CN114480644A

CN114480644A - 肺腺癌基于代谢基因的分子分型

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Publication number: CN114480644A
Application number: CN202210018326.1A
Authority: CN
Inventors: 陈文标; 沈观乐; 林俊其; 余瑞林; 黄小明; 高妩媚
Original assignee: Shenzhen Longhua Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Longhua Peoples Hospital
Priority date: 2022-01-07
Filing date: 2022-01-07
Publication date: 2022-05-13

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及肺腺癌基于代谢基因的分子分型。本发明提供了75个基因在制备肺癌预后的产品中的应用。本发明利用来自TCGA、GEO公共数据库中基因表达数据、CNV数据以及SNV突变数据，通过收集到的之前研究的代谢相关的基因集，通过预后相关的代谢基因对肺腺癌进行了重分类，分析比较了不同分类的生存曲线，并鉴定了不同分类中的免疫特征，并且比较了不同亚型与免疫治疗的效果。

Description

肺腺癌基于代谢基因的分子分型

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及肺腺癌基于代谢基因的分子分型。

背景技术

肺腺癌是肺癌的一种，属于非小细胞肺癌，多数起源于支气管黏膜上皮，少数起源于大支气管的黏液腺。肺腺癌早期通常不会引起明显的体征和症状，常常在胸部X光线检查时被发现。当肺腺癌病情进展至晚期时，会出现较为明显的咳嗽、血痰、胸痛、局部喘鸣以及发热和呼吸急促等症状。

肺腺癌的常规治疗方式包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗等。在肺腺癌早期，医生一般会选择手术治疗，以期获得最佳治疗效果。对于晚期患者而言，医生在选择治疗方案时，会采取多学科综合治疗和个体化治疗相结合的原则，具体方案取决于肺腺癌的临床分型以及患者年龄和整体健康状况。

现有技术中，根据肺腺癌的病理，将其分为浸润性腺癌，浸润性腺癌变异型、微浸润性腺癌和浸润前病变；浸润前病变又分为原位腺癌和不典型腺瘤样增生。根据这样的分类，可以对不同类型的肺腺癌进行预后，其中，不典型腺瘤样增生和原位腺癌的预后最好，微浸润腺癌的复发率最低。

但现有技术对肺腺癌的分类仅是通过病理进行区分，难免存在不够准确的问题，且目前的分型对用药的指导仍不够准确。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供肺腺癌基于代谢基因的分子分型。

本发明以如下基因为标志物，提供了其在制备肺腺癌患者预后的产品中的应用；

所述基因包括NOSTRIN、PDK4、DNASE1L3、ERN2、JPH1、ITLN2、 TGFBR3、BEX2、PIP5KIB、HMGCS2、RSPO4、GPX3、GRIA1、HIF3A、 ALKAL2、SOX13、UPK3B、GNMT、ADAMTSL3、DACT2、PKNOX2、SVEP1、XAGE2、GANC、GSTA2、S100P、SLC7A11、INSL4、FGA、RHCG、ARL14、FAM83B、MAGEA4、AKAP12、IGFBP1、SRXN1、SPX、EPS8L3、KLK8、 MAGEAI、G6PD、CDK6、AKR1C4、GCLM、SERPINB3、MAGEB2、CA12、 RND3、UGDH、TFRC、PREP、SFRP2、MMP11、CILP、CA9、ITPKA、COL1A1、 CCL20、C6orf223、GALNT6、PLPP4、TFP12、LRRC15、GALNT14、COL10A1、 MB、TNC、TBX15、SPP1、PLAU、KLK12、SULF1、CILP2、P2RY6或CST1 中至少一种。

本发明中，所述预后包括对肺腺癌进行分型、预测药物有效性、预测治疗方案有效性、预测患者生存率和/或评估患者的免疫细胞浸润得分。

本发明中，所述分型包括：将肺腺癌分为三个类型，其中：

所述分型包括：将肺腺癌分为三个类型，其中：C1亚型主要与代谢信号通路相关。C2亚型主要与肿瘤信号通路相关。C3亚型与代谢与肿瘤信号通路都相关。

本发明中，所述预测患者生存率包括：三个亚型中，C1亚型的预后最好， C2亚型的预后最差，亚型C3的预后介于C2与C1之间。

本发明中，所述预测药物有效性中，所述药物包括Bexarotene、 Doxorubicin、Embelin、Etoposide、Gemcitabine、Mitomycin C、Vinorelbine 或Cisplatin中至少一种。

本发明中，所述预测治疗方案有效性中，所述治疗方案包括免疫治疗。一些实施例中，所述免疫治疗包括nivolumab治疗或pembrolizumab治疗。

本发明中，所述预测治疗方案有效性包括，三个亚型中C3亚型的患者对pembrolizumab治疗的反应最好。

本发明中，所述预测患者生存率中，三个亚型中C2亚型的死亡率高于C1 亚型或C3亚型。

本发明中，所述评估患者的免疫细胞浸润得分中，三个亚型中C1亚型的免疫浸润得分最高。

本发明还提供了一种肺腺癌患者预后的产品，其包括检测如下基因的试剂：所述基因包括NOSTRIN、PDK4、DNASE1L3、ERN2、JPH1、ITLN2、 TGFBR3、BEX2、PIP5KIB、HMGCS2、RSPO4、GPX3、GRIA1、HIF3A、 ALKAL2、SOX13、UPK3B、GNMT、ADAMTSL3、DACT2、PKNOX2、SVEP1、XAGE2、GANC、GSTA2、S100P、SLC7A11、INSL4、FGA、RHCG、ARL14、 FAM83B、MAGEA4、AKAP12、IGFBP1、SRXN1、SPX、EPS8L3、KLK8、 MAGEAI、G6PD、CDK6、AKR1C4、GCLM、SERPINB3、MAGEB2、CA12、 RND3、UGDH、TFRC、PREP、SFRP2、MMP11、CILP、CA9、ITPKA、COL1A1、 CCL20、C6orf223、GALNT6、PLPP4、TFP12、LRRC15、GALNT14、COL10A1、 MB、TNC、TBX15、SPP1、PLAU、KLK12、SULF1、CILP2、P2RY6或CST1 中至少一种。

本发明所述的肺腺癌预后的产品中，所述检测基因的试剂包括引物和/或探针。所述检测采用rtPCR的方法或采用qPCR的方法。

本发明还提供了一种肺腺癌患者预后的方法，其首先对于患者的基因测序，得到75个基因的表达谱，使用生存数据利用R包survival(V3.1-12) 的coxph函数对代谢基因进行单因素cox分析，选择p<0.05作为阈值进行过滤；接下来使用R包ConsensusClusterPlus(V 1.52.0)对患者进行分子分型，选择最优的分型；最后使用Gene Pattern类别映射(SubMap)分析患者75个基因表达谱与亚型之间的相似性(一种基于独立患者队列的表达谱评估分子类别之间相似性的方法)，以确定在上述在患者识别出的亚类是否相关。

本发明提供了75个基因在制备肺癌预后的产品中的应用。本发明利用来自TCGA、GEO公共数据库中基因表达数据、CNV数据以及SNV突变数据，通过收集到的之前研究的代谢相关的基因集，通过预后相关的代谢基因对肺腺癌进行了重分类，分析比较了不同分类的生存曲线，并鉴定了不同分类中的免疫特征，并且比较了不同亚型与免疫治疗的效果。

附图说明

图1中A示六个GSE数据集消除批次效应之前的PCA分析；B示六个GSE数据集消除批次效应之后的PCA分析；

图2中的A示t-SNE分析支持将TCGA其分为三个LUAD子类；B示 t-SNE分析支持将GSE其分为三个LUAD子类；C示SubMap分析两个数据集中标识的子类是否相关，分子亚型的生存分析；

图3示不同数据集之间的预后KM生存分析；

图4示不同分子亚型中临床特征的分布比较；

图5示分子亚型代谢过程的ssGSEA得分的热图展示；

图6示分子亚型human signatures的ssGSEA得分的比较

图7示五种免疫评估软件评估的免疫细胞浸润评分在分子亚型上的热图；

图8示免疫检查点在分子亚型上的表达比较；

图9中的A示亚型之间的圈图比较(外层是我们的分子亚型，内层是现有的免疫分型，内圈灰色是没有现有免疫分型没有分类的样本)；B示现有分子亚型在我们的分子亚型之间的分布比较；C示现有分子亚型的生存曲线；

图10中的A示亚型之间的Wound.Healing比较；B示亚型之间的IFN.gamma.Response比较；C示亚型之间的TGF.beta.Response比较；D示亚型之间的SNV.Neoantigens比较；E示亚型之间的Proliferation比较；F示亚型之间的Leukocyte.Fraction比较；

图11中A-C示分子亚型突变频率最高的前20个基因的突变频率分布； D示分子亚型上TMB的比较；E-I示部分突变基因在亚型上突变频率的差异比较；

图12中A-C示分子亚型上突变频率最高的前20个基因拷贝数情况； D-I示部分基因在三种分子亚型中的拷贝数分布比较；

图13中A示60个基因的热图；BC示60个基因重分类后的一致性；

图14示分子亚型之间免疫治疗的反应比较，其中，A、B示接受了 NIVOLUMAB或PEMBROLIZUMAB治疗的患者的数据集，C、D示8种药物的IC50值。

具体实施方式

本发明提供了肺腺癌基于代谢基因的分子分型，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明通过生物信息学将肺腺癌进行分子分型，共分成三个类型(C1-C3)，然后综合考虑基因的准确性和临床应用潜力，筛选出FC值&gt 最高的20个基因，每个聚类中选择20个进行分类器的开发。三个类型差异性的基因共计75个用作建立临床分类器。然后，使用75个基因分类器重复 GSEdat的分类预测，并评估基于ConsensusClusterPlus的原始预测的一致性。结果显示，C1、C2和C3的一致性分别为74％、66％和58％，表明这75个基因分类器的准确性和重复性较高。

为了进一步了解3个分子分型的免疫和靶向治疗是否存在差异。本发明将3个亚型(C1、C2和C3)的表达谱与另一个发表的数据集(发表的文章：Roh, W.,Chen,P.L.,Reuben,A.,Spencer,C.N.,Prieto,P.A.,Miller,J.P.,et al.(2017). Integratedmolecular analysis of tumor biopsies on sequential CTLA-4and PD-1 blockadereveals markers of response andresistance.Sci Transl Med 9(379).doi: 10.1126/scitranslmed.aah3560.)进行了比较，该数据集包括接受nivolumab和 pembrolizumab治疗的患者，在TCGA数据库中观察到C1和nivolumab和 pembrolizumab应答之间的显著相关性。我们还发现，在GSEdat数据库中， C1与派姆单抗应答相关。此外，我们还比较了3组治疗靶点的敏感性。在TCGA 和GSEdat数据库中，C1治疗靶点的敏感性均高于C2和C3，说明C1治疗靶点的有效性较高。这些结果表明C1的LUAD样本具有良好的免疫和靶向治疗敏感性和反应性，间接提示C1的LUAD样本具有较好的生存率。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

1材料与方法

1.1数据来源与预处理

从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gLUAD/)中下载肺腺癌 (LUAD)的RNA-Seq数据、CNV数据(MaskedCopy Number Segment, affymetrix snp 6.0)、SNV数据(MuTect2.Variant0.Maf)以及临床随访信息数据，以上数据下载时间为2021年4月23日。

我们从GEO数据库中下载GSE19188[参见文献1]、GSE29013[参见文献2]、GSE30219[参见文献3]、GSE31210[参见文献4]、GSE37745[参见文献 5]、GSE50081[参见文献6]等六个数据集的CEL文件(含有生存时间的，以上数据下载时间为2021年4月23日)，保留着六个数据集中GPL570芯片 ([HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0Array)的样本。

我们使用R包aff(y V1.66.0)[参见文献7]的RMA功能(Robust Multi-ArrayAverage expressionmeasure)进行表达谱数据的处理，并进行标准化(normalize)得到数据集的表达谱；使用sva包[参见文献8]的ComBat功能消除这六个数据集之间的批次效应，合并为同一个数据集，以下简称为 GSEdat；我们将合并后的数据集根据GPL570的注释文件将探针转换为gene symbol(多个探针对应同一个gene symbol 时，取其中值作为genesymbol的表达谱；一个探针对应多个gene symbol时去除该探针的表达)；芯片数据集只保留具有生存时间和生存状态的肺腺癌肿瘤样本。

对于临床数据，我们去除了没有生存时间和生存状态的的样本，过滤后的样本临幸统计信息见S1.xlsx。

我们从之前的研究中[参见文献9]收集了代谢相关的基因集，经过整理后共有2752个基因(metabilism_genes.txt)。

1.2一致性聚类分析

对于预处理之后的TCGA数据，首先，排除了所有LUAD患者中中位数绝对偏差(MAD)值(MAD≤0.5)的2752个与代谢相关的基因。使用生存数据利用R包survival(V3.1-12)的coxph函数对代谢基因进行单因素 cox分析，选择p<0.05作为阈值进行过滤；接下来使用R包 ConsensusClusterPlus(V 1.52.0)[参见文献10]对TCGA样本进行分子分型，选择最优的分型；然后分析分子亚型之间的的生存曲线(KM曲线)是否具有差异。然后使用基于T分布的随机邻居嵌入(t-SNE)的方法，使用上述代谢基因的mRNA表达数据来验证亚型分配。

针对GSEdat，同样使用R包ConsensusClusterPlus(V 1.52.0)对GSEdat 样本进行分子分型，然后使用Gene Pattern类别映射(SubMap)分析TCGA 与GSEdat的亚型之间的相似性，一种基于独立患者队列的表达谱评估分子类别之间相似性的方法，以确定在上述两个数据集中识别出的亚类是否相关。

此外，比较了不同分子亚型之间临床特征之间的分布差异，并进行了卡方检验，p<0.05认为是显著的。

1.3肺腺癌亚型的特征分析

肺腺癌之间的差异表达基因(DEG)使用R软件包limma[参见文献11] 包进行分析鉴定。将|FC|>1.5且FDR<0.05的基因定义为DEG。使用R软件包clusterprofiler[参见文献12]进行GO功能和KEGG途径富集分析，并且将显着性阈值设置为FDR<0.05。

1.4基于代谢相关基因特征的单样本基因集富集分析(ssGSEA)

基因集变异分析(Gene set variation analysis，GSVA)是一种非参数，无监督的基因集富集方法，可以根据转录组数据估算某些途径或标记的得分[参见文献13]。从先前发表的研究中获得了113个与代谢相关的基因特征[参见文献14]，我们使用ssGSEA的方法对免疫细胞进行免疫浸润的定量。我们使用R包GSVA[参见文献13]和GSEABase

(V1.50.1)对113个与代谢相关的基因特征评估。然后使用进行了秩和检验(Kruskal-Wallis Test)对亚型之间的免疫细胞浸润得分进行比较。

此外，基于之前的研究还从以前的研究中选择了免疫检查点[参见文献 15、16]，以便在亚型之间进行比较。然后，进行了Kruskal–Wallis测试。

1.5分子亚型的免疫微环境分析

我们使用MCP-counter[参见文献17]方法，该方法可从转录组数据对异质组织中的八个免疫细胞和两个基质细胞种群的绝对丰度进行稳健的定量(T cells、CD8 T cells、Cytotoxic lymphocytes、B lineage、NKcells、Monocytic lineage、Myeloid dendriticcells、Neutrophils)。然后使用进行了秩和检验 (Kruskal-Wallis Test)对亚型之间的免疫细胞浸润得分进行比较。

TIMER[参见文献18]是一款肿瘤浸润免疫细胞组分分析软件。支持以下6 种免疫细胞的分析：B cell、T cellCD4+、T cellCD8+、Neutrophil、Macrophage、 Myeloiddendritic cell。然后使用进行了秩和检验(Kruskal-Wallis Test)对亚型之间的免疫细胞浸润得分进行比较。

我们使用ESTIMATE的算法基于表达数据用于评估恶性肿瘤组织中的基质细胞和免疫细胞[参见文献19]。ESTIMATE算法是从公共网站 (https://sourceforge.net/projects/estimateproject/)获得的，用于根据与肿瘤样品中基质细胞和免疫细胞浸润相关的特定生物标记物来估计基质分数和免疫分数。基质分数和分数免疫分别分析来预测肿瘤组织中基质细胞和免疫细胞的水平。用来计算每个样品的StromalScore，ImmuneScore，ESTIMATEScore。随后，将它们在亚型之间进行比较，使用了秩和检验(Kruskal-Wallis Test)。

我们从之前的研究中[参见文献20]获得了二十八种免疫细胞标志物，使用ssGSEA进行分析，并比较不同亚型之间的得分差异，使用了秩和检验 (Kruskal-WallisTest)。

CIBERSORT[参见文献21]是基于线性支持向量回归(linear support vectorregression)的原理对人类免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积的工具，对未知混合物和含有相近的细胞类型的表达矩阵的去卷积分析优于其他方法。该方法是基于已知参考集，提供了22种免疫细胞亚型的基因表达特征集： LM22。我们基于官方提供的22种免疫细胞亚型的基因使用CIBERSORT 对LUAD数据进行免疫浸润的评估，然后使用进行了秩和检验(Kruskal-Wallis Test)对亚型之间的免疫细胞浸润得分进行比较。

1.6分子亚型与现有分子分型的比较

之前的研究中将TCGA分为6中免疫亚型，六种类型的免疫浸润在人肿瘤中鉴定了从对应肿瘤促进对肿瘤抑制因子，它们分别是C1(伤口愈合)， C2(INF-γ占优势)，C3(炎症)，C4(淋巴细胞耗竭)，C5(在免疫学上沉默)和C6

(TGF-beta占优势)[参见文献22]。我们的分子亚型与现有的分子亚型之间进行比较，比较我们的分子亚型与现有分子亚型的区别和联系。

1.7分子亚型之间的SNV以及CNV

我们使用maftools(V2.4.05)软件包[参见文献23]用于分析和可视化分子亚型之间的突变数据。我们选取了在肺腺癌中突变频率最高的基因，使用 maftools进行可视化，并使用卡方检验对不同亚型种的突变分布进行检验。

此外，我们使用GISTIC(genomic identification of significant targets incancer)来鉴定肺腺癌种基因的拷贝数扩增与缺失[参见文献24～26]。我们将阈值设为0.2与-0.2，大于0.2的认为是扩增，小于-0.2的认为是缺失，我们将在肺腺癌中常见的有意义的突变基因的扩增与缺失进行可视化，并使用卡方检验对不同亚型种的突变分布进行检验。

1.8分类器的生成和性能验证

我们选择每个亚型特有的前20个差异基因(仅选择FC>0的基因，三个亚型一共60个基因)，使用进行ConsensusClusterPlus进行预测分析，并将结果与以前的基于ConsensusClusterPlus算法的分类结果进行比较。

1.9预测免疫疗法和靶向疗法对每个亚类的益处

通过基于SubMap分析(基因模式)测量亚类和黑素瘤患者之间基因表达谱的相似性，使用接受免疫疗法治疗的黑素瘤患者的可用数据通过预测亚类和黑素瘤患者之间基因表达谱的相似性来间接预测亚类免疫疗法的疗效[参见文献27,28]。

此外，我们还使用R包pRRophetic[参见文献29]来预测药物 Bexarotene、Doxorubicin、Embelin、Etoposide、Gemcitabine、Mitomycin C、 Vinorelbine、Cisplatin等在我们的分子亚型中的IC50的敏感性。

2结果分析

2.1数据预处理的结果分析

使用sva包[参见文献8]的ComBat功能消除GSE19188[参见文献1]、 GSE29013[参见文献2]、GSE30219[参见文献3]、GSE31210[参见文献4]、 GSE37745[参见文献5]、GSE50081[参见文献6]等六个数据集之间的批次效应，合并为同一个数据集，以下简称为GSEdat。

数据集消除批次效应前后分别使用PCA分析，从图1中看：1)六个GSE 数据集，没有消除批次效应之前数据区分很明显，而进行批次效应后，数据集的数据已经无法区分，说明数据集之间已经没有差异。

2.2构建基于代谢相关的基因的分子亚型

从先前的研究中选择了2752个与代谢相关的基因。首先，排除了所有LUAD患者中中位数绝对偏差(MAD)值(MAD≤0.5)的基因，使用生存数据利用R包survival(V3.1-12)的coxph函数对免疫甲基化位点进行单因素cox分析，选择p<0.05作为阈值进行过滤(metabilism_genes_sigcox.csv)；接下来使用R包ConsensusClusterPlus对TCGA样本进行分子分型(参数： clusterAlg＝"km"，distance＝"euclidean")，选择K＝3时将其分为3组。三个子类分别命名为C1，C2和C3。当k＝3时，共识矩阵热图仍保持清晰锐利的边界，表明样本的聚类稳定且稳健。为了验证子类的分配，我们还执行了t-SNE 来减小特征的维数，发现TCGA子类型名称在很大程度上与二维t-SNE分布模式一致(图2中的A)。随后，我们对来自GEO数据库的GSEdat样本的数据集进行了单独的聚类分析。揭示了LUAD存在三种不同的分子亚类。为了验证子类的分配，我们还执行了t-SNE来减小特征的维数，发现GSE 子类型名称在很大程度上与二维t-SNE分布模式一致(图2中的A)。然后进行SubMap分析以确定在上述两个数据集中标识的子类是否相关(图2中的B)，结果表明：GSEdat数据集中的C1，C2和C3子类与TCGA中的相应子类高度相关，表明存在三种具有不同基因表达模式的LUAD分子亚类。

2.3分子亚型的生存分析

如图3我们将TCGA和GSEdat的样本分成三个亚型，我们是使用 Kaplan–Meier方法绘制了分子亚型之间的生存曲线(图3)，结果表明：TCGA 数据中亚型C1的预后最好，亚型C2的预后最差，而亚型C3的预后介于 C2与C1之间(图3中的A)；GSE数据集中的三个亚型的预后同样具有差异，并且与TCGA的结果保持一致

2.4不同亚型之间临床特征的比较

我们比较了TCGA数据集不同分子亚型中生存状态、年龄、性别、T Stage、N Stage、MStage、Smoking以及Stage在分子亚型之间的分布(图4)，并使用卡方检验进行检验分组件是否存在差异，结果发现：1)生存状态在分子亚型之间的分布存在差异，C2亚型中的死亡比例高于C1、C3亚型；2)T Stage、N Stage、Stage在不同的分子亚型中的比例具有差异；3)Age、性别在不同的分子亚型中的比例具有差异。

2.5肺腺癌分子亚型特异基因鉴定以及功能富集分析

我们使用limma包分别计算亚型与其他亚型之间的差异基因，并使用 FDR<0.05且|FC|>1.5为阈值鉴定差异基因。其中，亚型C1的差异基因有 1869个(C1_limma_filtered.csv)，亚型C2的差异基因有2203个 (C2_limma_filtered.csv)，亚型C3的差异基因有236个 (C3_limma_filtered.csv)。我们使用R软件包ClusterProfiler(v3.16.0)[参见文献12]分别对亚型C1、C2、C3的差异基因进行KEGG通路分析和GO功能富集分析，结果显示：1)亚型C1的中上调的差异基因与Drug metabolism-cytochrome P450、Intestinalimmune networkfor IgAproduction等通路密切相关(tcga_C1_up_gokegg_plot.pdf、tcga_C1_up_gokegg_dat.csv)；亚型C1的中下调的差异基因与Cell cycle、p53signaling pathway、DNA replication、Mismatch repair等通路密切相关(tcga_C1_dn_gokegg_plot.pdf、 tcga_C1_dn_gokegg_dat.csv)；2)亚型C2的中上调的差异基因与Cellcycle、 p53 signaling pathway、Smallcelllung cancer、Ferroptosis等通路密切相关 (tcga_C2_up_gokegg_plot.pdf、tcga_C2_up_gokegg_dat.csv)；亚型C2的中下调的差异基因与Cytokine-cytokine receptor interaction、Th17 cell differentiation等通路密切相关(tcga_C2_dn_gokegg_plot.pdf、 tcga_C2_dn_gokegg_dat.csv)；3)亚型C3的中上调的差异基因与PI3K-Akt signaling pathway、Cytokine-cytokine receptorinteraction、IL-17signaling pathway、TNF signaling pathway等通路密切相关 (tcga_C3_up_gokegg_plot.pdf、tcga_C3_up_gokegg_dat.csv)；亚型C3的中下调的差异基因与PI3K-Akt signaling pathway、Metabolismof xenobiotics by cytochrome P450等通路密切相关(tcga_C3_dn_gokegg_plot.pdf、 tcga_C3_dn_gokegg_dat.csv)。

从以上结果可以看出：C1亚型中上调的基因与代谢相关，而下调与肿瘤通路相关；C2亚型与C1亚型正好相反，C2中上调基因与肿瘤通路更加的相关，而下调基因与代谢相关；C3亚型中不管是上调基因还是下调基因，同时与同流和代谢通路相关，这说明C3亚型可能是C1和C2亚型的过渡亚型。

此外，GSEA被用于鉴定每个亚类中富集的途径，对亚类特异性基因的途径分析。

2.6分子亚型上的代谢特征比较

考虑到分类是基于与代谢相关的基因，我们进一步探讨了不同的亚类是否具有不同的代谢特征。首先，使用gsva软件包利用TCGA数据对113个新陈代谢过程进行了ssGSEA量化。然后对不同亚型之间的代谢过程得分进行比较，其中亚型C1中有52个代谢过程的ssGSEA得分高于C2、C3亚型 (tcga_ssgsea_res_C1_plot.pdf)；亚型C2中有35个代谢过程的ssGSEA得分高于C1、C3亚型(tcga_ssgsea_res_C2_plot.pdf)；亚型C2中有10个代谢过程的ssGSEA得分高于C1、C2亚型(tcga_ssgsea_res_C3_plot.pdf)。然后我们将这些代谢过程以热图的形式展现(图5)。

为了进一步研究子类的特征，使用GSVA算法选择并量化了19个 humansignatures[参考文献30]相关的标志。然后发现这19种标志在亚型之间同样具有显著的差异(图6)。

2.7分子亚型免疫浸润评分(免疫微环境)比较

我们使用MCP-counter[参考文献17]、TIMER[参考文献18]、 ESTIMATE[参考文献19]、ssGSEA、CIBERSORT[参考文献21]等五种方法对 TCGA进行免疫浸润评估，然后比较不同亚型不同免疫细胞得分的差异，结果发现：亚型C1的免疫浸润得分较高，并且不同的软件的评估结果较为一致 (tcga_cibersort_plot.pdf、tcga_Timerplot.pdf、tcga_ssGSEAplot.pdf、 tcga_MCPcounter_plot.pdf、tcga_estimate_plot.pdf)。此外为了更加直观的展示不同亚型之间的免疫浸润情况，我们将五种软件的评估结果绘制了热图(图7)。

此外，我们从之前的研究中找到免疫检查点相关的基因[参考文献15、16、 31]，比较这些免疫检查点基因在不同亚型中的表达情况，结果发现：免疫检查点基因在亚型之间的表达具有显著的差异(图8)。

2.8分子亚型与现有免疫分子亚型的比较

六种类型的免疫浸润在人肿瘤中鉴定了从对应肿瘤促进对肿瘤抑制因子，他们分别是C1(伤口愈合)，C2(INF-r占优势)，C3(炎症)，C4(淋巴细胞耗竭)，C5(在免疫学上沉默)和C6(TGF-beta占优势)[参考文献 22]。TCGA数据中的大多数LUAD患者属于C2免疫亚型，LUAD数据中没有C5、C6免疫亚型；同时还有之前分类的Differentiated、Immunoreactive、 Mesenchymal和Proliferative四种亚型。通过生存曲线分析发现这免疫亚型在OS时间上个亚型之间据具有显著的差异(图9，P<0.05)，并且C3的预后较好。我们比较了我们的三种亚型与现有的亚型之间的样本分布 (Fig9ABC)，发现与现有免疫亚型比较，我们的亚型中包含的免疫亚型分布具有差异；预后较好的C1亚型中免疫亚型占比达到75％，预后最差的C2亚型包含免疫亚型的占比达到50％。

此外，我们从现有的研究中获取了TCGA数据集中的Wound.Healing、IFN.gamma.Response、TGF.beta.Response、Proliferation、Leukocyte.Fraction以及SNV.Neoantigens等信息[参见文献22]，然后比较不同亚型中的差异，结果发现：这些特征在三个亚型之中具有显著的区别。

2.9分子亚型之间的突变比较

我们使用maftools(V2.4.05)软件包[参考文献23]用于分析和可视化分子亚型之间的突变数据。我们选取了在肺腺癌中突变频率最高的钱20个基因，使用maftools进行可视化，同时我们计算了每一个样本的TMB并比较了分子亚型中的TMB的分布差异，结果发现预亚型之间的TMB具有显著的差异，基因的突变频率同样具有显著的差异(图11)。

2.10分子亚型之间拷贝数变化的比较

我们使用GISTIC(genomic identification of significant targets incancer) 来鉴定肺腺癌种常见基因的拷贝数扩增与缺失[参考文献24-26]。我们将阈值设为0.2与-0.2，大于0.2的认为是扩增，小于-0.2的认为是缺失，我们将在肺腺癌中常见的有意义的突变基因的扩增与缺失进行可视化(图12中 ABC)，并使用卡方检验对不同亚型种的突变分布进行检验，然后发现：基因 PCLO、KRAS、RYR2等基因在三个亚型中的分布存在显著的差异(图12中 D-I)。

2.11基于差异基因的重分类比较

差异分析产生了亚型C1的差异基因有1869个，亚型C2的差异基因有 2203个，亚型C3的差异基因有236个。为了建立用于临床的分类器，有必要选择信息量最高的亚类相关的签名基因。在综合考虑准确性和临床应用潜力之后，选择每个亚类中FC值>0的前20个基因用于亚类分类器的开发。因此，生成了一个60基因分类器，随后使用60基因分类器在数据集中重复了 TCGA数据的亚型预测。评估了与基于Consensus Cluster Plus的原始预测的一致性，我们观察到C1子类的一致性为74％，C2子类的一致性为66％，C3子类的一致性为58％。

2.12分子亚型之间免疫治疗的反应比较

在LUAD亚类中，不同的免疫浸润模式和免疫检查点基因的表达水平表明，应对免疫疗法的可能性有待进一步研究。使用亚类作图，我们将三种LUAD 亚型(C1，C2和C3)的表达谱与另一个已发布的数据集进行了比较，该数据集包含接受了NIVOLUMAB或PEMBROLIZUMAB治疗的患者(图14中 A、B)。针对TCGA数据比较C3组与PEMBROLIZUMAB反应组的表达谱时，存在显着相关性，这表明C3组的患者PEMBROLIZUMAB治疗的反应更有希望。同时，在GSE数据的三个亚型中，比较C3组与PEMBROLIZUMAB 反应组的表达谱时，存在显着相关性(P<0.05)，这表明C3组的患者对 PEMBROLIZUMAB治疗的反应更有希望，这一点与TCGA数据较为一致。

此外，我们还计算了Bexarotene、Doxorubicin、Embelin、Etoposide、Gemcitabine、Mitomycin C、Vinorelbine、Cisplatin等八种药物的IC50，然后比较他们在不同亚型之间的差异，结果发现：这八种药物在TCGA数据和 GSE数据中的亚型中均存在显著的差异，并且在不同的亚型中趋势表现一致。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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Claims

1.以如下基因为标志物，在制备肺腺癌患者预后的产品中的应用；

所述基因包括NOSTRIN、PDK4、DNASE1L3、ERN2、JPH1、ITLN2、TGFBR3、BEX2、PIP5KIB、HMGCS2、RSPO4、GPX3、GRIA1、HIF3A、ALKAL2、SOX13、UPK3B、GNMT、ADAMTSL3、DACT2、PKNOX2、SVEP1、XAGE2、GANC、GSTA2、S100P、SLC7A11、INSL4、FGA、RHCG、ARL14、FAM83B、MAGEA4、AKAP12、IGFBP1、SRXN1、SPX、EPS8L3、KLK8、MAGEAI、G6PD、CDK6、AKR1C4、GCLM、SERPINB3、MAGEB2、CA12、RND3、UGDH、TFRC、PREP、SFRP2、MMP11、CILP、CA9、ITPKA、COL1A1、CCL20、C6orf223、GALNT6、PLPP4、TFP12、LRRC15、GALNT14、COL10A1、MB、TNC、TBX15、SPP1、PLAU、KLK12、SULF1、CILP2、P2RY6或CST1中至少一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预后包括对肺腺癌进行分型、预测药物有效性、预测治疗方案有效性、预测患者生存率和/或评估患者的免疫细胞浸润得分。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分型包括：将肺腺癌分为三个类型，其中：

C1亚型主要与代谢信号通路相关；

C2亚型主要与肿瘤信号通路相关；

C3亚型与代谢与肿瘤信号通路都相关。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述预测患者生存率包括三个亚型中，C1亚型的预后最好，C2亚型的预后最差，亚型C3的预后介于C2与C1之间。

5.根据根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物包括Bexarotene、Doxorubicin、Embelin、Etoposide、Gemcitabine、Mitomycin C、Vinorelbine或Cisplatin中至少一种。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗方案包括免疫治疗；所述免疫治疗包括nivolumab治疗或pembrolizumab治疗。

7.根据权利要求2或6所述的应用，其特征在于，所述预测治疗方案有效性包括，三个亚型中C3亚型的患者对pembrolizumab治疗的反应最好。

8.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述预测患者生存率中，三个亚型中C2亚型的死亡率高于C1亚型或C3亚型。

9.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述评估患者的免疫细胞浸润得分中，三个亚型中C1亚型的免疫浸润得分最高。

10.一种肺腺癌患者预后的产品，其特征在于，包括检测如下基因的试剂：所述基因包括NOSTRIN、PDK4、DNASE1L3、ERN2、JPH1、ITLN2、TGFBR3、BEX2、PIP5KIB、HMGCS2、RSPO4、GPX3、GRIA1、HIF3A、ALKAL2、SOX13、UPK3B、GNMT、ADAMTSL3、DACT2、PKNOX2、SVEP1、XAGE2、GANC、GSTA2、S100P、SLC7A11、INSL4、FGA、RHCG、ARL14、FAM83B、MAGEA4、AKAP12、IGFBP1、SRXN1、SPX、EPS8L3、KLK8、MAGEAI、G6PD、CDK6、AKR1C4、GCLM、SERPINB3、MAGEB2、CA12、RND3、UGDH、TFRC、PREP、SFRP2、MMP11、CILP、CA9、ITPKA、COL1A1、CCL20、C6orf223、GALNT6、PLPP4、TFP12、LRRC15、GALNT14、COL10A1、MB、TNC、TBX15、SPP1、PLAU、KLK12、SULF1、CILP2、P2RY6或CST1中至少一种。