CN114657181A

CN114657181A - 一种靶向H1.4的sgRNA以及H1.4基因编辑方法

Info

Publication number: CN114657181A
Application number: CN202210346984.3A
Authority: CN
Inventors: 李勇; 陈荣; 陈倩; 张洁; 段新月; 石凡
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2022-04-01
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2042-04-01
Also published as: CN114657181B

Abstract

本发明涉及一种靶向组蛋白H1.4的sgRNA(single guide RNA，sgRNA)以及针对H1.4基因的编辑方法。所述靶向H1.4的sgRNA和H1.4基因编辑方法包括向肺癌细胞中导入抑制组蛋白H1.4表达的CRISPR/Cas9重组质粒，敲除肺癌细胞H1.4基因、调控肺癌细胞上皮‑间充质转化(EMT)进程，从而控制肺癌细胞的迁移和侵袭能力。本发明通过设计合成靶向H1.4的sgRNA以及CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除肺癌细胞组蛋白H1.4基因，促进肺癌细胞EMT进程，最终实现增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力。由此可见，本发明可为阐明肺癌的发生发展提供一个新的理论依据，特别是为制备治疗肺癌的靶向药物提供一个新的靶点。

Description

一种靶向H1.4的sgRNA以及H1.4基因编辑方法

技术领域

本发明属于分子生物学和肿瘤生物学领域，涉及癌症的免疫治疗，具体涉及一种靶向H1.4的sgRNA以及H1.4基因编辑方法。

背景技术

在中国，肺癌是最常被诊断出的癌症。由于其攻击性行为和缺乏有效的早期筛查方法，大多数肺癌患者在诊断时处于中晚期。化疗是中晚期肺癌的基本治疗手段，但是肺癌发展进程较快，疗效不尽如人意，预后不佳等原因导致肺癌的致死率仍处于癌症致死率的第一位。这表明肺癌在生物医学界的研究仍是重中之重。

近年来，越来越多的研究偏向于通过对肺癌的发病机制和发展过程进行研究，并基于此寻找在其发生发展过程中的关键因子，从而为肺癌的诊断和治疗探寻可能的方法和途径。为此，深入研究及阐明NSCLC(非小细胞肺癌)是如何发生和怎样发展，为其早期的诊断和治疗提供有效的思路具有尤其重要的意义。

H1.4是接头组蛋白H1的十一种变体之一，编码基因长度为787bp，编码蛋白大小为34Kd，由219个氨基酸构成，结构特点为高度保守的球状结构域和较少保守的N-和C-末端尾巴。H1.4主要在体细胞中调控细胞周期，自身具有丰富的甲基化位点以及磷酸化位点。H1.4对肺癌的影响是有争议的，并且从很大程度上来说是未知的。随着表观基因组分析技术的进步，已经证明异常组蛋白修饰特别是乙酰化在EMT和癌症转移中起重要作用。目前关于H1.4的研究相对较少，我们推测，H1.4可能参与EMT过程，但其机制尚不清楚。

上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，是指上皮细胞改变细胞表型，失去细胞极性以及与基底膜之间的连接，从而转化为具有间充质表型的细胞，是恶性肿瘤发生侵袭和转移的基本发育过程。EMT主要表现为钙黏附蛋白E-cadherin被能够提供更大黏附连接力的N-cadherin蛋白所取代，波形蛋白Vimentin表达量的上调等。

CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的DNA里一个称为CRISPR的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。CRISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因(CRISPR关联基因)两部分。CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short PalindromicRepeats(成簇的规律性间隔的短回文重复序列)。分布在40％的已测序细菌和90％的已测序古细菌当中。Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因(CRISPRassociated，Cas)。CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的sgRNA(single guideRNA)来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。

但是，目前并没有良好的能够促进人肺癌细胞EMT进程、增强人肺癌细胞迁移和侵袭能力的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种靶向H1.4的sgRNA以及H1.4基因编辑方法，其操作简单、敲除效率高、促进A549肺癌细胞EMT进程的效果确切，具有广泛的临床应用前景。

第一方面，本发明提供一种靶向1.4的gRNA，其特征在于，所述sgRNA基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，能够靶向H1.4外显子，并能够与Cas9蛋白共同敲除H1.4基因。

优选地，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:1所示，即

5’-ACGCGCCGGUGCCCUUGGUC-3’。

优选地，所述sgRNA的双链DNA模板序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，即5’-caccgGACCAAGGGCACCGGCGCGT-3’或5’-aaacACGCGCCGGTGCCCTTGGTCC-3’。

第二方面，本发明提供一种组合物，其特征在于，包括上述的靶向H1.4的sgRNA和Cas9蛋白，所述组合物用于敲除肺癌细胞H1.4基因、调控肺癌细胞EMT进程，从而调控肺腺癌细胞的迁移和侵袭。

优选地，所述Cas9蛋白是通过px459-hU6-H1.4-sgRNA基因敲除质粒重组表达的。

第三方面，本发明提供一种上述靶向H1.4的sgRNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、gRNA的设计与合成；

(2)、gRNA装载质粒的构建。

优选地，所述步骤(1)具体为：

(1.1)、找出H1.4基因的外显子序列；

(1.2)、找出外显子中的sgRNA序列，并根据sgRNA序列得分排序选择得分最高、脱靶率最低的sgRNA序列；

(1.3)、对所选择的sgRNA序列及互补链进行BbsI酶切位点粘性末端设计后进行合成。

优选地，所述步骤(2)具体为：将编码链及互补链退火形成的双链DNA插入px459载体中置于hU6启动子控制下，构建获得px459-hU6-H1.4-sgRNA基因敲除质粒。

第四方面，本发明提供一种敲除肺癌细胞H1.4基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、制备上述的靶向H1.4的sgRNA；

(2)、构建获得px459-hU6-H1.4-sgRNA基因敲除质粒；

(3)、体外培养和扩增人肺癌细胞A549；

(4)、将步骤(2)的px459-hU6-H1.4-sgRNA基因敲除质粒通过瞬时转染方式导入步骤(3)的人肺腺癌细胞A549中。

本发明通过合成一种靶向H1.4的sgRNA，通过px459重组质粒转染进A549肺癌细胞后成功敲除了H1.4基因，促进了肺癌细胞的EMT过程以及迁移和侵袭能力，为阐明肺癌的发生发展提供了一个新的理论依据，特别是为制备治疗肺癌的靶向药物提供了一个新的靶点。

附图说明

图1：px459质粒图谱。

图2：px459-hU6-H1.4-sgRNA经XbaI和PvuI双酶切结果：泳道由左到右的顺序依次

泳道1为未经酶切的px459-hU6-H1.4-sgRNA质粒，大小为9195bp；

泳道2为经XbaI和PvuI双酶切的px459-hU6-H1.4-sgRNA质粒，酶切片段大小为7510bp和1685bp；

泳道3为DNA Marker。

图3：px459-hU6-H1.4-sgRNA质粒测序比对结果。

图4：Western blot检测H1.4基因敲除效率：

泳道1、3、4为未敲除H1.4基因的A549肺癌细胞；

泳道6为通过H1.4-sgRNA敲除H1.4基因的A549肺癌细胞。

图5：Western blot检测通过敲除H1.4基因后对肺癌细胞EMT标志蛋白E-cadherin/N-cadherin/Vimentin的表达调控。

图6：Transwell实验检测敲除H1.4基因后对肺癌细胞迁移和侵袭能力的调控。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，实施例的内容不作为对本发明的保护范围的限制。

实施例1 sgRNA的设计与CRISPR/Cas9重组表达载体的合成

1、Single Guide RNA的设计

(1)、在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找出H1.4基因的外显子序列，用sgRNA设计网站(http://chopchop.cbu.uib.no/)找出外显子中的sgRNA序列，并根据sgRNA序列得分排序选择得分最高、脱靶率最低的sgRNA序列。最终选择的sgRNA序列及其互补链序列如下：

H1.4 sgRNA：

F:5′-caccgGACCAAGGGCACCGGCGCGT-3′(SEQ ID NO:2)，

R:5′-aaacACGCGCCGGTGCCCTTGGTCC-3′(SEQ ID NO:3)。

(2)、对sgRNA序列及互补链进行BbsI酶切位点粘性末端设计后送去通用生物公司合成。

2、px459-hU6-H1.4-sgRNA基因敲除质粒的构建

(1)、用BbsI内切酶和Fast AP(热敏性碱性磷酸酶)在37℃的条件下对px459质粒进行1h的酶切和去磷酸化。

(2)、对px459质粒酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收纯化。

(3)、将按上述序列合成sgRNA编码链及互补链用水稀释到l00uL，各取5uL混和，再加入T4多聚核苷酸激酶，37℃水浴锅放置30min后，再放置于95℃水浴锅变性5分钟后，关闭水浴锅，等待其自然冷却至室温，此步骤为磷酸化及退火。

(4)、将BbsI酶切后的px459质粒和稀释后的磷酸化及退火后的sgRNA进行连接。

(5)、取连接产物转入大肠杆菌DH5α涂布于LB培养基平板，抗生素为氨苄青霉素，37℃培养14小时后挑取阳性克隆摇菌，提取质粒。

(6)、用XbaI和PvuI内切酶对提取的质粒进行双酶切鉴定，37℃下酶切1～4小时后，经1％琼脂糖凝胶检验是否构建成功(双酶切结果见附图2)。

(7)、提取的质粒送往通用生物公司进行测序(测序结果见附图3)。

图2显示的双酶切结果为泳道2中的px459-hU6-H1.4-sgRNA成功被XbaI和PvuI内切酶切开，片段大小分别为7150bp和1685bp，与图1中px459质粒图谱相符合。

图3显示的px459-hU6-H1.4-sgRNA质粒测序比对结果为，H1.4-sgRNA成功插入到px459质粒中。

以上结果说明px459-hU6-H1.4-sgRNA基因敲除质粒构建成功。

实施例2 px459-hU6-H1.4-sgRNA质粒对肺癌细胞进行转染以及阳性细胞株的筛选

1、瞬时转染

(1)、将肺癌细胞以每孔细胞数为3×105个细胞种于六孔板中培养，使12h后，肺癌细胞密度能达到约70％。

(2)、第二天转染前将六孔板中的完全培养基换成含有血清但不含抗生素的新鲜培养基。

(3)、以每孔为例，将200uL无血清DMEM吸于管中，将3ug px459-hU6-H1.4-sgRNA打入其中，振荡混匀，静置5min，标记为管A。以每孔为例，将200uL无血清DMEM先逐个吸于管中，再加入10uL转染试剂Exfect2000，静置5min，标记为管B。将管A加入管B中混合，上下颠倒混匀，室温静置20min，用枪头转圈均匀滴加混合液进入六孔板中每个孔中，摇匀放入细胞培养箱中培养。

(4)、6h后贴六孔板的板壁缓慢地将培养基换成完全培养基。

(5)、48h后加入2uL浓度为2mg/mL的puromycin进行稳定表达细胞株的筛选。

2、阳性细胞株的筛选

(1)、在转染过程中需设置空细胞作为对照组，转染48h后，加入终浓度2ug/mL的puromycin抗生素，每三天换一液，对照细胞完全死亡后，换成不含puromycin的培养基维持培养。

(2)、等细胞长到一定数量时，将细胞悬液稀释，按照不同的浓度梯度转移至10cm皿扩大培养，等待培养皿中长出单克隆细胞集落。

(3)、用胰酶对单克隆细胞进行消化，然后用枪头将细胞吸出，转移至六孔板中，每个孔放一份单克隆细胞集落。

(4)、将单克隆细胞扩大培养，准备进行下一步分析。

实施例3 Western blot实验鉴定H1.4基因敲除效果

1、将多个筛选成功并且扩大培养的单克隆细胞接种于六孔板中，待细胞密度达到90％左右，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，统一上样量。

2、取40ug蛋白进行SDS-PAGE电泳，并点上5uL左右的蛋白预染Marker做参照，先恒压80V电泳至出现Marker条带，再将电压调至100V直至电泳结束。

3、电泳结束后取出SDS-PAGE凝胶，按棉垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸和棉垫的顺序依次组合好，放入电泳槽后开始转膜，电流为300mA。

4、转膜结束后用5％的脱脂牛奶对PVDF膜进行1～3小时的封闭。

5、封闭结束后将膜放置于抗体孵育袋中，加入1：1000稀释的H1.4抗体，4℃过夜孵育。

6、用PBS在摇床上洗膜三次，每次10min，结束后将莫放置于新的抗体孵育袋中，加入1：10000稀释的二抗，室温摇床孵育1小时。

7、孵育结束后，PBS洗膜三次，方法同步骤6。

8、按试剂盒说明书配置ECL底物发光液，曝光机进行曝光(曝光结果见附图4)。

图4显示的H1.4基因敲除效果结果为，泳道6中的A549肺癌细胞未表达H1.4蛋白，说明该A549肺癌细胞株被成功敲除了H1.4基因。

实施例4 基因编辑载体转录后对肺癌细胞EMT调控效果的检测

1、Western blot检测敲除H1.4基因后EMT标志蛋白E-cadherin表达量的变化

(1)、将多个筛选成功并且扩大培养的单克隆细胞接种于六孔板中，待细胞密度达到90％左右，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，统一上样量。

(2)、取40ug蛋白进行SDS-PAGE电泳，并点上5uL左右的蛋白预染Marker做参照，先恒压80V电泳至出现Marker条带，再将电压调至100V直至电泳结束。

(3)、电泳结束后取出SDS-PAGE凝胶，按棉垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸和棉垫的顺序依次组合好，放入电泳槽后开始转膜，电流为300mA。

(4)、转膜结束后用5％的脱脂牛奶对PVDF膜进行1～3小时的封闭。

(5)、封闭结束后将膜放置于抗体孵育袋中，加入1：1000稀释的E-cadherin/N-cadherin/Vimentin抗体，4℃过夜孵育。

(6)、用PBS在摇床上洗膜三次，每次10min，结束后将莫放置于新的抗体孵育袋中，加入1：10000稀释的二抗，室温摇床孵育1小时。

(7)、孵育结束后，PBS洗膜三次，方法同步骤(6)。

(8)、按试剂盒说明书配置ECL底物发光液，曝光机进行曝光(曝光结果见附图5)。

2、Western blot检测敲除H1.4基因后EMT标志蛋白N-cadherin/Vimentin表达量的变化

步骤同该实施例中“Western blot检测敲除H1.4基因后EMT标志蛋白E-cadherin表达量的变化”的步骤，曝光结果见附图5。

图5显示的检测敲除H1.4基因后A549肺癌细胞中EMT标志蛋白表达量结果为：敲除H1.4基因后，E-cadherin表达量降低，N-cadherin和Vimentin表达量升高，说明敲除H1.4基因促进了肺癌细胞的EMT进程。

实施例5 Transwell实验检测基因编辑载体转录后对肺癌细胞迁移和侵袭能力的调控

(1)、待细胞生长状态良好的时候进行传代，并在24孔板中加入600ul Collagen，将小室放入24孔板中，置于4℃过夜。

(2)、第二天将细胞取出，去旧培养基，并用PBS冲洗两次，加入含有10mM EDTA的PBS消化细胞，10min。

(3)、加入适量培养液收集细胞，1000rpm离心3min，吸出上清，加入无血清培养基洗两次，以洗去残留EDTA。

(4)、用无血清培养液悬浮细胞，并细胞计数：血球计数板上悬空滴加12ul细胞悬浮液，显微镜下计数，细胞个数＝4X16格细胞数/4X104(cells/ml)。

(5)、取适量细胞悬液，加入无血清RPMI培养基中，使细胞密度为5×10 5个细胞/ml。

(6)、将600ul完全培养基(含有10％FBS RPMI)加入到24孔transwell的下室中。

(7)、用完全培养基洗涤Collagen包被的小室一次，将小室放入24孔板中。

(8)、取100ul细胞悬液加入小室中。

(9)、37℃孵育6h。

(10)、用灭菌湿棉签吸净小室中的多余培养液，再加入5％戊二醛溶液固定细胞10min。

(11)、用配制好的结晶紫染色，室温30min。

(12)、显微镜下观察并拍照(结果见附图6)。

图6显示的Transwell实验检测敲除H1.4基因后对肺癌细胞迁移和侵袭能力调控的结果为，敲除H1.4基因后，A549肺癌细胞的细胞迁移数量有所增加，说明敲除H1.4增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力。

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 安徽大学

<120> 一种靶向组蛋白H1.4的sgRNA以及H1.4基因编辑方法

<130> 1

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgcgccggu gcccuugguc 20

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> 人(Human)

<400> 2

gaccaagggc accggcgcgu 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccggacca agggcaccgg cgcgt 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacacgcgc cggtgccctt ggtcc 25

<210> 5

<211> 787

<212> DNA

<213> 人(Human)

<400> 5

cgagtcccgg ccagtgcctc tgcttccggc tcgaattgct ctcgctcacg cttgccttca 60

acatgtccga gactgcgcct gccgcgcccg ctgctccggc ccctgccgag aagactcccg 120

tgaagaagaa ggcccgcaag tctgcaggtg cggccaagcg caaagcgtct gggcccccgg 180

tgtccgagct cattactaaa gctgttgccg cctccaagga gcgcagcggc gtatctttgg 240

ccgctctcaa gaaagcgctg gcagccgctg gctatgacgt ggagaagaac aacagccgca 300

tcaagctggg tctcaagagc ctggtgagca agggcaccct ggtgcagacc aagggcaccg 360

gcgcgtcggg ttccttcaaa ctcaacaaga aggcggcctc tggggaagcc aagcctaagg 420

ctaaaaaggc aggcgcggcc aaggccaaga agccagcagg agcggcgaag aagcccaaga 480

aggcgacggg ggcggccacc cccaagaaga gcgccaagaa gaccccaaag aaggcgaaga 540

agccggctgc agctgctgga gccaaaaaag cgaaaagccc gaaaaaggcg aaagcagcca 600

agccaaaaaa ggcgcccaag agcccagcga aggccaaagc agttaaaccc aaggcggcta 660

aaccaaagac cgccaagccc aaggcagcca agccaaagaa ggcggcagcc aagaaaaagt 720

agaaagttcc tttggccaac tgcttagaag cccaacacaa cccaaaggct cttttcagag 780

ccaccca 787

Claims

1.一种靶向1.4的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，能够靶向H1.4外显子，并能够与Cas9蛋白共同敲除H1.4基因。

2.如权利要求1所述的靶向H1.4的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:1所示，即

5’-ACGCGCCGGUGCCCUUGGUC-3’。

3.如权利要求2所述的靶向H1.4的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的双链DNA模板序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，即

5’-caccgGACCAAGGGCACCGGCGCGT-3’或

5’-aaacACGCGCCGGTGCCCTTGGTCC-3’。

4.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的靶向H1.4的sgRNA和Cas9蛋白，所述组合物用于敲除肺癌细胞H1.4基因、调控肺癌细胞EMT进程，从而调控肺腺癌细胞的迁移和侵袭。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述Cas9蛋白是通过px459-hU6-H1.4-sgRNA基因敲除质粒重组表达的。

6.一种如权利要求1-3中任一项所述的靶向H1.4的sgRNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、sgRNA的设计与合成；

(2)、sgRNA装载质粒的构建。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：

(1.1)、找出H1.4基因的外显子序列；

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：将编码链及互补链退火形成的双链DNA插入px459载体中置于hU6启动子控制下，构建获得px459-hU6-H1.4-sgRNA基因敲除质粒。

9.一种敲除肺癌细胞H1.4基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、制备如权利要求1所述的靶向H1.4的sgRNA；

(2)、构建获得px459-hU6-H1.4-sgRNA基因敲除质粒；

(3)、体外培养和扩增人肺癌细胞A549；