CN114602368B - 液滴生成装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型液滴生成装置及液滴生成方法。通过简单的腔体和孔结构可实现稳定的两种互不相溶液体的共流喷射，同时通过对共流内层液体流动进行高频振动调制使得内层液体喷射可以稳定的破裂为均匀的微滴，整个生成过程无需微米量级的微流道结构，且可以通过控制振动频率和推动液体流动的速率来调整微滴的生成体积和生成速率，而且通量高。同时，本发明装置产业上易于制造，本发明方法产业上容易实施。

Description

液滴生成装置及方法
技术领域
本发明涉及特别适于数字PCR、单细胞捕获、液滴分选以及药物传输等领域的液滴生成装置和方法。
背景技术
PCR, 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction , PCR) 是一种可在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的技术。这项技术是根据生物体内DNA 序列能进行快速复制的某些特点, 实现在体外对特定DNA 序列进行快速扩增, 可在短时间内获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术发展至今已经经历了３代的沿革。第一代PCR采用普通PCR仪来对靶基因进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析；第二代PCR是通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，借助荧光曲线的Ct值来定量起始靶基因的浓度的荧光定量PCR技术（Real-Time PCR，qPCR）；第三代PCR技术-数字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法，它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。数字PCR技术的策略可以称作“分而治之”： 样品被稀释并分割至成千上万的微反应室中，这样每个反应室中只包含零或一个靶基因序列（少数反应室中含有多个）。通过计数阳性结果的反应室个数，研究者可以知道在原样品中待检靶基因分子的绝对数目。由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。与传统的PCR技术相比，数字PCR具有采取样品量少、节省反应试剂、可实现核酸分子绝对定量、减少同一样品中拷贝间相互干扰、更加出色的灵敏度和特异性等优点。
目前，市场上的数字PCR产品主要有两类：微流控芯片式数字PCR和微滴式数字PCR。微流控芯片式数字PCR技术原理是基于微流体装置可以使数字PCR能在一次PCR反应中执行高度平行分析。多层软刻蚀( multilayer soft lithography，MSL)技术赋予了设计集成微流体路和控制生产微流体芯片的成本效益的能力。原则上，任何在反应管中能够进行的分子反应，都能够在微流体芯片中实现。在一个MSL芯片上能够执行成千上万个独立的PCR反应，减少了试剂消耗和移液器的必要步骤，利用微流体控制阀可将单个样本分解到大量单独的微坑（microwell）中，并以自动化的方式来执行数字PCR。在微流体芯片中，一个阳性的反应至少包含一个目标分子，非常稀的样本中阳性数与目标数非常相似。在浓度较高的样本中，阳性反应含有不止一个目标分子的情况下，即使很大比例的反应是阳性，也可以通过基于泊松分布的算法计算。微滴式数字PCR技术的基本工作原理是：以某种方式产生水相微滴混合样品，并操纵其在惰性油相载体溶液中沿着微通道运动；微滴间互不干扰，每个微滴是一个独立的PCR微反应器；微滴通常在体积上远远小于微量滴定板（在第一、二代PCR技术中广泛采用，如96孔板）上的孔，甚至可以小到进行单细胞分析。其数据分析方法与芯片式数字PCR类似。因为有许多产生和操纵微滴的技术，这给微滴式PCR技术带来了高度灵活性，研究者甚至可以为每个微滴设计个性化的实验流程。
基于微流控（Microfluidics）的液滴生成技术，在最近几年得到快速发展，液滴的生成是基于分散相在连续相相在微通道中交汇时的界面失稳。通过不同的微流控通道芯片设计，能够生成体积微小的液滴，并进行融合、反应和分选等操作；但是芯片上的液滴的生成需要满足特定的流速、油水界面张力、以及通道构型和通道表面修饰的条件，液滴的体积调节的范围也受到以上因素的制约。另外，液滴在通道内生成后，需要特定的步骤和装置转移到储存容器中，难以对单个液滴的条件进行定制，液滴的定位、提取和分析操作较为不方便。另外一种技术通过毛细管或微通道注射或喷射微量液体，并将液体注入微坑或点样在基片。这种技术在原理上是一种简便的液滴生成策略。然而，实际操作时，液滴在脱离毛细管时，存在液滴与管内连续液体分离的表面张力，以及液滴与管口表面的附着力，使液滴的体积定量受到影响。通常采用压电陶瓷、受热膨胀、超声等特殊的喷射或液滴激发方式增加液滴脱离出口的动能以克服表面张力的影响，通过微通道出口的特殊构型以及硅烷化或涂层处理降低液滴在管口的附着力。然而这些方式依赖于较为复杂的流体驱动装置，成本较高，对液滴体积的精确调控比较困难。此外，还可以采用将管道出口直接对准基片或微坑内点样的方法，利用液滴与基片接触的附着力和界面张力来克服液滴在管口的附着力。然而，对于成分复杂，粘度特性不一的生化样品，尚缺乏一种普遍适用的方法可以完全克服液体在微通道口附着的表面张力，避免液滴在通道口的残留及由此带来的体积误差、管口堵塞以及交叉污染。
综上所述，目前数字PCR产品所采用的微反应室生成技术（无论是微流控数字PCR还是微滴式数字PCR）都需要对微流或者微滴进行复杂精密的流速控制，并需要设计复杂的微流通道来实现对实验的操作。因而造成了数字PCR产品的耗材与qPCR的96孔板不兼容，价格昂贵。市场上存在需要基于更简单的微滴生成和控制技术的数字PCR产品。
又已知，随着对细胞生理研究的逐渐深入，科学家们开始从单细胞、单分子水平上对生命现象进行分析。对于多细胞生物来讲细胞和细胞之间是有差异的，即遗传信息的异质性。例如在肿瘤组织中，肿块中心细胞、肿块周围的细胞其基因组和转录组等遗传信息是存在差异的，这种差异在临床上可决定该肿瘤对某种疗法是否有效。目前实现单细胞测序的技术主要包括显微操作技术；激光捕获显微切割技术；激光诱导荧光检测流式细胞分选；以及微流控流式分选等，其中微流控流式分选被认为是相比较而言较为理想的单细胞分离分析手段。但是，如数字PCR液滴生成面临的问题类似，用于单细胞捕获的微流控芯片同样存在着设计、加工及操作复杂，成本高昂，且需要考虑许多因素（如特定的流速、油水界面张力以及通道构型和通道表面修饰等，生成液滴体积受各种流体力学和通道结构的影响），无法精确定量，调节的范围也受到以上因素的制约，液滴生成后尚需依赖转移装置进行进一步转移操作的步骤等不足。
发明内容
针对数字PCR液滴生成、单细胞液滴制备等的存在的现有问题，本发明提供一种新型液滴生成装置及液滴生成方法。
为解决以上问题，本发明一方面，提供一种特别适用于但不限于制备数字PCR液滴、单细胞液滴的液滴生成方法，通过混合第一液体和与所述第一液体不混溶的第二液体以形成液滴，该方法包括以下步骤：
向具有液滴输出口的第一腔体内持续输入第一液体；
经至少部分插入在所述第一腔体内并具有液体进出口的第二腔体，朝向所述液滴输出口输出第二液体，其中采用第一液体来驱动所述第二液体流动且对用于驱动所述第二液体的第一液体施加振动；
所述输出的第二液体被所述第一腔体内的第一液体包裹且二者共同喷射出所述液滴输出口，获得所述液滴，其中所述第一液体构成连续相，所述第二液体构成分散相。
进一步地，通过调整振动装置的振动频率和/或振动幅度、不同液体流动的相对速率、液体的粘滞性等中的一个或多个方式来调节第二液体从液滴输出口射出所形成射流的长度和粗细，而相应在所期望的位置按照所期望的速率获得具有期望体积和期望组成的液滴。
本发明另一方面提供一种液滴生成装置，该液滴生成装置包括用于输出振动的振动装置、用于液滴生成的第一室，所述第一室包括具有第一腔体的第一室本体，其特征在于，所述第一室本体上开设有分别与所述第一腔体连通的第一液体进口和液滴输出口，所述的液滴生成装置还包括第二室、第三室，所述第二室包括具有第二腔体的第二室本体，所述第三室包括具有第三腔体的第三室本体，所述第二室本体连接在所述第一室本体与第三室本体之间，且第二室本体具有分别与所述第一室的第一腔体、第三室的第三腔体连通的液体进出口，所述液体进出口用于第二液体的进出，所述第三室本体上设有用于通入第一液体的第一液体进口、与所述第二室本体连通的液体进出口、用于接入振动装置输出的振动的振动接入部。
本发明第三方面提供一种液滴生成装置，该液滴生成装置包括用于液滴生成的第一室，第一室包括具有第一腔体的第一室本体，所述第一室本体上开设有分别与第一腔体连通的第一液体进口和液滴输出口，与前述的液滴生成装置不同的是，该液滴生成装置包括多个振动进液单元。进一步地，各所述振动进液单元分别包括振动装置、第二室、第三室，所述第二室包括具有第二腔体的第二室本体，所述第三室包括具有第三腔体的第三室本体，所述第二室本体具有分别与对应的第三室的第三腔体、所述第一室的第一腔体连通的液体进出口，各所述的第三室本体上设有用于通入第一液体的第一液体进口、与所述第二室的第二腔体连通的液体进出口、用于接入振动装置输出的振动的振动接入部，所述多个振动进液单元的第二室本体的至少部分同心设置，且位于最外周的第二室本体连接在其所对应的第三室本体与第一室本体之间。
本发明第四方面提供一种液滴生成装置，其包括用于液滴生成的第一室，所述第一室包括具有第一腔体的第一室本体，多个振动进液单元，各所述振动进液单元分别包括振动装置、第二室、第三室，所述第二室包括具有第二腔体的第二室本体，所述第三室包括具有第三腔体的第三室本体，所述第二室本体具有分别与对应的第三室的第三腔体、所述第一室的第一腔体连通的液体进出口，各所述的第三室本体上设有用于通入第一液体的第一液体进口、与所述第二室的第二腔体连通的液体进出口、用于接入振动装置输出的振动的振动接入部，所述多个振动进液单元的第二室本体的至少部分并排设置，且均位于所述第一室的第一腔体内。
本发明第五方面提供一种数字PCR液滴生成系统及生成方法，其采用上述的液滴生成装置及液滴生成方法。
本发明第六方面提供一种单细胞液滴捕获系统及捕获方法，其采用上述的液滴生成装置及液滴生成方法。
本发明的液滴生成装置及方法不限于数字PCR液滴制备、单细胞液滴制备等，还适用于液滴分选、药物传输等生物医学领域液滴的制备。
本发明提供的技术方案带来的有益效果如下：
本发明通过简单的腔体和孔结构可实现稳定的两种互不相溶液体的共流喷射，同时通过对共流内层液体流动进行高频振动调制使得内层液体喷射可以稳定的破裂为均匀的微滴。整个生成过程无需微米量级的微流道结构，通量高，且可以通过控制振动频率、振动幅度、不同液体流动的相对速率、液体的粘滞性来调整微滴的生成位置、生成体积、生成速率以及控制液滴的组成。同时，本发明装置产业上易于制造，本发明方法产业上容易实施。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供的微滴生成装置的分解示意图；
图2是本发明实施例1提供的微滴生成装置的使用状态示意图；
图3是本发明实施例2提供的微滴生成装置的分解示意图；
图4是本发明实施例2提供的微滴生成装置的使用状态示意图；
图5是本发明实施例3提供的微滴生成装置的分解示意图；
图6是本发明实施例3提供的微滴生成装置的使用状态示意图；
图7是本发明实施例4提供的微滴生成装置的分解示意图；
图8是本发明实施例4提供的微滴生成装置的使用状态示意图；
图9是本发明中第一室的另一种实施例的示意图。
其中，附图标记包括：
1-第一室；10-第一室本体；10a-第一液体进口；10b-液滴输出口；10c-阀；10d-接口；10e-延伸管；11-第一腔体；
2-第二室；20-第二室本体；20a,20b-液体进出口；20c，20d-连接部；21-第二腔体；
3-第三室；30-第三室本体；30a-第一液体进口；30b-液体进出口；31-第三腔体；32-振动接入部；32a-开口；32b-薄膜；
4-振动装置；5a,5b，5c，5d-泵；6-收集器；7a，7b-进液管道。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、装置、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
根据本发明的一个方面，本发明提供一种特别适用于但不限于制备数字PCR液滴、单细胞液滴的液滴生成方法，通过混合第一液体和与所述第一液体不混溶的第二液体以形成液滴，该方法包括以下步骤：
向具有液滴输出口的第一腔体内持续输入第一液体；
经至少部分插入在所述第一腔体内并具有液体进出口的第二腔体，朝向所述液滴输出口输出第二液体，其中采用第一液体来驱动所述第二液体流动且对用于驱动所述第二液体的第一液体施加振动；
所述输出的第二液体被所述第一腔体内的第一液体包裹且二者共同喷射出所述液滴输出口，获得所述液滴，其中所述第一液体构成连续相，所述第二液体构成分散相。
通常，可分别采用泵来驱动所述第一液体的运动和第二液体的运动。其中输入第一液体的速度可以为1000~10000ml/h，输出第二液体的速度可以为1~100ml/h。
在根据本发明的优选实施例中，所述第一液体为油相，所述第二液体为包含了待检测生物或化学物质的水相；和/或，所施加振动的频率为10~10kHZ。
在一些具体实施方式中，所述的液滴输出口、液体进出口的内径分别为0.1~5mm。所述的液滴输出口的高度没有特别限制，例如可以是1~5mm。
优选地，使所述的液体进出口保持在所述的液滴输出口的正上方且二者之间保留0.1~5mm间隙的位置，进行所述第二液体的输出。
根据本发明，所述的第二腔体可以为单腔体或多腔体，当为多腔体时，其数量优选为2个、3个、4个或更多个腔体。多个腔体之间优选同心设置或并排设置，当然也可以部分同心部分并排地设置。
在根据本发明的一些实施方式中，所述的第二腔体为单腔体，先在第二腔体中填充第一液体，然后经所述液体进出口将存放第二液体的容器中的第二液体吸取到已经存有第一液体的第二腔体中，最后驱动第一液体进而驱动第二液体再从所述第二腔体输出。这种实施方式下，在需要制备例如数字PCR液滴的场合，就需要预先将构成水相的液体配置为一个混合物，然后进行液滴制备。
在根据本发明的又一些实施方式中，所述的第二腔体为单腔体，通过驱动多股液体使其在进入第二腔体前进行混合后或者在第二腔体内进行混合形成第二液体，所述多股液体中的每一股分别通过第一液体来驱动，并且其中至少一股液体对应的第一液体被施加振动。这种实施方式下，在需要制备例如数字PCR液滴的场合，可以根据需要先将构成水相的液体分为多个组，然后进行液滴制备。
在根据本发明的另一些实施方式中，所述的第二腔体为多腔体，包括外腔体和位于外腔体内并与其同心设置的内腔体，第一液体包括第一组份和第二组份，分别经外腔体和内腔体的液体进出口输出第一组份和第二组份，输出时，分别驱动第一组份和第二组份并分别对驱动第一组份、第二组份的第一液体施加振动；所输出的第一组份、第二组份被第一腔体内的第一液体包裹且共同喷射出所述液滴输出口，获得液滴。该种实施方式在一些场合例如单细胞捕获液滴的制备是尤其有利的。
在根据本发明的还一些实施方式中，所述的第二腔体为多腔体，包括并排设置的多个分腔体，所述第一液体相应包括多个分组份，分别经所述多个分腔体一一输出所述多个分组份，输出时，分别驱动各分组份并分别对驱动各分组份的第一液体施加振动，所述分腔体的个数为2个、3个、4个或5个或其他数量；所述输出的多个分组份被所述第一腔体内的第一液体包裹且共同喷射出所述液滴输出口，获得液滴。
进一步，还优选的是，采用具有接口并在接口处封装薄膜的第三腔体，施加振动时，在第三腔体内充满第一液体使第一液体与薄膜内侧充分接触，并同时使薄膜外侧与振动装置的输出端接触，从而振动装置的振动通过薄膜传送到第一液体中并进而传送至被第一液体驱动的第二液体。
本发明上述的液滴生成方法，对于生化样品而言，也可以稳定获得均一大小的液滴，液滴体积和生成速率可自由调节，并且不容易受到外力干扰的影响。
本发明进一步提供产业上易于制造并且特别适于数字PCR及单细胞液滴捕获的液滴生成装置。在根据本发明的一些方面，该液滴生成装置包括用于输出振动的振动装置、用于液滴生成的第一室，所述第一室包括具有第一腔体的第一室本体，其特征在于，所述第一室本体上开设有分别与所述第一腔体连通的第一液体进口和液滴输出口，所述的液滴生成装置还包括第二室、第三室，所述第二室包括具有第二腔体的第二室本体，所述第三室包括具有第三腔体的第三室本体，所述第二室本体连接在所述第一室本体与第三室本体之间，且第二室本体具有分别与所述第一室的第一腔体、第三室的第三腔体连通的液体进出口，所述液体进出口用于第二液体的进出，所述第三室本体上设有用于通入第一液体的第一液体进口、与所述第二室本体连通的液体进出口、用于接入振动装置输出的振动的振动接入部。
优选地，所述第二室本体与第三室本体相可拆卸地连接，如此，只需更换第三室本体，就可以用于不同液滴的制备，方便于临床应用和检测。具体可拆卸连接方式可以是常规的各种方式，没有任何限制。在一些具体实施方式中，第二室本体的上部与第三室本体的底部连接。
优选地，所述第二室本体与第一室本体也是可拆卸地连接的。在一个具体实施方式中，在所述第一室本体的顶部设置有接口，第二室本体穿过所述接口设置。
在一些优选的实施方式中，第二室本体包括两端开口的管体，该管体的下部靠近开口处收窄，形成与管体其他部位相比相对更窄的液体进出口。
进一步地，在另一些实施方式中，第二室本体还包括设置在前述管体上的一个、二个或更多个用于连接其他管道的连接部，液滴生成装置还可选择地包括通过连接部与管体接通的一个或多个进液管道，如此，第二室本体以及所述一个或多个进液管道可用于分别通入第二液体的不同组成部分，即，不需要将组成第二液体的所有组份先混合在一起，而是可以先配置多组，在制备液滴的过程中再进行混合。在一些具体案例中，第二室本体以及多个进液管道整体上构成了十字型结构。
根据本发明的另一些方面，提供了一种液滴生成装置，该液滴生成装置包括用于液滴生成的第一室，第一室包括具有第一腔体的第一室本体，所述第一室本体上开设有分别与第一腔体连通的第一液体进口和液滴输出口，与前述的液滴生成装置不同的是，该液滴生成装置包括多个振动进液单元。进一步地，各所述振动进液单元分别包括振动装置、第二室、第三室，所述第二室包括具有第二腔体的第二室本体，所述第三室包括具有第三腔体的第三室本体，所述第二室本体具有分别与对应的第三室的第三腔体、所述第一室的第一腔体连通的液体进出口，各所述的第三室本体上设有用于通入第一液体的第一液体进口、与所述第二室的第二腔体连通的液体进出口、用于接入振动装置输出的振动的振动接入部，所述多个振动进液单元的第二室本体的至少部分同心设置，且位于最外周的第二室本体连接在其所对应的第三室本体与第一室本体之间。
优选地，所述第二室本体与第三室本体相可拆卸地连接，具体可拆卸连接方式可以是常规的各种方式，没有任何限制。在一些具体实施方式中，第二室本体的上部与第三室本体的底部连接。
优选地，所述第二室本体与第一室本体也是可拆卸地连接的。在一个具体实施方式中，在所述第一室本体的顶部设置有接口，第二室本体穿过所述接口设置。
在一些优选的实施方式中，第二室本体包括两端开口的管体，该管体的下部靠近开口处收窄，形成与管体其他部位相比相对更窄的液体进出口。
在一些具体实施方式中，所述的振动进液单元为2个，包括第一振动进液单元、第二振动进液单元，第一振动进液单元的第二室本体连接在其所对应的第三室本体与第一室本体之间，第二振动进液单元的第二室本体的部分插入在第一振动进液单元的第二室本体中，且其下端的液体进出口位于所述的第一振动进液单元的第二室本体的下端的液体进出口的上方。
根据本发明的再一些方面，提供了一种液滴生成装置，包括用于液滴生成的第一室，所述第一室包括具有第一腔体的第一室本体，多个振动进液单元，各所述振动进液单元分别包括振动装置、第二室、第三室，所述第二室包括具有第二腔体的第二室本体，所述第三室包括具有第三腔体的第三室本体，所述第二室本体具有分别与对应的第三室的第三腔体、所述第一室的第一腔体连通的液体进出口，各所述的第三室本体上设有用于通入第一液体的第一液体进口、与所述第二室的第二腔体连通的液体进出口、用于接入振动装置输出的振动的振动接入部，所述多个振动进液单元的第二室本体的至少部分并排设置，且均位于所述第一室的第一腔体内。
优选地，所述第二室本体与第三室本体相可拆卸地连接，具体可拆卸连接方式可以是常规的各种方式，没有任何限制。在一些具体实施方式中，第二室本体的上部与第三室本体的底部连接。
优选地，所述第二室本体与第一室本体也是可拆卸地连接的。在一个具体实施方式中，在所述第一室本体的顶部设置有接口，第二室本体穿过所述接口设置。
在一些优选的实施方式中，第二室本体包括两端开口的管体，该管体的下部靠近开口处收窄，形成与管体其他部位相比相对更窄的液体进出口。
进一步地，各种实施方式下，第二室本体的下部的液体进出口优选位于液滴输出口的正上方，且进一步优选二者之间具有0.1~5mm间隙。
进一步地，各种实施方式下，所述液滴生成装置还优选包括用于提供各液体流动所需驱动力的泵、用于接收所生成的液滴的收集器等。所述的泵可以是注射泵或其他流体泵，比如蠕动泵等。
进一步地，振动装置可以采用本领域常规的各种高频振动发生器，没有特别限制，例如可以是高频机械振动发生器（压电陶瓷装置、MEMS等）。
进一步地，各种实施方式下，所述的振动接入部包括开设在所述第三室上的开口和封装在开口处的薄膜。
还优选地，在第一室的液滴输出口处设置有阀；和/或，第三室的液体进出口处设置有阀。或者其它有需要的位置设置阀。
进一步地，所述第一室还可以包括自所述液滴输出口处向下延伸形成的延伸管。用于接收液滴的收集器设于延伸管下方。
本发明还进一步提供了数字PCR液滴生成系统或单细胞液滴捕获系统，其通过在现有的液滴生成系统或单细胞捕获系统的基础上，采用前述的液滴生成装置形成。
实施例1
如图1、图2所示，本例提供一种液滴生成装置，其包括第一室1、第二室2、第三室3、振动装置4、泵5a,5b、收集器6等。
第一室1包括具有第一腔体11的第一室本体10，第一室本体10上开设有分别与第一腔体11连通的第一液体进口10a和液滴输出口10b，第一液体进口10a与泵5a连接，液滴输出口10b处设置阀10c，其内径通常可以为0.1~5mm。此外，还在第一室本体10的顶部设置有接口10d，用于连接第二室2，该接口10d处优选设置弹性密封圈或其他密封结构。
第二室2包括具有第二腔体21的第二室本体20。第三室3包括具有第三腔体31的第三室本体30。第二室本体20连接在第一室本体10与第三室本体30之间。第二室本体20具有液体进出口20a,20b, 分别与第一室1的第一腔体11、第三室3的第三腔体31连通。第三室本体30上设有第一液体进口30a、液体进出口30b，第一液体进口30a与泵5b连接，用于通入第一液体，液体进出口30b用于与第二室本体20连通。此外，在第三室本体30还设置了用于接入振动装置4输出的振动的振动接入部32。振动接入部32包括在第三室本体30上形成的开口32a和在开口处设置的薄膜32b，振动装置4的振动输出端与该薄膜32b接触。
第一室本体10、第二室本体20以及第三室本体30是三个独立的部件，其中，第二室本体20由两端开口的管体构成，其下部靠近开口处收窄形成比管体其余部分窄的液体进出口20b，该液体进出口20b的内径通常可以为0.1~5mm。第二室本体20的上端与第三室本体30可拆卸地连接，下部可穿过第一室本体10顶部的接口10d进入第一腔体11内，并且其下端的液体进出口20b位于第一室本体10上的液滴输出口10b的正上方，二者的中心线重合。液体进出口20b与液滴输出口10b之间的距离约为0.1~5mm。当第二室本体20插入接口10时，接口10d处的弹性密封圈可以使二者连接处保持密封和稳定。
如图9所示了另一种第一室1的可替换结构，该结构中第一室1还包括自液滴输出口10b处向下延伸形成的延伸管10e。
采用上述微滴生成装置可以进行数字PCR液滴的制备，过程如下：在第三腔体31内注满连续相液体（油相）A。通过泵5b的控制可用第二室2通过液体进出口20b吸入分散相液体（水相）B，吸入的分散相液体体积不超过第二腔体21的容积，分散相液体A与液体B互不相溶。将第二室本体20插入第一腔体11内，直至其液体进出口20b接近液滴输出口10b。然后向第一腔体11中注满连续相液体C，阀10c打开，同时推动泵5a和泵5b，使得第二腔体21中的分散相液体B和第一腔体11中的连续相液体C共流喷射出液滴输出口10b。泵5a推动速度为1~100ml/hour。泵5b推动速度为1000~10000ml/hour。在推动双泵的同时，振动装置4进行10~10kHZ的高频机械振动，振动通过薄膜32b传递到第三腔体31中的液相，进而传递到第二腔体中正在喷射出的分散相液体B。受到扰动的分散相液体B的喷射流按照振动装置4的振动频率破裂为均匀的微滴，随着连续相液体C一同流入收集器6。当分散相液体B完全流入收集器6后，整个流程结束。将第二室本体20从第一腔体11中拔出，更换新的第二室本体20后，可直接用于下一次或下一个PCR液滴的制备。
采取上述微滴生成方法，可以容易地控制微滴的生成位置、生成体积、生成速率以及液滴的组成。具体地，可以通过调整振动频率、振动幅度、不同液体流动的相对速率、液体的粘滞性等中的一个或多个方式来调节第二液体从液滴输出口射出所形成射流的长度和粗细，而相应在所期望的位置按照所期望的速率获得具有期望体积和期望组成的液滴。
实施例2
如图3、图4所示，本例提供一种液滴生成装置，本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：第二室2的管体上设置两个用于连接其他管道的连接部20c、20d，在本实施例中，连接部20c、20d位于管体的两侧，且连接部20c、20d的中心线重合。
液滴生成装置还包括通过连接部20c、20d与管体接通的两个进液管道7a，7b，进液管道7a，7b与连接部20c、20d可拆卸连接。此外，两个进液管道7a，7b还分别连接泵5c，5d。第二室本体20以及两个进液管道7a，7b用于分别通入第二液体的不同组成部分。
采用上述微滴生成装置可以进行数字PCR液滴的制备，过程如下：在第三腔体31内注满连续相液体（油相）A。通过泵5a的控制可用第二室2通过液体进出口20b吸入分散相液体（水相）B1，吸入的分散相液体体积不超过第二腔体21的容积，分散相液体A与液体B1互不相溶。将第二室本体20插入第一腔体11内，直至其液体进出口20b接近液滴输出口10b。通过泵5c、5d的控制可用进液管道7a，7b吸入分散相液体（水相）B2，B3，将进液管道7a、7b通过连接部20c、20d与管体接通。然后向第一腔体11中注满连续相液体C，阀10c打开，同时推动泵5a，5b，5c，5d，使得分散相液体B1，B2，B3在第二腔体21内进行混合成分散相液体B（水相），第二腔体21中的分散相液体B和第一腔体11中的连续相液体C共流喷射出液滴输出口10b。在推动泵的同时，振动装置4进行10~10kHZ的高频机械振动，振动通过薄膜32b传递到第三腔体31中的液相，进而传递到第二腔体中正在喷射出的分散相液体B。受到扰动的分散相液体B的喷射流按照振动装置4的振动频率破裂为均匀的微滴，随着连续相液体C一同流入收集器6。当分散相液体B完全流入收集器6后，整个流程结束。将第二室本体20从第一腔体11中拔出，更换新的第二室本体20、新的进液管道7a，7b后，可直接用于下一次或下一个PCR液滴的制备。
采取上述微滴生成方法，可以容易地控制微滴的生成位置、生成体积、生成速率以及液滴的组成。与实施例1方式相比，本实施例所生成的液滴更具可调性，调节更灵活，尤其是液滴的组成的调节和控制更加方便。此外，应用范围更加广泛。
实施例3
如图5、图6所示，本例提供一种液滴生成装置，其包括第一室1、两个第二室2，2’、两个第三室3，3’、振动装置4，4’、泵5a,5b，5b’、收集器6等。
第一室1包括具有第一腔体11的第一室本体10，第一室本体10上开设有分别与第一腔体11连通的第一液体进口10a和液滴输出口10b，第一液体进口10a与泵5a连接，液滴输出口10b处设置阀10c，其内径通常可以为0.1~5mm。此外，还在第一室本体10的顶部设置有接口10d，用于连接第二室2，该接口10d处优选设置弹性密封圈或其他密封结构。
一个第二室2包括具有第二腔体21的第二室本体20。第三室3包括具有第三腔体31的第三室本体30。第二室本体20具有液体进出口20a,20b，分别与第一室1的第一腔体11、第三室3的第三腔体31连通。第三室本体30上设有第一液体进口30a、液体进出口30b，第一液体进口30a与泵5b连接，用于通入第一液体的第一组份，液体进出口30b用于与第二室本体20连通。此外，在第三室本体30还设置了用于接入振动装置4输出的振动的振动接入部32。振动接入部32包括在第三室本体30上形成的开口32a和在开口处设置的薄膜32b，振动装置4的振动输出端与该薄膜32b接触。
另一个第二室2’也包括具有第二腔体21’的第二室本体20’。第三室3’也包括具有第三腔体31’的第三室本体30’。第二室本体20’具有液体进出口20a’,20b’，其液体进出口20a’与第三室3’的第三腔体31’连通，第二室本体20’的部分插入在第二室本体20中，且其下端的液体进出口20b’位于第二室本体20的下端的液体进出口20b的上方，且第二室本体20’插入在第二室本体20的部分与第二室本体20同心设置。第三室本体30’上设有第一液体进口30a’、液体进出口30b’，第一液体进口30a’与泵5b’连接，用于通入第一液体的第二组份，液体进出口30b’用于与第二室本体20’连通。此外，在第三室本体30’也设置了用于接入振动装置4’输出的振动的振动接入部3’2。振动接入部32’包括在第三室本体30’上形成的开口32a’和在开口处设置的薄膜32b’，振动装置4’的振动输出端与该薄膜32b’接触。
第一室本体10、第二室本体20、第二室本体20’以及第三室本体3、第三室本体30’均是独立的部件，其中，第二室本体20，20’由两端开口的管体构成，其下部靠近开口处收窄形成比管体其余部分窄的液体进出口20b，20b’。第二室本体20的上端与第三室本体30可拆卸地连接，下部可穿过第一室本体10顶部的接口10d进入第一腔体11内，并且其下端的液体进出口20b位于第一室本体10上的液滴输出口10b的正上方，二者的中心线重合。液体进出口20b与液滴输出口10b之间的距离约为0.1~5mm。当第二室本体20插入接口10时，接口10d处的弹性密封圈可以使二者连接处保持密封和稳定。
采用上述微滴生成装置可以进行数字PCR液滴的制备，过程如下：在第三腔体31，31’内分别注满连续相液体（油相）A1，A2。通过泵5a，5a’的控制可用第二室2，2’通过液体进出口20b，20b’吸入分散相液体（水相）B1，B2，吸入的分散相液体体积不超过第二腔体21,21’的容积，分散相液体A1，A2与液体B1，B2互不相溶。将第二室本体20插入第一腔体11内，直至其液体进出口20b接近液滴输出口10b。然后向第一腔体11中注满连续相液体C，阀10c打开，同时推动泵5a，5b，5b’，分散相液体B1，B2在第二腔体21的液体进出口20b的上方混合为分散相液体B，分散相液体B进一步和第一腔体11中的连续相液体C共流喷射出液滴输出口10b。在推动泵的同时，振动装置4，4’进行10~10kHZ的高频机械振动，振动通过薄膜32b，32b’传递到第三腔体31，31’中的液相，进而传递到第二腔体21,21’中正在混合并喷射出的分散相液体B。受到扰动的分散相液体B的喷射流按照振动装置4,4’的振动频率破裂为均匀的微滴，随着连续相液体C一同流入收集器6。当分散相液体B完全流入收集器6后，整个流程结束。将第二室本体20从第一腔体11中拔出，更换新的第二室本体20，20’后，可直接用于下一次或下一个PCR液滴的制备。
采取上述微滴生成方法，可以容易地控制微滴的生成位置、生成体积、生成速率以及液滴的组成。与实施例1相比，本实施例方法制备液滴更具可调性，调节更灵活，尤其是液滴的组成的调节和控制更加方便。此外，应用范围更加广泛。
实施例4
如图7、图8所示，本例提供一种液滴生成装置，本实施例与实施例3基本相同，不同之处在于：第二室本体20、第二室本体20’至少部分并排设置，共同穿过第一室本体10顶部的接口10d进入第一腔体11内，并且其下端的液体进出口20b，20b’位于第一室本体10上的液滴输出口10b的正上方。
采用上述微滴生成装置可以进行数字PCR液滴的制备，过程如下：在第三腔体31，31’内分别注满连续相液体（油相）A1，A2。通过泵5a，5a’的控制可用第二室2，2’通过液体进出口20b，20b’吸入分散相液体（水相）B1，B2，吸入的分散相液体体积不超过第二腔体21,21’的容积，分散相液体A1，A2与液体B1，B2互不相溶。将第二室本体20，20‘插入第一腔体11内，直至其液体进出口20b，20b’接近液滴输出口10b。然后向第一腔体11中注满连续相液体C，阀10c打开，同时推动泵5a，5b，5b’，使得分散相液体B1，B2在液体进出口20b，20b’处进行混合成分散相液体B，混合后的分散相液体B和第一腔体11中的连续相液体C共流喷射出液滴输出口10b。在推动泵的同时，振动装置4，4’进行10~10kHZ的高频机械振动，振动通过薄膜32b，32b’传递到第三腔体31，31’中的液相，进而传递到第二腔体21,21’中喷射出的分散相液体B。受到扰动的分散相液体B的喷射流按照振动装置4,4’的振动频率破裂为均匀的微滴，随着连续相液体C一同流入收集器6。当分散相液体B完全流入收集器6后，整个流程结束。将第二室本体20，20’从第一腔体11中拔出，更换新的第二室本体20，20’后，可直接用于下一次或下一个PCR液滴的制备。
采取上述微滴生成方法，可以容易地控制微滴的生成位置、生成体积、生成速率以及液滴的组成。与实施例1相比，本实施例所生成的液滴更具可调性，调节更灵活，尤其是液滴的组成的调节和控制更加方便。此外，应用范围更加广泛。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (29)

1.一种适用于制备数字PCR液滴、单细胞液滴的液滴生成方法，通过混合第一液体和与所述第一液体不混溶的第二液体以形成液滴，其特征在于，包括以下步骤：
向具有液滴输出口的第一腔体内持续输入第一液体；
经至少部分插入在所述第一腔体内并具有液体进出口的第二腔体，朝向所述液滴输出口输出第二液体，其中采用第一液体来驱动所述第二液体流动且对用于驱动所述第二液体的第一液体施加振动，施加振动时，采用具有接口并在接口处封装薄膜的第三腔体，在第三腔体内充满第一液体使第一液体与薄膜内侧充分接触，并同时使薄膜外侧与振动装置的输出端接触，从而振动装置的振动通过薄膜传送到第一液体中并进而传送至被第一液体驱动的第二液体；
所述输出的第二液体被所述第一腔体内的第一液体包裹且二者共同喷射出所述液滴输出口，获得所述液滴，其中所述第一液体构成连续相，所述第二液体构成分散相。
2.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于，分别采用泵来驱动所述第一液体的运动和第二液体的运动，其中所述输入第一液体的速度为1000~10000ml/h，所述输出第二液体的速度为1~100ml/h。
3.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于，所述第一液体为油相，所述第二液体为包含了待检测生物或化学物质的水相；和/或，所施加振动的频率为10~10kHZ。
4.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于，所述的液滴输出口、液体进出口的内径分别为0.1~5mm；和/或，所述的液滴输出口的高度为1~5mm。
5.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于，所述的第二腔体为单腔体或多腔体，所述多腔体为2个、3个、4个或更多个腔体，多个腔体之间同心设置或并排设置或部分同心部分并排地设置。
6.根据权利要求5所述的液滴生成方法，其特征在于，所述的第二腔体为单腔体，先在第二腔体中填充第一液体，然后经所述液体进出口将存放第二液体的容器中的第二液体吸取到已经存有第一液体的第二腔体中，最后驱动第一液体进而驱动第二液体再从所述第二腔体输出。
7.根据权利要求6所述的液滴生成方法，其特征在于，所述的第二腔体为单腔体，通过驱动多股液体使其在进入第二腔体前进行混合后或者在第二腔体内进行混合形成第二液体，所述多股液体中的每一股分别通过第一液体来驱动，并且其中至少一股液体对应的第一液体被施加振动。
8.根据权利要求5所述的液滴生成方法，其特征在于，所述的第二腔体为多腔体，包括外腔体和位于所述外腔体内并与其同心设置的内腔体，所述第一液体包括第一组份和第二组份，分别经所述外腔体和内腔体的液体进出口输出第一组份和第二组份，输出时，分别驱动第一组份和第二组份并分别对驱动第一组份、第二组份的第一液体施加振动；
所述输出的第一组份、第二组份二者被所述第一腔体内的第一液体包裹且共同喷射出所述液滴输出口，获得所述液滴。
9.根据权利要求5所述的液滴生成方法，其特征在于，所述的第二腔体为多腔体，包括并排设置的多个分腔体，所述第一液体相应包括多个分组份，分别经所述多个分腔体一一输出所述多个分组份，输出时，分别驱动各分组份并分别对驱动各分组份的第一液体施加振动，所述分腔体的个数为2个、3个、4个或5个；
所述输出的多个分组份被所述第一腔体内的第一液体包裹且共同喷射出所述液滴输出口，获得所述液滴。
10.一种液滴生成装置，适用于制备数字PCR的液滴或单细胞液滴，所述液滴生成装置包括用于输出振动的振动装置、用于液滴生成的第一室，所述第一室包括具有第一腔体的第一室本体，其特征在于，所述第一室本体上开设有分别与所述第一腔体连通的第一液体进口和液滴输出口，所述的液滴生成装置还包括第二室、第三室，所述第二室包括具有第二腔体的第二室本体，所述第三室包括具有第三腔体的第三室本体，所述第二室本体连接在所述第一室本体与第三室本体之间，且第二室本体具有分别与所述第一室的第一腔体、第三室的第三腔体连通的液体进出口，所述液体进出口用于第二液体的进出，所述的第二室本体的下部的液体进出口位于所述的液滴输出口的正上方，所述第二室本体包括两端开口的管体，该管体的下部靠近开口处收窄，形成与管体其他部位相比相对更窄的液体进出口，所述第三室本体上设有用于通入第一液体的第一液体进口、与所述第二室本体连通的液体进出口、用于接入振动装置输出的振动的振动接入部。
11.根据权利要求10所述的液滴生成装置，其特征在于，所述第二室本体与所述的第三室本体相可拆卸地连接。
12.根据权利要求10所述的液滴生成装置，其特征在于，所述第二室本体的上部与所述的第三室本体的底部连接。
13.根据权利要求10所述的液滴生成装置，其特征在于，所述第二室本体与所述的第一室本体相可拆卸地连接。
14.根据权利要求13所述的液滴生成装置，其特征在于，在所述第一室本体的顶部设置有接口，所述的第二室本体穿过所述接口设置。
15.根据权利要求10所述的液滴生成装置，其特征在于，所述第二室本体还包括设置在所述管体上的一个、二个或更多个用于连接其他管道的连接部，所述的液滴生成装置还可选择地包括通过所述连接部与所述管体接通的一个或多个进液管道，所述第二室本体以及所述一个或多个进液管道用于分别通入第二液体的不同组成部分。
16.一种液滴生成装置，适用于制备数字PCR的液滴或单细胞液滴，所述液滴生成装置包括用于液滴生成的第一室，所述第一室包括具有第一腔体的第一室本体，其特征在于，所述第一室本体上开设有分别与所述第一腔体连通的第一液体进口和液滴输出口，所述的液滴生成装置还包括多个振动进液单元；
各所述振动进液单元分别包括振动装置、第二室、第三室，所述第二室包括具有第二腔体的第二室本体，所述第三室包括具有第三腔体的第三室本体，所述第二室本体具有分别与对应的第三室的第三腔体、所述第一室的第一腔体连通的液体进出口，所述的第二室本体的下部的液体进出口位于所述的液滴输出口的正上方，所述第二室本体包括两端开口的管体，该管体的下部靠近开口处收窄，形成与管体其他部位相比相对更窄的液体进出口，各所述的第三室本体上设有用于通入第一液体的第一液体进口、与所述第二室的第二腔体连通的液体进出口、用于接入振动装置输出的振动的振动接入部，所述多个振动进液单元的第二室本体至少部分同心设置，且位于最外周的第二室本体连接在其所对应的第三室本体与第一室本体之间。
17.根据权利要求16所述的液滴生成装置，其特征在于，所述第二室本体与所述的第三室本体相可拆卸地连接，和/或，所述第二室本体与所述的第一室本体相可拆卸地连接。
18.根据权利要求17所述的液滴生成装置，其特征在于，在所述第一室本体的顶部设置有接口，所述的第二室本体穿过所述接口设置。
19.根据权利要求16所述的液滴生成装置，其特征在于，所述第二室本体的上部与所述的第三室本体的底部连接。
20.根据权利要求16所述的液滴生成装置，其特征在于，所述的振动进液单元为2个，包括第一振动进液单元、第二振动进液单元，第一振动进液单元的第二室本体连接在其所对应的第三室本体与第一室本体之间，第二振动进液单元的第二室本体的部分插入在第一振动进液单元的第二室本体中，且其下端的液体进出口位于所述的第一振动进液单元的第二室本体的下端的液体进出口的上方。
21.一种液滴生成装置，适用于制备数字PCR的液滴或单细胞液滴，所述液滴生成装置包括用于液滴生成的第一室，所述第一室包括具有第一腔体的第一室本体，其特征在于，所述的液滴生成装置还包括多个振动进液单元；
各所述振动进液单元分别包括振动装置、第二室、第三室，所述第二室包括具有第二腔体的第二室本体，所述第三室包括具有第三腔体的第三室本体，所述第二室本体具有分别与对应的第三室的第三腔体、所述第一室的第一腔体连通的液体进出口，所述的第二室本体的下部的液体进出口位于所述的液滴输出口的正上方，所述第二室本体包括两端开口的管体，该管体的下部靠近开口处收窄，形成与管体其他部位相比相对更窄的液体进出口，各所述的第三室本体上设有用于通入第一液体的第一液体进口、与所述第二室的第二腔体连通的液体进出口、用于接入振动装置输出的振动的振动接入部，所述多个振动进液单元的第二室本体至少部分并排设置，且均位于所述第一室的第一腔体内。
22.根据权利要求21所述的液滴生成装置，其特征在于，所述第二室本体与所述的第三室本体相可拆卸地连接，和/或，所述第二室本体与所述的第一室本体相可拆卸地连接。
23.根据权利要求22所述的液滴生成装置，其特征在于，在所述第一室本体的顶部设置有接口，所述的第二室本体穿过所述接口设置。
24.根据权利要求21所述的液滴生成装置，其特征在于，所述第二室本体的上部与所述的第三室本体的底部连接。
25.根据权利要求10至24中任一项权利要求所述的液滴生成装置，其特征在于，所述的第二室本体的下部的液体进出口、液滴输出口之间具有0.1~5mm间隙。
26.根据权利要求10至24中任一项权利要求所述的液滴生成装置，其特征在于，所述液滴生成装置还包括用于提供各液体流动所需驱动力的泵；和/或，所述液滴生成装置还包括用于接收所生成的液滴的收集器；和/或，所述的振动接入部包括开设在所述第三室上的开口和封装在开口处的薄膜。
27.根据权利要求10至24中任一项权利要求所述的液滴生成装置，其特征在于，所述第一室的液滴输出口处设置有阀；和/或，所述第三室的液体进出口处设置有阀。
28.根据权利要求10至24中任一项权利要求所述的液滴生成装置，其特征在于，所述第一室还包括自所述液滴输出口处向下延伸形成的延伸管。
29.一种数字PCR液滴生成系统或单细胞液滴捕获系统，其特征在于，包括如权利要求10至28中任一项权利要求所述的液滴生成装置。
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