述生物孔板到达一初始位置，使所述传导单元的物镜对准所述生物孔板的至少一个孔，所述载物组件带动所述物镜沿一第三方向Z运动至预设对焦位；

步骤S102：使所述物镜在所述第三方向Z运动并拍摄至少两组图片，每组图片包括多张图片，选取所述多张图片中与清晰度峰值所匹配的一张所对应的拍摄位置为实际对焦位，并对所述生物孔板的至少一个孔进行拍摄；

步骤S103：使所述照明单元开启并朝所述生物孔板分别照射白光及荧光激发光，所述传导单元以及所述生物相机相配合以获取所述生物孔板的至少一个孔的形貌图形及荧光图形；以及

步骤S104：使所述载物组件带动所述生物孔板在一第一方向X及一第二方向Y的至少一个上相对于所述物镜发生相对位移，以使所述物镜对准所述生物孔板的至少另一个孔，并重复步骤S103，将多个所述形貌图形进行拼接获取所述生物孔板的完整形貌图形，将多个所述荧光图形进行拼接获取所述生物孔板的完整荧光图形。

在一种可能的实施方式中，所述传导单元在一次拍摄过程中可获取所述生物孔板上一个孔的完整形貌图形及荧光图形，随后将所述生物孔板的多个孔的所述形貌图形及荧光图形进行拼接以获取所述生物孔板的完整形貌图形以及完整荧光图。

在一种可能的实施方式中，所述传导单元在一次拍摄过程中可获取所述生物孔板上一个孔的部分形貌图形及部分荧光图形，使所述传导单元多次拍摄所述生物孔板上的一个孔的不同区域以获取所述一个孔的部分形貌图形及部分荧光图形，将多个部分的形貌图形及荧光图形进行拼接获取所述一个孔的完整形貌图形及荧光图形，随后将所述生物孔板的多个孔的所述形貌图形及荧光图形进行拼接以获取所述生物孔板的完整形貌图形以及完整荧光图。

在一种可能的实施方式中，每次执行步骤S103前均执行步骤S102，使所述生物孔板成像装置对所述生物孔板上的每个孔分别进行对焦。

在一种可能的实施方式中，选取所述生物孔板上的至少三个孔并记录所述至少三个孔的实际对焦位，通过所述至少三个孔的实际对焦位模拟所述生物孔板剩余孔的实际对焦位，并继续执行步骤S103。

在一种可能的实施方式中，在步骤S102中，所述至少两组图片包括第一定焦图组及第二定焦图组，使所述物镜以第一拍摄方式或第二拍摄方式或第三拍摄方式获取多张图片组成所述第一定焦图组，其中，所述第一拍摄方式为以所述预设对焦位为原点沿所述第三方向Z朝远离所述生物孔板以及靠近所述生物孔板的方向分别获取多张图片，所述第二拍摄方式为由所述预设对焦位远离所述生物孔板一侧沿所述第三方向Z朝靠近所述生物孔板的方向运动至所述预设对焦位靠近所述生物孔板一侧以获取多张图片，所述第三拍摄方式为由所述预设对焦位靠近所述生物孔板一侧沿所述第三方向Z朝远离所述生物孔板的方向运动至所述预设对焦位远离所述生物孔板一侧以获取多张图片，选取所述第一定焦图组中与清晰度峰值所匹配的两张中更靠近所述生物孔板的上表面的所述图片对应的位置为过渡对焦位；使所述物镜以第四拍摄方式或第五拍摄方式或第六拍摄方式获取多张图片组成所述第二定焦图组，其中，所述第四拍摄方式为以所述过渡对焦位为原点沿所述第三方向Z朝远离所述生物孔板以及靠近所述生物孔板的方向分别获取多张图片，所述第五拍摄方式为由所述过渡对焦位远离所述生物孔板一侧沿所述第三方向Z朝靠近所述生物孔板的方向运动至所述过渡对焦位靠近所述生物孔板一侧以获取多张图片，所述第五拍摄方式为由所述过渡对焦位靠近所述生物孔板一侧沿所述第三方向Z朝远离所述生物孔板的方向运动至所述过渡对焦位远离所述生物孔板一侧以获取多张图片，选取所述第二定焦图组中与清晰度峰值所匹配的一张所对应的拍摄位置为对焦位。

在一种可能的实施方式中，步骤S102中，在所述第一拍摄方式或所述第二拍摄方式或所述第三拍摄方式中，以第一步长为所述物镜沿所述第三方向Z每次运动的间距；在所述第四拍摄方式或所述第五拍摄方式或所述第六拍摄方式中，以第二步长为所述物镜沿所述第三方向Z每次运动的间距；其中，所述第一步长大于所述第二步长。

相较于现有技术，本申请的生物孔板成像装置具备同时照射白光及荧光激发光的照明单元，使得传导单元、生物相机可再一次对焦过程中同时获取样品的形貌图像及荧光图像；第一运动单元、第二运动单元、第三运动单元可驱动载物台在不同方向上运动以获取样品不同区域的形貌图像及荧光图像。本申请的生物孔板成像方法，通过分别获取样品不同区域的形貌图像及荧光图像，随后通过单个孔的图形进行拼接以及对生物孔板的多个孔的图形进行拼接获取样品的完整图形，大幅缩短对焦时间，且单个孔整体拍照时间小于20秒，对焦成功率大于99％，提升拍摄效率；本申请的生物孔板成像方法可实现对生物孔板的自动对焦及自动获取样品形貌信息及荧光信息。

附图说明

图1为本申请一实施例的生物孔板成像装置的立体示意图。

图2为本申请一实施例的生物孔板成像装置的立体示意图。

图3为本申请一实施例的生物孔板成像装置的局部立体示意图。

图4为本申请一实施例的生物孔板成像装置的局部立体示意图。

图5为本申请一实施例的生物孔板成像装置的局部立体示意图。

图6为本申请一实施例的生物孔板成像装置的局部分解示意图。

图7为本申请一实施例的生物孔板成像方法的流程示意图。

图8为本申请一实施例的生物孔板的截面示意图。

图9为本申请一实施例的生物孔板成像方法的拍摄示意图。

主要元件符号说明

生物孔板成像装置 1

壳体 10

框体 100

底板 101

顶板 102

开合板 103

开窗 104

第一侧板 105

第二侧板 106

第三侧板 107

第四侧板 108

载物组件 11

载物台 110

第一运动单元 111

第二运动单元 112

第三运动单元 113

固定件 114

光路开口 115

转接件 116

光学组件 12

传导单元 120

物镜 121

筒镜 122

照明单元 129

白光照明单元 123

荧光激发单元 124

生物相机 125

二向色镜 126

滤光片 127

反射镜 128

控制组件 13

控制器 131

辅助单元 132

电源 133

散热单元 134

减震平台 14

减震环 15

激光发生单元 16

生物孔板 2

上表面 21

下表面 22

如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本申请。

具体实施方式

以下描述将参考附图以更全面地描述本申请内容。附图中所示为本申请的示例性实施例。然而，本申请可以以许多不同的形式来实施，并且不应该被解释为限于在此阐述的示例性实施例。提供这些示例性实施例是为了使本申请透彻和完整，并且将本申请的范围充分地传达给本领域技术人员。类似的附图标记表示相同或类似的组件。

本文使用的术语仅用于描述特定示例性实施例的目的，而不意图限制本申请。如本文所使用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一”，“一个”和“该”旨在也包括复数形式。此外，当在本文中使用时，“包括”和/或“包含”和/或“具有”，整数，步骤，操作，组件和/或组件，但不排除存在或添加一个或多个其它特征，区域，整数，步骤，操作，组件，组件和/或其群组。

除非另外定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。此外，除非文中明确定义，诸如在通用字典中定义的那些术语应该被解释为具有与其在相关技术和本申请内容中的含义一致的含义，并且将不被解释为理想化或过于正式的含义。

以下内容将结合附图对示例性实施例进行描述。须注意的是，参考附图中所描绘的组件不一定按比例显示；而相同或类似的组件将被赋予相同或相似的附图标记表示或类似的技术用语。

下面参照附图，对本申请的具体实施方式作进一步的详细描述。

如图1及图2所示，本申请提供一种生物孔板成像装置1，用于采集一生物孔板的光学形貌特征。由于图1及图2中均存在角度遮挡，为便于说明，结合图1及图2进行描述，生物孔板成像装置1包括壳体10，壳体10包括框体100、底板101、顶板102、开合板103、第一侧板105、第二侧板106、第三侧板107及第四侧板108。底板101及顶板102正对设置并与框体100连接，开合板103与顶板102可活动的连接以覆盖开设于顶板102上的开窗104。第一侧板105、第二侧板106、第三侧板107及第四侧板108环绕底板101及顶板102设置并与框体100连接；第一侧板105与第二侧板106相邻，第一侧板105及第二侧板106分别于框体100可活动的连接，使得第一侧板105及第二侧板106可相对于框体100开合，第一侧板105及第二侧板106可开合使得壳体10内部暴露以进行必要操作；第三侧板107与第四侧板108相邻，第三侧板107及第四侧板108与框体100可拆卸的连接，第三侧板107与第四侧板108上可设置有散热孔。

如图3至图5所示，本申请实施例所提供的生物孔板成像装置1还包括载物组件11、光学组件12以及控制组件13，由于图3至图5中均存在角度遮挡，为便于说明，结合图3至图5进行描述。

如图3所示，生物孔板成像装置1还包括减震平台14以及减震环15，控制组件13设置于底板101表面，载物组件11及光学组件12设置于减震平台14远离底板101一侧，减震平台14通过减震环15设置于底板101上，减震环15为弹性材质，具体可以为橡胶圈。将载物组件11及光学组件12设置于减震平台14，并使减震平台14通过减震环15与底板101连接，可降低载物组件11及光学组件12在工作过程中可能产生的震动，提升测量精度。

如图4所示，控制组件13至少包括控制器131及辅助单元132，控制器131与辅助单元132可以间隔设置。控制器131可以为至少包括电路板及中央处理器的集成单元，控制器131可获取光学组件12传递的光学信息并对所述光学信息进行处理并给出反馈，控制器131还可以给载物组件11及光学组件12下达指令。辅助单元132可以为包含有电源133及散热单元134的集成单元，电源133用于给生物孔板成像装置1供给电能，散热单元134提升生物孔板成像装置1的散热能力。于一实施例中，散热单元134可以为风扇或液冷式散热结构。

于一实施例中，控制器131及辅助单元132可分别对应第三侧板107及第四侧板108中的一个设置并通过设置于第三侧板107及第四侧板108上的散热孔增强散热，提升生物孔板成像装置1的持续工作能力。

如图5所示，生物孔板成像装置1还包括一激光发生单元16，该激光发生单元16设置于底板101表面，激光发生单元16可设置于控制器131与辅助单元132之间，激光发生单元16可与光学组件12连接并向光学组件12供给激光以作为一种荧光激发光。

如图6所示，为生物孔板成像装置1的载物组件11及光学组件12的分解示意图。

载物组件11包括载物台110、第一运动单元111、第二运动单元112、第三运动单元113、固定件114以及转接件116。载物台110用于承载生物孔板2，第一运动单元111及第二运动单元112与载物台110连接，固定件114与载物台110、第一运动单元111及第二运动单元112固定并设置于减震平台14以支撑载物台110、第一运动单元111及第二运动单元112，第三运动单元113通过转接件116与第一运动单元111及第二运动单元112固定连接。在本实施例中，载物台110可通过一调平螺丝调整其平整度。

于一实施例中，载物台110包括一光路开口115，生物孔板2设置于载物台110远离减震平台14一侧并覆盖光路开口115，固定件114设置于载物台110与减震平台14之间，第三运动单元113设置于载物台110与减震平台14之间。

光学组件12包括传导单元120、照明单元129、生物相机125，照明单元129朝向生物孔板2设置并用于发出白光及荧光激发光以照射设置于载物台110上的生物孔板2，传导单元120用于采集生物孔板内的样品受照明单元129所发出的白光或荧光激发光照射后反馈的光学信号，生物相机125用于接收传导单元120采集的所述光学信号。在本实施例中，照明单元129可耦合有白光照射功能及荧光激发光照射功能，照明单元129设于载物台110远离传导单元120一侧，照明单元129交替地发出白光及荧光激发光以照射生物孔板2以及设于生物孔板2内的样品，传导单元120接收生物孔板2内样品反馈的所述光学信息中由白光照射所获取的形貌信息以及由荧光激发光照射所获取的荧光信息。

于一实施例中，照明单元129可包括间隔设置的白光照明单元123及荧光激发单元124，白光照明单元123设置于载物台110远离传导单元120一侧，白光照明单元123照射生物孔板2并使传导单元120接收生物孔板2内样品反馈的所述光学信息中的形貌信息，荧光激发单元124设置于载物台110远离白光照明单元123一侧，荧光激发单元124照射生物孔板2并激发生物孔板2内的样品发出荧光以使传导单元120获取生物孔板2内样品反馈的所述光学信息中的荧光信息。其中，荧光激发单元124发出的光线可以为激光或特定波段的LED光。

于一实施例中，光学组件12还包括、二向色镜126、滤光片127及反射镜128，传导单元120包括间隔设置的物镜121及筒镜122。物镜121与第三运动单元113连接，物镜121正对载物台110，白光照明单元123及荧光激发单元124设置于载物台110相背的两侧，二向色镜126设置于荧光激发单元124与物镜121之间，生物相机125与筒镜122间隔设置，滤光片127覆盖筒镜122以筛选荧光，反射镜128设置于生物相机125及筒镜122之间用于改变光路。于一实施例中，光学组件12中的各单元可根据实际需求进行尺寸及功能上的变更。

于一实施例中，物镜121及筒镜122配合对生物孔板2内的样品进行放大以获取形貌信息及光学信息。在本实施例中，物镜121可以为5倍放大物镜；筒镜122可以为焦距f＝181mm的筒镜；生物相机125可以为CCD生物相机，CCD生物相机低噪声、高灵敏度的特性保证了样品的检测浓度。

于一实施例中，白光照明单元123可由LED面光源和光源适配器组成，通过光源适配器可调节LED面光源的开关和亮度，LED面光源位于物镜121正上方，用于获取样品的形貌信息。

于一实施例中，荧光激发单元124可由光纤激光器和平凸透镜组成，利用平凸透镜将荧光激发单元124发出的光整形为平行光，该平行光通过物镜121照射到生物孔板2，用于激发样品中的荧光分子，以便获取样品的荧光信息。在本实施例中，所述平凸透镜可以为焦距f＝3mm的平凸透镜。

于一实施例中，可使用特定波长的白光照明单元123作为荧光激发光源，以替代荧光激发单元124以降低成本。

于一实施例中，可通过调节设置于荧光激发单元124与物镜121之间的二向色镜126以调节荧光激发光入射到物镜121的角度，保证荧光激发光光束垂直照射到样品上，样品发出的荧光透过二向色镜126进入相机。在本实施例中，二向色镜126反射532nm的激光并透射578nm的荧光。

于一实施例中，滤光片127用于获取特定波段的荧光信号，减少其他波段对荧光信号的影响，滤光片127可通过圆形固定件固定并采用插拔方式设置，不同的荧光样品采用不同的波段的滤光片127，有效提升生物孔板成像装置1的适用性。在本实施例中，滤光片127可以为578/21nm的滤光片。

于一实施例中，生物相机125可安装在筒镜122的后焦点位置，生物相机125可用于拍摄样品的显微图像包括样品白光图(形貌信息)和样品荧光图(荧光信息)。生物相机125可包括数据线接口，用于将采集到的图像传输给软件进行实时处理处理，进而获取样品的形貌信息和荧光信息。

拍摄过程中，可在生物孔板2放置有生物样品的孔内放置微磁片，磁片的尺寸可以为25umX30um，磁片的单个小齿轮的尺寸可以为5um，磁片上带有荧光染料，拍摄过程中可获取磁片的光学信息并依据不同微磁片的光学信息区分不同的孔，以便于快速提取信息。

控制器131用于控制第一运动单元111带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2在第一方向X上运动，控制器131用于控制第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2在第二方向Y上运动，控制器131用于控制第三运动单元113带动物镜121在第三方向Z上运动。所述第一方向X、第二方向Y及第三方向Z相互垂直。

于一实施例中，控制器131控制第一运动单元111及第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2在第一运动方向X及第二运动方向Y上运动，以调整物镜121所拍摄的生物孔板2的区域并实现对生物孔板2的局部拍摄，通过局部拍摄分别对焦可提升对焦速度；控制器131控制第三运动单元113带动载物台110在第三方向Z上运动，以此调整物镜121与生物孔板2之间的距离，并通过多次调整物镜121与生物孔板2之间的距离以寻找最佳对焦面，并实现自动对焦。

如图7所示，本申请还提供一种生物孔板2的成像方法，应用前述的生物孔板成像装置1，包括如下步骤：

步骤S101：载物组件11带动设于载物台110上的生物孔板2到达一初始位置，使传导单元120的物镜121对准生物孔板2的至少一个孔，载物组件11带动物镜121沿一第三方向Z运动至预设对焦位。

于一实施例中，生物孔板可以为96孔板、384孔板、512孔板等，还可以为盖玻片细胞计数板等其他承载由生物样品的载板。

步骤S102：使物镜121在第三方向Z运动并拍摄至少两组图片，每组图片包括多张图片，选取所述多张图片中与清晰度峰值所匹配的一张所对应的拍摄位置为实际对焦位，并对生物孔板2的至少一个孔进行拍摄；

于一实施例中，如图8所示，为本申请一实施例的生物孔板2的截面示意图。生物孔板2包括上表面21及下表面22，其中，上表面21为生物孔板2用于承载样品的底壁的上表面，下表面22为生物孔板2用于承载样品的底壁的下表面，上表面21与下表面22设于所述底壁的相背两侧，上表面21连接于生物孔板2的孔位。

于一实施例中，至少两组图片包括第一定焦图组及第二定焦图组，使物镜121以第一拍摄方式或第二拍摄方式或第三拍摄方式获取多张图片组成所述第一定焦图组，其中，所述第一拍摄方式为以所述预设对焦位为原点沿第三方向Z朝远离生物孔板2或靠近生物孔板2的方向分别获取多张图片，所述第二拍摄方式为由所述预设对焦位远离生物孔板2一侧沿第三方向Z朝靠近生物孔板2的方向运动至所述预设对焦位靠近生物孔板2一侧以获取多张图片，所述第三拍摄方式为由所述预设对焦位靠近生物孔板2一侧沿所述第三方向Z朝远离生物孔板2的方向运动至所述预设对焦位远离生物孔板2一侧以获取多张图片，选取所述第一定焦图组中与清晰度峰值所匹配的两张中更靠近生物孔板2的上表面21的所述图片对应的位置为过渡对焦位；若所述第一定焦图组中存在两个与清晰度峰值匹配的图片，则选取更靠近生物孔板2的上表面21的拍摄位置对应的图片作为确定所述过渡对焦位的参照。使物镜121以第四拍摄方式或第五拍摄方式或第六拍摄方式获取多张图片组成所述第二定焦图组，其中，所述第四拍摄方式为以所述过渡对焦位为原点沿所述第三方向Z朝远离生物孔板2以及靠近生物孔板2的方向分别获取多张图片，所述第五拍摄方式为由所述过渡对焦位远离生物孔板2一侧沿所述第三方向Z朝靠近生物孔板2的方向运动至所述过渡对焦位靠近生物孔板2一侧以获取多张图片，所述第五拍摄方式为由所述过渡对焦位靠近生物孔板2一侧沿所述第三方向Z朝远离生物孔板2的方向运动至所述过渡对焦位远离生物孔板2一侧以获取多张图片，选取所述第二定焦图组中与清晰度峰值所匹配的一张所对应的拍摄位置为对焦位。

于一实施例中，在所述第一拍摄方式或所述第二拍摄方式或所述第三拍摄方式中，以第一步长为物镜121沿所述第三方向Z每次运动的间距；在所述第四拍摄方式或所述第五拍摄方式或所述第六拍摄方式中，以第二步长为物镜121沿所述第三方向Z每次运动的间距；其中，第一步长大于第二步长，即，物镜通过所述第一定焦图组进行大致对焦，随后通过所述第二定焦图组进行精确对焦。

步骤S103：使照明单元129开启并朝生物孔板2分别照射白光及荧光激发光，传导单元120以及生物相机125相配合以获取生物孔板2的至少一个孔的形貌图形及荧光图形；

于一实施例中，每次执行步骤S103前均执行步骤S102，使生物孔板成像装置1对生物孔板2上的每个孔分别进行对焦。即，每次拍摄前均对所拍摄的孔进行对焦，并获取孔的形貌图形及荧光图形。

于一实施例中，选取生物孔板2上的至少三个孔并记录所述至少三个孔的实际对焦位，通过所述至少三个孔的实际对焦位模拟生物孔板2上剩余孔的实际对焦位，并继续执行步骤S103。即，通过选取生物孔板2上部分孔(可以为随机位置，也可以为特定位置，例如同一行或同一列或散列的多个孔)进行对焦并记录实际对焦位置，结合生物孔板2形貌模拟剩余孔的实际对焦位置，并获取孔的形貌图形及荧光图形。

在其他实施例中，还可存在快速扫描模式。在该模式下，可省略步骤S102中的精确对焦，以预设对焦位为焦面快速拍摄一张图片，以快速获取孔内的部分样品信息。

步骤S104：使载物组件11带动生物孔板2在一第一方向X及一第二方向Y的至少一个上相对于物镜121发生相对位移，以使物镜121对准生物孔板2的至少另一个孔，并重复步骤S103，将多个所述形貌图形进行拼接获取生物孔板2的完整形貌图形，将多个所述荧光图形进行拼接获取生物孔板2的完整荧光图形。

于一实施例中，对于单孔尺寸较小的生物孔板2(例如384孔板)，传导单元120在一次拍摄过程中可获取生物孔板2上一个孔的完整形貌图形及荧光图形，随后将生物孔板2的多个孔的所述形貌图形及荧光图形进行拼接以获取生物孔板2的完整形貌图形以及完整荧光图。

于一实施例中，如图9所示，对于单孔尺寸较大的生物孔板2(例如96孔板)，传导单元120在一次拍摄过程中可获取生物孔板2上一个孔的部分形貌图形及部分荧光图形，使传导单元120多次拍摄所述生物孔板上的一个孔的不同区域以获取所述一个孔的部分形貌图形及部分荧光图形，将多个部分的形貌图形及荧光图形进行拼接获取所述一个孔的完整形貌图形及荧光图形，随后将所述生物孔板的多个孔的所述形貌图形及荧光图形进行拼接以获取所述生物孔板的完整形貌图形以及完整荧光图。在本实施例中，多次拍摄一个孔时，可首先拍摄该孔中心区域，随后拍摄该中心区域周边至少8个相邻区域，并进行拼接。在其他实施例中，多次拍摄一个孔时，可以首先拍摄该孔的一个角(例如左下角或右上角)，随后以该角为起点扫描拍摄该一给角所在的一行或者一列，完成该一行或者一列的扫描后，拍摄相邻的一列或者一行上的点，随后以该点为起点扫描拍摄该点所在的一行或者一列，使物镜以“蛇形”或“S形”的方式进行扫描直至完成。

整个生物孔板2拍照时间小于30分钟，提高了工作效率，输出结果为每个孔的白光拼图和荧光拼图，对于同一位置的样品白光图片可获取样品的形貌信息，荧光图片可获取相同位置的样品的荧光信息。

下面列举本申请提供的生物孔板2的成像方法的两种不同实施例。

实施例1

在实施例1中，生物孔板成像装置1对生物孔板2中的每一个孔均进行自动对焦。

步骤S11，使生物孔板成像装置1系统开机，并完成初始化设置(测试第一运动单元111、第二运动单元112、第三运动单元113均可走至零点，确认光学组件12各单元是否工作正常)，控制器131控制第一运动单元111及第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2在第一方向X及第二方向Y的至少一个上相较于物镜121发生相对位移以到达一初始位置，该初始位置可以为生物孔板2的第一个孔的位置，控制器131控制第三运动单元113带动物镜121沿第三方向Z运动至预设距离预设焦面-1.2mm处的对焦位(其中，该预设焦面为系统调试过程中生物孔板2内样品的实际焦面位置，后续更换生物孔板，实际焦面在预设焦面附近)，设置需要拍摄的孔位信息。

步骤12，控制器131控制第一运动单元111及第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2运动到需要拍摄孔位的中间位置，控制器131控制第三运动单元113带动物镜121沿第三方向Z运动至预设焦面的位置以40um步长(步长范围可以为20um-60um，优选为40um)，在预设焦面-1.2mm处的上下位置各拍摄9张白光形貌信息图片，拍摄过程中，可以在预设焦面-1.2mm处为原点上下各拍摄9张白光形貌信息图片，或可以在预设焦面下方涵盖距离其-1.2mm处向上拍摄18张白光形貌信息图片，或可以在预设焦面上方涵盖距离其-1.2mm处向下拍摄18张白光形貌信息图片，将所述图片传输给自动对焦算法计算每张图片的清晰度，并寻找清晰度所有峰值。

拍摄过程中，由于生物孔板2底部透明且具有一定的厚度，因此生物孔板2存在上下两个清楚的表面，生物样品被放于生物孔板2的上表面21，生物孔板的上表面21与下表面22距离相差约200-400um，根据上表面21与下表面22的相对位置，选择自动对焦计算得到的两个最高峰值靠近生物孔板2的上表面21的一个作为样品的大概焦面位置，控制器131控制第三运动单元113带动物镜121运动到峰值靠后的一个对应的相应的第三方向Z的位置；然后以4um步长(步长范围可以为1um-10um，优选为4um)，再上下各拍摄9张白光形貌信息图片或从下至上拍摄18张白光形貌信息图片或从上至下拍摄18张白光形貌信息图片，将图片传输给自动对焦算法，计算每张图片的清晰度寻找所有峰值，由于第二次拍摄步长较小，该精细扫描过程只会出现一个峰值，选择此峰值作为最终焦面的位置。控制器131控制第三运动单元113带动物镜121沿第三方向Z运动至最终焦面的位置所对应的第三方向Z的并将此位置作为当前孔的最终焦面位置，然后保持第三运动单元113静止。

步骤13，生物孔板2根据每个孔的大小可分为不同类型，例如96孔板，384孔板等。根据具体生物孔板2的孔大小，需要进行不同拼图设置，对于类似于96孔板，其单个孔的直径较大，单次拍照成像并不能完全覆盖整个孔的位置，为了不丢失样品信息，采用单孔多个位置拍照拼图的方法获取整个孔内样品的信息，对于96孔板采用3X3拼图的方式获取单个孔的全部信息。

具体操作为，自动对焦完成后，保持第三运动单元113静止，控制器131控制第一运动单元111及第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2运动至孔的第一个位置，白光照明单元123开启，物镜121、筒镜122以及生物相机125相配合获取当前位置样品的白光图并进行保存，然后白光照明单元123关闭，荧光激发单元124开启，物镜121、筒镜122以及生物相机125相配合获取当前位置样品的荧光图。然后控制器131控制第一运动单元111及第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2运动至孔的下一个位置，重复上述操作。当一个孔的全部位置拍摄完毕，根据光学组件整体放大率和第一运动单元111及第二运动单元112的移动距离，将获得的所有白光图片和荧光图片进行拼接，最终获得一个孔的白光图和荧光图，进而获得一个孔内所有样品的形貌信息和荧光信息。对于小孔的生物孔板，例如384孔板，因为单个孔尺寸较小，采用一次白光和荧光拍照就能获取其所有信息。

步骤14，获得单个孔内的全部信息后，然后控制器131控制第一运动单元111及第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2运动至下一孔，重复上步骤12和步骤13，直至完成。

实施例2

在实施例2中，可选取生物孔板2上的三个特定孔位，(一般最边缘三个孔，例如96孔板选择A1，H1，A12孔，384孔板选择A1，A24，P1孔，也可选择其三个孔位)进行自动对焦，根据选定特孔的焦面位置信息模拟全部孔的焦面位置，以实现自动对焦。

步骤21，使生物孔板成像装置1系统开机，并完成初始化设置(测试第一运动单元111、第二运动单元112、第三运动单元113均可走至零点，确认光学组件12各单元是否工作正常)，控制器131控制第一运动单元111及第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2在第一方向X及第二方向Y的至少一个上相较于物镜121发生相对位移以到达一初始位置，该初始位置可以为生物孔板2的第一个孔的位置，控制器131控制第三运动单元113带动物镜121沿第三方向Z运动至预设距离预设焦面-1.2mm处的对焦位(其中，该预设焦面为系统调试过程中生物孔板2内样品的实际焦面位置，后续更换生物孔板，实际焦面在预设焦面附近)，设置需要拍摄的孔位信息。

步骤22，在选定第一个孔A1的位置，控制器131控制第一运动单元111及第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2运动到需要拍摄孔位的中间位置，控制器131控制第三运动单元113带动物镜121沿第三方向Z运动至预设焦面的位置以40um步长(步长范围可以为20um-60um，优选为40um)，在预设焦面-1.2mm处的上下位置各拍摄9张白光形貌信息图片，拍摄过程中，可以在预设焦面-1.2mm处为原点上下各拍摄9张白光形貌信息图片，或可以在预设焦面下方涵盖距离其-1.2mm处向上拍摄18张白光形貌信息图片，或可以在预设焦面上方涵盖距离其-1.2mm处向下拍摄18张白光形貌信息图片，将所述图片传输给自动对焦算法计算每张图片的清晰度，并寻找清晰度所有峰值。

拍摄过程中，由于生物孔板2底部透明且具有一定的厚度，因此生物孔板2存在上下两个清楚的表面，生物样品被放于生物孔板2的上表面21，生物孔板的上表面21与下表面22距离相差约200-400um，根据上表面21与下表面22的相对位置，选择自动对焦计算得到的两个最高峰值靠近生物孔板2的上表面21的一个作为样品的大概焦面位置，控制器131控制第三运动单元113带动物镜121运动到峰值靠后的一个对应的相应的第三方向Z的位置；然后以4um步长(步长范围可以为1um-10um，优选为4um)，再上下各拍摄9张白光形貌信息图片或从下至上拍摄18张白光形貌信息图片或从上至下拍摄18张白光形貌信息图片，将图片传输给自动对焦算法，计算每张图片的清晰度寻找所有峰值，由于第二次拍摄步长较小，该精细扫描过程只会出现一个峰值，选择此峰值作为最终焦面的位置。控制器131控制第三运动单元113带动物镜121沿第三方向Z运动至最终焦面的位置所对应的第三方向Z的并将此位置作为当前孔的最终焦面位置，然后保持第三运动单元113静止。

记录当前孔的在第三方向Z上的位置数据，然后，控制器131控制第一运动单元111及第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2下一个选定需要进行自动对焦的孔，重复上述过程，获取全部选定孔(96孔板为A1，H1，A12孔，384孔板为A1，A24，P1)的焦面位置。根据选定三个孔的三方向Z上的位置数据，自动对焦算法模拟整个生物孔板的平整度，进而推算出每个孔的焦面位置。

步骤23，根据自动对焦计算得到的每个孔的焦面位置，依据所述焦面位置将物镜121移动到与所述焦面位置对应的第三方向Z的位置并保持不变，控制器131控制第一运动单元111及第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2运动到孔的第一个位置。白光照明单元123开启，物镜121、筒镜122以及生物相机125相配合获取当前位置样品的白光图并进行保存，然后白光照明单元123关闭，荧光激发单元124开启，物镜121、筒镜122以及生物相机125相配合获取当前位置样品的荧光图。然后控制器131控制第一运动单元111及第二运动单元112带动载物台110及设于载物台110上的生物孔板2运动至孔的下一个位置，重复上述操作。当一个孔的全部位置拍摄完毕，根据光学组件整体放大率和第一运动单元111及第二运动单元112的移动距离，将获得的所有白光图片和荧光图片进行拼接，最终获得一个孔的白光图和荧光图，进而获得一个孔内所有样品的形貌信息和荧光信息。对于小孔的生物孔板，例如384孔板，因为单个孔尺寸较小，采用一次白光和荧光拍照就能获取其所有信息。

上文中，参照附图描述了本申请的具体实施方式。但是，本领域中的普通技术人员能够理解，在不偏离本申请的精神和范围的情况下，还可以对本申请的具体实施方式作各种变更和替换。这些变更和替换都落在本申请所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种生物孔板成像装置，用于采集一生物孔板的光学形貌特征，其特征在于，所述生物孔板成像装置包括：

载物组件，包括载物台，所述载物台用于承载生物孔板并带动生物孔板发生位移；以及

光学组件，所述光学组件包括传导单元、照明单元以及生物相机，所述照明单元朝向生物孔板设置并至少用于发出白光及荧光激发光以照射设置于所述载物台上的生物孔板，所述传导单元用于采集生物孔板内的样品受所述照明单元所发出的白光或荧光激发光照射后反馈的光学信号，所述生物相机用于接收所述传导单元采集的所述光学信号。

2.如权利要求1所述的生物孔板成像装置，其特征在于，所述照明单元设于所述载物台远离所述传导单元一侧，所述照明单元交替地发出白光及荧光激发光，所述照明单元耦合有白光光源及LED光源，所述白光光源发出白光，所述LED光源发出可激发荧光的预定波段光线以作为所述荧光激发光。

3.如权利要求1所述的生物孔板成像装置，其特征在于，所述照明单元包括间隔设置的白光照明单元及荧光激发单元，所述白光照明单元设置于所述载物台远离所述传导单元一侧，所述白光照明单元照射所述生物孔板并使所述传导单元接收所述生物孔板内样品反馈的所述光学信息中的形貌信息，所述荧光激发单元设置于所述载物台远离所述白光照明单元一侧，所述荧光激发单元照射所述生物孔板并激发所述生物孔板内的样品发出荧光以使所述传导单元获取所述生物孔板内样品反馈的所述光学信息中的荧光信息。

4.一种生物孔板的成像方法，应用如权利要求1所述的生物孔板成像装置，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S101：所述载物组件带动设于所述载物台上的所述生物孔板到达一初始位置，使所述传导单元的物镜对准所述生物孔板的至少一个孔，所述载物组件带动所述物镜沿一第三方向Z运动至预设对焦位；

步骤S102：使所述物镜在所述第三方向Z运动并拍摄至少两组图片，每组图片包括多张图片，选取所述多张图片中与清晰度峰值所匹配的一张所对应的拍摄位置为实际对焦位，并对所述生物孔板的至少一个孔进行拍摄；

步骤S103：使所述照明单元开启并朝所述生物孔板分别照射白光及荧光激发光，所述传导单元以及所述生物相机相配合以获取所述生物孔板的至少一个孔的形貌图形及荧光图形；以及

步骤S104：使所述载物组件带动所述生物孔板在一第一方向X及一第二方向Y的至少一个上相对于所述物镜发生相对位移，以使所述物镜对准所述生物孔板的至少另一个孔，并重复步骤S103，将多个所述形貌图形进行拼接获取所述生物孔板的完整形貌图形，将多个所述荧光图形进行拼接获取所述生物孔板的完整荧光图形。

5.如权利要求4所述的生物孔板的成像方法，其特征在于，所述传导单元在一次拍摄过程中获取所述生物孔板上一个孔的完整形貌图形及荧光图形，随后将所述生物孔板的多个孔的所述形貌图形及荧光图形进行拼接以获取所述生物孔板的完整形貌图形以及完整荧光图。

6.如权利要求4所述的生物孔板的成像方法，其特征在于，所述传导单元在一次拍摄过程中获取所述生物孔板上一个孔的部分形貌图形及部分荧光图形，使所述传导单元多次拍摄所述生物孔板上的一个孔的不同区域以获取所述一个孔的部分形貌图形及部分荧光图形，将多个部分的形貌图形及荧光图形进行拼接获取所述一个孔的完整形貌图形及荧光图形，随后将所述生物孔板的多个孔的所述形貌图形及荧光图形进行拼接以获取所述生物孔板的完整形貌图形以及完整荧光图。

7.如权利要求4所述的生物孔板的成像方法，其特征在于，每次执行步骤S103前均执行步骤S102，使所述生物孔板成像装置对所述生物孔板上的每个孔分别进行对焦。

8.如权利要求4所述的生物孔板的成像方法，其特征在于，选取所述生物孔板上的至少三个孔并记录所述至少三个孔的实际对焦位，通过所述至少三个孔的实际对焦位模拟所述生物孔板剩余孔的实际对焦位，并继续执行步骤S103。

9.如权利要求4所述的生物孔板的成像方法，其特征在于，在步骤S102中，所述至少两组图片包括第一定焦图组及第二定焦图组，使所述物镜以第一拍摄方式或第二拍摄方式或第三拍摄方式获取多张图片组成所述第一定焦图组，其中，所述第一拍摄方式为以所述预设对焦位为原点沿所述第三方向Z朝远离所述生物孔板以及靠近所述生物孔板的方向分别获取多张图片，所述第二拍摄方式为由所述预设对焦位远离所述生物孔板一侧沿所述第三方向Z朝靠近所述生物孔板的方向运动至所述预设对焦位靠近所述生物孔板一侧以获取多张图片，所述第三拍摄方式为由所述预设对焦位靠近所述生物孔板一侧沿所述第三方向Z朝远离所述生物孔板的方向运动至所述预设对焦位远离所述生物孔板一侧以获取多张图片，选取所述第一定焦图组中与清晰度峰值所匹配的两张中更靠近所述生物孔板的上表面的所述图片对应的位置为过渡对焦位；使所述物镜以第四拍摄方式或第五拍摄方式或第六拍摄方式获取多张图片组成所述第二定焦图组，其中，所述第四拍摄方式为以所述过渡对焦位为原点沿所述第三方向Z朝远离所述生物孔板以及靠近所述生物孔板的方向分别获取多张图片，所述第五拍摄方式为由所述过渡对焦位远离所述生物孔板一侧沿所述第三方向Z朝靠近所述生物孔板的方向运动至所述过渡对焦位靠近所述生物孔板一侧以获取多张图片，所述第五拍摄方式为由所述过渡对焦位靠近所述生物孔板一侧沿所述第三方向Z朝远离所述生物孔板的方向运动至所述过渡对焦位远离所述生物孔板一侧以获取多张图片，选取所述第二定焦图组中与清晰度峰值所匹配的一张所对应的拍摄位置为对焦位。

10.如权利要求9所述的生物孔板的成像方法，其特征在于，步骤S102中，在所述第一拍摄方式或所述第二拍摄方式或所述第三拍摄方式中，以第一步长为所述物镜沿所述第三方向Z每次运动的间距；在所述第四拍摄方式或所述第五拍摄方式或所述第六拍摄方式中，以第二步长为所述物镜沿所述第三方向Z每次运动的间距；其中，所述第一步长大于所述第二步长。

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