CN114828836A - 脂质和用于药物递送的脂质纳米颗粒配方 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脂质及它们的组合物。在本发明的各个方面，组合物是脂质纳米颗粒组合物，用于将各种核酸分子和/或治疗剂递送至选定的靶，例如递送至细胞以进行基因递送，和/或用于在有需要的受试者中预防或治疗疾病或病症。

Description

脂质和用于药物递送的脂质纳米颗粒配方
相关申请的引用
本申请要求2019年10月18日提交的美国临时申请No.62/923,258的优先权和权益，其公开的全部内容通过引用并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是根据美国国立卫生研究院颁发的DP2 TR002776在政府支持下完成的。政府对发明享有一定的权利。
背景技术
由于裸露的mRNA会迅速降解并且不能轻易穿过细胞膜，因此需要通过递送方法以功能性摄取到T细胞中。目前，电穿孔(EP)在临床上用于有效地将mRNA递送至多种细胞，包括T细胞(Smits E et al.,2004,Leukemia,18:1898–1902；Barrett DM et al.,2011,HumGene Ther,22:1575–1586；DiTommaso T et al.,2018,PNAS,115)，但它有很多缺点。EP期间发生的膜破裂可能会导致细胞内容物的损失和细胞毒性的风险，同时无法保证一致的跨细胞膜渗透以实现均匀递送。这可能导致低活力，并改变存活细胞群的行为(DiTommaso Tet al.,2018,PNAS,115；Dullaers M et al.,2004,Mol Ther,10:768–779；Singh N etal.,2014,Cancer Immunol Res,2:1059–1070)。因此，需要进一步研究电穿孔后转基因的长期表达和细胞中的行为，以了解与这种核酸递送方法相关的潜在风险(Lambricht L etal.,2016,Expert Opin Drug Deliv,13:295-310；Nickoloff JA et al.,1995,AnimalCell Electroporation and Electrofusion Protocols Methods in MolecularBiology,273–280)。
总之，T细胞明显难以转染。因此，为了将mRNA递送给T细胞，最常用的方法是EP。EP使用电脉冲以细胞膜中开孔，让细胞溶液中的任何物质(在本例中为mRNA)进入细胞溶质。虽然EP能有效地将mRNA导入细胞，但EP往往对T细胞有毒，可导致基因组表达改变，并且没有体内翻译的潜力。
因此，本领域需要改进的将序列和/或药物递送至有需要的细胞或受试者的组合物和方法。本发明满足了这种未满足的需要。
发明内容
在一方面，本发明部分地涉及一种具有式(I)结构的化合物或其盐，
Figure BDA0003700689930000021
在一些实施方式中，A1和A2独立地为C、C(H)、N、S或P。在一些实施方式中，每个L1、L2、L3、L4、L5和L6独立地为C、C(H)2、C(H)(R19)、O、N(H)或N(R19)。在一些实施方式中，每个R1、R2、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6a、R6b、R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R10b、R11a、R11b、R12a、R12b、R13a、R13b、R14a、R14b、R15a、R15b、R16、R17、R18和R19独立地为H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、-Y(R20)z`(R21)z``-环烷基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、-Y(R20)z`(R21)z``-杂环烷基、取代的-(R20)z`(R21)z``-杂环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、-Y(R20)z`(R21)z``-环烯基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、-Y(R20)z`(R21)z``-环炔基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-环炔基、芳基、取代的芳基、-Y(R20)z`(R21)z``-芳基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-芳基、杂芳基、取代的杂芳基、-Y(R20)z`(R21)z``-杂芳基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-杂芳基、烷氧羰基、直链烷氧羰基、支链烷氧羰基、酰胺基、氨基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基芳基、氨基醋酸酯、酰基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基芳基、烷氧基、羧基、羧酸酯、酯、-Y(R20)z`(R21)z``-酯、-Y(R20)z`(R21)z``、＝O、-NO2、-CN、或亚砜(sulfoxy)。
在一些实施方式中，Y为C、N、O、S或P。在一些实施方式中，每个R20和R21独立地为H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧羰基、直链烷氧羰基、支链烷氧羰基、酰胺基、氨基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基芳基、氨基醋酸酯、酰基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基芳基、烷氧基、羧基、羧酸酯、酯、＝O、-NO2、-CN、或亚砜。
在一些实施方式中，每个z`和z``独立地为由0、1或2表示的整数。在一些实施方式中，每个m、n、o、p、q、r、s、t、u、v、w和x独立地为由0、1、2、3、4或5表示的整数。
在一些实施方式中，具有式(I)结构的化合物是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0003700689930000031
Figure BDA0003700689930000041
在一些实施方式中，每个R1、R2、R3、R4和R5独立地为H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧羰基、直链烷氧羰基、支链烷氧羰基、酰胺基、氨基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基芳基、氨基醋酸酯、酰基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基芳基、烷氧基、羧基、羧酸酯、或酯。
在一些实施方式中，每个m、n、o、p和q独立地为0到25的整数。在一些实施方式中，每个r、s、t、u、v、w和x独立地为由0、1、2、3、4或5表示的整数。
在一些实施方式中，具有式(I)结构的化合物是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0003700689930000042
Figure BDA0003700689930000051
Figure BDA0003700689930000061
在各种实施方式中，具有式(I)结构的化合物是可离子化的脂质。
在另一方面，本发明部分地涉及包含一种或多种本发明化合物的脂质纳米颗粒(LNP)。在各种实施方式中，所述LNP以约1mol％至约100mol％的浓度范围包含一种或多种本发明的化合物。在一些实施方式中，所述LNP以约10mol％至约50mol％的浓度范围包含一种或多种本发明的化合物。
在一些实施方式中，所述LNP进一步包含至少一种辅助脂质。在一些实施方式中，所述LNP以约0.01mol％至约99.9mol％的浓度范围包含至少一种辅助脂质。在一些实施方式中，所述LNP以约0.5mol％至约50mol％的浓度范围包含至少一种辅助脂质。
在一些实施方式中，所述辅助脂质为磷脂、胆固醇脂质、聚合物或它们的任意组合。
在一些实施方式中，磷脂是二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)或其衍生物、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或其衍生物、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)或其衍生物、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱(SOPC)或其衍生物、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)或其衍生物、N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)或其衍生物、或它们的任何组合。在一些实施方式中，所述LNP以约15mol％至约50mol％的浓度范围包含磷脂。
在一些实施方式中，胆固醇脂质是胆固醇或其衍生物。在一些实施方式中，所述LNP以约20mol％至约50mol％的浓度范围包含胆固醇脂质。
在一些实施方式中，所述聚合物为聚乙二醇(PEG)或其衍生物。在一些实施方式中，所述LNP以约0.5mol％至约10mol％的浓度范围包含聚合物。
在一些实施方式中，LNP包含至少一种核酸分子、治疗剂、或它们的任何组合。在一个实施方式中，核酸分子是治疗剂。
在一些实施方式中，核酸分子是DNA分子或RNA分子。在一些实施方式中，核酸分子是cDNA、mRNA、miRNA、siRNA、修饰的RNA、antagomir(拮抗mir)、反义分子、肽、治疗性肽、靶向核酸或它们的任何组合。
在一个实施方式中，mRNA编码荧光素酶。
在另一个实施方式中，mRNA编码一种或多种抗原。在一些实施方式中，所述抗原包括至少一种病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、流感抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或它们的任何组合。
在一些实施方式中，核酸分子包含启动子或调节序列。
在一个实施方式中，LNP还包含佐剂。
在一些实施方式中，所述核酸分子、治疗剂或它们的组合被包封在本发明的化合物中。
在一个方面，本发明部分地涉及组合物，其包含至少一种具有式(I)结构的化合物、至少一种本发明的LNP或它们的任何组合。在一个实施方式中，所述组合物是疫苗。
在另一方面，本发明部分地涉及一种将核酸分子、治疗剂或它们的组合递送至有需要的受试者的方法。在一个实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种本发明的LNP或组合物。在一些实施方式中，所述LNP或组合物将核酸分子、治疗剂或它们的组合递送至靶。
在一些实施方式中，靶是免疫细胞、T细胞、驻留T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、癌细胞、与疾病或病症相关的细胞、与疾病或病症相关的组织、脑组织、中枢神经系统组织、肺组织、顶端表面组织、上皮细胞、内皮细胞、肝组织、肠组织、结肠组织、小肠组织、大肠组织、粪便、骨髓、巨噬细胞、脾组织、肌肉组织、关节组织、肿瘤细胞、病变组织、淋巴结组织、淋巴循环或它们的任何组合。
在一些实施方式中，通过皮内递送途径、皮下递送途径、肌内递送途径、脑室内递送途径、鞘内递送途径、口服递送途径、静脉递送途径、气管内递送途径、腹腔递送途径、子宫内递送途径或它们的任何组合施用所述LNP或组合物。
在一个实施方式中，该方法包括单次施用LNP或组合物。在一些实施方式中，该方法包括多次施用LNP或组合物。
在各种实施方式中，所述方法治疗或预防至少一种病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染、流感感染、癌症、关节炎、心脏病、心血管疾病、神经系统病症或疾病、遗传疾病、自身免疫性疾病、胎儿疾病、影响胎儿发育的遗传疾病、或它们的任何组合。
在另一方面，本发明部分地涉及一种在有需要的受试者中预防或治疗疾病或病症的方法。在一个实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种本发明的LNP或组合物。
在一些实施方式中，所述LNP或组合物将核酸分子、治疗剂或它们的组合递送至细胞。
在另一方面，本发明部分地涉及一种将核酸分子递送至细胞的方法。在一个实施方式中，该方法包括向细胞施用治疗有效量的一种或多种本发明的LNP或组合物。
在一个实施方式中，所述方法是一种基因递送方法。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解以下对本发明优选实施方式的详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了目前优选的实施方式。然而，应当理解的是，本发明不限于附图中所示实施方式的精确布置和机构。
图1包含图1A和图1B，描绘了LNP配方的示意图。图1A描绘了用于通过微流体混合生成LNP的组分的示意图以及由此产生的LNP的预期结构。图1B描绘了C14-4(也称为C14-494)LNP的代表性样品的尺寸(z平均值)分布，使用动态光散射显示直径约为70nm。误差棒代表三个样品的标准偏差。
图2包含图2A至图2C，描绘了用于创建在本研究中筛选的脂质库的代表性环氧化物封端的烷基链和代表性聚胺核。脂质通过迈克尔加成化学制备。此处描述的发明是该图命名的C14-4(也称为C14-494)。图2A描述了用于生成可离子化的脂质库的脂质尾部的代表性结构。图2B描绘了用于生成可离子化的脂质库的胺核的代表性结构。图2C描绘了迈克尔加成反应化学的示意图，其用于通过使过量的脂质尾部与胺核反应来合成可离子化的脂质。
图3包含图3A到图3E，描绘了各种条件下的代表性荧光素酶表达。结果归一化为减去背景的未处理细胞。图3B、图3D和图3E，n＝3。图3A描绘了使用LNP库和脂转染胺(lipofectamine)以30ng/60,000个细胞的剂量处理48小时后，Jurkat细胞的代表性荧光素酶表达，揭示了表现最佳的LNP。将结果归一化为未处理的细胞并减去背景。在与脂转染胺的配对的学生T检验中，*＝p<0.05，n＝4。图3B描绘了用表现最佳的五种LNP配方处理的Jurkat细胞的代表性荧光素酶表达，以确定最佳的LNP配方。将结果归一化为未处理的细胞并减去背景。在C14-4(也称为C14-494)和各其它配方之间的tukey多重比较检验中，*＝p<0.05。图3C描述了一个表格，报告了前五种LNP配方的代表性直径(z平均)、多分散指数和mRNA浓度(±标准偏差)。图3D描绘了使用C14-4(也称为C14-494)以30ng/60,000个细胞处理24小时的Jurkat细胞中代表性荧光素酶表达随时间的变化，证实了蛋白质的瞬时表达。结果归一化为24小时时的表达，减去了背景。图3E描绘了使用脂转染胺或C14-4(也称为C14-494)以30ng mRNA/60,000个细胞处理48小时的Jurkat细胞的代表性活力，显示了与C14-4(也称为C14-494)LNP相关的最小毒性。
图4包含图4A至图4C，描绘了各种条件下的代表性荧光素酶表达。对于图4A和图4C，荧光素酶表达归一化为最低处理(75ng/60,000个细胞)，并且活力归一化为无处理，减去了背景。n＝3。图4A描绘了使用粗制C14-4(也称为C14-494)LNP处理24小时的原代T细胞的代表性荧光素酶表达和活力。图4B描绘了TNS测定的代表性结果，用以确定包封荧光素酶mRNA的粗制和纯C14-4(也称为C14-494)LNP的LNP pKa。pKa计算为对应于最大TNS荧光值一半的pH。图4C描绘了使用粗制或纯化的C14-4(也称为C14-494)处理的原代T细胞的代表性荧光素酶表达和活力，显示荧光素酶表达增加而毒性没有增加。在配对学生T检验中，*＝p<0.05。
图5描绘了用于生成可离子化脂质库的胺核的代表性命名结构。
图6描绘了每种LNP配方的代表性直径(z-平均值)、PDI和mRNA浓度，显示了LNP配方中LNP尺寸、单分散性和类似mRNA负载的窄范围。
图7描绘了包封荧光素酶mRNA的粗制和纯C14-4(也称为C14-494)LNP的代表性特性比较。n＝3+的平均值以及±标准偏差(averages n＝3+with±standard deviation)。
图8包含图8A和图8B，描绘了筛选的具有不同摩尔比％的代表性库A配方，并且数据显示，可离子化的脂质(例如C14-494)在包封在LNP中时全部仍然可离子化。在本研究中，“S2”配方被设定为赋形剂的标准C14-494配方。图8A描绘了代表性库A配方的代表性制造参数，表示为摩尔比。图8B描绘了库A配方的代表性pKa比率。使用TNS测定，库A的pKa表明全部仍然可离子化。
图9描绘了具有不同摩尔比％的代表性库A配方的代表性制造参数。这些代表性配方的选择是基于筛选库A的结果选择的。
图10描绘了两个库的代表性归一化递送效率。大于一的值(虚线)表示与阳性对照相比递送效率增加。
图11描绘了库A配方的代表性归一化细胞活力。虚线表示100％的活力。
图12描绘了库B配方的代表性归一化细胞活力。虚线表示100％的活力。
图13包含图13A和图13B，描绘了代表性的mRNA递送和活力赋形剂组合物：体外库。使用30ng/60,0000个细胞将Jurkat处理24小时。库A以橙色显示以进行比较；库B显示为蓝色。图13A描绘了代表性的mRNA递送赋形剂组合物：体外库。图13B描绘了代表性的活力递送赋形剂组合物：体外库。
图14描绘了展示B10和脂转染胺的相对荧光素酶活性的代表性结果。
图15包含图15A和图15B，描绘了在不同浓度/剂量下各种代表性配方的代表性发光和活力结果。使用萤光素酶编码mRNA将Jurkat处理24小时(“S2”配方被设定为赋形剂的标准C14-494配方)。*对于发光和毒理学，归一化为0ng-图15A和图15B中绘制的所有处理组的值是已归一化为未处理组的值。更具体地，每个处理组的发光和毒性读数是发光的量度。每次处理的原始值(发光)除以在未接受处理的细胞组中测量的原始值(发光)。因此，图表值表示与未处理细胞相比的递送或毒性。这允许将背景发光(在各实验之间有所不同)作为一个因素去除。此外，该实验使用三个独立的Jurkat细胞群/通道在三个不同的时间完成(三个生物学重复)，并且在每个实验中，将细胞接种在一式三份的孔中(三个技术重复)。因此，确保结果是可重复的(生物重复)和可靠的(技术重复)。图15A描绘了各种代表性配方在不同浓度下的代表性发光结果。图15B描绘了各种代表性配方在不同浓度下的代表性活力结果。
图16包含图16A至图16C，描绘了代表性赋形剂组合物：患者A、患者B和患者C，离体。图16A描绘了代表性赋形剂组合物：患者A的离体。图16B描绘了代表性赋形剂组合物：患者B的离体。图16C描绘了代表性赋形剂组合物：患者C的离体。
具体实施方式
本发明涉及脂质和脂质纳米颗粒(LNP)及它们的组合物。在一些实施方式中，所述组合物包含至少一种本发明的脂质和至少一种辅助脂质。在某些实施方式中，本发明提供了一种包含至少一种脂质或LNP的组合物，其用于将各种核酸分子和/或治疗剂递送到细胞中。因此，在各种实施方式中，本发明涉及使用包含至少一种脂质或LNP的组合物进行基因递送的方法。在某些实施方式中，本发明提供了一种包含至少一种脂质或LNP的组合物，其用于在有需要的受试者中预防或治疗各种疾病或病症。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但描述了优选的方法和材料。
如本文所用，以下每个术语在本节中具有与其相关的含义。
冠词“一(a)”和“一个(an)”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即至少一个)。例如，“一个要素”是指一个要素或多于一个要素。
本文在提及诸如量、持续时间等可测量值时使用的“约”是指涵盖指定值±20％或±10％的变化，更优选±5％，甚至更优选±1％，且还更优选±0.1％，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。
“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其是饱和或不饱和的(即含有一个或多个双键和/或三键)，具有一到二十四个碳原子(C1-C24烷基)、一到十二个碳原子(C1-C12烷基)、一到八个碳原子(C1-C8烷基)或一到六个碳原子(C1-C6烷基)，并通过单键连接到分子的其余部分，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非另有特别说明，否则烷基任选地被取代。除非另有说明，术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分，是指具有指定碳原子数(即C1-6指1到6个碳原子)的直链或支链烃并且包括直链、支链或环状取代基。
如本文所用，术语“取代的烷基”是指如上所述的烷基被一个、两个或三个选自以下的取代基取代：卤素、-OH、烷氧基、-NH2、-N(CH3)2、-C(＝O)OH、三氟甲基、-C≡N、-C(＝O)O(C1-C4)烷基、-C(＝O)NH2、-SO2NH2、-C(＝NH)NH2和-NO2，优选含有选自卤素、-OH、烷氧基、-NH2、三氟甲基、-N(CH3)2和-C(＝O)OH中的一个或两个取代基，更优选选自卤素、烷氧基和-OH。取代的烷基的实例包括但不限于2,2-二氟丙基、2-羧基环戊基和3-氯丙基。
“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子的其余部分连接到基团的直链或支链二价烃链，仅由碳和氢组成，其是饱和或不饱和的(即含有一个或多个双键(亚烯基)和/或三键(亚炔基))，并且具有例如1到24个碳原子(C1-C24亚烷基)、1到15个碳原子(C1-C15亚烷基)、1到12个碳原子(C1-C12亚烷基)、1到8个碳原子(C1-C8亚烷基)、1到6个碳原子(C1-C6亚烷基)、2到4个碳原子(C2-C4亚烷基)、1到2个碳原子(C1-C2亚烷基)，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、亚正烯基、亚丙炔基、亚正丁炔基等。亚烷基链通过单键或双键连接到分子的其余部分，并通过单键或双键连接到基团。亚烷基链与分子其余部分和基团的连接点可以是通过链中的一个碳或任意两个碳。除非在说明书中另有特别说明，否则亚烷基链可以任选地被取代。
“环烷基”或“碳环”是指仅由碳和氢原子组成的稳定的非芳族单环或多环烃基，其可以包括稠环或桥环系统，具有三至十五个碳原子，优选具有三至十个碳原子，并且其是饱和或不饱和的，并通过单键连接到分子的其余部分。单环基团包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环基团包括例如金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、7,7-二甲基双环[2.2.1]庚基等。除非另有特别说明，环烷基任选地被取代。
“亚环烷基”是二价环烷基。除非说明书中另有特别说明，否则亚环烷基可以任选地被取代。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一术语组合是指由所述碳原子数和选自以下的一个或两个杂原子组成的稳定的直链或支链烷基基团：O、N、Si、P和S，并且其中氮和硫原子可以任选地被氧化并且氮杂原子可以任选地被季铵化。杂原子可以放置在杂烷基的任何位置，包括杂烷基的其余部分和它所连接的片段之间，以及连接到杂烷基中最远端的碳原子。示例包括：-O-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH2-OH、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-S-CH2-CH3和-CH2CH2-S(＝O)-CH3。最多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3或-CH2-CH2-S-S-CH3。
“杂环基”或“杂环环”是指稳定的3至18元非芳香族环基团，其由2至12个碳原子和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子组成。除非在说明书中另有特别说明，杂环基可以是单环、双环、三环或四环环系统，其可以包括稠环或桥环系统；并且杂环基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；氮原子可以任选地被季铵化；并且杂环基可以是部分或完全饱和的。此类杂环基的实例包括但不限于二氧杂环戊烷基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、噻吗啉基、1-氧代硫代吗啉基和1,1-二氧代硫代吗啉基。除非另有特别说明，杂环基可任选被取代。
如本文所用，术语“芳族”是指具有一个或多个多不饱和环并具有芳族特性的碳环或杂环，即具有(4n+2)个离域π(pi)电子，其中n是整数。
如本文所述，单独使用或与其它术语组合使用的术语“芳基”，除非另有说明，是指一种碳环芳族系统，含有一个或多个环(通常是一个、两个或三个环)，其中这些环可以以悬垂的方式连接在一起，例如联苯基，或者可以是稠合的，例如萘。例子包括苯基、蒽基和萘基。优选苯基和萘基，最优选苯基。
如本文所用，术语“杂芳基”或“杂芳族”是指含有至少一个选自N、O、Si、P和S的杂原子的芳基；其中氮和硫原子可以任选地被氧化，并且氮原子可以任选地被季铵化。杂芳基可以是取代的或未取代的。杂芳基可以通过杂原子连接到分子的其余部分。多环杂芳基可以包括一个或多个部分饱和的环。例子包括四氢喹啉、2,3-二氢苯并呋喃基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。
非芳族杂环的实例包括单环基团如氮丙啶、环氧乙烷、硫杂环丙烷、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、吡咯烷、吡咯啉、咪唑啉、吡唑烷、二氧戊环、环丁砜、2,3-二氢呋喃、2,5-二氢呋喃、四氢呋喃、噻吩、哌啶、1,2,3,6-四氢吡啶、1,4-二氢吡啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、吡喃、2,3-二氢吡喃、四氢吡喃、1,4-二氧己环、1,3-二氧己环、高哌嗪、高哌啶、1,3-二氧杂环庚烷、4,7-二氢-1,3-二噁平(4,7-dihydro-1,3-dipxepin)和环氧己烷。
杂芳基的实例包括吡啶基、吡嗪基，嘧啶基(特别是2-和4-嘧啶基)、哒嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基(特别是2-吡咯基)、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基(特别是3-和5-吡唑基)、异噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,3,4-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,3,4-噻二唑基和1,3,4-噁二唑基。
多环杂环的实例包括吲哚基(特别是3-、4-、5-、6-和7-吲哚基)、吲哚啉基、喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基(特别是1-和5-异喹啉基)、1,2,3,4-四氢异喹啉基、肉桂基、喹喔啉基(特别是2-和5-喹喔啉基)、喹唑啉基、酞嗪基、1,8-萘啶基、1,4-苯并二噁烷基、香豆素、二氢香豆素、1,5-萘啶基、苯并呋喃基(特别是3-、4-、5-、6-和7-苯并呋喃基)、2,3-二氢苯并呋喃基、1,2-苯并异噁唑基、苯并噻吩基(特别是3-、4-、5-、6和7-苯并噻吩基)、苯并噁唑基、苯并噻唑基(特别是2-苯并噻唑基和5-苯并噻唑基)、嘌呤基、苯并咪唑基(特别是2-苯并咪唑基)、苯并三唑基、硫代黄嘌呤基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、吡咯里西啶基和喹里西啶基。
上述杂环基和杂芳基部分的列表旨在是代表性的而非限制性的。
如本文所用，术语“氨基芳基”是指包含氨基部分的芳基部分。此类氨基部分可包括但不限于伯胺、仲胺、叔胺、掩蔽胺或受保护胺。此类叔胺、掩蔽胺或受保护胺可转化为伯胺或仲胺部分。此外，胺部分可包括具有与胺部分相似的化学特性的胺样部分，包括但不限于化学反应性。
如本文所用，术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”以其常规含义使用，是指分别通过氧原子、氨基、硫原子与分子连接的烷基。
如本文所用，单独使用或与其它术语组合使用的术语“烷氧基”，除非另有说明，是指通过氧原子连接到分子其余部分的具有如上定义指定碳原子数的烷基，例如甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基(异丙氧基)和高级同系物和异构体。优选(C1-C3)烷氧基，特别是乙氧基和甲氧基。
如本文所用，单独或作为另一取代基的一部分的术语“卤代”或“卤素”，除非另有说明，是指氟、氯、溴或碘原子，优选氟、氯或溴，更优选氟或氯。
本文使用的术语“取代的”是指任何上述基团(例如烷基、环烷基或杂环基)，其中至少一个氢原子被与非氢原子的键替换，所述非氢原子例如但不限于：卤原子，例如F、Cl、Br和I；氧代基(＝O)；羟基(-OH)；烷氧基(-ORa，其中Ra为C1-C12烷基或环烷基)；羧基(-OC(＝O)Ra或-C(＝O)ORa，其中Ra为H、C1-C12烷基或环烷基)；胺基(-NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C12烷基或环烷基)；C1-C12烷基；和环烷基。在一些实施方式中，取代基是C1-C12烷基。在其它实施方式中，取代基是环烷基。在其它实施方式中，取代基是卤素基团，例如氟。在其它实施方式中，取代基是氧代基。在其它实施方式中，取代基是羟基。在其它实施方式中，取代基是烷氧基。在其它实施方式中，取代基是羧基。在其它实施方式中，取代基是胺基。
如本文所用，术语“纳米颗粒”是指具有纳米级粒径的颗粒，小于1微米。例如，纳米颗粒可具有高达约50nm的粒径。在另一个实例中，纳米颗粒可以具有高达约10nm的粒径。在另一个例子中，纳米颗粒可以具有高达约6nm的粒径。如本文所用，“纳米颗粒”是指许多纳米颗粒，包括但不限于纳米团簇、纳米囊泡、胶束、薄片状颗粒、聚合物泡囊、树枝状大分子、以及本领域技术人员已知的各种其它小型制造的其它纳米尺寸颗粒。纳米颗粒的形状和组成可以在原子凝聚过程中通过选择性地促进特定晶面的生长以产生球、棒、线、盘、笼、核壳结构和许多其它形状来引导。落入纳米胶囊范围内的实体的定义和理解是本领域技术人员已知的，并且这些定义通过引用并入本文并且用于理解本申请主题的一般性质的目的。
如本文所用，“核酸”意在包括任何核酸，无论是由脱氧核糖核苷还是核糖核苷组成，且无论是由磷酸二酯键或修饰键组成，诸如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰胺酸酯、氨基甲酸酯、硫醚、桥联氨基磷酸酯、桥联亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、桥联的硫代磷酸酯或砜键以及这些键的组合。术语核酸还具体包括由五种生物学发生的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外的碱基组成的核酸。术语“核酸”通常是指大的多核苷酸。
“分离的”是指从自然状态改变或取出的。例如，活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非原生环境中，例如宿主细胞。
“分离的核酸”是指核酸节段或片段，其已与处于天然存在状态的其侧翼的序列分离，即DNA片段，其已从通常与该片段相邻的序列中取出，所述相邻序列即与该片段在其天然存在的基因组中相邻的序列。该术语也适用于从天然伴随核酸的其它成分(即在细胞中自然伴随核酸的RNA或DNA或蛋白质)中基本纯化出来的核酸。因此，该术语包括例如重组DNA或RNA，其被整合到载体中、自主复制的质粒或病毒中、或原核生物或真核生物的基因组DNA或RNA中，或其作为独立于其它序列的单独分子(即作为cDNA或通过PCR或限制酶消化产生的基因组或cDNA片段)存在。它还包括作为编码附加多肽序列的杂合基因的一部分而存在的重组DNA或RNA。
mRNA分子的“编码区”也由mRNA分子的核苷酸残基组成，其在mRNA分子的翻译过程中与转移RNA分子的反密码子区域匹配，或其编码终止密码子。因此，编码区可以包括核苷酸残基，该核苷酸残基包含氨基酸残基的密码子，这些氨基酸残基不存在于由mRNA分子编码的成熟蛋白质中(例如，蛋白质输出信号序列中的氨基酸残基)。
如本文所用，术语“DNA”定义为脱氧核糖核酸。
如本文所用，术语“RNA”定义为核糖核酸。
“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，所述特定核苷酸序列在生物过程中用作合成具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性的其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，例如掺入有重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中的)RNA和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个中的一个位置被腺嘌呤占据，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是该两个序列共享的匹配或同源位置的数量除以比较的位置数量×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个是匹配或同源的，那么这两个序列是60％同源的。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常，当比对两个序列以给出最大同源性时进行比较。
“免疫原”是指为了产生免疫反应而引入体内的任何物质。该物质可以是物理分子，例如蛋白质，也可以由载体例如DNA、mRNA或病毒编码。
在本发明的上下文中，使用以下常用核苷的缩写(核碱基通过N-糖苷键与核糖或脱氧核糖结合)。“A”指腺苷，“C”指胞苷，“G”指鸟苷，“T”指胸苷，“U”指尿苷。
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的简并版本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语核苷酸序列也可以包括内含子，在某种程度上，编码蛋白质的核苷酸序列在某些版本中可以含有内含子。
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的简并版本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。此外，核苷酸序列可以含有经修饰的核苷，这些核苷能够通过细胞中的翻译机器进行翻译。
如本文所用，术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有一般知识，即核酸是多核苷酸，可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何方式获得的所有核酸序列，包括但不限于重组方式，即使用普通克隆技术和PCRTM等从重组库或细胞基因组克隆核酸序列，以及通过合成方式。
在某些情况下，本发明的多核苷酸或核酸是“核酸”，其是指包含至少一种经修饰的核苷的核酸。“经修饰的核苷”是指具有修饰的核苷。例如，已在RNA中鉴定出超过一百种不同的核苷修饰(Rozenski,et al.,1999,The RNA Modification Database:1999update.Nucl Acids Res 27:196-197)。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语既指短链，例如在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体，也指长链，在本领域中通常称为蛋白质，其中有多种类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。
如本文所用，术语“重组多肽”定义为通过使用重组DNA或RNA方法产生的多肽。
如本文所用，术语“重组DNA”定义为通过连接来自不同来源的DNA片段产生的DNA。
如本文所用，术语“重组RNA”定义为通过连接来自不同来源的RNA片段产生的RNA。
如本文所用，术语“相同的/同一的(identical)”是指两个或更多个相同的序列或子序列。
此外，如本文所用的术语“基本相同/基本同一”是指，使用比较算法或通过手动对齐并目视检查测量，在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以实现最大对应时，具有一定百分比相同顺序单元的两个或多个序列。仅作为示例，如果在指定区域上顺序单元为约60％同一、约65％同一、约70％同一、约75％同一、约80％同一、约85％同一、约90％同一或约95％同一，则两个或更多个序列可能“基本同一”。这样的百分比来描述两个或多个序列的“百分比同一性”。序列的同一性可以存在于长度至少为约75-100个顺序单元的区域、长度为约50个顺序单元的区域中，或者在未指定的情况下，存在于整个序列上。该定义还涉及测试序列的补体。
如本文所用的术语“变体”是分别在序列上与参考核酸序列或肽序列不同但保留了参考分子的基本生物学特性的核酸序列或肽序列。核酸变体序列的变化可能不会改变由参考核酸编码的肽的氨基酸序列，或可能导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截断。肽变体序列的变化通常是有限的或保守的，因此参考肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域相同。变体和参考肽可以通过任何组合的一个或多个取代、添加、缺失在氨基酸序列上有所不同。核酸或肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或者可以是未知天然发生的变体。核酸和肽的非天然变体可以通过诱变技术或通过直接合成来制备。在各种实施方式中，变体序列与参考序列具有至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少89％、至少88％、至少87％、至少86％、至少85％的同一性。
如本文所用，“片段”定义为免疫球蛋白分子可变区的至少一部分，其结合其靶，即抗原结合区。可以包括免疫球蛋白的某些恒定区。
如本文所用，术语“键”是指由接头的官能团与另一分子之间的化学反应形成的键或化学部分。此类键可包括但不限于共价键和非共价键，而此类化学部分可包括但不限于酯、碳酸酯、亚胺磷酸酯、腙、缩醛、原酸酯、肽键和寡核苷酸键。水解稳定的键是指键在水中基本上稳定并且在有用的pH值下不与水反应，包括但不限于在生理条件下长时间，甚至可能无限期地稳定。水解不稳定或可降解的键是指键在水或水溶液中可降解，包括例如血液。酶不稳定或可降解的键是指键可以被一种或多种酶降解。仅举例来说，PEG和相关聚合物可以在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或多个末端官能团之间的接头基团中包括可降解的键。这种可降解的键包括但不限于由PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键，其中此类酯基通常在生理条件下水解以释放生物活性剂。其它可水解降解的键包括但不限于碳酸酯键；由胺和醛反应产生的亚胺键；通过醇与磷酸基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼和醛的反应产物的腙键；作为醛和醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸酯和醇的反应产物的原酸酯键；由胺基(包括但不限于在诸如PEG等聚合物的端部)与肽的羧基形成的肽键；和由亚磷酰胺基团(包括但不限于在聚合物末端)和寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。
如本文所用，术语“基因”是指编码蛋白质或功能性RNA(例如，tRNA)的核酸分子。基因可以包括不编码最终蛋白质或RNA产物的区域，例如5'或3'非翻译区、内含子、核糖体结合位点、启动子或增强子区域，或其它相关和/或调控序列区域。
术语“基因表达”和“表达”在本文中可互换使用，是指将来自基因(例如DNA序列)的可遗传信息制成功能性基因产物(例如蛋白质或RNA)的过程。
如本文所用，术语“启动子”或“调控序列”是指为表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在某些情况下，该序列可以是核心启动子序列，而在其它情况下，该序列还可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其它调控元件。例如，启动子/调控序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
术语“可操作地连接”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能键，导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，该第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA或RNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框中。
如本文所用，关于抗体的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其它分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可能结合来自一个或多个其它物种的所述抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不会改变抗体作为特异性抗体的分类。在另一个例子中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应本身并不会改变抗体作为特异性抗体的分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用，意指所述相互作用取决于化学物种上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A的分子(或游离、未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记A的量。
如本文所用，术语“抗原”或“Ag”被定义为引发适应性免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体的产生，或特定免疫原活性细胞的激活，或两者。本领域技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以来自重组或基因组DNA或RNA。本领域技术人员将理解，任何DNA或RNA，其包含编码引发适应性免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文所用术语的“抗原”。另外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所需的免疫反应。此外，本领域技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见地，抗原可以合成产生或来源于生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
如本文所用，术语“佐剂”定义为增强抗原特异性适应性免疫反应的任何分子。
“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能维持体内平衡，并且如果疾病没有得到改善，那么动物的健康状况会继续恶化。
相比之下，动物的“病症”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但动物的健康状态不如没有病症时的健康状态。如果不及时治疗，病症不一定会导致动物的健康状况进一步下降。
如本文所用，“癌症”是指细胞的异常生长或分裂。通常，癌细胞的生长和/或寿命超过其周围正常细胞和组织的生长和/或寿命，并且不与之协调。癌症可以是良性的、恶变前的或恶性的。癌症发生在多种细胞和组织中，包括口腔(例如嘴、舌、咽等)、消化系统(如食道、胃、小肠、结肠、直肠、肝脏、胆管、胆囊、胰腺等)、呼吸系统(如喉、肺、支气管等)、骨骼、关节、皮肤(如基底细胞、鳞状细胞、脑膜瘤等)、乳腺、生殖系统(如子宫、卵巢、前列腺、睾丸等)、泌尿系统(如膀胱、肾脏、输尿管等)、眼睛、神经系统(例如大脑等)、内分泌系统(例如甲状腺等)和造血系统(如淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病等)。
如本文所用，“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。
如本文所用，术语“治疗性”是指治疗和/或预防。通过抑制、减少、缓解或根除疾病或病症状态的至少一种体征或症状来获得治疗性效果。
术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医师或其它临床医生正在寻找的组织、系统或受试者的生物学或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时，足以预防进展或在一定程度上减轻所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者年龄、体重等而变化。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指任何动物或其细胞或任何多细胞生物或其细胞，无论是体外还是原位，都适用于本文所述的方法。在某些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人类。在某些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是胎儿。在某些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是胚胎。
如本文所用，术语“调节”是指与没有治疗或化合物时受试者的反应水平相比，和/或与其它方面相同但未治疗的受试者的反应水平相比，介导受试者反应水平可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或反应，从而在受试者优选人类中介导有益的治疗反应。
如本文所用术语，“治疗”疾病是指降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重性。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代受试者细胞及其后代。
如本文所用的短语“在转录控制下”或“可操作地连接”是指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
“载体”是包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于直链多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
“任选的”或“任选地”(例如任选地被取代)是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且描述包括所述事件或情况发生的实例和不发生的实例。例如，“任选取代的烷基”是指烷基可以被取代或可以不被取代，并且该描述包括取代的烷基和没有取代的烷基。
范围：在整个本公开中，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解的是，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及个体数值。例如，对诸如1至6范围的描述应该被认为已经具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的个体数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。
描述
本发明部分地涉及新型脂质和脂质纳米颗粒(LNP)及它们的组合物。在一些实施方式中，所述组合物包含至少一种本发明的脂质和至少一种辅助脂质。本发明还部分地涉及如下发现，即所述新型脂质、LNP和/或它们的组合物以增强的效率和低毒性将mRNA分子递送至T细胞。因此，在一些方面，本发明还涉及使用所述包含至少一种脂质或LNP的组合物将核酸分子和/或治疗剂递送到靶(例如细胞)中的方法。在各种实施方式中，本发明涉及使用所述包含至少一种脂质或LNP的组合物进行基因递送的方法。在某些实施方式中，本发明提供了使用所述包含至少一种脂质或LNP的组合物在有需要的受试者中预防或治疗疾病或病症的方法。
脂质和脂质纳米颗粒(LNP)
本发明部分地涉及新型脂质化合物。在一个实施方式中，所述新型脂质化合物是可离子化的脂质化合物。在各个方面，所述新型脂质化合物是具有式(I)结构的化合物或其盐，
Figure BDA0003700689930000221
在一些实施方式中，A1为C、C(H)、N、S或P。在一些实施方式中，A2为C、C(H)、N、S或P。
在一些实施方式中，L1为C、C(H)2、C(H)(R19)、O、N(H)或N(R19)。在一些实施方式中，L2为C、C(H)2、C(H)(R19)、O、N(H)或N(R19)。在一些实施方式中，L3为C、C(H)2、C(H)(R19)、O、N(H)或N(R19)。在一些实施方式中，L4为C、C(H)2、C(H)(R19)、O、N(H)或N(R19)。在一些实施方式中，L5为C、C(H)2、C(H)(R19)、O、N(H)或N(R19)。在一些实施方式中，L6为C、C(H)2、C(H)(R19)、O、N(H)或N(R19)。
在一些实施方式中，R1、R2、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6a、R6b、R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R10b、R11a、R11b、R12a、R12b、R13a、R13b、R14a、R14b、R15a、R15b、R16、R17、R18或R19为H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、-Y(R20)z`(R21)z``-环烷基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、-Y(R20)z`(R21)z``-杂环烷基、取代的-(R20)z`(R21)z``-杂环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、-Y(R20)z`(R21)z``-环烯基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、-Y(R20)z`(R21)z``-环炔基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-环炔基、芳基、取代的芳基、-Y(R20)z`(R21)z``-芳基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-芳基、杂芳基、取代的杂芳基、-Y(R20)z`(R21)z``-杂芳基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-杂芳基、烷氧羰基、直链烷氧羰基、支链烷氧羰基、酰胺基、氨基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基芳基、氨基醋酸酯、酰基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基芳基、烷氧基、羧基、羧酸酯、酯、-Y(R20)z`(R21)z``-酯、-Y(R20)z`(R21)z``、＝O、-NO2、-CN、或亚砜。
在各种实施方式中，Y为C、N、O、S或P。
在一些实施方式中，R20或R21为H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧羰基、直链烷氧羰基、支链烷氧羰基、酰胺基、氨基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基芳基、氨基醋酸酯、酰基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基芳基、烷氧基、羧基、羧酸酯、酯、＝O、-NO2、-CN、或亚砜。
在一些实施方式中，z`是由0、1、2或3表示的整数。在一些实施方式中，z``是由0、1、2或3表示的整数。
在一些实施方式中，m、n、o、p、q、r、s、t、u、v、w或x是0到25的整数。在各种实施方式中，m、n、o、p、q、r、s、t、u、v、w或x是由0、1、2、3、4或5表示的整数。
在一些实施方式中，所述脂质化合物是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0003700689930000231
Figure BDA0003700689930000241
Figure BDA0003700689930000251
因此，在各种实施方式中，R1、R2、R3、R4或R5为H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧羰基、直链烷氧羰基、支链烷氧羰基、酰胺基、氨基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基芳基、氨基醋酸酯、酰基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基芳基、烷氧基、羧基、羧酸酯或酯。
在一些实施方式中，m、n、o、p或q是0到25的整数。在一些实施方式中，r、s、t、u、v、w或x是由0、1、2、3、4和5表示的整数。
在一些实施方式中，所述脂质化合物是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0003700689930000252
Figure BDA0003700689930000261
Figure BDA0003700689930000271
在各个方面，本发明还包含脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施方式中，LNP包含本文所述的一种或多种脂质。
在各种实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度范围为约0.1mol％至约100mol％的。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度范围为约1mol％至约100mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度范围为约10mol％至约70mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度范围为约10mol％至约50mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度范围为约15mol％至约45mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度范围为约35mol％至约40mol％。
例如，在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约1mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约2mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约5mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约5.5mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约10mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约12mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约15mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约20mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约25mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约30mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约35mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约37mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约40mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约45mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约50mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约60mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约70mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约80mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约90mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约95mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约95.5mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约99mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约99.9mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种本发明的脂质，其浓度为约100mol％。
在各种实施方式中，LNP进一步包含至少一种辅助化合物。在一些实施方式中，辅助化合物是辅助脂质、辅助聚合物或它们的任何组合。在一些实施方式中，辅助脂质为磷脂、胆固醇脂质、聚合物、阳离子脂质、中性脂质、带电脂质、类固醇、类固醇类似物、聚合物结合脂质、稳定脂质、或它们的任何组合。
在各种实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度范围为约0mol％至约100mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度范围为约0.01mol％至约99.9mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度范围为约0.1mol％至约90mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度范围为约0.1mol％至约70mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度范围为约5mol％至约95mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度范围为约0.5mol％至约50mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度范围为约0.5mol％至约47mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度范围为约2.5mol％至约47mol％。
例如，在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约0.01mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约0.1mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约0.5mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约1mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约1.5mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约2mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约2.5mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约5mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约10mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约12mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约15mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约16mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约20mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约25mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约30mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约35mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约37mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约40mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约45mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约46.5mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约47mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约50mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约60mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约63mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约70mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约80mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约90mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约95mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约95.5mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约99mol％。在一些实施方式中，LNP包含一种或多种辅助化合物，其浓度为约100mol％。
在一些实施方式中，磷脂是二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)或其衍生物、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或其衍生物、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)或其衍生物、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱(SOPC)或其衍生物、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)或其衍生物、N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)或其衍生物、或它们的任何组合。
例如，在一些实施方式中，LNP包含磷脂，其浓度范围为约0mol％至约100mol％。在一些实施方式中，LNP包含磷脂，其浓度范围为约15mol％至约50mol％。在一些实施方式中，LNP包含磷脂，其浓度范围为约10mol％至约40mol％。在一些实施方式中，LNP包含磷脂，其浓度范围为约16mol％至约40mol％。
在一些实施方式中，所述胆固醇脂质是胆固醇或其衍生物。例如，在一些实施方式中，LNP包含胆固醇脂质，其浓度范围为约0mol％至约100mol％。在一些实施方式中，LNP包含胆固醇脂质，其浓度范围为约20mol％至约50mol％。在一些实施方式中，LNP包含胆固醇脂质，其浓度范围为约20mol％至约47mol％。在一些实施方式中，LNP包含浓度为约47mol％的胆固醇脂质和浓度为约16mol％的DOPE。
在一些实施方式中，所述聚合物为聚乙二醇(PEG)或其衍生物。例如，在一些实施方式中，LNP包含聚合物，其浓度范围为约0mol％至约100mol％。在一些实施方式中，LNP包含聚合物，其浓度范围为约0.5mol％至约10mol％。在一些实施方式中，LNP包含聚合物，其浓度范围为约0.5mol％至约2.5mol％。
如本文所用，术语“阳离子脂质”是指当pH降低至低于脂质的可离子化基团的pK时为阳离子或变成阳离子(质子化)、但在更高的pH值下逐渐变得更中性的脂质。在低于pK的pH值下，脂质随后能够与带负电荷的核酸结合。在某些实施方式中，阳离子脂质包含在pH降低时呈现正电荷的两性离子脂质。
在一些实施方式中，阳离子脂质包含在选择性pH(例如生理pH)下携带净正电荷的多种脂质种类中的任何一种。此类脂质包括但不限于N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、3-(N-(N′,N′-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、双十八烷基酰胺基甘氨酰羧基精胺(DOGS)、,2-二油酰基-3-二甲铵丙烷(DODAP)、N,N-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)和N-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。此外，许多商业化的阳离子脂质制剂可用于本发明。这些包括例如
Figure BDA0003700689930000301
(市售的阳离子脂质体，包含DOTMA和1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，来自GIBCO/BRL,GrandIsland,N.Y.)；
Figure BDA0003700689930000302
(市售的阳离子脂质体，包含N-(1-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA和(DOPE)，来自GIBCO/BRL)；和
Figure BDA0003700689930000303
(市售的阳离子脂质，包含在乙醇中的双十八烷基酰胺基甘氨酰羧基精胺(DOGS)，来自Promega Corp.,Madison,Wis.)。以下脂质是阳离子的，在低于生理pH值时带正电荷：DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油烯氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLenDMA)。
在一个实施方式中，阳离子脂质是氨基脂质。可用于本发明的合适的氨基脂质包括在WO 2012/016184中描述的那些，通过引用将其全部并入本文。代表性的氨基脂质包括但不限于1,2-二亚油氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油酰氧基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油酰氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)和2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)。
术语“中性脂质”是指在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质种类中的任何一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
示例性的中性脂质包括例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸盐(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)-马来酰亚胺-PEG、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)-马来酰亚胺-PEG2000、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱(SOPC)和1,2-二elaidoyl-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一个实施方式中，中性脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
在一些实施方式中，所述组合物包含选自以下的中性脂质：DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。
“类固醇”是包含以下碳骨架的化合物：
Figure BDA0003700689930000311
在某些实施方式中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在这些实施方式中的一些中，阳离子脂质的摩尔比。
术语“阴离子脂质”是指在生理pH下带负电的任何脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)和与中性脂质结合的其它阴离子修饰基团。
术语“聚合物缀合脂质”是指包含脂质部分和聚合物部分的分子。聚合物缀合脂质的一个例子是聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指同时包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质是本领域已知的并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-s-DMG)等。
在某些实施方式中，LNP包含附加的稳定脂质，其是聚乙二醇-脂质(聚乙二醇化脂质)。合适的聚乙二醇-脂质包括PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG-修饰的磷脂酸、PEG-修饰的神经酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG-修饰的二烷基胺、PEG-修饰的二酰基甘油、PEG-修饰的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG)。在其它实施方式中，LNP包含聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)诸如4-O-(2’,3’-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基))乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯诸如ω-甲氧基(聚乙氧基))乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基))乙基)氨基甲酸酯。
在某些实施方式中，LNP中存在的附加脂质的量为约1mol％至约10mol％。在一个实施方式中，LNP中存在的附加脂质的量为约1mol％至约5mol％。在一个实施方式中，LNP中存在的附加脂质的量为约1mol％或约2.5mol％。
术语“脂质纳米颗粒”是指具有至少一个纳米级尺寸(例如1-1,000nm)的颗粒，其包含一种或多种脂质，例如式(I)-(XV)的脂质。
在各种实施方式中，所述脂质纳米颗粒的平均直径为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm、或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。
在各种实施方式中，本发明的脂质或LNP基本上是无毒的。
在各种实施方式中，本文所述的脂质或LNP容易转运至目的组织。例如，在各种实施方式中，本文所述的脂质或LNP容易通过细胞膜转运至细胞。在各种实施方式中，本文所述的脂质或LNP高效地通过细胞膜转运至细胞。在一些实施方式中，本文所述的脂质或LNP以增强的功效通过细胞膜转运至细胞。
脂质和LNP组合物
在各个方面，本发明还提供了包含一种或多种本文所述的脂质或LNP的组合物。在各种实施方式中，该组合物包含一种或多种核酸分子、一种或多种治疗剂或它们的任何组合。在一些实施方式中，所述核酸分子、治疗剂、或它们的任何组合被脂质包封。在一些实施方式中，所述核酸分子、治疗剂、或它们的任何组合被LNP包封。
在一个实施方式中，核酸分子是DNA分子。在一个实施方式中，核酸分子是RNA分子。在一些实施方式中，核酸分子是DNA分子或RNA分子。此类核酸的实例包括但不限于：cDNA、mRNA、miRNA、siRNA、经修饰的RNA、antagomir、反义分子、肽、治疗性肽、靶向核酸及它们的任意组合。
在一个实施方式中，mRNA编码荧光素酶。
在各种实施方式中，核酸分子是治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂是分离的核酸。在各种实施方式中，分离的核酸分子是DNA分子或RNA分子。在各种实施方式中，分离的核酸分子是cDNA、mRNA、miRNA、siRNA、antagomir或反义分子。在一个实施方式中，分离的核酸分子编码治疗性肽。在一些实施方式中，治疗剂是抑制靶向核酸的siRNA、miRNA或反义分子。
在一个实施方式中，所述组合物包含启动子或调控序列。在一个实施方式中，所述核酸包含启动子或调控序列，使得该核酸能够指导核酸的表达。因此，在一个实施方式中，包含本发明的代谢物-基聚合物或聚合物颗粒的组合物包含表达载体，并且本发明包含一种将外源DNA引入目的细胞或组织中并伴随外源DNA在该目的细胞或组织中表达的方法。
在一个实施方式中，核酸分子是mRNA。在一个实施方式中，所述组合物包含mRNA。在一个实施方式中，所述组合物包含包封在LNP内的mRNA。在各种实施方式中，包含包封在LNP内的mRNA的组合物与分离的mRNA相比具有特别的优势，包括例如增加的稳定性、低或不存在先天免疫原性、和增强的翻译。
在一个实施方式中，RNA是经修饰的RNA。在另一个实施方式中，本发明经修饰的RNA中0.1％至100％的残基被修饰。在另一个实施方式中，0.1％的残基被修饰。在另一个实施方式中，被修饰的残基的分数为0.2％。在另一个实施方式中，所述分数为0.3％。在另一个实施方式中，所述分数为0.4％。在另一个实施方式中，所述分数为0.5％。在另一个实施方式中，所述分数为0.6％。在另一个实施方式中，所述分数为0.8％。
在另一个实施方式中，所述分数为1％。在另一个实施方式中，所述分数为1.5％。在另一个实施方式中，所述分数为2％。在另一个实施方式中，所述分数为2.5％。在另一个实施方式中，所述分数为3％。在另一个实施方式中，所述分数为4％。在另一个实施方式中，所述分数为5％。在另一个实施方式中，所述分数为6％。在另一个实施方式中，所述分数为8％。在另一个实施方式中，所述分数为10％。在另一个实施方式中，所述分数为12％。在另一个实施方式中，所述分数为14％。在另一个实施方式中，所述分数为16％。在另一个实施方式中，所述分数为18％。在另一个实施方式中，所述分数为20％。在另一个实施方式中，所述分数为25％。在另一个实施方式中，所述分数为30％。在另一个实施方式中，所述分数为35％。在另一个实施方式中，所述分数为40％。在另一个实施方式中，所述分数为45％。在另一个实施方式中，所述分数为50％。在另一个实施方式中，所述分数为60％。在另一个实施方式中，所述分数为70％。在另一个实施方式中，所述分数为80％。在另一个实施方式中，所述分数为90％。在另一个实施方式中，所述分数为100％。
在另一个实施方式中，所述分数小于5％。在另一个实施方式中，所述分数小于3％。在另一个实施方式中，所述分数小于1％。在另一个实施方式中，所述分数小于2％。在另一个实施方式中，所述分数小于4％。在另一个实施方式中，所述分数小于6％。在另一个实施方式中，所述分数小于8％。在另一个实施方式中，所述分数小于10％。在另一个实施方式中，所述分数小于12％。在另一个实施方式中，所述分数小于15％。在另一个实施方式中，所述分数小于20％。在另一个实施方式中，所述分数小于30％。在另一个实施方式中，所述分数小于40％。在另一个实施方式中，所述分数小于50％。在另一个实施方式中，所述分数小于60％。在另一个实施方式中，所述分数小于70％。
在另一个实施方式中，给定核苷(即尿苷、胞苷、鸟苷或腺苷)的残基的0.1％被修饰。在另一个实施方式中，被修饰的给定核苷酸的分数是0.2％。在另一个实施方式中，所述分数为0.3％。在另一个实施方式中，所述分数为0.4％。在另一个实施方式中，所述分数为0.5％。在另一个实施方式中，所述分数为0.6％。在另一个实施方式中，所述分数为0.8％。
在另一个实施方式中，所述分数为1％。在另一个实施方式中，所述分数为1.5％。在另一个实施方式中，所述分数为2％。在另一个实施方式中，所述分数为2.5％。在另一个实施方式中，所述分数为3％。在另一个实施方式中，所述分数为4％。在另一个实施方式中，所述分数为5％。在另一个实施方式中，所述分数为6％。在另一个实施方式中，所述分数为8％。在另一个实施方式中，所述分数为10％。在另一个实施方式中，所述分数为12％。在另一个实施方式中，所述分数为14％。在另一个实施方式中，所述分数为16％。在另一个实施方式中，所述分数为18％。在另一个实施方式中，所述分数为20％。在另一个实施方式中，所述分数为25％。在另一个实施方式中，所述分数为30％。在另一个实施方式中，所述分数为35％。在另一个实施方式中，所述分数为40％。在另一个实施方式中，所述分数为45％。在另一个实施方式中，所述分数为50％。在另一个实施方式中，所述分数为60％。在另一个实施方式中，所述分数为70％。在另一个实施方式中，所述分数为80％。在另一个实施方式中，所述分数为90％。在另一个实施方式中，所述分数为100％。
在另一个实施方式中，被修饰的给定核苷酸的分数小于8％。在另一个实施方式中，所述分数小于10％。在另一个实施方式中，所述分数小于5％。在另一个实施方式中，所述分数小于3％。在另一个实施方式中，所述分数小于1％。在另一个实施方式中，所述分数小于2％。在另一个实施方式中，所述分数小于4％。在另一个实施方式中，所述分数小于6％。在另一个实施方式中，所述分数小于12％。在另一个实施方式中，所述分数小于15％。在另一个实施方式中，所述分数小于20％。在另一个实施方式中，所述分数小于30％。在另一个实施方式中，所述分数小于40％。在另一个实施方式中，所述分数小于50％。在另一个实施方式中，所述分数小于60％。在另一个实施方式中，所述分数小于70％。
在另一个实施方式中，包封在本发明的LNP中的RNA在细胞中比具有相同序列的分离的RNA分子更有效地翻译。在另一个实施方式中，包封在LNP中的RNA表现出增强的被靶细胞翻译的能力。在另一个实施方式中，相对于未修饰的对应物，翻译增强了2倍的因数。在另一个实施方式中，翻译增强了3倍因数。在另一个实施方式中，翻译增强了5倍因数。在另一个实施方式中，翻译增强了7倍因数。在另一个实施方式中，翻译增强了10倍因数。在另一个实施方式中，翻译增强了15倍因数。在另一个实施方式中，翻译增强了20倍因数。在另一个实施方式中，翻译增强了50倍因数。在另一个实施方式中，翻译增强了100倍因数。在另一个实施方式中，翻译增强了200倍因数。在另一个实施方式中，翻译增强了500倍因数。在另一个实施方式中，翻译增强了1000倍因数。在另一个实施方式中，翻译增强了2000倍因数。在另一个实施方式中，所述因数为10-1000倍。在另一个实施方式中，所述因数为10-100倍。在另一个实施方式中，所述因数为10-200倍。在另一个实施方式中，所述因数为10-300倍。在另一个实施方式中，所述因数为10-500倍。在另一个实施方式中，所述因数为20-1000倍。在另一个实施方式中，所述因数为30-1000倍。在另一个实施方式中，所述因数为50-1000倍。在另一个实施方式中，所述因数为100-1000倍。在另一个实施方式中，所述因数为200-1000倍。在另一个实施方式中，翻译增强了任何其它显著量或量的范围。
在某些实施方式中，mRNA不激活任何病理生理途径，非常有效地翻译且几乎在递送后立即进行，并在体内持续数天作为连续蛋白质生产的模板(Karikó et al.,2008,MolTher 16:1833-1840；Karikó et al.,2012,Mol Ther 20:948-953)。在某些情况下，与分离的mRNA编码的抗原相比，包封在LNP内的mRNA编码的抗原诱导生产更多的抗原特异性抗体产生。
在一个实施方式中，核酸分子编码抗原。在一个实施方式中，核酸分子编码多种抗原。在一些实施方式中，mRNA编码一种或多种抗原。在一个实施方式中，治疗剂是抗原。
在各种实施方式中，抗原包含病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、流感抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原、或它们的任何组合。在一个实施方式中，本发明包括编码佐剂的核酸分子。
在一个实施方式中，抗原由核酸分子的核酸序列编码。在某些实施方式中，核酸序列包含DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或它们的组合。在一个实施方式中，核酸序列包含经修饰的核酸序列。例如，在一个实施方式中，编码抗原的核酸序列包含RNA，如本文别处详细描述的。在某些情况下，核酸序列包含编码通过肽键与抗原连接的接头或标签序列的附加序列。
在某些实施方式中，由核酸分子编码的抗原包含来自任何数量生物体(例如，病毒、寄生虫、细菌、真菌或哺乳动物)的蛋白质、肽、其片段、或其变体、或它们的组合。例如，在某些实施方式中，抗原与自身免疫性疾病、过敏或哮喘有关。在其它实施方式中，抗原与癌症、疱疹、流感、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头瘤病毒(HPV)、埃博拉病毒、肺炎球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌、登革热、肺结核、疟疾、诺如病毒或人类免疫缺陷病毒(HIV)有关。在某些实施方式中，抗原包含基于两种或更多种不同生物体的氨基酸序列的共有序列。在某些实施方式中，优化编码抗原的核酸序列以便在递送组合物的生物体中有效翻译。
在一个实施方式中，抗原包含肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原，使得抗原诱导针对肿瘤的适应性免疫反应。在一个实施方式中，抗原包含肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的片段，使得抗原诱导针对肿瘤的适应性免疫反应。在某些实施方式中，肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原是宿主蛋白的突变变体。
因此，在一个实施方式中，所述组合物包含抗原。在一个实施方式中，所述组合物包含编码抗原的核酸序列。例如，在某些实施方式中，所述组合物包含编码抗原的RNA。抗原可以是任何分子或化合物，包括但不限于在受试者中诱导适应性免疫反应的多肽、肽或蛋白质。
在一个实施方式中，抗原包含与病原体相关的多肽或肽，使得抗原诱导针对抗原的适应性免疫反应，并因此针对病原体。在一个实施方式中，抗原包含与病原体相关的多肽或肽的片段，使得抗原诱导针对病原体的适应性免疫反应。
在某些实施方式中，抗原包含氨基酸序列，其与本文所述抗原的氨基酸序列基本同源并保留了原始氨基酸序列的免疫原性功能。例如，在某些实施方式中，抗原的氨基酸序列相对于原始氨基酸序列具有至少60％、有利地至少70％、优选地至少85％且更优选地至少95％的同一性程度。
病毒抗原-在一个实施方式中，抗原包含病毒抗原或其片段或其变体。在某些实施方式中，病毒抗原来自以下家族之一的病毒：腺病毒科，沙粒病毒科、布尼亚病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒科、正粘病毒科、乳多空病毒科、副黏液病毒科、细小病毒科、小核糖核酸病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科或披膜病毒科。在某些实施方式中，病毒抗原来自乳头状瘤病毒，例如人乳头状瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、天花病毒(主要和次要天花病毒)、牛痘病毒、流感病毒、鼻病毒、登革热病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病病毒、诺沃克病毒、甲型肝炎病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、毛细胞白血病病毒(HTLV-II)、加州脑炎病毒、汉坦病毒(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉热病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹1(口腔疱疹)、单纯疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，又名水痘)、巨细胞病毒(CMV)例如人类CMV、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、黄病毒、口蹄疫病毒、基孔肯雅病毒、拉沙病毒、沙粒病毒或致癌病毒。
肝炎抗原-在一个实施方式中，抗原包括肝炎病毒抗原(即肝炎抗原)、或其片段、或其变体。在某些实施方式中，肝炎抗原包含来自甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和/或戊型肝炎病毒(HEV)的抗原或免疫原。在某些实施方式中，肝炎抗原是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。
在一个实施方式中，肝炎抗原包括来自HAV的抗原。例如，在某些实施方式中，肝炎抗原包含HAV衣壳蛋白、HAV非结构蛋白、其片段、其变体或它们的组合。
在一个实施方式中，肝炎抗原包括来自HCV的抗原。例如，在某些实施方式中，肝炎抗原包含HCV核衣壳蛋白(即核心蛋白)、HCV包膜蛋白(例如E1和E2)、HCV非结构蛋白(例如NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b)、其片段、其变体或它们的组合。
在一个实施方式中，肝炎抗原包含来自HDV的抗原。例如，在某些实施方式中，肝炎抗原包括HDVδ抗原、其片段或其变体。
在一个实施方式中，肝炎抗原包括来自HEV的抗原。例如，在某些实施方式中，肝炎抗原包括HEV衣壳蛋白、其片段或其变体。
在一个实施方式中，肝炎抗原包括来自HBV的抗原。例如，在某些实施方式中，肝炎抗原包含HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV DNA聚合酶、由基因X编码的HBV蛋白、其片段、其变体或它们的组合。在某些实施方式中，肝炎抗原包含HBV基因型A核心蛋白、HBV基因型B核心蛋白、HBV基因型C核心蛋白、HBV基因型D核心蛋白、HBV基因型E核心蛋白、HBV基因型F核心蛋白、HBV基因型G核心蛋白、HBV基因型H核心蛋白、HBV基因型A表面蛋白、HBV基因型B表面蛋白、HBV基因型C表面蛋白、HBV基因型D表面蛋白、HBV基因型E表面蛋白、HBV基因型F表面蛋白、HBV基因型G表面蛋白、HBV基因型H表面蛋白、其片段、其变体或它们的组合。
人类乳头瘤病毒(HPV)抗原-在一个实施方式中，抗原包含人类乳头瘤病毒(HPV)抗原、或其片段、或其变体。例如，在某些实施方式中，抗原包括来自HPV类型16、18、31、33、35、45、52和58的抗原，其导致宫颈癌、直肠癌和/或其它癌症。在一个实施方式中，抗原包括来自HPV类型6和11的抗原，它们会导致生殖器疣，并且已知是头颈癌的致因。例如，在某些实施方式中，HPV抗原包含来自任何HPV类型的HPV E6或E7结构域、或其片段或变体。
RSV抗原-在一个实施方式中，抗原包含RSV抗原或其片段、或其变体。例如，在某些实施方式中，RSV抗原包含人类RSV融合蛋白(本文也称为“RSV F”、“RSV F蛋白”和“F蛋白”)、或其片段或变体。在一个实施方式中，人类RSV融合蛋白在RSV亚型A和B之间是保守的。在某些实施方式中，RSV抗原包含来自RSV Long毒株(GenBank AAX23994.1)的RSV F蛋白、或其片段或变体。在一个实施方式中，RSV抗原包含来自RSV A2毒株(GenBankAAB59858.1)的RSV F蛋白、或其片段或变体。在某些实施方式中，RSV抗原是RSV F蛋白的单体、二聚体或三聚体，或其片段或变体。根据本发明，在某些实施方式中，RSV F蛋白是融合前形式或融合后形式。
在一个实施方式中，RSV抗原包含人类RSV附着糖蛋白(本文也称为“RSV G”、“RSVG蛋白”和“G蛋白”)、或其片段或变体。人类RSV G蛋白在RSV亚型A和B之间有所不同。在一个实施方式中，抗原包含来自RSV Long毒株(GenBank AAX23993)的RSV G蛋白、或其片段或变体。在一个实施方式中，RSV抗原包含来自以下的RSV G蛋白：RSV亚型B分离株H5601，RSV亚型B分离株H1068，RSV亚型B分离株H5598，RSV亚型B分离株H1123，或其片段或变体。
在其它实施方式中，RSV抗原包含人类RSV非结构蛋白1(“NS1蛋白”)、或其片段或变体。例如，在一个实施方式中，RSV抗原包含来自RSV Long毒株(GenBank AAX23987.1)的RSV NS1蛋白、或其片段或变体。在一个实施方式中，RSV抗原包含RSV非结构蛋白2(“NS2蛋白”)、或其片段或变体。例如，在一个实施方式中，RSV抗原包含来自RSV Long毒株(GenBankAAX23988.1)的RSV NS2蛋白、或其片段或变体。在一个实施方式中，RSV抗原包含人RSV核衣壳(“N”)蛋白、或其片段或变体。例如，在一个实施方式中，RSV抗原是来自RSV Long毒株(GenBank AAX23989.1)的RSV N蛋白、或其片段或变体。在一个实施方式中，RSV抗原包含人类RSV磷蛋白(“P”)蛋白、或其片段或变体。例如，在一个实施方式中，RSV抗原包含来自RSVLong毒株(GenBank AAX23990.1)的RSV P蛋白、或其片段或变体。在一个实施方式中，RSV抗原包含人类RSV基质蛋白(“M”)蛋白、或其片段或变体。例如，在一个实施方式中，RSV抗原包含来自RSV Long毒株(GenBank AAX23991.1)的RSV M蛋白、或其片段或变体。
在还其它实施方式中，RSV抗原包含人类RSV小疏水性(“SH”)蛋白、或其片段或变体。例如，在一个实施方式中，RSV抗原包含来自RSV Long毒株(GenBank AAX23992.1)的RSVSH蛋白、或其片段或变体。在一个实施方式中，RSV抗原包含人类RSV基质蛋白2-1(“M2-1”)蛋白、或其片段或变体。例如，在一个实施方式中，RSV抗原包含来自RSV Long毒株(GenBankAAX23995.1)的RSV M2-1蛋白、或其片段或变体。在一个实施方式中，RSV抗原包含RSV基质蛋白2-2(“M2-2”)蛋白、或其片段或变体。例如，在一个实施方式中，RSV抗原包含来自RSVLong毒株(GenBank AAX23997.1)的RSV M2-2蛋白、或其片段或变体。在一个实施方式中，RSV抗原包含RSV聚合酶L(“L”)蛋白、或其片段或变体。例如，在一个实施方式中，RSV抗原包含来自RSV Long毒株(GenBank AAX23996.1)的RSV L蛋白、或其片段或变体。
流感抗原-在一个实施方式中，抗原包括流感抗原或其片段、或其变体。流感抗原是那些能够在哺乳动物中引发针对一种或多种流感血清型的适应性免疫反应的抗原。在某些实施方式中，抗原包含全长翻译产物血凝素(HA)0、亚基HA1、亚基HA2、其变体、其片段或它们的组合。在某些实施方式中，流感血凝素抗原来源于甲型流感血清型H1、甲型流感血清型H2或乙型流感的一种或多种毒株。
在一个实施方式中，流感抗原含有至少一种抗原表位，该表位可以有效对抗特定的流感免疫原，针对这些免疫原可以诱导免疫反应。在某些实施方式中，抗原可以提供存在于完整流感病毒中的一整套免疫原性位点和表位。
在一些实施方式中，流感抗原包含H1 HA、H2 HA、H3 HA、H5 HA或BHA抗原。在某些实施方式中，流感抗原包括神经氨酸酶(NA)、基质蛋白、核蛋白、M2胞外域-核蛋白(M2e-NP)、其变体、其片段或它们的组合。
人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原–在一个实施方式中，抗原包括HIV抗原或其片段、或其变体。
在某些实施方式中，HIV抗原包含包膜(Env)蛋白或其片段或变体。例如，在某些实施方式中，HIV抗原包含选自gp120、gp41或它们的组合的Env蛋白。
在某些实施方式中，HIV抗原包含nef、gag、pol、vif、vpr、vpu、tat、rev或其变体的片段中的至少一种。
HIV抗原可以来源于任何HIV毒株。例如，在某些实施方式中，HIV抗原包括来自HIV组M、N、O和P、以及亚型A、HIV亚型B、HIV亚型C、HIV亚型D、亚型E、亚型F、亚型G、亚型H、亚型J或亚型K的抗原。在一个实施方式中，HIV抗原包含来自HIV-R3A毒株的Env或其片段或变体(R3A-Env)。
寄生虫抗原-在某些实施方式中，抗原包括寄生虫抗原或其片段或变体。在某些实施方式中，寄生虫是原生动物、蠕虫或体外寄生虫。在某些实施方式中，蠕虫(即蠕虫)是扁虫(例如吸虫和绦虫)、棘头蠕虫、圆形的蠕虫(例如蛲虫)。在某些实施方式中，外寄生虫是虱子、跳蚤、蜱虫和螨虫。
在某些实施方式中，寄生虫是引起以下疾病的任何寄生虫：棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、巴贝虫病、小袋虫病、贝利斯蛔虫病、查加斯病、支睾吸虫病、锥蝇属、隐孢子虫病、犬裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、包虫病、象皮病、蛲虫病、肝片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、梨形鞭毛虫病、颚口虫病、膜壳绦虫病、等孢球虫病、片山热、利什曼病、莱姆病、疟疾、后殖吸虫病、蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡症、类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、毛线虫病和鞭虫病。
在某些实施方式中，寄生虫是棘阿米巴、异尖线虫、人蛔虫、肤蝇、结肠小袋纤毛虫、臭虫、绦虫类(绦虫)、恙螨、螺旋蝇、痢疾阿米巴、肝片吸虫、肠兰伯氏鞭毛虫、钩虫、利什曼虫、舌形虫、肝吸虫、罗阿丝虫、并殖吸虫-肺吸虫、蛲虫、镰状疟原虫、裂体吸虫属、粪类圆线虫、螨虫、绦虫、刚地弓形虫、锥体虫属、鞭虫或班氏吴策线虫。
疟疾抗原-在一个实施方式中，抗原包括疟疾抗原(即PF抗原或PF免疫原)、或其片段、或其变体。例如，在一个实施方式中，抗原包含来自引起疟疾的寄生虫的抗原。在一个实施方式中，引起疟疾的寄生虫是镰状疟原虫。
在一些实施方式中，疟疾抗原包含镰状疟原虫免疫原CS；LSA1；TRAP；CelTOS；和Ama1中的一种或多种。免疫原可以是全长蛋白质的全长或免疫原性片段。
细菌抗原-在一个实施方式中，抗原包括细菌抗原或其片段或变体。在某些实施方式中，细菌来自以下门类的任何一种：酸杆菌、放线菌、水生菌、拟杆菌、嗜热丝菌门(Caldiserica)、衣原体、绿菌门、绿弯菌门、产金菌门、蓝藻细菌、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、奇异球菌-栖热菌、网团菌门、迷踪菌门、纤维杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、黏胶球形菌门、硝化螺菌属、浮霉菌门、变形菌门、螺旋体门、互养菌门、软壁菌门、热脱硫杆菌门、热袍菌门和疣微菌门。
在某些实施方式中，细菌是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。在某些实施方式中，细菌为需氧菌或厌氧菌。在某些实施方式中，细菌是自养细菌或异养细菌。在某些实施方式中，细菌是嗜温菌、嗜中性菌、嗜极端菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌或嗜渗透菌。
在某些实施方式中，细菌是炭疽杆菌、抗生素耐药菌、引起疾病的细菌、食物中毒细菌、传染性细菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌或破伤风杆菌。在某些实施方式中，细菌是分枝杆菌、破伤风梭菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或艰难梭菌。
结核分枝杆菌抗原-在一个实施方式中，抗原包含结核分枝杆菌抗原(即TB抗原或TB免疫原)、或其片段、或其变体。TB抗原可以来自TB抗原的Ag85家族，例如Ag85A和Ag85B。TB抗原可以来自TB抗原的Esx家族，例如EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV和EsxW。
真菌抗原-在一个实施方式中，抗原包含真菌抗原或其片段或变体。在某些实施方式中，真菌是曲霉属、皮炎芽生菌、念珠菌(例如白色念珠菌)、球孢子菌、新型隐球菌、加特隐球菌、皮肤癣菌、镰刀菌属、荚膜组织胞浆菌、毛霉菌亚门、耶氏肺孢子菌、申克孢子丝菌、突脐蠕孢属或枝孢属。
肿瘤抗原-在某些实施方式中，抗原包括肿瘤抗原，包括例如肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性病症抗原”或“与过度增殖性病症相关的抗原”是指特定的过度增殖性病症共有的抗原。在某些方面，本发明的过度增殖性病症抗原来源于癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、间皮瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，可引发免疫反应，特别是T细胞介导的免疫反应。在一个实施方式中，本发明的肿瘤抗原包含一种或多种抗原性癌症表位，这些抗原性癌症表位被源自哺乳动物癌症肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)免疫原性地识别。抗原的选择将取决于要通过本发明的组合物治疗或预防的特定癌症类型。
肿瘤抗原在本领域是众所周知的并且包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、prostase、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一个实施方式中，肿瘤抗原包含一种或多种与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。性肿瘤表达多种蛋白质，可作为免疫攻击的靶抗原。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，诸如黑色素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP 100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化相关分子组，例如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。又另一组靶抗原是癌-胎儿抗原，例如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原，其是个体肿瘤所特有的。B细胞分化抗原如CD19、CD20和CD37是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选物。这些抗原(CEA、HER-2、CD19、CD20、独特型)的一些已被用作单克隆抗体被动免疫治疗的靶，但成功率有限。
本发明所指的肿瘤抗原类型也可以是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞独有的，并且不会发生在身体的其它细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞独有的，而是在不能诱导对该抗原的免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。在使免疫系统能够对抗原作出反应的条件下，可能发生抗原在肿瘤上的表达。TAA可以是在胎儿发育过程中免疫系统不成熟且无法做出反应时在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是通常在正常细胞上以极低水平存在但在肿瘤细胞上以远高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2，和肿瘤特异性多系抗原，例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原，例如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，例如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，例如爱泼斯坦-巴尔病毒抗原EBVA和人类乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它基于蛋白质的大型抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在优选的实施方式中，抗原包括但不限于CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGE A3 TCR等。
在某些实施方式中，核酸分子编码抗原，该抗原诱导针对该抗原的适应性免疫反应。在某些实施方式中，治疗剂是诱导针对该抗原的适应性免疫反应的抗原。
编码如本文所述的抗原或佐剂的核苷酸序列可以替代地包含相对于原始核苷酸序列的序列变异，例如一个或多个核苷酸的取代、插入和/或缺失，条件是所得多核苷酸编码根据本发明的多肽。因此，本发明的范围包括与本文所述的核苷酸序列基本上同源并编码目的抗原或佐剂的核苷酸序列。
如本文所用，当一核苷酸序列相对于任何本文所述的核苷酸序列具有至少60％、有利地至少70％、优选至少85％、更优选至少95％的同一性程度时，该核苷酸序列与本文所述的核苷酸序列是“基本上同源的”。例如，通过引入保守或非保守取代，基于核苷酸序列中含有的信息，通常可以从抗原的生产生物体中分离出与编码抗原的核苷酸序列基本同源的核苷酸序列。可能的修饰的其它例子包括在序列中插入一个或多个核苷酸、在序列的任何末端添加一个或多个核苷酸、或缺失序列的任何末端或内部的一个或多个核苷酸。使用本领域技术人员众所周知的计算机算法和方法确定两个多核苷酸之间的同一性程度。
在一个实施方式中，本发明涉及一种构建体，其包含编码抗原的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述构建体包含多个编码多种抗原的核苷酸序列。例如，在某些实施方式中，所述构建体编码1或以上、2或以上、5或以上、10或以上、15或以上、或20或以上种抗原。在一个实施方式中，本发明涉及一种构建体，其包含编码佐剂的核苷酸序列。在一个实施方式中，该构建体包含编码抗原的第一核苷酸序列和编码佐剂的第二核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述组合物包含多种构建体，每种构建体编码一种或多种抗原。在某些实施方式中，所述组合物包含1或以上、2或以上、5或以上、10或以上、15或以上、或20或以上种构建体。在一个实施方式中，所述组合物包含第一构建体，其包含编码抗原的核苷酸序列；和第二构建体，其包含编码佐剂的核苷酸序列。
在另一个特定实施方式中，所述构建体可操作地结合到翻译控制元件。所述构建体可以掺入可操作地结合的调控序列，用于表达本发明的核苷酸序列，从而形成表达盒。
在一个实施方式中，本发明的组合物包含体外转录的(IVT)RNA。例如，在某些实施方式中，本发明的组合物包含编码抗原的IVT RNA，其中所述抗原诱导适应性免疫反应。在某些实施方式中，所述抗原是病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原中的至少一种。然而，本发明不限于任何特定抗原或抗原组合。
例如，在一个实施方式中，所述组合物包含包封在LNP内的抗原编码核酸分子。在某些情况下，LNP增强所述核酸分子的细胞摄取。
在一个方面，核酸分子是编码抗原的IVT RNA。因此，在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码抗原的IVT RNA。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码多种抗原的IVT RNA。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码佐剂的IVT RNA。在一个实施方式中，本发明的组合物包含编码一种或多种抗原和一种或多种佐剂的IVT RNA。
在一个实施方式中，所述组合物包含编码佐剂的核酸分子。因此，在一个实施方式中，所述组合物包含佐剂。在一个实施方式中，所述编码佐剂的核酸分子是IVT RNA。在一个实施方式中，所述编码佐剂的核酸分子是RNA。
示例性佐剂包括但不限于α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括具有缺失信号序列的IL-15且任选地包括来自IgE的信号肽。其它有用的佐剂的其它基因包括编码以下的那些：MCP-I、MIP-Ia、MIP-Ip、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-I、VLA-I、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-I、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-I、Ap-I、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活跃的NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP 1、TAP2、抗-CTLA4-sc、抗-LAG3-Ig、抗-TIM3-Ig及其功能片段。
在一些实施方式中，所述组合物还包含阳离子脂质和一种或多种选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物缀合脂质的赋形剂。在一些实施方式中，核酸分子被包封在脂质纳米颗粒的脂质部分中或被脂质纳米颗粒的脂质部分的一些或全部包围的水性空间中，从而保护它免受由宿主生物体或细胞的机制引起的酶促降解或其它不良影响，例如不良免疫反应。
在一个实施方式中，所述组合物包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和聚乙二醇化脂质。
在一个实施方式中，所述组合物包含阳离子脂质。如本文所用，术语“阳离子脂质”是指当pH降低至低于脂质的可离子化基团的pK时为阳离子或变成阳离子(质子化)、但在更高的pH值下逐渐变得更中性的脂质。在低于pK的pH值下，脂质随后能够与带负电荷的核酸结合。在某些实施方式中，阳离子脂质包含在pH降低时呈现正电荷的两性离子脂质。
在某些实施方式中，阳离子脂质包含在选择性pH(例如生理pH)下携带净正电荷的多种脂质种类中的任何一种。此类脂质包括但不限于N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、3-(N-(N′,N′-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、双十八烷基酰胺基甘氨酰羧基精胺(DOGS)、1,2-二油酰基-3-二甲铵丙烷(DODAP)、N,N-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙胺(DODMA)和N-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。此外，可获得可用于本发明的大量阳离子脂质的商业制剂。这些包括例如
Figure BDA0003700689930000461
(包含DOTMA和1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)的市售阳离子脂质体，来自GIBCO/BRL,Grand Island,N.Y.)；
Figure BDA0003700689930000462
(包含N-(1-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)和(DOPE)的市售阳离子脂质体，来自GIBCO/BRL)；和
Figure BDA0003700689930000463
(在乙醇中包含双十八烷基酰胺基甘氨酰羧基精胺(DOGS)的市售阳离子脂质，来自Promega Corp.,Madison,Wis.)。以下脂质是阳离子的并且在低于生理pH下具有正电荷：DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油烯氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLenDMA)。
在一个实施方式中，阳离子脂质是氨基脂质。有用于本发明的合适的氨基脂质包括在WO 2012/016184中描述的那些，其通过引用全部并入本文。代表性的氨基脂质包括但不限于1,2-二亚油氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油酰氧基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油酰氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)和2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质以约30至约95摩尔百分比的量存在于组合物中。在一个实施方式中，所述阳离子脂质以约30至约70摩尔百分比的量存在于组合物中。在一个实施方式中，所述阳离子脂质以约40至约60摩尔百分比的量存在于组合物中。在一个实施方式中，阳离子脂质以约50摩尔百分比的量存在于组合物中。在一个实施方式中，组合物仅包含阳离子脂质。
在某些实施方式中，所述组合物包含在颗粒形成过程中稳定颗粒形成的一种或多种附加脂质。合适的稳定脂质包括中性脂质和阴离子脂质。
术语“中性脂质”是指在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质种类中的任何一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
示例性的中性脂质包括例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸盐(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)-马来酰亚胺-PEG、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)-马来酰亚胺-PEG2000、16-O-一甲基PE,16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱(SOPC)和1,2-二elaidoyl-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一个实施方式中，中性脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
在一些实施方式中，所述组合物包含选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM中的中性脂质。
在各种实施方式中，所述组合物进一步包含类固醇或类固醇类似物。“类固醇”是包含以下碳骨架的化合物：
Figure BDA0003700689930000481
在某些实施方式中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在这些实施方式中的一些中，阳离子脂质的摩尔比。
术语“阴离子脂质”是指在生理pH下带负电的任何脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)以及与中性脂质结合的其它阴离子修饰基团。
在某些实施方式中，所述组合物包含糖脂(例如单唾液酸神经节苷脂GM1)。在某些实施方式中，所述组合物包含甾醇，例如胆固醇。
在一些实施方式中，所述组合物包含聚合物缀合脂质。术语“聚合物缀合脂质”是指包含脂质部分和聚合物部分的分子。聚合物缀合脂质的例子是聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指同时包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质是本领域已知的并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-s-DMG)等。
在某些实施方式中，所述组合物包含附加的稳定脂质，其是聚乙二醇-脂质(聚乙二醇化脂质)。合适的聚乙二醇-脂质包括PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG-修饰的磷脂酸、PEG-修饰的神经酰胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG-修饰的二烷基胺、PEG-修饰的二酰基甘油、PEG-修饰的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG)。在其它实施方式中，LNP包含聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)，诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)诸如4-O-(2’,3’-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基))乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯诸如ω-甲氧基(聚乙氧基))乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基))乙基)氨基甲酸酯。在各种实施方式中，阳离子脂质与聚乙二醇化脂质的摩尔比为约100:1至约25:1。
在某些实施方式中，LNP中存在的附加脂质的量为约1至约10摩尔％。在一个实施方式中，LNP中存在的附加脂质的量为约1至约5摩尔％。在一个实施方式中，附加脂质以约1摩尔％或约1.5摩尔％存在于LNP中。
在某些实施方式中，当存在于脂质纳米颗粒中时，核酸分子在水溶液中对核酸酶的降解具有抗性。
在各种实施方式中，所述组合物包含一种或多种转染试剂。在另一个实施方式中，所述转染试剂是基于脂质的转染试剂。在另一个实施方式中，所述转染试剂是基于蛋白质的转染试剂。在另一个实施方式中，所述转染试剂是基于聚乙烯亚胺的转染试剂。在另一个实施方式中，所述转染试剂为磷酸钙。在另一个实施方式中，所述转染试剂为
Figure BDA0003700689930000491
Figure BDA0003700689930000492
或
Figure BDA0003700689930000493
在另一个实施方式中，转染试剂是本领域已知的任何其它转染试剂。
在另一个实施方式中，转染试剂形成脂质体。在另一个实施方式中，脂质体增加细胞内稳定性、增加摄取效率并提高生物活性。在另一个实施方式中，脂质体是由脂质组成的中空球形囊泡，其中脂质排列方式与构成细胞膜的脂质相似。在另一个实施方式中，它们具有用于捕获水溶性化合物的内部水空间，且尺寸范围为直径0.05至数微米。在另一个实施方式中，脂质体可以以生物活性形式将RNA递送给细胞。
在各种实施方式中，本发明的组合物可以包含能够形成颗粒的任何脂质，一种或多种核酸分子附着于该颗粒，或其中包封了一种或多种核酸分子。术语“脂质”是指一组有机化合物，它们是脂肪酸的衍生物(例如酯类)，并且通常的特征是不溶于水但可溶于许多有机溶剂。脂质通常至少分为三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生脂质”，例如类固醇。
在某些实施方式中，所述组合物包含能够将LNP靶向至细胞、细胞群、目的组织或它们的任何组合的一种或多种靶向部分。例如，在一个实施方式中，所述靶向部分是一种配体，其将LNP引导至在细胞表面发现的受体。
在某些实施方式中，所述组合物包含一个或多个内化结构域。例如，在一个实施方式中，所述组合物包含与细胞结合以诱导LNP内化的一个或多个结构域。例如，在一个实施方式中，所述一个或多个内化结构域结合到细胞表面上发现的受体以诱导LNP的受体-介导的摄取。在某些实施方式中，LNP能够在体内结合生物分子，其中LNP结合的生物分子然后可以被细胞表面受体识别以诱导内化。例如，在一个实施方式中，LNP与系统性ApoE结合，从而导致LNP和相关货物(例如一种或多种核酸分子、一种或多种治疗剂、或它们的任何组合)的摄取。
使用合成生成的质粒DNA模板通过体外转录产生RNA。使用适当的引物和RNA聚合酶，任何来源的目的DNA都可以通过PCR直接转化为体外mRNA合成用模板。例如，DNA的来源可以是基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它合适的DNA来源。在一个实施方式中，用于体外转录的所需模板是能够诱导适应性免疫反应的抗原，包括例如与病原体或肿瘤相关的抗原，如本文别处所述。在一个实施方式中，体外转录所需的模板是能够增强适应性免疫反应的佐剂。
在一个实施方式中，要用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以来自生物体基因组中天然存在的DNA序列。在一个实施方式中，DNA是基因一部分的全长目的基因。基因可以包括5'和/或3'未翻译区(UTR)的一些或全部。基因可以包括外显子和内含子。在一个实施方式中，要用于PCR的DNA是人类基因。在另一个实施方式中，要用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人类基因。在另一个实施方式中，要用于PCR的DNA是来自致病或共生生物(包括细菌、病毒、寄生虫和真菌)的基因。在另一个实施方式中，要用于PCR的DNA来自致病或共生生物，包括细菌、病毒、寄生虫和真菌，包括5'和3'UTR。或者，DNA可以是在天然存在的生物体中通常不表达的人工DNA序列。示例性的人工DNA序列是含有多个基因的多个部分的序列，所述多个基因的多个部分连接在一起形成编码融合蛋白的开放阅读框。连接在一起的DNA的部分可以来自单个有机体或来自多个有机体。
可用作PCR用DNA的来源的基因包括编码多肽的基因，这些多肽可诱导或增强生物体中的适应性免疫反应。优选的基因是对短期治疗有用的基因，或在剂量或表达基因方面存在安全问题的基因。
在各种实施方式中，质粒用于生成用于体外转录mRNA的模板，所述mRNA用于转染。
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率能力的化学结构。RNA优选具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度在0到3000个核苷酸之间。要添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，包括但不限于设计退火至UTR不同区域的PCR用引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可以修改所需的5'和3'UTR长度，以在转染转录的RNA后实现最佳翻译效率。
5'和3'UTR可以是目的基因的天然存在的内源性5'和3'UTR。或者，可以通过将UTR序列掺入到正向和反向引物中或通过模板的任何其它修饰来添加对目的基因非内源的UTR序列。使用对目的基因非内源的UTR序列可用于修改RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中富含AU的要素会降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3'UTR，以基于本领域公知的UTR的特性来增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方式中，5'UTR可以含有内源基因的Kozak序列。或者，当如上所述通过PCR添加对目的基因非内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高某些RNA转录物的翻译效率，但似乎并非所有RNA都需要以实现高效翻译。许多mRNA对Kozak序列的要求是本领域已知的。在其它实施方式中，5'UTR可以来源于RNA病毒，其RNA基因组在细胞中是稳定的。在其它实施方式中，各种核苷酸类似物都可用于3'或5'UTR中以阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了能够在不需要基因克隆的情况下从DNA模板合成RNA，转录启动子应附接到待转录序列上游的DNA模板。当作为RNA聚合酶启动子的序列被添加到正向引物的5'端时，RNA聚合酶启动子会被并入到要转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个优选的实施方式中，启动子是T7 RNA聚合酶启动子，如本文别处所述。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个优选的实施方式中，mRNA在5'端具有帽和3'多(A)尾，其决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板(例如质粒DNA)上，RNA聚合酶会产生不适合在真核细胞中表达的长串联产物。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，当它在转录后被多腺苷酸化时，它在真核转染中是有效的。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录物的3'端延伸到模板的最后一个碱基之外(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nachevaand Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
将多A/T伸展(stretch)整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的多A/T序列会导致质粒不稳定性，这可以通过使用用于质粒繁殖的重组无能细菌细胞来改善。
在体外转录后，可以使用poly(A)聚合酶(例如大肠杆菌多A聚合酶(E-PAP)或酵母多A聚合酶)进一步延伸RNA的poly(A)尾。在一个实施方式中，将poly(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300至400个核苷酸之间，导致RNA的翻译效率增加两倍。此外，将不同化学基团附接到3'端可以增加mRNA稳定性。这种附接可以包含修饰/人工核苷酸、适体和其它化合物。例如，可以使用poly(A)聚合酶将ATP类似物掺入poly(A)尾。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
5'帽也为mRNA分子提供稳定性。在优选的实施方式中，通过这些方法产生的包含5'cap1结构的RNA。这种cap1结构可以使用牛痘加帽酶和2'-O-甲基转移酶产生(CellScript,Madison,WI)。或者，使用本领域已知和本文描述的技术提供5'帽(Cougot,etal.,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,et al.,RNA,7:1468-95(2001)；Elango,et al.,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
编码抗原或佐剂的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选库、通过从已知包含相同基因的载体中获得基因、或通过使用标准技术从含有相同基因的细胞和组织中直接分离。或者，可以合成产生目的基因。
可以将核酸克隆到多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体、测序载体和针对体外转录优化的载体。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑了使用脂质配方将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可以包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层中、通过与脂质体和寡核苷酸相关联的连接分子附接到脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、作为悬浮液包含在脂质中、包含或与胶束复合、或以其它方式与脂质相关联。脂质、脂质/RNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以存在于双层结构中，如胶束，或具有“塌陷”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪烃及其衍生物的一类化合物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以获自Sigma,St.Louis,MO；磷酸双十六烷基酯(“DCP”)可以获自K&K Laboratories(Plainview,NY)；胆固醇(“Chol”)可以获自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以获自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可储存在约-20℃。氯仿被用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是一个通用术语，涵盖由封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质载体。脂质体可以表征为具有有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh et al.,1991 Glycobiology 5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同结构的组合物。例如，脂质可能呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还预期了脂转染胺-核酸复合物。
LNP疫苗
在本发明的一个方面，本文所述的组合物是疫苗。对于可用作疫苗的组合物，该组合物必须在细胞、组织或哺乳动物(例如人类)中诱导针对抗原的适应性免疫反应。在某些情况下，疫苗在哺乳动物中诱导保护性免疫反应。如本文所用，“免疫原性组合物”可包含抗原(例如肽或多肽)、编码抗原的核酸、表达或呈递抗原或细胞成分的细胞、或它们的组合。在特定的实施方式中，所述组合物包含或编码任何本文所述的肽抗原的全部或部分，或其免疫原性功能等效物。在其它实施方式中，所述组合物处于混合物中，该混合物包含附加的免疫刺激剂或编码这种药剂的核酸。免疫刺激剂包括但不限于附加抗原、免疫调节剂、抗原呈递细胞或佐剂。在其它实施方式中，一种或多种附加药剂以任何组合共价结合到抗原或免疫刺激剂。在某些实施方式中，所述抗原组合物缀合至或包含HLA锚定基序氨基酸。
在本发明的上下文中，术语“疫苗”是指在接种到动物体内后诱导免疫的物质。
本发明的疫苗可以在其核酸和/或细胞成分的组成上有所不同。在非限制性实例中，编码抗原的核酸也可以与佐剂一起配制。当然，应理解的是，本文所述的各种组合物可进一步包含附加组分。例如，一种或多种疫苗组分可以包含在脂质、脂质体或脂质纳米颗粒中。在另一非限制性实例中，疫苗可包含一种或多种佐剂。本发明的疫苗及其各种组分可以通过本文公开的任何方法或考虑了本公开的本领域普通技术人员已知的任何方法制备和/或施用。
可以通过在体内或体外观察宿主免疫系统的全部或任何部分对抗原的反应，来检测抗原表达对免疫的诱导。
例如，检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是众所周知的。进入活体的异物在APC的作用下呈递给T细胞和B细胞。由于抗原的刺激，对APC呈递的抗原作出反应的T细胞以抗原特异性方式分化为细胞毒性T细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞或CTL)。这些抗原刺激的细胞然后增殖。该过程在本文中称为T细胞的“激活”。因此，通过APC将多肽或肽或它们的组合的表位呈递给T细胞，并检测CTL的诱导，可以评估通过多肽或肽或它们的组合的表位的CTL诱导。此外，APC具有激活B细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞的作用。
使用树突细胞(DC)作为APC来评估CTL的诱导作用的方法是本领域公知的。DC是代表性的APC，在APC中具有强大的CTL诱导作用。在本发明的方法中，最初由DC表达多肽或肽或它们的组合的表位，然后将该DC与T细胞接触。与DC接触后，检测对目的细胞具有细胞毒性作用的T细胞表明，多肽或肽或它们的组合的表位具有诱导细胞毒性T细胞的活性。此外，通过使用抗-IFN-γ抗体进行可视化，例如ELISPOT测定，通过在携带固定肽或肽组合的抗原呈递细胞存在下测量CTL生产并释放的IFN-γ，也可以检查诱导的提免疫反应。
除DC外，外周血单核细胞(PBMC)也可用作APC。据报道，通过在GM-CSF和IL-4存在下培养PBMC可增强CTL的诱导。类似地，已显示可通过在钥孔虫戚血兰素(KLH)和IL-7存在下培养PBMC来诱导CTL。
通过这些方法证实具有CTL诱导活性的抗原是具有DC活化作用和随后的CTL诱导活性的抗原。此外，由于APC呈递抗原而具有细胞毒性的CTL也可用作针对抗原-相关病症的疫苗。
通过观察针对抗原的抗体产生的诱导可以进一步确认通过抗原表达的免疫诱导。例如，当在用编码抗原的组合物免疫的实验动物中诱导针对所述抗原的抗体时，并且当这些抗体抑制抗原-相关的病理学时，确定该组合物诱导免疫。
通过观察CD4+T细胞的诱导，可以进一步确认通过抗原表达的免疫诱导。CD4+ T细胞也可以裂解靶细胞，但主要在诱导其它类型的免疫反应(包括CTL和抗体生成)中提供帮助。CD4+ T细胞帮助的类型可以表征为Th1、Th2、Th9、Th17、T调控、或T滤泡辅助(Tfh)细胞。CD4+ T细胞的每个亚型都有助于某些类型的免疫反应。本发明特别感兴趣的是，Tfh亚型有助于生成高亲和力抗体。
药用LNP组合物
本文所述的药物组合物的配方可以通过药理学领域已知或以后开发的任何方法制备。通常，此类制备方法包括步骤：使活性成分与载体或一种或多种其它辅助成分结合，然后，如果必要或需要，将产品成型或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于伦理地施用于人类的药物组合物，但本领域技术人员将理解此类组合物通常适合施用于各种动物。对适用于人类施用的药物组合物进行修改以使该组合物适用于各种动物是众所周知的，并且普通的兽医药理学家可以通过普通的(如果有)实验来设计和执行这种修改。预期了施用本发明药物组合物的对象包括但不限于人类和其它灵长类动物、哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物如非人类灵长类动物、牛、猪、马、羊、猫和狗。
可用于本发明方法的药物组合物可以配方形式制备、包装或销售，该配方适用于眼部、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺部、鼻内、口腔、静脉内、脑室内、皮内、肌肉内、皮下、心室内、鞘内、气管内、腹膜内、子宫内施用或其他施用途径或它们的任何组合。其它预期的配方包括投射的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫原的配方。
本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量批量制备、包装或销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用受试者的活性成分的剂量或此类剂量的方便部分，例如此类剂量的二分之一或三分之一。
取决于治疗受试者的身份、大小和状况并进一步取决于组合物的施用途径，本发明的药物组合物中活性成分、药学上可接受的载体和任何附加成分的相对量可以变化。例如，组合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。
除了活性成分之外，本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种另外的药物活性剂。
本发明药物组合物的控释或缓释配方可以使用常规技术制备。
如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括任何施用途径，其特征在于物理破裂受试者的组织和通过组织中的破裂施用药物组合物。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物来施用药物组合物、通过手术切口施用组合物、通过组织穿透性非手术伤口施用组合物等。在一些实施方式中，预期肠胃外施用包括但不限于眼内、玻璃体内、皮下、腹膜内、子宫内递送、肌肉内、皮内、胸骨内注射、瘤内、静脉内、脑室内和肾透析输液技术。
适用于肠胃外施用的药物组合物的配方包含活性成分与药学上可接受的载体，例如无菌水或无菌等渗盐水。此类配方可以以适合推注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可注射配方可以以单位剂型制备、包装或销售，例如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的配方包括但不限于混悬剂、溶液、在油性或水性载体中的乳剂、糊剂、和可植入的缓释或可生物降解的配方。此类配方可以进一步包含一种或多种附加成分，包括但不限于助悬剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用用配方的一个实施方式中，所述活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，用于在肠胃外施用重构的组合物之前用合适的载体(例如无菌无热原水)重构。
所述药物组合物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。所述悬浮液或溶液可以根据已知技术配制，并且除了活性成分之外，还可以包含附加成分，例如本文所述的分散剂、润湿剂或助悬剂。可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂例如水或1,3-丁二醇来制备此类无菌可注射配方。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格溶液、等渗氯化钠溶液和固定油，例如合成甘油单酯或甘油二酯。其它有用的可肠胃外施用配方包括包含微晶形式的、脂质体制剂的或作为生物可降解聚合物体系的组分的活性成分的那些配方。用于持续释放或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
可以以适合通过颊腔进行肺部施用的配方的形式制备、包装或销售本发明的药物组合物。此类配方可以包含干颗粒，该干颗粒包含活性成分并且具有约0.5至约7纳米和直径，优选约1至约6纳米。此类组合物方便地以干粉的形式存在，以便使用包括干粉贮存器的装置施用，可以向该干粉贮存器导入推进剂流以分散粉末，或者使用自推进溶剂/粉末分配容器进行施用，例如包含溶解或悬浮在密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分的装置。优选地，此类粉末包含这样的颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒具有大于0.5纳米的直径并且按数量计至少95％的颗粒具有小于7纳米的直径。更优选地，按重量计至少95％的颗粒具有大于1纳米的直径，并且按数量计至少90％的颗粒具有小于6纳米的直径。干粉组合物优选包括固体细粉稀释剂例如糖并且方便地以单位剂量形式提供。
低沸点推进剂通常包括在大气压下沸点低于65°F的液体推进剂。通常，推进剂可占组合物的50至99.9％(w/w)，并且活性成分可占组合物的0.1至20％(w/w)。推进剂可以进一步包含附加成分，例如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或固体稀释剂(优选具有与包含活性成分的颗粒相同数量级的粒径)。
适用于肠胃外施用的药物组合物的配方包含与药学上可接受的载体(例如无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。此类配方可以以适合推注施用或连续施用的形式制备、包装或销售。可注射配方可以以单位剂型制备、包装或销售，例如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的配方包括但不限于混悬剂、溶液、在油性或水性载体中的乳剂、糊剂、和可植入的缓释或生物可降解配方。此类配方可进一步包含一种或多种附加成分，包括但不限于助悬剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的配方的一个实施方式中，活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，以用于在肠胃外施用重构的组合物之前用合适的载体(例如无菌无热原水)重构。
所述药物组合物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。这种悬浮液或溶液可以根据已知技术配制，并且除了活性成分之外，还可以包含附加成分，例如本文所述的分散剂、润湿剂或助悬剂。可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如水或1,3-丁二醇)来制备此类无菌可注射配方。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格溶液、等渗氯化钠溶液和固定油，例如合成甘油单酯或甘油二酯。其它有用的肠胃外施用配方包括包含微晶形式、脂质体制剂形式或作为生物可降解聚合物系统的组分的活性成分的那些配方。用于缓释或植入的组合物可包含药学上可接受的聚合或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
如本文所用，“附加成分”包括但不限于以下一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理可降解组合物，如明胶；水性载体和溶剂；油性载体和溶剂；助悬剂；分散剂或润湿剂；乳化剂、缓和剂；缓冲剂；盐类；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；以及药学上可接受的聚合或疏水材料。可以包括在本发明的药物组合物中的其它“附加成分”是本领域已知的并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences(1985,Genaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA)，其通过引用并入本文。
本发明的治疗性化合物或组合物可以预防性地(即预防疾病或病症)或治疗性地(即治疗疾病或病症)施用于患有或有风险(或易患)发展疾病或病症的受试者。可以使用标准临床方法识别此类受试者。在本发明的上下文中，预防性施用发生在疾病的明显临床症状表现之前，从而预防疾病或病症或延迟其进展。在医学领域中，术语“预防”包括减少疾病造成的死亡率或发病率负担的任何活动。预防可以以一级、二级和三级预防级别进行。虽然一级预防避免了疾病的发展，但二级和三级水平的预防包括旨在预防疾病进展和症状出现以及通过恢复功能并减少疾病-相关并发症来减少已经建立的疾病的负面影响的活动。
递送方式
在一个方面，本发明提供了一种用于将核酸分子、治疗剂或它们的任何组合递送至目的靶的方法。此种靶的示例包括但不限于免疫细胞、T细胞、驻留T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、癌细胞、与疾病或病症相关的细胞、与疾病或病症相关的组织、脑组织、中枢神经系统组织、肺组织、顶端表面组织、上皮细胞、内皮细胞、肝组织、肠组织、结肠组织、小肠组织、大肠组织、粪便、骨髓、巨噬细胞、脾组织、肌肉组织、关节组织、肿瘤细胞、病变组织、淋巴结组织、淋巴循环、或它们的任何组合。在各种实施方式中，该方法包括施用治疗有效量的一种或多种本发明的组合物。
例如，在一些实施方式中，本发明提供了一种向细胞递送核酸分子、治疗剂或它们的任何组合的方法。此类细胞的实例包括但不限于T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、癌细胞、与疾病或病症相关的细胞、或它们的任何组合。
在一个方面，所述方法是基因递送方法。
在一个实施方式中，所述方法包括本文所述的IVT RNA，可以使用本发明的LNP组合物将其作为瞬时转染的形式引入目的靶(例如细胞、组织等)。
在一个实施方式中，所述方法包括组合物的单次施用。在一个实施方式中，所述方法包括组合物的多次施用。
在一些实施方式中，通过皮内递送途径、皮下递送途径、肌内递送途径、脑室内递送途径、鞘内递送途径、口服递送途径、静脉递送途径、气管内递送途径、腹腔递送途径、子宫内递送途径、或它们的任何组合施用所述组合物。
在一些实施方式中，包含施用治疗有效量本发明组合物的用于向目的靶(例如细胞、组织等)递送核酸分子、治疗剂或它们的任何组合的方法与多种不同方法中的任何一种同时进行，例如可商购的方法，包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(AmaxaBiosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,HamburgGermany)、
Figure BDA0003700689930000591
转染试剂盒(Mirus,Madison WI)、阳离子脂质体介导的脂质体转染、聚合物封装、肽介导的转染、或基因枪粒子输送系统如“基因枪”(见例如Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001))。
在某些情况下，通过递送编码mRNA来表达蛋白质与使用蛋白质、质粒DNA或病毒载体的方法相比有很多益处。在mRNA转染过程中，所需蛋白质的编码序列是传递给细胞的唯一物质，从而避免了与质粒骨架、病毒基因和病毒蛋白相关的所有副作用。更重要的是，与基于DNA和基于病毒的载体不同，mRNA不存在被整合到基因组中的风险，并且蛋白质生产在mRNA递送后立即开始。例如，在体内注射编码mRNA后15至30分钟内测量到高水平的循环蛋白。在某些实施方式中，使用mRNA而不是蛋白质也有很多优点。循环中蛋白质的半衰期通常很短，因此蛋白质治疗需要频繁施用，而mRNA为连续数天的蛋白质生产提供了模板。蛋白质的纯化存在问题，并且它们可能含有会导致不良影响的聚集体和其它杂质(Kromminga andSchellekens,2005,Ann NY Acad Sci 1050:257-265)。
为了确认宿主细胞中mRNA序列的存在，可以进行多种测定。此种测定包括例如本领域技术人员众所周知的“分子生物学”测定，诸如Northern印迹和RT-PCR；生化”测定，例如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫原性手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定来鉴定落入本发明范围内的药剂。
在一个方面，本发明还公开了一种向有需要的受试者递送核酸分子、治疗剂或它们的任何组合的方法。在各种实施方式中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种本发明的组合物。在各种实施方式中，所述方法包括本发明的组合物，向受试者的细胞、组织或两者递送核酸分子、治疗剂或任何组合。
治疗方法
本发明提供了在受试者中诱导适应性免疫反应的方法，包括施用有效量的本发明的组合物。例如，在一些实施方式中，所述组合物包含本发明的一种或多种脂质或LNP。在一些实施方式中，所述组合物包含一种或多种抗原、一种或多种编码一种或多种抗原的核酸、或它们的任何组合以及本发明的一种或多种脂质或LNP。
在一个实施方式中，所述方法在受试者中提供对与抗原相关的感染、癌症、或疾病或病症的免疫力。因此，本发明提供了一种治疗或预防与抗原相关的感染、癌症、或疾病、或病症的方法。本文别处描述了示例性抗原和相关的感染、疾病和肿瘤。
例如，所述方法可用于治疗或预防病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染、关节炎、心脏病、心血管疾病、神经病症或疾病、遗传病、自身免疫病、胎儿病、影响胎儿发育的遗传病、或癌症，这取决于所施用组合物的抗原类型。
以下是可以通过所公开的方法和组合物治疗的癌症的非限制性实例：急性淋巴细胞白血病；急性髓性白血病；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，儿童；阑尾癌；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤，儿童；脑肿瘤，成人；脑肿瘤，脑干胶质瘤，儿童；脑肿瘤，中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌瘤，儿童；中枢神经系统胚胎肿瘤；小脑星形细胞瘤；脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；颅咽管瘤；室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；成神经管细胞瘤；髓上皮瘤；中度分化的松果体实质肿瘤；幕上原始神经外胚层肿瘤和松果体母细胞瘤；视觉通路和下丘脑胶质瘤；脑部和脊髓肿瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；类癌瘤，胃肠道；中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌瘤；中枢神经系统胚胎肿瘤；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，儿童；宫颈癌；脊索瘤，儿童；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；结直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；食管癌；尤文肿瘤家族；腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼癌、眼内黑色素瘤；眼癌、视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃)癌；胃肠道类癌；胃肠道间质瘤(gist)；生殖细胞肿瘤，颅外；生殖细胞肿瘤，性腺外；生殖细胞肿瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；胶质瘤；胶质瘤，儿童脑干；胶质瘤，儿童脑星形细胞瘤；胶质瘤、儿童视觉通路和下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌；组织细胞增多症，朗格汉斯细胞；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视觉通路胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；肾(肾细胞)癌；朗格汉斯细胞组织细胞增多症；喉癌；白血病，急性淋巴细胞；白血病，急性髓系；白血病，慢性淋巴细胞；白血病，慢性粒细胞性；白血病，毛细胞；唇癌和口腔癌；肝癌；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴瘤，艾滋病相关；淋巴瘤，伯基特；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，Waldenstrom；骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；髓母细胞瘤；黑色素瘤；黑色素瘤，眼内(眼)；默克尔细胞癌；间皮瘤；具有隐匿性原发性的转移性鳞状颈部癌；口腔癌；多发性内分泌瘤综合征，(儿童)；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；霉菌病；蕈样；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；粒细胞白血病，慢性；粒细胞白血病，成人急性；粒细胞白血病，儿童急性；多发性骨髓瘤；慢性骨髓增生性疾病；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞瘤；卵巢低度恶性潜能肿瘤；胰腺癌；胰腺癌、胰岛细胞瘤；乳头状瘤病；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；中间分化松果体实质肿瘤；松果体母细胞瘤和幕上原发性神经外胚层肿瘤；垂体瘤；浆细胞瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾盂和输尿管，移行细胞癌；涉及15号染色体上nut基因的呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；肉瘤，尤文肿瘤家族；肉瘤，卡波西；肉瘤，软组织；肉瘤，子宫；塞扎里综合征；皮肤癌(非黑色素瘤)；皮肤癌(黑色素瘤)；皮肤癌，默克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌，具有隐匿性原发性、转移性的颈鳞癌；胃(胃)癌；幕上原发性神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；滋养细胞肿瘤，妊娠；尿道癌；子宫癌、子宫内膜；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；华氏巨球蛋白血症；和肾母细胞瘤。
在一个实施方式中，将所述组合物施用于患有与抗原相关的感染、疾病、心脏病、心血管疾病、神经病症或疾病、遗传疾病、自身免疫疾病或癌症的受试者。在一个实施方式中，将所述组合物施用于有发展与抗原相关的感染、疾病、心脏病、心血管疾病、神经病症或疾病、遗传疾病、自身免疫疾病或癌症风险的受试者。例如，可以将所述组合物施用于有与病毒、细菌、真菌、寄生虫等接触的风险的受试者。在一个实施方式中，将所述组合物施用于通过遗传因素、环境因素等而具有增加发展癌症的可能性的受试者。
在一些实施方式中，通过皮内递送途径、皮下递送途径、肌内递送途径、脑室内递送途径、鞘内递送途径、口服递送途径、静脉递送途径、气管内递送途径、腹腔递送途径、子宫内递送途径、或它们的任何组合来施用所述组合物。
在另一个实施方式中，与未修饰的体外合成的具有相同序列的RNA分子相比，包含抗原-编码RNA的本发明的组合物诱导显著更强的适应性免疫反应。在另一个实施方式中，所述组合物表现出比其未修饰的对应物大2倍的适应性免疫反应。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增加了3倍因数。在另一实施方式中，所述适应性免疫反应增加了5倍因数。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增加了7倍因数。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增加了10倍因数。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增加了15倍因数。在另一实施方式中，所述适应性免疫反应增加了20倍因数。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增加了50倍因数。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增加了100倍因数。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增加了200倍因数。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增加了500倍因数。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增加了1000倍因数。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增加了2000倍因数。在另一个实施方式中，所述适应性免疫反应增加了另一倍数差。
在另一个实施方式中，“诱导显著更多的适应性免疫反应”是指适应性免疫反应的可检测增加。在另一个实施方式中，该术语是指适应性免疫反应的倍数增加(例如上面列举的倍数增加之1)。在另一个实施方式中，该术语是指增加，使得包含RNA的本发明的组合物可以以比具有相同物种的分离的RNA分子更低的剂量或频率施用，同时仍诱导有效的适应性免疫反应。在另一个实施方式中，该增加使得可以使用单剂量施用包含RNA的本发明的组合物以诱导有效的适应性免疫反应。
在另一个实施方式中，与具有相同序列的分离的体外合成的RNA分子相比，包含RNA的本发明的组合物表现出显著更低的先天免疫原性。
在另一个实施方式中，包含RNA的本发明的组合物表现出的先天免疫反应与其分离的对应物相比少2倍。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了3倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了5倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了7倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了10倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了15倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了20倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了50倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了100倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了200倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了500倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了1000倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了2000倍因数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低了另一个倍数差。
在另一个实施方式中，“表现出显著更低的先天免疫原性”是指先天免疫原性可检测到的降低。在另一个实施方式中，该术语是指先天免疫原性倍数降低(例如上面列举的倍数降低之1)。在另一个实施方式中，该术语是指降低使得可以施用有效量的包含RNA的本发明的组合物，而不触发可检测的先天免疫反应。在另一个实施方式中，该术语是指降低使得可以重复施用包含RNA的本发明的组合物，而不会引发足以可检测地减少重组蛋白生产的先天免疫反应。在另一个实施方式中，降低使得可以重复施用包含RNA的本发明的组合物，而不会引发足以消除重组蛋白的可检测生产的先天免疫反应。
在一个方面，本发明部分地涉及在有需要的受试者中预防或治疗疾病或病症的方法。在各种实施方式中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的组合物。在一些实施方式中，所述组合物向目的靶(例如细胞、组织等)递送核酸分子、治疗剂或它们的组合。
在一个实施方式中，所述方法包括施用包含编码一种或多种抗原的一种或多种核酸分子和一种或多种佐剂的组合物。在一个实施方式中，所述方法包括施用包含编码一种或多种抗原的第一核酸分子和编码一种或多种佐剂的第二核酸分子的组合物。在一个实施方式中，所述方法包括施用第一组合物和施用第二组合物，该第一组合物包含编码一种或多种抗原的一种或多种核酸分子，该第二组合物包含编码一种或多种佐剂的一种或多种核酸分子。
在某些实施方式中，所述方法包括向受试者施用编码多个抗原、佐剂或它们的组合的多个核酸分子。
在某些实施方式中，本发明的方法允许在施用后的至少数天内持续表达本文所述的抗原或佐剂。然而，在某些实施方式中，所述方法还提供了瞬时表达，因为在某些实施方式中，核酸没有整合到受试者基因组中。
在某些实施方式中，所述方法包括施用提供本文所述抗原或佐剂的稳定表达的RNA。在一些实施方式中，施用RNA几乎没有或没有产生先天免疫反应，同时诱导有效的适应性免疫反应。
可以通过本领域已知的方法以多种不同的方式实现在治疗方法中施用本发明的组合物。在一个实施方式中，本发明的方法包括受试者的全身施用，包括例如肠内或肠胃外施用。在某些实施方式中，所述方法包括组合物的皮内递送。在另一个实施方式中，所述方法包括组合物的静脉内递送。在一些实施方式中，所述方法包括组合物的肌肉内递送。在一个实施方式中，所述方法包括组合物的皮下递送。在一个实施方式中，所述方法包括组合物的吸入。在一个实施方式中，所述方法包括组合物的鼻内递送。
应当理解的是，本发明的组合物可以单独或与另一种药剂一起施用于受试者。
因此，本发明的治疗性和预防性方法包括使用编码本文所述的抗原、佐剂或它们的组合的药物组合物来实施本发明的方法。可以施用有用于实施本发明的药物组合物以递送从ng/kg/天到100mg/kg/天的剂量。在一个实施方式中，本发明设想施用剂量，该剂量导致本发明化合物的浓度在哺乳动物中为从10nM到10μM。
典型地，在本发明的方法中可以施用至哺乳动物(优选人类)的剂量为每千克哺乳动物体重0.01μg至约50mg，而施用的精确剂量将取决于许多因素，包括但不限于哺乳动物的类型和所治疗的疾病状态的类型、哺乳动物的年龄和施用途径。优选地，化合物的剂量可以为每千克哺乳动物体重约0.1μg至约10mg。更优选地，剂量可以为每千克哺乳动物体重约1μg至约1mg。
可以以每天数次的频率向哺乳动物施用所述组合物，或者可以以更低的频率施用，诸如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次，或者甚至频率更低，例如每几个月一次或甚至一年一次或更少。施用频率对本领域技术人员来说是显而易见的，并且将取决于许多因素，例如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度、哺乳动物的类型和年龄等。
在某些实施方式中，本发明的组合物或疫苗的施用可以通过单次施用进行或通过多次施用加强。
在一个实施方式中，本发明包括一种方法，该方法包括施用编码本文所述的一种或多种抗原或佐剂的一种或多种组合物。在某些实施方式中，所述方法具有累加效应，其中施用该组合的总体效应大约等于施用每种抗原或佐剂的效应的总和。在其它实施方式中，所述方法具有协同效应，其中施用该组合的总体效应大于施用每种抗原或佐剂的效应的总和。
在一个实施方式中，所述方法包括将组合物全身施用到受试者中，包括例如皮内施用。在某些实施方式中，所述方法包括向受试者施用多个剂量。在另一个实施方式中，所述方法包括施用单个剂量的所述组合物，其中所述单个剂量有效于诱导适应性免疫反应。
实验实验例
通过参考下列实验例进一步详细地描述了本发明。提供这些实施例仅用于说明目的，除非另有说明，否则并非旨在限制。因此，本发明绝不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
在没有进一步描述的情况下，相信本领域的普通技术人员可以使用前面的描述和下面的说明性实施例来制造和利用本发明并实践要求保护的方法。因此，以下工作例具体指出了本发明的优选实施方式，而不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：用于mRNA-基T细胞工程的可离子化脂质纳米颗粒
由基于脂质和聚合物的材料组成的纳米颗粒(NP)-基递送系统提供了一种有前景的方法来克服使用机械和病毒细胞工程方法所面临的挑战(DiTommaso T et al.,2018,PNAS,115；Hajj KA et al.,2017,Nat Rev Mater,2；McKinlay CJ et al.,2018,PNAS,115:E5859-E5866；Mukalel AJ et al.,2019,Cancer Lett,458:102-112)。NP具有许多潜在的益处，包括稳定核酸货物、协助细胞内递送和减轻毒性的能力(Pardi N et al.,2018,Nat Rev Drug Discov,17:261-279；Fornaguera C et al.,2018,Adv Healthc Mater,7:1-11；Zhang R et al.,2018,J Control Release,292:256-276；Islam MA et al.,2015,Biomater Sci,1519-1533)。一些对聚合物-基NP用于将mRNA递送至细胞的研究具有可喜的结构，包括与EP相比降低的毒性(McKinlay CJ et al.,2018,PNAS,115:E5859-E5866；Olden BR et al.,2018,J Control Release,282:140-147；Moffett HF et al.,2017,NatCommun,8:389；Démoulins T et al.,2016,Biol Med,12:711-722；Anderson DG et al.,2003,Angew Chem Int Ed Engl,42:3153-3158)。
然后，考虑到Alnylam’s Onpattro的批准，在RNA递送方面，可离子化纳米颗粒(LNP)递送系统在临床上比聚合物更先进(Pardi N et al.,2018,Nat Rev Drug Discov,17:261-279；Garber K et al.,2018,Nat Biotechnol,36:777)。另外，LNP具有可离子化的脂质核心，其在生理相关pH中保持中性，但在酸性环境(例如核内体)中建立电荷，最终帮助核内体逃逸并导致有效的细胞内核酸递送(Hajj KA et al.,2017,Nat Rev Mater,2；Kauffman KJ et al.,2016,J Control Release,240:227-234；Oberli MA et al.,2017,Nano Lett,17:1326-1335；Fan YN et al.,2018,Biomater Sci Royal Society ofChemistry,6:3009-3018)。这已在包括免疫细胞在内的多种细胞类型中得到验证，毒性最小，并且先前关于淋巴细胞递送的工作表明LNP比市售脂转染胺更有效地递送mRNA(HajjKA et al.,2017,Nat Rev Mater,2；McKinlay CJ et al.,2018,PNAS,115:E5859-E5866；Zhang R et al.,2018,J Control Release,292:256-276；Kauffman KJ et al.,2016,JControl Release,240:227-234；Oberli MA et al.,2017,Nano Lett,17:1326-1335；LoveKT et al.,2010,Proc Natl Acad Sci,107:9915-9915)。
此外，LNP易于修改的组成允许调整它们的物理化学性质，以最大限度地使其摄入到特定细胞类型中，而它们的可离子化特性允许它们与带负电荷的核酸货物进行静电复合(Hajj KA et al.,2017,Nat Rev Mater,2；McKinlay CJ et al.,2018,PNAS,115:E5859-E5866；Zhang R et al.,2018,J Control Release,292:256-276；Kauffman KJ et al.,2016,J Control Release,240:227-234；Love KT et al.,2010,Proc Natl Acad Sci,107:9915-9915；Kauffman KJ et al.,2015,Nano Lett,15:7300-7306)。
更具体地，生成了24LNP的不同库(图2A)，表征(图2B)并且筛选了向Jurkat细胞(一种永生化人类T细胞系)的萤光素酶mRNA递送。首先通过迈克尔加成化学合成了可离子化的脂质，其中使多胺核心与过量的环氧化物封端的不同长度的烷基链反应(图2C)。此处，评估了脂质向T细胞的mRNA递送。
为了配制LNP，在乙醇中将可离子化的脂质与三种其它赋形剂混合：(i)胆固醇，用于LNP稳定性和膜融合，(ii)1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，用于加强LNP的双层结构并促进内体逃逸，和(iii)C14-PEG，用于减少聚集和非特异性内吞作用(GranotY et al.,2017,Semin Immunol,34:68-77；Varkouhi AK et al.,2011,J ControlRelease,151:220-228；Mui BL et al.,2013,Mol Ther Acids,2:1-8)。然后在微流体装置中将该乙醇相与水相mRNA混合(图1)。这些赋形剂及其摩尔比是基于先前优化的用于mRNA递送的LNP配方选择的，其通常利用(i)DOPE作为磷脂成分、(ii)降低摩尔百分比的可离子化脂质和(iii)增加浓度的胆固醇和脂质-PEG(Kauffman KJ et al.,2015,Nano Lett,15:300-7306；Ball RL e al.,2018,Nano Lett,18:3814-3822)。鉴于赋形剂摩尔比的变化会影响LNP的物理化学性质和最终的有效递送，因此组分的比例在这些实验中保持恒定(Kauffman KJ et al.,2015,Nano Lett,15:300-7306；Ball RL e al.,2018,Nano Lett,18:3814-3822；Cheng Q et al.,2018,Adv Mater,30:1805308)。
为了评估LNP递送功能性mRNA的能力，选择荧光素酶作为编码的报告蛋白。这种筛选显示出七种LNP配方与脂转染胺(一种常用的转染试剂)相比具有增强的mRNA递送(Cardarelli F et al.,2016,Sci Reports,6:25879)。另外，在筛选了24种LNP向Jurkat细胞(永生化人类T细胞)的mRNA递送后，选择了最佳LNP配方C14-4 LNP用于进一步开发其强效递送和低毒性。然后针对原代T细胞的转染优化C14-4 LNP，结果表明，饱和可离子化脂质的纯化可改善粗产物上的mRNA递送。
LNP库的表征
在这项研究中，研究了可离子化脂质纳米颗粒(LNP)向T细胞的mRNA递送。之所以选择LNP，是因为它们已被证明可以在细胞内向体内和离体的一系列细胞和组织靶以高效且低毒性递送mRNA。最近，LNP已被用于将核酸递送至一系列免疫细胞类型(Berdeja JG etal.,2017,J Clin Oncol,35；Oberli MA et al.,2017,Nano Lett,17:1326-1335；Love KTet al.,2010,Proc Natl Acad Sci,107:9915-9915；Kauffman KJ et al.,2015,NanoLett,15:7300-7306；Midoux P et al.,2014,Expert Rev Vaccines,14:221-234；Lokugamage MP et al.,2019,Adv Mater,1902251:1-8)。
为了研究特异性向T细胞的mRNA传递，首先通过迈克尔加成化学合成可离子化的脂质材料，生成了具有24种不同LNP配方的库，其中多胺核与过量的环氧化物封端的不同长度的烷基链反应(图2和图5)。在该库中合成的特定可离子化脂质是可离子化脂质的结构类似物，其先前被配制成LNP，并显示可将siRNA和mRNA递送至免疫细胞(Oberli MA et al.,2017,Nano Lett,17:1326-1335；Love KT et al.,2010,Proc Natl Acad Sci,107:9915-9915；Leuschner F et al.,2012,Nat Biotechnol,29:1005-1010)。
评估了脂质将mRNA特异性的递送至T细胞而非一系列细胞类型。为了配制LNP，可在乙醇中将可离子化脂质与其它三种赋形剂混合：(i)胆固醇，用于LNP稳定性和膜融合，(ii)DOPE，用于加强LNP的双层结构并促进核内体逃逸，和(iii)C14-PEG，用于减少聚集和非特异性内吞作用(Granot Y et al.,2017,Semin Immunol,34:68-77；Varkouhi AK etal.,2011,J Control Release,151:220-228；Mui BL et al.,2013,Mol Ther Acids,2:1-8)。然后在微流体装置中将该乙醇相与水相mRNA混合(图1A)。这些赋形剂及其摩尔比是根据先前优化的用于mRNA递送的LNP配方选择的，该配方通常使用(i)DOPE作为磷脂组分，(ii)降低摩尔百分比的可离子化脂质，和(iii)增加浓度的胆固醇和脂质-PEG(KauffmanKJ et al.,2015,Nano Lett,15:7300-7306；Ball RL et al.,2018,Nano Lett,18:3814-3822)。考虑到赋形剂摩尔比的变化会影响LNP的物理化学性质和最终的有效递送，因此在这些实验中组分的比例保持恒定(Kauffman KJ et al.,2015,Nano Lett,15:7300-7306；Ball RL et al.,2018,Nano Lett,18:3814-3822；Cheng Q et al.,2018,Adv Mater,30:1805308)。
然后使用动态光散射(DLS)和A260吸光度测量对所得LNP的尺寸和mRNA浓度进行表征。LNP的直径，报告为z平均测量值，范围为51.05至97.01nm，PDI低于0.3(图6)。测量为A260吸光度的mRNA浓度在LNP配方中显示出一致性，范围为33.3至48.3ng/μL。总的来说，这些结果确认了要在本研究中用于T细胞递送的包封mRNA的24种不同的LNP配方的配方。
筛选用于将mRNA递送至Jurkat细胞的LNP
为了评估LNP递送功能性mRNA的能力，选择荧光素酶作为编码的报告蛋白。添加荧光素后，只有从mRNA翻译的荧光素酶蛋白会反应以产生发光信号，从而产生与功能性mRNA递送相关的易于检测的输出(Hajj KA et al.,2019,Small,15:1-7)。这些实验中使用的荧光素酶mRNA利用了N1-甲基-伪U和5-甲基-C修饰，已证明其可增强mRNA翻译并成功地包封在LNP中(Pardi N et al.,2015,J Control Release,217:345-351；Svitkin YV et al.,2017,Nucelic Acids Res,45:6023-6036；Trixl L et al.,2018,WIREs RNA,10:1-17)。这些修饰可能改变LNP中的mRNA封装、mRNA的递送和整体免疫原性，因此在未来的工作中可以探索对这些特定LNP递送载体的优化修饰的进一步研究(Pardi N et al.,2015,J ControlRelease,217:345-351；Zhang R et al.,2018,J Control Release,292:256-276；KarikóK et al.,2005,Immunity,23:165-175；Li J et al.,2017,ACS Nano,11:2531-2544；ShenX et al.,2018,Nucleic Acids Res,46:1584-1600；Sahin U et al.,2014,Nat Rev DrugDiscovery,13:759-780)。
使用Jurkat细胞观察到了荧光素酶mRNA的功能传递，Jurkat细胞是一种常用于研究T细胞行为的永生化人类T细胞系(Olden BR et al.,2018,J Control Release,282:140-147；Abraham RT et al.,2004,Nat Rev Immunol,4:1-8；Cancer P et al.,2018,Nucleic Acid Ther,28:285-296)。以浓度30ng/60,000个细胞将包封荧光素酶mRNA的LNP用于处理Jurkat细胞。48小时后，通过发光测量评估荧光素酶表达。将来自LNP配方的发光测量值归一化为未处理的细胞组，并且与市售脂转染胺进行比较，脂转染胺是一种被广泛认为是体外金标准的常用转染试剂(Cardarelli F et al.,2016,Sci Reports,1-8；WangT et al.,2018,Molecules,23)。库筛选揭示了七种LNP配方，它们导致荧光素酶表达显著高于脂转染胺，表明向Jurkat细胞递送荧光素酶mRNA的能力得到了提高(图3A)。在这七种中，三种配方具有带C12尾的可离子化脂质，三种具有C14尾，且一种具有C16尾。与脂转染胺相比，多胺核心3、6和7未增强转染，与脂质尾长度无关。然而，多胺核心2、4和5，都具有只有一个环和额外的氧的相似结构，负责产生具有最高荧光素酶表达的五种配方，即C14-4、C14-2、C14-5、C16-2和C12-4 LNP。
然后在一系列mRNA浓度范围内比较了这前面五种LNP配方，以确定用于Jurkat细胞转染的最佳LNP配方和最佳LNP剂量。结果确认，C14-4 LNP(原始库筛选中表现最好的LNP配方)在前五种配方中诱导了最高的荧光素酶表达(图3B)。与剂量大于20ng的所有其它LNP配方相比，荧光素酶表达的增加显著，表明Jurkat细胞中C14-4 LNP的最佳剂量为30ng。C14-4 LNP的增强性能并不反映尺寸或mRNA浓度的差异，因为该配方的直径为70.17nm且浓度为35.6ng/μL(图3C)。C14-4 LNP对Jurkat细胞的毒性最小，并且将细胞活力与脂转染胺处理的细胞组和未处理的细胞组进行了比较，在使用C14-4 LNP处理后测量到大于95％的活力。
另外，为了验证通过C14-4递送的mRNA的瞬时表达，在96小时内观察了用LNP处理的Jurkat细胞中的荧光素酶表达。结果显示，与24小时相比，在48小时的表达减少23％，且在72小时减少84％，到96小时未检测到表达(图3D)，确认瞬时荧光素酶表达并告知后续实验使用24小时时间点。总的来说，这些结果允许选择C14-4 LNP作为mRNA递送的最佳配方，并为C14-4 LNP提供优化的体外转染方法。
脂质纳米颗粒介导的mRNA递送至原代人类T细胞
表现最佳的C14-4 LNP被用于将mRNA递送至原代人类T细胞，以证明超出Jurkat细胞系的可翻译性。Jurkat细胞系的V局限性包括仅来源于CD4+ T细胞，而原代T细胞还包括CD8+表型(Abraham RT et al.,2004,Nat Rev Immunol,4:1-8)。然而，原代T细胞需要激活才能实现转染(Barrett DM et al.,2011,Hum Gene Ther,22:1575-1586；Harrer DC etal.,2017,BMC Cancer,17:551)。Dynabeads是一种在临床上广泛使用的磁珠，其表面涂有CD3和CD28抗体，将其用于以与临床试验中使用的方式相似的方式激活T细胞(Hajj KA etal.,2019,Small,15:1-7；Wang X et al.,2016,Mol Ther Oncolytics,3:1-7；Lee DW etal.,2015,Lancet,385:517-528)。将分离的T细胞以1:1的CD4+:CD8+比例悬浮，并用包封了一系列浓度荧光素酶mRNA的C14-4 LNP处理。24小时后，对荧光素酶表达和细胞活力量化(图4A)。LNP以mRNA剂量依赖性方式诱导T细胞中的荧光素酶表达，表明荧光素酶mRNA成功递送至T细胞。此外，仅在最高剂量下观察到最低毒性，表明了C14-4 LNP与原代细胞的生物相容性。
为了进一步探索C14-4将mRNA递送至T细胞的潜力，通过快速色谱纯化了完全饱和的可离子化脂质，并利用纯化的产物生产C14-4 LNP。将这些纯化的C14-4 LNP与由粗C14-4可离子化脂质制成的C14-4 LNP进行比较，以验证哪种结构负责有效的mRNA传递。纯化的C14-4 LNP的DLS和A260吸光度表征显示直径为65.19nm且mRNA浓度为29.8ng/μL，与用粗C14-4产物制成的LNP没有太大差异(图7)。使用Ribogreen测定评估每种配方包封mRNA的能力，结果表明粗制配方和纯化的配方具有相似的包封装效率，分别为92.5％和86.3％。最后，在TNS分析中，对两种LNP配方的表面电离或pKa进行了评估，pKa定义为LNP质子化50％时的pH且指示了pH如何影响LNP的表面电荷和稳定性(Hajj KA et al.,2019,Small,15:1-7)。可离子化脂质的pKa低于7，这使它们能够在酸性核内体区室中带电荷，导致释放包封的mRNA(Hajj KA et al.,2019,Small,15:1-7；Zhang J et al.,2011,Langmuir,27:9473-9483)。粗制C14-4 LNP和纯化的C14-4 LNP均显示可离子化，纯化的配方具有略高的pKa值(图4B)。
然后比较粗制C14-4 LNP和纯化的C14-4 LNP在原代T细胞中递送mRNA的能力。T细胞以1:1的CD4+与CD8+比例悬浮，并在用LNP处理之前用Dynabeads激活。在两种浓度下研究了包封荧光素酶mRNA的粗制C14-4 LNP和纯化的C14-4 LNP的荧光素酶表达和活力(图4C)。在两种浓度下，纯化的C14-4 LNP与粗制LNP配方相比具有显著增加的荧光素酶表达，并且两种配方对细胞活力的影响很小。总体而言，荧光素酶表达的增加而毒性没有任何增加表明纯化的C14-4 LNP为原代T细胞mRNA递送的表现最佳配方。
总之，本文描述的数据公开了一种新型可离子化脂质和新型LNP配方，它们可有效地将mRNA递送至T细胞。本发明使用新型LNP系统部分地解决了将mRNA靶向递送至T细胞的问题。本发明部分地公开了一种称为C14-4的可离子化脂质及其LNP配方(包括胆固醇、磷脂和PEG组分)，其已用于将mRNA有效递送至T细胞。利用了粗制脂质和纯化的完全饱和脂质。本文描述的研究还证明了与目前金标准试剂脂转染胺相比，C14-4和C14-4 LNP配方以低毒性和增强的功效将mRNA递送至T细胞的能力，赋予C14-4改变T细胞工程方式的潜力。这可以适用于临床领域，其中本发明具有未来商业潜力，但它也适用于实验室/研究环境，因为T细胞特别难以转染。
其它研究开始使用这种脂质纳米颗粒将mRNA在体内递送至T细胞，可能会添加基于抗体的靶向剂或其它靶向配体。还研究了LNP配方在赋形剂比例(改变磷脂、胆固醇、PEG和C14-4的摩尔比)和可离子化脂质与mRNA的比例方面的进一步优化。这可导致引入新的赋形剂或对C14-4脂质本身进行修饰，例如使用支链烷基链而不是直链。此外，还探索了荧光素酶以外的其它mRNA货物。
现在描述这些实验中使用的材料和方法。
脂质合成
通过使用迈克尔加成化学使环氧化物封端的烷基链(Avanti Polar Lipids)与多胺核(Enamine,Monmouth Jct,NJ)反应合成可离子化脂质。将这些组分与7倍过量的烷基链混合，并在80℃下用磁力搅拌棒混合48小时。然后将粗产物转移到Rotavapor R-300(BUCHI,Newark,DE)进行溶剂蒸发，并将脂质悬浮在乙醇中。最后，为了纯化表现最佳的脂质(C14-4)，通过CombiFlash Nextgen 300+色谱系统(Teledyne ISCO,Lincoln,NE)分离脂质级分，并且使用液相色谱-质谱法通过分子量鉴定饱和脂质级分。
LNP配方和表征
为了合成LNP，如前所述(Chen D et all.,2012,J Am Chem Soc,134:6948-6951)，使用微流体装置混合含有mRNA的水相和含有脂质和胆固醇组分的乙醇相。简言之，使用10mM柠檬酸盐缓冲液以及1mg/mL具有N1-甲基-伪和5-甲基-C取代的荧光素酶mRNA(Trilink Biotechnologies,San Diego,CA)制备水相。为了制备乙醇相，分别以设定摩尔比35％、16％、46.5％和2.5％组合可离子化脂质、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)、胆固醇(Sigma,St.Louis,MO)和脂质锚定PEG(Avanti Polar Lipids)组分。使用Pump33DS注射泵(Harvard Apparatus,Holliston,MA)在微流体装置中以3:1的比例混合乙醇和水相(Chen D et all.,2012,J Am Chem Soc,134:6948-6951)。混合后，将LNP用1x PBS透析2小时，然后通过0.22μm过滤器进行灭菌。然后使用在Zetasizer Nano(Malvern nstruments,Malvern,UK)上进行的动态光散射(DLS)测量(一式三份)悬浮在1x PBS中的LNP的直径(z平均)和多分散指数(PDI)。使用NanoDropND-1000分光光度计(ThermoFisher,Waltham,MA)获得各LNP配方的mRNA浓度。
表现最佳的LNP配方的进一步分析包括Quant-iT Ribogreen(ThermoFisher)和6-(对甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS)测定，以分别确定LNP的包封效率和pKa。如先前描述(HeyesJ et al.,2005,J Control Release,107:276-287)进行Quant-iT Ribogreen。简言之，相等浓度的LNP使用Triton X-100(Sigma)处理以裂解LNP或不处理，10分钟后，将这些组与RNA标准一起一式三份接种在96个孔板中。根据制造商说明添加荧光Ribogreen试剂，并在读板器上测量所得荧光。将这些值与标准曲线进行比较以量化RNA含量，并计算包封效率。为了确定LNP pKa，如前所述(Hajj KA et al.,2019,Small,15:1-7)，使用TNS测定来测量表面电离。调节150mM氯化钠、20mM磷酸钠、25mM檬酸铵和20mM乙酸铵的缓冲溶液以达到2至12的pH值，增量为0.5。在96孔板的一式三孔中，将LNP添加到每个经过pH调节的溶液中。然后将TNS添加到每个孔中以达到6μM的最终TNS浓度，并在读板器上读取所得荧光。然后将pKa计算为荧光强度为其最大值的50％时的pH-反映50％质子化。
Jurkat细胞的mRNA转染
在补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的含L-谷氨酰胺的RPMI-1640(ThermoFisher)中培养永生化人T细胞系Jurkat细胞(ATCC TIB-152)(Abraham RT etal.,2004,Nat Rev Immunol,4:1-8)。将细胞以每孔60,000个细胞接种在96孔板中的60μL培养基，并立即用60μL在PBS中稀释至不同浓度的LNP处理。按照制造商协议，将用作阳性对照比较的脂转染胺MessengerMAX转染试剂(ThermoFisher)与mRNA组合10分钟，并且使用与LNP组相同的mRNA浓度处理细胞。温育48小时后，将细胞以300xg离心4分钟，并且重新悬浮于50μL 1x裂解缓冲液(Promega,Madison,WI)和100μL萤光素酶测定底物(Promega)中。然后使用Infinite M Plex读板器(Tecan,Morrisville,NC)对发光进行量化。将来自每组的发光信号归一化为未处理的细胞或最低浓度的处理组，并减去以有试剂但没有细胞的孔测量的背景。为了评估细胞毒性，在相同条件下接种Jurkat细胞并且使用C14-4或脂转染胺以30ng mRNA/60,000个细胞进行处理。48小时后，向每孔中添加60μL CellTiter-Glo(Promega)，并且使用读板器量化对应于ATP生产的发光。将每组的发光信号归一化为未处理的细胞，并减去背景。
原代T细胞的mRNA转染
原代T细胞(CD3+)获得自宾夕法尼亚大学人类免疫学核心并且以1:1的CD4:CD8比例组合。然后使用人类T激活剂CD3/CD28 Dynabeads(ThermoFisher)以3:1珠与细胞比将待使用LNP处理的细胞激活过夜。激活后，将细胞以每孔60,000个细胞接种在96孔板中的60μL培养基中，并用不同mRNA浓度的LNP处理。对于电穿孔，将T细胞用培养基洗涤3次，重悬108个细胞/mL，并以每1mL T细胞100μg mRNA的浓度与转录的mRNA混合。然后使用ECM830Electro Square Wave Porator(Harvard Apparatus BTX)在2-mm比色皿中将细胞电穿孔。对于荧光素酶mRNA处理的实验，使用上述相同的协议来评估48时后的发光和24小时后的毒性。
实施例2：用于T细胞递送的工程脂质纳米颗粒
C14-4配方参数在赋形剂比例方面的进一步优化已经开始。所附的是生成的两个配方库(库A和随后的库B，基于库A的结果；库A的代表配方命名为A#，库B的代表配方为B#)。两者都是使用C14-4脂质制成的，但一些新配方在T细胞系中显示出比原始C14-4配方增强的mRNA递送，而不会增加毒性。
可离子化的LNP显示出作为治疗性大分子(包括核酸)的细胞内递送载体的巨大前景(Mukalel A.J.,2019,Cancer Lett,458:102-112)。LNP配方众多，但它们使用常见的赋形剂：胆固醇用于膜稳定性，磷脂协助核内体逃逸，和聚乙二醇(PEG)用于降低免疫原性(Reichmuth A.M.,2016,Ther Deliv,7:319-334)。不同的赋形剂组合可以显著改变LNP的物理化学性质，从而影响其递送能力(Kauffman K.,2015,Nano Lett,15:7300-7306)。在本研究过程中，针对T细胞设计了两个LNP库(图8和图9)。使用正交DOE设计选择配方，以便仅使用16种代表性配方就能观察到大范围的组分变化。
每种配方都含有不同摩尔比的可离子化脂质、胆固醇、辅助脂质和脂质缀合的PEG。分别使用动态光散射、2-(对甲苯胺基)萘-6-磺酸(TNS)测定和260nm吸光度测量来确定每种配方的z平均直径和pKa。用每种制剂处理Jurkat细胞(永生化人类T细胞)48小时，并评估体外细胞内递送。通过商业Cell-Titer Glo测定类似地评估每种配方的细胞毒性。
优化配方的数据如图8和图9所示。使用标准荧光素酶表达测定评估每种配方的体外递送效率。简而言之，将含有编码萤火虫荧光素酶的mRNA的LNP以每60,000个细胞30ng的mRNA浓度递送至Jurkat胞(永生化人类T细胞)。温育48小时后，将细胞裂解并用萤火虫萤光素处理。然后在读板器上将LNP介导的转染程度测量为发光强度。使用商业Cell-Titer Glo测定法类似地评估每种配方的细胞毒性。
库A的表征揭示了与赋形剂组成相关的一些递送趋势。库A中的最佳赋形剂条件促成了下一代库B的开发。库B中的配方表现出比库A中的那些更高的包封效率和更大的z平均直径，并且库B中的许多配方表现甚至优于库A中表现最好的配方，支持了上述趋势。此外，观察到库B中的所有配方在48小时内都表现出超过80％的活力。因此，报道了开发多种高效LNP配方用于细胞内递送至T细胞。这些LNP具有用于未来T细胞工程应用的潜力，包括癌症免疫治疗。
实施例3：改变LNP的赋形剂组成以提高其将mRNA递送至T细胞的能力(毒性最小)
本实施例展示了代表性库A和库B配方获得的体外和离体数据。在体外研究中，筛选了库A(包含16种具有不同赋形剂浓度的C14-494代表性配方(例如图8A))将荧光素酶mRNA递送至Jurkat细胞系(永生化人类T细胞)的能力。基于库A结果生成的库B(例如图9)也在体外研究中在Jurkat中进行了筛选。进一步的体外研究聚焦在使用库A和B的代表性最佳性能配方将荧光素酶mRNA递送到原代T细胞。
更具体地说，用30ng/60,0000个细胞处理Jurkat 24小时。基于库A的数据对库B进行调整导致了更多“命中”配方(也就是那些比标准配方S2实现更高递送的产品)，并且导致LNP配方中的总体毒性较小。在用LNP(含有荧光素酶mRNA)温育24小时后使用荧光素酶测定法测量荧光素酶活性(图13A)。使用Cell Titer Glo测定法在同一时间点测量百分比活力(图13B)。每个条含有三个生物学重复(每个具有三个技术重复)并归一化为0ng处理。
脂转染胺比较(图14)显示，配方B10优于该市售标准。此外，毒理学结果表明，两者都对Jurkat没有毒性。
此外，Jurkat用编码荧光素酶的mRNA处理24小时，以评估不同浓度/剂量下各种代表性配方的发光和活力(图15A和图15B)。此外，将三个不同的原代患者T细胞样品激活过夜，并用多个剂量的标准、A16或B10配方处理(图16A至图16C)。将递送编码荧光素酶的mRNA值归一化为0ng处理。供体变异性导致不同的整体荧光素酶读数。
本文引用的每一专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用整体并入本文。虽然本发明已参照特定实施方式进行了公开，但显然，本领域技术人员可以在不背离本发明的真实精神和范围的情况下设想出本发明的其它实施方式和变型。所附权利要求旨在解释为包括所有此类实施方式和等效变型。

Claims (49)

1.一种具有式(I)结构的化合物或其盐
Figure FDA0003700689920000011
其中A1和A2独立地选自由C、C(H)、N、S和P组成的组；
其中每个L1、L2、L3、L4、L5和L6独立地选自由C、C(H)2、C(H)(R19)、O、N(H)和N(R19)组成的组；
其中每个R1、R2、R3a、R3b、R4a、R4b、R5a、R5b、R6a、R6b、R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R10b、R11a、R11b、R12a、R12b、R13a、R13b、R14a、R14b、R15a、R15b、R16、R17、R18和R19独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、-Y(R20)z`(R21)z``-环烷基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、-Y(R20)z`(R21)z``-杂环烷基、取代的-(R20)z`(R21)z``-杂环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、-Y(R20)z`(R21)z``-环烯基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、-Y(R20)z`(R21)z``-环炔基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-环炔基、芳基、取代的芳基、-Y(R20)z`(R21)z``-芳基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-芳基、杂芳基、取代的杂芳基、-Y(R20)z`(R21)z``-杂芳基、取代的-Y(R20)z`(R21)z``-杂芳基、烷氧羰基、直链烷氧羰基、支链烷氧羰基、酰胺基、氨基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基芳基、氨基醋酸酯、酰基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基芳基、烷氧基、羧基、羧酸酯、酯、-Y(R20)z`(R21)z``-酯、-Y(R20)z`(R21)z``、＝O、-NO2、-CN和亚砜组成的组；
其中Y选自由C、N、O、S和P组成的组；
其中每个R20和R21独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧羰基、直链烷氧羰基、支链烷氧羰基、酰胺基、氨基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基芳基、氨基醋酸酯、酰基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基芳基、烷氧基、羧基、羧酸酯、酯、＝O、-NO2、-CN和亚砜；
其中z`和z``各自独立地为0、1或2表示的整数；并且
其中m、n、o、p、q、r、s、t、u、v、w和x各自独立地为0、1、2、3、4或5表示的整数。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中具有式(I)结构的所述化合物是具有选自由以下项组成的组的结构的化合物：
Figure FDA0003700689920000021
Figure FDA0003700689920000031
其中每个R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧羰基、直链烷氧羰基、支链烷氧羰基、酰胺基、氨基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基芳基、氨基醋酸酯、酰基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基芳基、烷氧基、羧基、羧酸酯和酯组成的组；
其中m、n、o、p和q各自独立地为0至25的整数；并且
其中r、s、t、u、v、w和x各自独立地为0、1、2、3、4和5表示的整数。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中具有式(I)结构的所述化合物是具有选自由以下项组成的组的结构的化合物：
Figure FDA0003700689920000041
Figure FDA0003700689920000051
其中每个R1、R2、R3、R4和R5独立地选自由H、卤素、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、炔基、取代的炔基、环炔基、取代的环炔基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧羰基、直链烷氧羰基、支链烷氧羰基、酰胺基、氨基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基、氨基芳基、氨基醋酸酯、酰基、羟基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、羟基芳基、烷氧基、羧基、羧酸酯和酯组成的组；并且
其中m、n、o、p和q各自独立地为0至25的整数。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中具有式(I)结构的所述化合物是可离子化的脂质。
5.一种脂质纳米颗粒(LNP)，包含权利要求1所述的一种或多种化合物。
6.根据权利要求5所述的LNP，其中所述LNP包含浓度范围为约1mol％至约100mol％的具有式(I)结构的一种或多种化合物或其盐。
7.根据权利要求6所述的LNP，其中所述LNP包含浓度范围为约10mol％至约50mol％的具有式(I)结构的一种或多种化合物或其盐。
8.根据权利要求5所述的LNP，其中所述LNP进一步包含至少一种辅助脂质。
9.根据权利要求8所述的LNP，其中所述LNP包含浓度范围为约0.01mol％至约99.9mol％的至少一种辅助脂质。
10.根据权利要求9所述的LNP，其中所述LNP包含浓度范围为约0.5mol％至约50mol％的至少一种辅助脂质。
11.根据权利要求8所述的LNP，其中所述辅助脂质选自由磷脂、胆固醇脂质、聚合物及它们的任意组合组成的组。
12.根据权利要求11所述的LNP，其中所述磷脂选自由二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)或其衍生物、双硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或其衍生物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或其衍生物、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱(SOPC)或其衍生物、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)或其衍生物、N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)或其衍生物、及它们的任意组合组成的组。
13.根据权利要求11所述的LNP，其中所述LNP包含浓度范围为约15mol％至约50mol％的磷脂。
14.根据权利要求11所述的LNP，其中所述胆固醇脂质是胆固醇或其衍生物。
15.根据权利要求11所述的LNP，其中所述LNP包含浓度范围为约20mol％至约50mol％的胆固醇脂质。
16.根据权利要求11所述的LNP，其中所述聚合物为聚乙二醇(PEG)或其衍生物。
17.根据权利要求11所述的LNP，其中所述LNP包含浓度范围为约0.5mol％至约10mol％的聚合物。
18.根据权利要求11所述的LNP，其中所述LNP包含选自由核酸分子、治疗剂及它们的任意组合组成的组中的至少一种。
19.根据权利要求18所述的LNP，其中所述核酸分子是治疗剂。
20.根据权利要求18所述的LNP，其中所述核酸分子是DNA分子或RNA分子。
21.根据权利要求18所述的LNP，其中所述核酸分子选自由cDNA、mRNA、miRNA、siRNA、经修饰的RNA、antagomir、反义分子、肽、治疗性肽、靶向核酸、及它们的任意组合组成的组。
22.根据权利要求21所述的LNP，其中所述mRNA编码荧光素酶。
23.根据权利要求21所述的LNP，其中所述mRNA编码一种或多种抗原。
24.根据权利要求23所述的LNP，其中所述抗原包含选自由病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、流感抗原、肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原组成的组中的至少一种。
25.根据权利要求18所述的LNP，其中所述核酸分子包含启动子或调控序列。
26.根据权利要求18所述的LNP，其中所述LNP进一步包含佐剂。
27.根据权利要求18所述的LNP，其中所述核酸分子、治疗剂或它们的组合被包封在具有式(I)结构的所述化合物或其盐中。
28.一种包含至少一种权利要求1所述的化合物、至少一种权利要求5所述的LNP或它们的任意组合的组合物。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述组合物是疫苗。
30.一种将核酸分子、治疗剂或它们的组合递送至有需要的受试者的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的至少一种权利要求5所述的LNP或它们的组合物，
其中所述LNP或它们的组合物将所述核酸分子、治疗剂或它们的组合递送至靶。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述核酸分子为治疗剂。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述核酸分子为DNA分子或RNA分子。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述核酸分子选自由cDNA、mRNA、miRNA、siRNA、antagomir、反义分子、肽、治疗性肽、靶向核酸及它们的任意组合组成的组。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述mRNA编码荧光素酶。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述靶选自由免疫细胞、T细胞、驻留T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、癌细胞、与疾病或病症相关的细胞、与疾病或病症相关的组织、脑组织、中枢神经系统组织、肺组织、顶端表面组织、上皮细胞、内皮细胞、肝组织、肠组织、结肠组织、小肠组织、大肠组织、粪便、骨髓、巨噬细胞、脾组织、肌肉组织、关节组织、肿瘤细胞、病变组织、淋巴结组织、淋巴循环及它们的任意组合组成的组。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述mRNA编码一种或多种抗原。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述抗原包含选自由病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、流感抗原、肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原组成的组中的至少一种。
38.根据权利要求30所述的方法，其中所述核酸分子包含启动子或调控序列。
39.根据权利要求30所述的方法，其中所述LNP或它们的组合物进一步包含佐剂。
40.根据权利要求30所述的方法，其中所述核酸分子、治疗剂或它们的组合被包封在权利要求1的化合物中。
41.根据权利要求30所述的方法，其中所述LNP组合物是疫苗。
42.根据权利要求30所述的方法，其中所述LNP或其组合物通过由皮内、皮下、肌内、心室内、鞘内、口服递送、静脉内、气管内、腹膜内、子宫内递送及它们的任意组合组成的组中选择的递送途径来施用。
43.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法包括LNP组合物的单次施用。
44.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法包括LNP组合物的多次施用。
45.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法治疗或预防由病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染、流感感染、癌症、关节炎、心脏病、心血管疾病、神经病症或疾病、遗传疾病、自身免疫疾病、胎儿疾病、影响胎儿发育的遗传疾病及它们的任意组合组成的组中的至少一种。
46.一种在有需要的受试者中预防或治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的至少一种权利要求5所述的LNP或其组合物。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述LNP或其组合物将核酸分子、治疗剂或它们的组合递送至细胞。
48.一种将核酸分子递送至细胞的方法，包括向所述细胞施用治疗有效量的至少一种权利要求5所述的LNP或其组合物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述方法是基因递送方法。
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