CN114699530A - 一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点及应用，所述靶点为YIPF2，所述YIPF2潜在的抑制分子为Q5114941，所述YIPF2与辅助蛋白CD147相结合，且不与辅助蛋白gp70相结合，所述辅助蛋白CD147与MCT1相结合，所述辅助蛋白gp70与MCT2相结合，所述MCT1为少突胶质细胞的表达，所述MCT2为神经元的表达，所述少突胶质细胞的MCT1在人胰岛淀粉样多肽的刺激下其转运功能受到抑制，所述神经元的MCT2在人胰岛淀粉样多肽的刺激下仍能向胞外输出乳酸用于维持自身pH值稳态。YIPF2可作为改善糖尿病脑病认知障碍的重要靶点，其潜在抑制分子Q5114941可通过增加CD147上膜量，改善少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的高易损性，为临床糖尿病脑病的防治提供新思路。

Description

一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点及应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点及应用。

背景技术

目前，全球糖尿病患者已超4.4亿人，其中近三分之一在中国。中国糖尿病患病率已达12％，是世界上糖尿病患者最多，患病率上升最快的国家，且发病有年轻化趋势。糖尿病同样还是世界范围内重要的致残原因，但是随着医疗条件的改善，更多的患者能够在患病后存活。然而，由于各种并发症的存在，这些幸存者大多发展为身体残疾，不仅严重危害患者的生活质量，还会给社会及患者家庭带来沉重的负担。糖尿病脑病是我国糖尿病的重要并发症。糖尿病患者中，糖尿病脑病的发病率高达40％左右。

深入探究糖尿病脑病的发病机制，寻找干预治疗的新靶点对于防治糖尿病脑病，改善患者生活质量具有重要意义，近年研究认为，人胰岛淀粉样多肽过度分泌导致的脑白质脱髓鞘是糖尿病脑病的重要病理基础，但为何生成髓鞘的少突胶质细胞容易损伤并不清楚，而糖尿病脑病临床表现为学习记忆能力减退、语言表达和理解能力下降，可伴有神情淡漠、行动迟缓等，影像学方面以白质脱髓鞘为主要特征，但为何髓鞘容易损伤并不清楚，临床尚无有效的防治办法。

发明内容

(一)发明目的

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点及应用，以实现深入探究糖尿病脑病的发病机制，寻找干预治疗的新靶点用于防治糖尿病脑病，改善患者生活质量。

(二)技术方案

为达到上述技术目的，本发明提供了一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点：所述靶点为YIPF2，所述YIPF2潜在的抑制分子为Q5114941。

优选的，所述YIPF2与辅助蛋白CD147相结合，且不与辅助蛋白gp70相结合。

优选的，所述辅助蛋白CD147与MCT1相结合，所述辅助蛋白gp70与MCT2相结合。

优选的，所述MCT1为少突胶质细胞的表达，所述MCT2为神经元的表达，所述MCT1、MCT2为单羧酸转运体中的一种，所述单羧酸转运体用于维持细胞内pH值稳态。

优选的，所述少突胶质细胞的MCT1在人胰岛淀粉样多肽的刺激下其转运功能受到抑制，所述神经元的MCT2在人胰岛淀粉样多肽的刺激下仍能向胞外输出乳酸用于维持自身pH值稳态。

优选的，所述人胰岛淀粉样多肽在糖尿病患者血浆中的浓度，与其白质损伤面积呈正相关，与认知评分呈负相关。

优选的，所述少突胶质细胞损伤造成髓鞘损伤，所述人胰岛淀粉样多肽用于降低血糖。

优选的，所述抑制分子Q5114941通过增加辅助蛋白CD147上膜量用于改善少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的高易损性。

本发明还提供了一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的应用，上述的靶点应用于改善糖尿病脑病的髓鞘损伤及认知障碍。

从以上技术方案可以看出，本申请具有以下有益效果：

YIPF2可作为改善糖尿病脑病认知障碍的重要靶点，其潜在抑制分子Q5114941可通过增加CD147上膜量，改善少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的高易损性，为临床糖尿病脑病的防治提供新思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的人胰岛淀粉样多的浓度变化示意图。

图2为本发明提供的单羧酸转运体受到刺激的变化示意图。

图3为本发明提供的胰岛淀粉样多肽干预会特异性妨碍MCT1与CD147结合的示意图。

图4为本发明提供的基于LC-MS/MS方法筛选出靶点蛋白YIPF2示意图。

图5为本发明提供的YIPF2与CD147结合而不与gp70结合示意图。

图6为本发明提供的YIPF2可明显减轻髓鞘损伤示意图。

图7为本发明提供的YIPF2可改善动物模型的认知障碍示意图。

图8为本发明提供的抑制YIPF2的分子示意图。

图9为本发明提供的Q5114941可明显改善糖尿病脑病转基因模型鼠的白质损伤示意图。

图10为本发明提供的具体操作流程示意图。

图11为本发明提供的人胰岛淀粉样多肽氨基酸结构示意图。

图12为本发明提供的单羧酸转运体与辅助蛋白功能示意图。

图13为本发明提供的抑制分子Q5114941可通过增加CD147上膜量的假说示意图。

具体实施方式

下文的描述本质上仅是示例性的而并非意图限制本公开、应用及用途。应当理解，在所有这些附图中，相同或相似的附图标记指示相同的或相似的零件及特征。各个附图仅示意性地表示了本公开的实施方式的构思和原理，并不一定示出了本公开各个实施方式的具体尺寸及其比例。在特定的附图中的特定部分可能采用夸张的方式来图示本公开的实施方式的相关细节或结构。

参照图1-13：

实施例一

一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点，靶点为YIPF2，YIPF2潜在的抑制分子为Q5114941，YIPF2与辅助蛋白CD147相结合，且不与辅助蛋白gp70相结合，辅助蛋白CD147与MCT1相结合，辅助蛋白gp70与MCT2相结合。

MCT1为少突胶质细胞的表达，MCT2为神经元的表达，MCT1、MCT2为单羧酸转运体中的一种，单羧酸转运体用于维持细胞内pH值稳态，少突胶质细胞的MCT1在人胰岛淀粉样多肽的刺激下其转运功能受到抑制，神经元的MCT2在人胰岛淀粉样多肽的刺激下仍能向胞外输出乳酸用于维持自身pH值稳态。

人胰岛淀粉样多肽在糖尿病患者血浆中的浓度，与其白质损伤面积呈正相关，与认知评分呈负相关，少突胶质细胞损伤造成髓鞘损伤，人胰岛淀粉样多肽用于降低血糖，抑制分子Q5114941通过增加辅助蛋白CD147上膜量用于改善少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的高易损性。

一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的应用，上述的靶点应用于改善糖尿病脑病的髓鞘损伤及认知障碍。

实施例二

一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点及应用，其在实施例一的基础上，包括以下三大步骤：

(一)发现问题，探究机制；

(二)明确靶点，尝试干预；

(三)筛选药物，验证结果。

具体操作流程图见图10。

实施例三

一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点及应用，其在实施例一和实施例二的基础上，对于发现问题，探究机制的归纳：

糖尿病早期，患者脑部已可观察到明显的脑白质脱髓鞘，部分患者甚至在临床症状出现之前，中枢神经系统就已经发生脱髓鞘改变。髓鞘功能障碍会导致患者临床症状加重，功能恢复缓慢。其中，少突胶质细胞(oligodendrocytes，OLs)损伤是造成髓鞘功能障碍的主要原因。

人胰岛淀粉样多肽(humanamylin，hAmylin)是由胰岛β细胞产生的一种荷尔蒙。生理作用为抑制食欲、抑制胃排空，协同胰岛素降低血糖。人胰岛淀粉样多肽与胰岛素共同储存于胰岛β细胞的释放小泡内，在促胰岛β细胞释放激素的作用下与胰岛素共同释放。正常时，人胰岛淀粉样多肽:胰岛素的释放比例为1:100，而糖尿病患者这一比例可上升至1:20。早期糖尿病患者体内多呈高胰岛素状态，此时同样大量分泌的人胰岛淀粉样多肽，由于浓度增加，极易出现错误折叠，形成具有细胞毒性的寡聚体及纤维样蛋白沉积，损伤胰岛功能。

人胰岛淀粉样多肽的细胞毒性与其可诱导氧化应激及凋亡相关基因的表达、触发炎症瀑布、损伤线粒体功能、诱发钙超载、破坏细胞膜等机制有关。其中，造成细胞代谢异常，导致酸中毒亦是其损伤细胞的重要途径之一。受到人胰岛淀粉样多肽刺激后，少突胶质细胞容易出现酸中毒。

单羧酸转运体(monocarboxylatetransporters，MCTs)是一类重要的跨膜转运蛋白，负责细胞间乳酸、丙酮酸及酮体等单羧酸类化合物的转运。不论输出还是输入，单羧酸转运体都需将一分子的单羧酸与一个质子协同传递。因此，除转运能量物质外，单羧酸转运体对维持细胞内pH值稳态同样重要。中枢神经系统表达MCT1、MCT2和MCT4三型。星形胶质细胞表达MCT1、MCT4两种亚型。神经元表达MCT2。少突胶质细胞表达MCT1，是少突胶质细胞维持pH稳态的重要途径。人胰岛淀粉样多肽刺激下，少突胶质细胞的MCT1转运功能受到抑制，造成胞内乳酸堆积，导致细胞酸中毒；而神经元的MCT2在人胰岛淀粉样多肽刺激下，仍能向胞外输出乳酸，维持自身pH值稳态。

单羧酸转运体需要与相应的辅助蛋白结合(见图12)，才能形成功能性的转运体。不同亚型的单羧酸转运体辅助蛋白不同。MCT1与辅助蛋白CD147结合，而MCT2则与辅助蛋白gp70结合，并不与CD147相互作用。缺乏相应的辅助蛋白，将导致单羧酸转运体转运功能障碍。人胰岛淀粉样多肽并不影响MCT1于细胞膜的表达量及CD147的总表达量。此外，人胰岛淀粉样多肽会特异性妨碍MCT1与CD147的结合，导致MCT1功能障碍；而对MCT2与gp70的结合无影响。

实施例四

一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点及应用，其在实施例一和实施例三的基础上，进行明确靶点，并尝试干预：

采用LC-MS/MS方法，通过蛋白质组学差异分析已经筛选出了调控CD147上膜过程的新靶点YIPF2(YeastRabGTPase-Interactingprotein2)。YIPF2是YIP家族成员。该家族均为跨膜蛋白，主要定位于高尔基体。其N端暴露于细胞质，短C端暴露于高尔基体腔内。目前，有关YIPF2及其家族功能的研究仍十分有限。新近研究认为，该家族成员主要参与胞内的囊泡运输。其中，YIPF2可通过与膜蛋白结合，使膜蛋白滞留在高尔基体表面，并根据自身表达量的变化调控膜蛋白上膜量。YIPF2表达增加，则膜蛋白上膜量下降；相反YIPF2表达减少，将导致膜蛋白更多的被运输到细胞膜上。预实验结果显示：YIPF2可与CD147结合，而不与gp70结合。抑制YIPF2可明显改善人胰岛淀粉样多肽的细胞毒性作用，减轻细胞及动物模型的髓鞘损伤。提示，YIPF2是改善糖尿病脑病认知障碍的重要治疗靶点。

人胰岛淀粉样多肽可妨碍少突胶质细胞的MCT1与辅助蛋白CD147结合，导致MCT1转运障碍造成酸中毒；而神经元表达MCT2，其与辅助蛋白的结合不受影响，故可维持pH稳态。因此，我们认为增加CD147上膜量，提高MCT1-CD147二者结合机会，可改善糖尿病脑病的髓鞘损伤。通过采用LC-MS/MS方法，通过蛋白质组学差异分析已经找到了调CD14上膜量的重要靶点YIPF2，并通过虚拟筛选及TR-FRET(Time-ResolvedFluorescenceResonanceEnergyTransfer，时间分辨荧光共振能量转移)分析得到了YIPF2的潜在抑制分子Q5114941。

综上所述提出如下科学假设(见图13)：YIPF2可作为改善糖尿病脑病认知障碍的重要靶点，其潜在抑制分子Q5114941可通过增加CD147上膜量，改善少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的高易损性，为临床糖尿病脑病的防治提供新思路。

实施例五

一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点及应用，其在实施例四的基础上，从以下三个方面加以论证：

(1)明确糖尿病脑病中少突胶质细胞的高易损性机制源于人胰岛淀粉样多肽可特异性妨碍MCT1与CD147的结合；

(2)明确抑制YIPF2，增加CD147上膜量，可改善糖尿病脑病中少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的高易损性；

(3)明确Q5114941可通过抑制YIPF2改善糖尿病脑病的髓鞘损伤及认知障碍。

实验探究：(1)以明确糖尿病脑病状态下，少突胶质细胞高易损性的机制与人胰岛淀粉样多肽可特异性妨碍MCT1与CD147的结合有关：

临床实验部分：

采集糖尿病患者的血液标本，检测其血浆中人胰岛淀粉样多肽的浓度、脑白质损伤面积及认知评分，明确人胰岛淀粉样多肽血浆浓度与白质损伤程度、认知障碍间的相关性。

动物实验部分：

利用高表达人胰岛淀粉样多肽的hIAPP+Atg7Δβ-cell转基因小鼠作为糖尿病脑病转基因模型鼠，以WT鼠为对照组。对不同月龄的小鼠进行行为学检测，测量脑白质损伤面积、脑水肿程度，明确糖尿病脑病转基因模型鼠存在认知障碍及脑白质损伤；检测脑白质区域MCT1、MCT2与各自辅助蛋白CD147、gp70结合量变化。明确与WT鼠相比，糖尿病脑病转基因模型鼠MCT1与CD147的结合减少。

细胞实验部分：

利用单独培养的少突胶质细胞及神经元，通过给予不同时长、不同浓度的人胰岛淀粉样多肽干预，作为糖尿病脑病细胞模型。检测人胰岛淀粉样多肽对细胞数量、细胞内外乳酸含量、胞内pH值变化及单羧酸转运体转运功能的影响。明确人胰岛淀粉样多肽可特异性抑制MCT1的转运功能，对MCT2无影响；检测MCT1、MCT2与各自辅助蛋白CD147、gp70结合量变化，观察CD147、gp70表达位置及细胞膜表达量的变化，明确少突胶质细胞的高易损性机制与人胰岛淀粉样多肽可特异性妨碍MCT1与CD147的结合有关。

(2)以明确抑制YIPF2，增加CD147上膜量，增加MCT1-CD147二者结合机会，可改善人胰岛淀粉样多肽造成的髓鞘损伤及认知障碍：

细胞实验部分：

利用单独培养的少突胶质细胞，筛选出人胰岛淀粉样多肽干预下，与CD147存在强相互作用的候选靶分子(预实验中，我们已发现抑制YIPF2对糖尿病脑病细胞及动物模型的改善作用最为明显)；检测人胰岛淀粉样多肽干预下，抑制YIPF2对少突胶质细胞CD147的细胞膜表达量的影响，及其对少突胶质细胞细胞数量、细胞内外乳酸含量、胞内pH值、髓鞘覆盖率的影响。明确抑制YIPF2可于细胞层面改善少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的高易损性，其机制与增加CD147上膜量有关。

动物实验部分：

利用YIPF2-olig1cKO小鼠与WT小鼠进行对比，通过埋置侧脑室留置针，长时间给予人胰岛淀粉样多肽干预，模拟糖尿病脑病状态。检测人胰岛淀粉样多肽干预下，敲除YIPF2对脑白质MCT1-CD147结合量的影响。

此外，测量脑白质梗死面积、脑水肿程度、髓鞘覆盖率、认知功能。明确抑制YIPF2可于动物层面改善人胰岛淀粉样多肽造成的髓鞘损伤及认知障碍，其机制与增加CD147上膜量有关。

(3)以明确对YIPF2靶点具有抑制作用的Q5114941分子，可改善糖尿病脑病的髓鞘损伤及认知障碍。

虚拟筛选部分：

利用DiscoveryStudio2020软件，根据YIPF2的蛋白结构，虚拟筛选DrugBank数据库中的13490个分子，获得与YIPF2相互作用的候选分子，并对其进行功能验证。采用TR-FRET法检测各候选分子的IC50(半抑制浓度)，并通过细胞和动物实验，对具有YIPF2抑制作用的候选分子进一步验证，最终筛选出Q5114941这个对YIPF2具有显著抑制作用的分子(IC50＝380nM)。

细胞实验部分：

利用单独培养的少突胶质细胞及神经元，通过给予不同时长、不同浓度的人胰岛淀粉样多肽干预，模拟糖尿病脑病状态。检测Q5114941对CD147、gp70上膜量的影响，明确Q5114941对YIPF2的功能抑制作用；检测Q5114941对细胞数量、细胞内外乳酸含量、细胞内pH值、单羧酸转运体转运功能，及髓鞘覆盖率的影响，明确Q5114941可于细胞层面，改善少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的易损性。

动物实验部分：

利用高表达人胰岛淀粉样多肽的hIAPP+Atg7Δβ-cell转基因小鼠作为糖尿病脑病转基因模型鼠，以WT鼠为对照组。通过侧脑室注射Q5114941，检测组间MCT1-CD147结合量的变化，对比梗死面积、脑水肿程度、髓鞘覆盖率，及认知功能的变化，明确Q5114941可于动物层面改善人胰岛淀粉样多肽造成的髓鞘损伤及认知障碍。

实施例六

一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点及应用，其在实施例一至实施例五的基础上，进行筛选药物，验证结果：

从以下三个方面加以验证：

(1)证明糖尿病脑病中少突胶质细胞的高易损性机制与人胰岛淀粉样多肽可特异性妨碍MCT1-CD147二者的结合有关；

(2)证明抑制YIPF2，增加CD147上膜量，可改善糖尿病脑病中少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的高易损性；

(3)证明Q5114941可通过抑制YIPF2改善糖尿病脑病造成的髓鞘损伤及认知障碍。

证明一：①临床实验：收集糖尿病患者100例。入组标准：⒈临床确诊为2型糖尿病；⒉年龄50-70岁；⒊患者本人或家属签署知情同意书。排除标准：⒈既往存在急性脑血管病病史；⒉既往存在严重中枢神经系统感染、癫痫、精神系统疾病等病史；⒊未受过教育的文盲；⒋严重神经功能缺损(NIHSS评分1a＞1；1b＞1；第9条＞2)；⒌严重的肢体运动障碍、听力障碍、视力障碍、阅读障碍或配合程度差无法完成神经心理测评者；⒍严重的系统性疾病(心血管、肺部、代谢、肿瘤等)。采集受试者空腹静脉血5ml，利用ELISA试剂盒检测人胰岛淀粉样多肽的血浆浓度。要求采集标本血样过程中无溶血。血液样本采集后储存于4℃冰箱中，并在采集后4h内进行分装处理。计算患者MRI的脑白质损伤面积。量表评估：包括①MMSE、②MOCA、③Rey听觉词语学习测验(RAVLT)④连线试验、⑤波士顿命名试验、⑥数字广度、⑦ADL量表检查，对各量表结果分别从记忆、执行能力、视空间功能、语言、注意力以及日常生活能力6个认知域进行分析。所有入组患者，均使用汉密尔顿抑郁量表(HAMD)进行测评，要求HAMD分值＜7分。明确人胰岛淀粉样多肽血浆浓度与白质损伤程度、认知功能之间的相关性；

②动物实验：利用不同月龄(2、4、6、8、10、12月)的糖尿病脑病转基因模型鼠与WT小鼠，进行脑片TTC染色，检测脑损伤部位及面积。通过测量脑干湿重探究脑水肿程度。明确与WT鼠相比，糖尿病脑病转基因模型鼠存在脑白质损伤；

③动物实验：利用不同月龄(2、4、6、8、10、12月)的糖尿病脑病转基因模型鼠与WT小鼠，通过Co-IP及冰冻切片免疫荧光PLA技术，检测脑白质中MCT1、MCT2及其相应辅助蛋白CD147、gp70的表达位置及结合量变化。明确与WT鼠相比，糖尿病脑病转基因模型鼠MCT1与CD147的结合减少；

④细胞实验：利用单独培养的少突胶质细胞及神经元，通过给予不同时长(0、3、6、9、12h)、不同浓度(0、0.1、1μM)的人胰岛淀粉样多肽干预，模拟糖尿病脑病状态。利用活细胞工作站，观察不同时长(1-12h)、不同浓度(0、0.1、1μM)的人胰岛淀粉样多肽干预下，少突胶质细胞及神经元细胞数量、细胞内外乳酸含量及胞内pH值的变化。明确人胰岛淀粉样多肽可特异性抑制MCT1的转运功能，对MCT2无影响；

⑤细胞实验：利用膜片钳技术，明确不同浓度(0、0.1、1μM)人胰岛淀粉样多肽对MCT1、MCT2转运功能的影响，为活细胞工作站的结果提供佐证；

⑥细胞实验：利用单独培养的少突胶质细胞及神经元，通过给予不同时长(0、3、6、9、12h)、不同浓度(0、0.1、1μM)的人胰岛淀粉样多肽干预，模拟糖尿病脑病状态。利用Co-IP技术检测MCT1、MCT2与各自辅助蛋白CD147、gp70的结合量变化。此外，利用膜蛋白提取试剂盒及免疫荧光技术，检测CD147、gp70于细胞膜上的表达量变化。明确少突胶质细胞高易损性的机制与人胰岛淀粉样多肽可特异性妨碍MCT1与CD147的结合有关。

证明二：

①细胞实验：利用单独培养的少突胶质细胞，通过Co-IP及蛋白组学差异分析，筛选1μM人胰岛淀粉样多肽干预状态下，与CD147存在强相互作用的靶分子(预实验中，已发现抑制YIPF2对糖尿病脑病细胞及动物模型的改善作用最为明显)；

②细胞实验：利用siRNA转染敲低少突胶质细胞的YIPF2，通过膜蛋白提取试剂盒及免疫荧光技术，探究抑制YIPF2表达后少突胶质细胞CD147细胞膜表达量的变化，明确抑制YIPF2可增加CD147的上膜量；

③细胞实验利用siRNA转染敲低少突胶质细胞的YIPF2，通过活细胞工作站技术，检测不同时长(0、3、6、9、12h)、不同浓度(0、0.1、1μM)的人胰岛淀粉样多肽干预对少突胶质细胞细胞数量、细胞内外乳酸含量及胞内pH值的影响。明确抑制YIPF2可改善少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的易损性；

④细胞实验：利用体外髓鞘模型，通过siRNA转染敲低YIPF2，借助免疫荧光技术，检测不同时长(0、3、6、9、12h)的1μM人胰岛淀粉样多肽干预对髓鞘覆盖率的影响。明确YIPF2可于细胞层面改善人胰岛淀粉样多肽造成的髓鞘损伤；

⑤动物实验：利用立体定位仪，对不同月龄(2、4、6、8、10、12月)小鼠侧脑室埋置留置针，给予7天的人胰岛淀粉样多肽干预(1μM人胰岛淀粉样多肽，5μl/天)。通过对比YIPF2-olig1cKO小鼠与WT小鼠的脑白质梗死面积、脑水肿程度变化，明确条件性敲除少突胶质细胞的YIPF2可于动物层面改善人胰岛淀粉样多肽造成的髓鞘损伤；

⑥动物实验：利用透射电镜观察侧脑室注射人胰岛淀粉样多肽7天后(1μM人胰岛淀粉样多肽，5μl/天)，YIPF2-olig1cKO小鼠与WT小鼠的脑白质损伤情况，明确YIPF2可作为改善糖尿病脑病髓鞘损伤的重要靶点。

⑦动物实验：利用立体定位仪，对不同月龄(2、4、6、8、10、12月)小鼠侧脑室埋置留置针，给予7天的人胰岛淀粉样多肽干预(1μM人胰岛淀粉样多肽，5μl/天)。通过新旧物体识别、Y迷宫对比YIPF2-olig1cKO小鼠与WT小鼠的认知功能。明确YIPF2可于动物层面改善人胰岛淀粉样多肽造成的认知障碍。

证明三：

①虚拟筛选：利用DiscoveryStudio2020软件，根据YIPF2的蛋白结构，虚拟筛选DrugBank数据库中的13490个分子，获得与YIPF2相互作用的候选分子，并对其进行功能验证。我们采用TR-FRET法检测各候选分子的IC50，将对YIPF2具有抑制作用的候选分子进一步进行细胞和动物实验验证，最终筛选出Q5114941这个对YIPF2具有显著抑制作用的分子(IC50＝380nM)。

②细胞实验：利用WesternBlot技术，探究人胰岛淀粉样多肽干预下，不同时长(0、3、6、9、12h)、不同浓度(0、0.01、0.1、1μM)的Q5114941对少突胶质细胞CD147上膜量及MCT1-CD147二者结合量的影响，明确Q5114941对YIPF2的功能抑制作用；

③细胞实验：利用活细胞工作站技术，探究人胰岛淀粉样多肽干预下，不同时长(0、3、6、9、12h)、不同浓度(0、0.01、0.1、1μM)的Q5114941对少突胶质细胞细胞数量、细胞内外乳酸含量及胞内pH值的影响。明确Q5114941可改善少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的高易损性；

④细胞实验：利用体外髓鞘模型，通过免疫荧光技术，探究人胰岛淀粉样多肽干预下，不同时长(0、3、6、9、12h)、不同浓度(0、0.01、0.1、1μM)的Q5114941对髓鞘覆盖率的影响。明确Q5114941可于细胞层面改善人胰岛淀粉样多肽造成的髓鞘损伤；

⑤动物实验：利用立体定位仪，对不同月龄(2、4、6、8、10、12月)小鼠侧脑室埋置留置针，注射Q5114941(1μM，5μl/天)。7天后对比糖尿病脑病转基因模型鼠与WT鼠的脑白质梗死面积、脑水肿程度变化，明确Q5114941可于动物层面改善人胰岛淀粉样多肽造成的髓鞘损伤；

⑥动物实验：利用透射电镜观察侧脑室注射Q5114941(1μM，5μl/天)7天后，糖尿病脑病转基因模型鼠与WT小鼠的脑白质损伤情况，明确Q5114941可作为改善糖尿病脑病的候选药物；

⑦动物实验：通过新旧物体识别、Y迷宫，明确侧脑室注射Q5114941(1μM，5μl/天)7天后，可改善糖尿病脑病转基因模型鼠的认知障碍。

实验结论：下述hAmylin为人胰岛淀粉样多肽，OLs为少突胶质细胞，MCTs为单羧酸转运体，DE为糖尿病脑病。

结论一：糖尿病患者血浆中的hAmylin浓度，与其白质损伤面积呈正相关，与认知评分呈负相关(图1)。

结论二：hAmylin刺激下，OLs的MCT1转运功能受到抑制，无法向胞外输出乳酸(图2中B)，造成胞内乳酸堆积(图2中C)，导致细胞酸中毒(图2中A)；而神经元的MCT2在hAmylin刺激下，仍能向胞外输出乳酸(图2中E)，维持自身pH值稳态(图2中D，F)。图3中G是对上述数据的3D拟合展示，三个轴分别为：(hAmylin给药浓度、干预时间、胞内pH值或乳酸含量)。可更加直观地反应hAmylin对不同亚型MCTs功能的差异性影响。hAmylin干预会特异性妨碍MCT1与CD147的结合(图3中I)，造成CD147于细胞膜上的表达量降低(图3中H)；而对MCT2与gp70的结合无影响(图3中J，K)。

结论三：利用Co-IP技术，我们发现hAmylin干预后，一个分子量在37kDa左右的蛋白与CD147结合明显增加(图4中A)。采用LC-MS/MS方法，通过蛋白质组学差异分析，我们筛选出了与CD147存在互作的靶点蛋白YIPF2(图4中B，C)。Co-IP进一步证明，YIPF2可与CD147结合，而不与gp70结合(图5中D)。新近报道指出：YIPF2可调控膜蛋白的上膜量。在此，我们利用siRNA转染技术，敲低YIPF2后(图5中E)发现，hAmylin长时间干预下，OLs的细胞存活数量明显增加(图5中F)。

结论四：利用细胞免疫荧光技术(绿色荧光为神经纤维标记，红色荧光为髓鞘标记。将二者重叠后，有髓纤维用白色表示，无髓纤维用灰色表示，以计算髓鞘覆盖率)。我们发现敲低YIPF2可明显减轻hAmylin于细胞模型上造成的髓鞘损伤(图6中A，图7中B)，利用新旧物体识别实验(F：Familiar，旧物体；N：Novel，新物体。方块颜色指代小鼠在该区域内停留时间长短)，我们发现侧脑室给予hAmylin后可造成WT小鼠、YIPF2-olig1cKO小鼠的认知水平下降(图7中C，D)。与WT小鼠相比，YIPF2-olig1cKO小鼠认知水平下降较低。提示敲除YIPF2可改善动物模型的认知障碍。

结论五：根据YIPF2的蛋白构象，利用DiscoveryStudio2020对与YIPF2存在对接可能的小分子进行虚拟筛选，并发现Q5114941这个对YIPF2具有潜在功能抑制作，用的小分子(前期我们筛选了13490种分子，篇幅原因在此只展示Q5114941所在组的3000个分子的评分，以颜色指代评分高低。TR-FRET法检测该分子IC50＝380nM)(图8中A，B，C)。预实验中，我们发现Q5114941在细胞实验中，可明显改善hAmylin的细胞毒性作用，减轻细胞模型的髓鞘损伤(图9中D，E)。在动物实验中，侧脑室给予Q5114941可明显改善DE转基因模型鼠的白质损伤(图9中F，G)。

上文中参照优选的实施例详细描述了本公开所提出的方案的示范性实施方式，然而本领域技术人员可理解的是，在不背离本公开理念的前提下，可以对上述具体实施例做出多种变型和改型，且可以对本公开提出的各种技术特征、结构进行多种组合，而不超出本公开的保护范围，本公开的保护范围由所附的权利要求确定。

Claims (9)

1.一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点，其特征在于，所述靶点为YIPF2，所述YIPF2潜在的抑制分子为Q5114941。

2.根据权利要求1所述的一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点，其特征在于，所述YIPF2与辅助蛋白CD147相结合，且不与辅助蛋白gp70相结合。

3.根据权利要求2所述的一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点，其特征在于，所述辅助蛋白CD147与MCT1相结合，所述辅助蛋白gp70与MCT2相结合。

4.根据权利要求3所述的一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点，其特征在于，所述MCT1为少突胶质细胞的表达，所述MCT2为神经元的表达，所述MCT1、MCT2为单羧酸转运体中的一种，所述单羧酸转运体用于维持细胞内pH值稳态。

5.根据权利要求4所述的一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点，其特征在于，所述少突胶质细胞的MCT1在人胰岛淀粉样多肽的刺激下其转运功能受到抑制，所述神经元的MCT2在人胰岛淀粉样多肽的刺激下仍能向胞外输出乳酸用于维持自身pH值稳态。

6.根据权利要求5所述的一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点，其特征在于，所述人胰岛淀粉样多肽在糖尿病患者血浆中的浓度，与其白质损伤面积呈正相关，与认知评分呈负相关。

7.根据权利要求5所述的一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点，其特征在于，所述少突胶质细胞损伤造成髓鞘损伤，所述人胰岛淀粉样多肽用于降低血糖。

8.根据权利要求5所述的一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的靶点，其特征在于，所述抑制分子Q5114941通过增加辅助蛋白CD147上膜量用于改善少突胶质细胞对人胰岛淀粉样多肽的高易损性。

9.一种减轻糖尿病脑病的髓鞘损伤的应用，其特征在于，包括权利要求1-8任一所述的靶点应用于改善糖尿病脑病的髓鞘损伤及认知障碍。

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