CN114751968B - 一种松针抗冻蛋白及其在鸡精液冷冻保存稀释液中的应用 - Google Patents

一种松针抗冻蛋白及其在鸡精液冷冻保存稀释液中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种松针抗冻蛋白及其在鸡精液冷冻保存稀释液中的应用，所述鸡精液冷冻保存稀释液成分简单易得，渗透偏高渗，有利于适当降低胞内水分，减少冰晶损伤。经过冷冻后的精子活力均在0.65以上，达到并远远超过了用于人工授精的标准。在使用后仍获得了相对较高受精率，比对照组高出近一倍，用于保种没有问题，为冻精提供更好的保护效果。

Description

一种松针抗冻蛋白及其在鸡精液冷冻保存稀释液中的应用
技术领域
本发明涉及生物领域，涉及一种新发现的松针抗冻蛋白，及其进一步的涉及这种松针抗冻蛋白在鸡精液冷冻保存稀释液中的应用。
背景技术
精液冷冻保存是人工授精技术的一项重大革新。它解决了精液长期保存的问题，使精液不受时间、地域和种畜生命的限制，可充分利用良种最佳阶段的遗传性能，极大限度的发挥和提高优良种公鸡的利用率，大大提高遗传进展，加速品种的育成和改良步伐。同时，对优良种公鸡在短期进行后裔测定，保留和恢复某一品种或个体公鸡的优秀特性，以及在进行血统更新、引种、减低生产成本和品种资源保护等方面都具有重要意义和应用价值。
近50多年来，国内外学者及动物繁殖技术研究者对家畜、家禽的精液冷冻保存和人工授精技术进行了大量的研究。尤其，自1949年英国Polge等发现甘油(丙三醇)对牛精子具有抗冻保护作用后，该技术研究与应用取得了飞速的发展，尤其在乳牛上的应用效果已同鲜精无明显差异。因此国内外畜牧工作者已相继在牛、羊、马、猪、鸡、鹅、鸭、火鸡等种畜禽上开展了精液冷冻保存的研究，均取得了重大进展和显著效果。在家禽(鹅、鸡、鸭、火鸡等)主要从如下几方面进行了大量研究：目前鸡精液冷冻保护剂主要有甘油、DMSO(二甲亚砜)、DMA(N，N-二甲基乙酰胺)以及EG(乙二醇)等。但另一方面也发现这些化学成分对精子也有一定的毒害作用(即抗受精作用)。尤其是本发明的前期试验表明，甘油、DMSO、DMA、EG对精子的存活都会产生较显著的毒害作用(P＜0.05)，其中以DMA的毒性最小，乙二醇和DMSO次之。可见，筛选出高效、无毒的、优良冷冻保护剂是种公鸡精液冷冻的重要环节之一。而且精液冷冻保存不仅涉及到保存液，还涉及到冷冻的具体步骤、解冻的具体步骤，这些都会直接影响到最终的受精效果。而现有的精液冷冻技术方法上仍存在如下4个方面的不足或缺陷：
(1)精液冷冻基础稀释液的配方组成是最重要的环节之一，但在有关报道中很少详细介绍稀释液的组成成分，仅仅提到一些主要组分而已，而无详尽的配方资料可以参考。在基础稀释液的配方及配伍上缺乏筛选。
(2)在冷冻保护剂的选择和使用浓度上没有预先进行毒力性实验，带有一定的盲目性。
(3)在基础稀释液和冷冻保护剂的配伍和配比方面缺乏实验依据。
(4)有些冷冻程序或技术工艺不合理，操作方法过于复杂、不方便使用。如冷冻平衡时间、平衡温度以及冷冻必须进行特异性测试；再如所要求的低温(5℃)离心及渗析等，在生产上应用，可行性就受到影响。
本申请的申请人在前期研究中发现，在精液冷冻保存过程中添加合适的植物成分即可以保证精液的稳定性，而且在精液的冷冻、解冻过程中会有很好的缓冲作用，减少冷冻冷藏对精子的损伤。其中，松针粗提物是效果较好一种添加组分。中国古代人首先发现了松树的叶-松针的抗炎、活血、祛腐、强身等药用作用。近代医学研究，发现松针是集药用、养生、预防疾病、抗衰老等为一体的宝贵药用。近代医学研究，发现松针能降血脂、降血压、降血糖、降低血粘稠度，并对高血压有降低、低血压有升高的血压双向调节作用。松针是天然绿色植物产品，对动物体无毒、无任何的副作用，而且松针提取物是世界上迄今为止文献记载和实验发现是最强的天然抗氧化，最强效的自由基清除剂，它的抗氧化清除自由基的能力是维生素E的50倍，是维生素C的20倍。但是松针粗提物成分较为复杂，会在一定程度上影响到后续受精效果，因此有必要对其进行进一步的分析研究，获得较为单一和纯净的功能物质实现提高精液冷冻保存效果的功效。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是：
提供一种松针抗冻蛋白，所述松针抗冻蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该种多肽具有β折叠结构的高级结构，在1mg/ml的水溶液中，具有0.6℃的热滞后值。该种多肽在较低的浓度，即具有高的热滞后值，为优选抗冻多肽；
进一步的，本发明提供一种松针抗冻蛋白的应用，所述应用制备保存精子活力高、保存时间长、使用简便的鸡精液冷冻稀释液。
进一步的，本发明提供一种原料易得、配制方便、受精率达到60%以上的鸡精液冷冻保存稀释液。
进一步的，所述鸡精液冷冻保存稀释液分为I液和II液，I液含有果糖、蔗糖、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、谷氨酸钠、谷胱甘肽和松针抗冻多肽，II液为I液加入二甲基乙酰胺（DMA）。
进一步优选的，将果糖0.5~1.5g，蔗糖1.0~4.0g，磷酸二氢钾0.1~0.3g，十二水磷酸氢二钠0.3~0.7g，谷氨酸钠1.2~2g，谷胱甘肽0.01~0.05g，溶于100ml水，充分溶解，然后加入松针抗冻多肽（1mg/ml，溶于0.01M PBS缓冲液）0.1~0.5ml为I液，取I液66ml，加入DMA8~12ml，为II液，I、II液均用0.22um滤器过滤除菌，分装至2ml离心管保存。
进一步的，本发明提供一种精液冷冻方法，所述方法为：取I液37℃预热，充分混匀后与原精进行1:2等温稀释，用纱布包裹放入冰箱，使其1h内缓慢降温平衡至4℃，然后加入II液进行1:1稀释，装入0.25ml细管，用冷冻仪冷冻，冷冻曲线以7℃/min从5℃降至-35℃，然后以-60℃/min的速率降低-140℃。
进一步的，本发明提供一种冷冻精液的解冻方法方法，所述方法为：水浴锅里水浴解冻，解冻温度50℃ 8s。
有益效果
本发明成分简单易得，渗透偏高渗，有利于适当降低胞内水分，减少冰晶损伤；其中的松针抗冻蛋白可以保证精液的稳定性，而且在精液的冷冻、解冻过程中会有很好的缓冲作用，减少冷冻冷藏时产生的冰晶对精子的损伤；磷酸盐有较强的缓冲能力，使pH维持在6.8~7.2，并且能够提供钾离子，维持离子平衡；果糖是精子能够直接利用的糖类，可以为精子提供能量，混合糖类对精子膜有更好的保护作用；并且含有对精子保存十分有益的谷氨酸钠；谷胱甘肽可以减少氧化损伤；抗冻保护剂DMA具有毒性较低的特点，输精时不用离心脱去抗冻剂。
附图说明
图1本发明松针抗冻蛋白的制备方法的工艺流程图；
图2 鸡精精子运动轨迹检测图，其中图A为control复苏后的精子运动轨迹图，图B为方案4复苏后的精子运动轨迹图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1 松针抗冻蛋白粗提物的提取及其抗冻蛋白的筛选
如图1所示，本发明松针抗冻蛋白的制备方法的工艺流程图。包括如下步骤：
采集松针原料冲洗干净后气爆粉碎；
将松针粗粉置于储罐中加5倍量体积的水煮沸1小时，蒸汽压力1Mpa，得提取液浓缩，相对密度D＝1.1，即得滤液I和滤渣；
滤渣中再加入5倍量的水煮沸3小时，煮沸2小时，蒸汽压力1Mpa，得提取液浓缩，相对密度D＝1.1，即得滤液II和滤渣；
将滤液I和滤液II混合过滤后浓缩，相对密度D＝1.1，得浸膏；
在装有浸膏的容器中加3倍量75％乙醇静置沉淀24小时；
容器中的液体通过减压浓缩装置回收乙醇，即得醇提物和沉淀物；
沉淀物进入喷雾干燥机，进风温度控制在180℃～195℃，出风温度控制在70℃～90℃，经粉碎过筛后得松针提取物干粉，即松针抗冻蛋白粗提物；
将松针抗冻蛋白粗提物溶于5倍体积的PBS中经预平衡的DEAE－SepharoseFastFlow阴离子交换层析柱，用0.01M pH7.0～7.5的PBS洗柱，再用含0.2~0.6M NaCl的0.01M pH7.0～7.5的PBS分段洗脱，收集洗脱峰；
将上述洗脱液超滤浓缩后透析去除NaCl；
将透析后的蛋白组份进行用纳升渗透仪Nanolitre Osmometer(OtagoOsmometers Ltd，New Zealand)在蔡司显微镜AX10(Zeiss，German)下，观察抗冻蛋白对冰晶的形态修饰作用和抑制重结晶作用。具体方法是，用0.50μL的微量进样器，将待观测样品(0.1mM，pH＝7.4)加入纳升渗透压仪控温台上的样品孔中，然后将控温台置于显微镜的载物台上先快速降温到-20℃～-30℃将样品快速冷冻，然后缓慢升高温度，观察冰开始熔化的温度，直至视野中只有单个(或少数几个)冰晶存在，再更加缓慢地升温，观测冰晶熔化时的形态变化；或者看到单冰晶后，缓慢地降温，观测冰晶生长时的情况。
用差示扫描量热仪DSC 200F3(Maia，German)测定抗冻蛋白的热滞活性。具体做法是，先用移液器量取约1μL的抗冻蛋白溶液，添加在铝盘中央，并加盖密封，以密封后的空白铝盘做参照，分别放置在样品池中的两个测量台上。首先以1℃/min的降温速率降温至-30℃，然后以1℃/min的升温速率升至25℃，再以1℃/min的降温速度降至-30℃，测量样品的熔化温度(Tm)。随后，根据样品的熔化温度(Tm)，设定样品的保留温度(Th)(样品体系为固液混合物的状态时的温度，保留温度略低于熔化温度)，并将样品由-30℃以1℃/min的速率升温至保留温度(Th)，停留2min，再将温度以1℃/min的降温速度降至-30℃，测定样品开始结晶的温度(T0)。之后，重复以上测试过程，并分别在不同的保留温度下停留2min，以测定在不同的保留温度下，样品体系开始冻结的温度(T0)。保持温度(Th)和重结冰温度(To)之差即为THA值，即THA＝Th-To。
最后筛选出一种具有较好抗冻活性和延缓冰晶形成的蛋白，经测序后确认其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示（Ser-Ala-Arg-Glu-Arg-Thr-Cys-Thr-Ser-Ser-Thr-Asn-Ser-Lys-Ala-Cys-Ala-Lys-Tyr-Thr-Pro-Thr-Asp-Thr-Cys-Thr）。
并对获得的多肽进一步验证，在圆二色光谱检测中显示负的单峰，由此可以证实了其β折叠结构的存在。差示扫描量热法测量，发现该种多肽，在1mg/ml的水溶液中，具有0.6℃的热滞后值。该种多肽在较低的浓度，即具有高的热滞后值，为优选抗冻多肽。
实施例2鸡精液冷冻保存体系的构建
按照如下组分进行鸡精液冷冻保存稀释液的配置
松针抗冻多肽液的配置：将纯化或者人工合成的松针抗冻多肽稀释在PBS缓冲液（0.01M pH7.4）中，调整浓度为1mg/ml；
I液的配置：果糖0.5~1.5g，蔗糖1.0~4.0g，磷酸二氢钾0.1~0.3g，十二水磷酸氢二钠0.3~0.7g，谷氨酸钠1.2~2g，谷胱甘肽0.01~0.05g，溶于100ml水，充分溶解，然后加入松针抗冻多肽液0.1~0.5ml为I液，用0.22um滤器过滤除菌，分装至2ml离心管保存；
II液的配置：取I液66ml，加入DMA 8~12ml，为II液，用0.22um滤器过滤除菌，分装至2ml离心管保存；
按照表1所示配置相应的鸡精液冷冻保存稀释液。
表1鸡精液冷冻保存稀释液的配置
Figure DEST_PATH_IMAGE001
鸡精液冷冻保存方法为：首先配置冷冻缓冲液I液和II液，使用时用预热的I液充分混合后与原精进行1:2等温稀释，用纱布包裹放入冰箱，使其1h内缓慢降温平衡至4℃，然后加入II液进行1:1稀释，装入0.25ml细管，用冷冻仪冷冻，冷冻曲线以7℃/min从5℃降至-35℃，然后以-60℃/min的速率降低-140℃。对照6（control）的方法为预热的缓冲液与原精进行1:2等温稀释，用纱布包裹放入冰箱，使其1h内缓慢降温平衡至4℃，然后再加入缓冲液进行1:1稀释，装入0.25ml细管，用冷冻仪冷冻，冷冻曲线以7℃/min从5℃降至-35℃，然后以-60℃/min的速率降低-140℃。
冷冻鸡精液的解冻步骤为：解冻温度50℃ 8s。
对上述不同方案获得的解冻的鸡精液进行相应的指标检测（冷冻保藏时间为10天），
活力检查：用田园奥瑞CASA系统自动检测。以全部精子呈直线运动，定为1.0，50％的精子直线运动其活力定为0.5，10％的精子呈直线运动其活力为0.1，依次类推；
种蛋的受精率：取200日龄、健康无病、产蛋率高的种母鸡600只，供输精试验。母鸡每隔3天输精一次，每次输精0.2ml，从第二次输精后的第7天开始收集种蛋，进行孵化。所收集的种蛋在18℃恒温条件下保存，在7天以内入孵。孵化方式采用常用的人工孵化程序进行，于孵化第7天检验种蛋的受精情况，统计种蛋的受精率。
实验结果如表2所示。
表2 冷冻鸡精液进行相应的指标检测
Figure DEST_PATH_IMAGE003
从上述数据和图2中可以明显看出，本申请所提供的这种松针抗冻多肽可以在很大程度上提升鸡精液冷冻保藏稀释液的冷冻保藏效果，与新鲜鸡精的相关数据相比，其精子活力虽然有所降低，但精子活力均在0.60以上(0.61-0.69)，达到并远远超过了用于人工授精的标准(0.3)。在对种蛋受精的影响上，冻精对种蛋受精率有较大影响，但在使用后仍获得了相对较高受精率，比对照组高出近60%，用于保种没有问题。可以进一步优化缓冲液的组成为冻精提供更好的保护效果。
前述内容出于解释目的描述了一些示例性实施方案。尽管前面的讨论已经给出了具体的实施方案，但是本领域技术人员将认识到，可以在形式和细节上做出改变，而不脱离本发明的更广泛的精神和范围。因此，说明书和附图应当以说明性的而不是限制性的意义考虑。因此，该详细描述不应以限制性意义理解，并且本发明的范围仅由所包括的权利要求书以及这些权利要求书所享有的等同方案的全部范围来限定。
〈110〉贵州省种畜禽种质测定中心
<120>一种松针抗冻蛋白及其在鸡精液冷冻保存稀释液中的应用
<160>1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211>26
<212> PRT
<213>松针抗冻多肽
Ser-Ala-Arg-Glu-Arg-Thr-Cys-Thr-Ser-Ser-Thr-Asn-Ser-Lys-Ala-Cys-Ala-Lys-Tyr-Thr-Pro-Thr-Asp-Thr-Cys-Thr

Claims (6)

1.一种松针抗冻蛋白，所述松针抗冻蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该多肽具有β折叠结构的高级结构，在1mg/ml的水溶液中，具有0.6℃的热滞后值。
2.如权利要求1所述的一种松针抗冻蛋白的应用，所述应用为制备保存精子活力高、保存时间长、使用简便的鸡精液冷冻稀释液。
3.一种鸡精液冷冻保存稀释液，其特征在于所述鸡精液冷冻保存稀释液中含有如权利要求1所述的松针抗冻蛋白、果糖、蔗糖、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、谷氨酸钠、谷胱甘肽和二甲基乙酰胺DMA，其中，松针抗冻蛋白 0.5~1.5ml，果糖0.5~1.5g，蔗糖1.0~4.0g，磷酸二氢钾0.1~0.3g，十二水磷酸氢二钠0.3~0.7g，谷氨酸钠1.2~2g，谷胱甘肽0.01~0.05g，DMA 8~12ml，松针抗冻蛋白的浓度为1mg/ml，溶于0.01M PBS。
4.如权利要求3所述的鸡精液冷冻保存稀释液的制备方法，其步骤包括：
取果糖0.5~1.5g，蔗糖1.0~4.0g，磷酸二氢钾0.1~0.3g，十二水磷酸氢二钠0.3~0.7g，谷氨酸钠1.2~2g，谷胱甘肽0.01~0.05g溶于100ml水，充分溶解，然后加入浓度为1mg/ml，溶于0.01M PBS的松针抗冻多肽 0.1~0.5ml为I液；
取I液66ml，加入DMA 8~12ml，为II液，I、II液均用0.22um滤器过滤除菌，分装至2ml离心管保存。
5.一种鸡精液冷冻方法，所述方法为：首先按照权利要求4的方法配制 鸡精液冷冻保存稀释液I液和II液，取I液37℃预热，充分混匀后与鸡精液进行1:2等温稀释，用纱布包裹放入冰箱，使其1h内缓慢降温平衡至4℃，然后加入II液进行1:1稀释，装入0.25ml细管，用冷冻仪冷冻，冷冻曲线以7℃/min的速率从5℃降至-35℃，然后以60℃/min的速率降低至-140℃。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于还包括解冻步骤，所述步骤为：水浴锅里水浴解冻，解冻温度50℃，解冻时间为8s。
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