CN114414440A - 具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供一种具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，包括：制作表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片；对培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理；在亲水化处理后的培养皿中加入含有荧光颗粒的聚丙烯酰胺预聚液，采用所述表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印所述聚丙烯酰胺预聚液，待聚丙烯酰胺溶液凝固后，得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底。本公开通过微接触印刷技术在聚丙烯酰胺凝胶基底上实现单细胞图案阵列，制作出表面具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底，该方法具备在单一装置中规则排列大量细胞的特点，制备简便易行，且一次成型，无需多余操作，为高通量单细胞力谱测试提供良好的基础。
Description
技术领域
本公开涉及细胞力学测量技术领域，尤其涉及一种基于微接触印刷技术实现的表面具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法。
背景技术
细胞所处的力学环境研究近些年越来越受到人们的重视。在生物体内，细胞与细胞外基质之间的连接和相互作用构成了绝大多数细胞赖以存活和生长的力学环境。细胞牵引力是指细胞与周围环境之间的相互作用力，细胞的粘附、铺展和迁移等行为都是通过细胞牵引力来驱动的。很多重要的生理活动，如胚胎发育、伤口愈合和免疫反应等，都需要细胞牵引力的作用。
对于细胞牵引力的测量和研究主要依靠牵引力显微镜(Traction ForceMicroscopy，TFM)技术，其主要设计是，在柔性聚丙烯酰胺水凝胶基底中均匀分布荧光颗粒，细胞的运动、粘附与解离等过程会引起凝胶基底的形变，进而引起基底中荧光颗粒的位移变化，通过荧光显微镜拍摄这些过程中荧光颗粒位移发生变化的图像，并利用数字相关图像方法、傅里叶变换等方式反演出细胞牵引力。
聚丙烯酰胺凝胶的弹性模量可以由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，凝胶的多孔性和弹性为细胞提供了比硬基底更近似体内的生长环境。
在传统的细胞牵引力显微镜技术中，所使用的细胞培养装置大多以盖玻片或共聚焦培养皿的玻璃基底作为聚丙烯酰胺凝胶的支撑基底，当进行大批量实验时，具有通量较低、制作时间较长，操作过程复杂等缺陷，而且大批量制作柔性基底培养皿，难以保证差异最小化，对实验稳定性的影响难以忽略。
发明内容
(一)要解决的技术问题
有鉴于此，本公开的主要目的在于提出一种基于微接触印刷技术实现的表面具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法。
(二)技术方案
本公开的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，该方法包括：
制作表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片；
对培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理；以及
在亲水化处理后的培养皿中加入含有荧光颗粒的聚丙烯酰胺预聚液，采用所述表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印所述聚丙烯酰胺预聚液，待聚丙烯酰胺溶液凝固后，得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底。
上述方案中，所述制作表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片，包括：设计带有单细胞微图案阵列的光刻掩膜板；利用所述光刻掩膜板制备带有单细胞微图案阵列的硅片模板，采用聚二甲基硅氧烷翻膜复刻所述硅片模板上的单细胞微图案阵列，得到具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章；将至少含有胶原和纤连蛋白的细胞外基质蛋白表衬在具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章上，并采用微接触印刷的方式将细胞外基质蛋白转印到盖玻片上，得到表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片。
上述方案中，所述光刻掩膜板采用铬板材料或菲林材料。
上述方案中，所述单细胞微图案阵列依据单细胞铺展面积具有不同的形状和尺寸。所述单细胞微图案阵列的形状包括等边三角形、圆形、正方形中的至少一种，所述单细胞微图案阵列的面积为850-1500平方微米。
上述方案中，所述利用所述光刻掩膜板制备带有单细胞微图案阵列的硅片模板，是利用软光刻技术在高精度紫外曝光光刻机上制备带有单细胞微图案阵列的硅片模板，所述硅片模板的厚度为30-50微米。所述采用聚二甲基硅氧烷翻膜复刻所述硅片模板上的单细胞微图案阵列，得到具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章，是采用聚二甲基硅氧烷翻膜复刻所述硅片模板上的单细胞微图案阵列，并采用打孔器将聚二甲基硅氧烷模板处理成直径为18毫米的圆形片。
上述方案中，所述将至少含有胶原和纤连蛋白的细胞外基质蛋白表衬在具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章上，是将单细胞尺寸的细胞外基质微图案阵列通过微接触印刷技术转印到聚二甲基硅氧烷印章表面，采用的活化细胞外基质蛋白的试剂为高碘酸钠。所述细胞外基质微图案阵列为细胞外基质微图案“小岛”阵列，采用质量百分比为3.6mg/mL高碘酸钠活化细胞外基质蛋白，并将活化的基质蛋白孵育在含有单细胞微图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章表面。
上述方案中，所述采用微接触印刷的方式将细胞外基质蛋白转印到盖玻片上，是采用微接触印刷技术将聚二甲基硅氧烷印章表面的蛋白转印到直径为18毫米的盖玻片表面。
上述方案中，所述对培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理，包括：在培养皿底部的玻璃衬底上依次修饰羟基、氨基和醛基，将培养皿底部的玻璃衬底由疏水性变为亲水性。所述在培养皿底部的玻璃衬底上依次修饰羟基、氨基和醛基，采用的处理试剂分别为甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和戊二醛。
上述方案中，所述培养皿采用共聚焦培养皿，采用甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和戊二醛对共聚焦培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理，包括：将共聚焦培养皿用超声清洗，并冲洗干净，备用；将共聚焦培养皿用质量百分比为0.1％氢氧化钠溶液或甲醇浸泡5分钟以上，之后室温晾干；在共聚焦培养皿底部的玻璃衬底表面涂布一层亲和硅烷溶液，该亲和硅烷溶液为质量百分比1％-50％的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(APTES)丙酮溶液，丙酮挥发后，3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷覆盖在玻璃衬底表面，反应5-30分钟，使玻璃衬底接上氨基；双蒸水清洗2-4次，每次3-5分钟；加入体积浓度为0.5％戊二醛磷酸盐缓冲液，通风厨中放置30分钟，接上醛基；用双蒸水清洗，晾干即可。
上述方案中，所述在亲水化处理后的培养皿中加入含有荧光颗粒的聚丙烯酰胺预聚液的步骤中，所述聚丙烯酰胺预聚液中含有：质量百分比为10％的丙烯酰胺，质量百分比为0.01％-1％的甲叉双丙烯酰胺，质量百分比为0.05％的过硫酸铵，质量百分比为0.05％的四甲基乙二胺(TEMED)，以及质量百分比为0.8％的直径为0.2-1微米的荧光颗粒。可选地，所述甲叉双丙烯酰胺的质量百分比为0.03％-0.26％。
上述方案中，所述采用所述表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印所述聚丙烯酰胺预聚液，是采用“三明治”方法，采用表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印含有荧光颗粒的聚丙烯酰胺预聚液，将培养皿倒置，待聚丙烯酰胺预聚液凝固后，即得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底。
上述方案中，所述得到的含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的步骤中，凝胶的厚度至少为70微米。可选地，所述凝胶的厚度为70-100微米。
上述方案中，该方法在得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底之后，还包括：对所述具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底进行灭菌，然后接种细胞实现高通量单细胞牵引力谱的测试。
上述方案中，所述接种细胞实现高通量单细胞牵引力谱的测试，包括：接种适当比例的各类细胞，待细胞黏附铺展后，依托激光共聚焦显微镜进行自动化图像识别和细胞相差与荧光图像扫描；利用数字图像相关方法和傅里叶变换牵引力显微术反演出细胞牵引力及响应药物刺激后牵引力的变化，实现细胞力学图谱的绘制，对细胞进行力学分型。
(三)有益效果
本公开提供的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，通过微接触印刷技术在聚丙烯酰胺凝胶基底上实现单细胞图案阵列，制作出表面具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底，该方法具备在单一装置中规则排列大量细胞的特点，制备简便易行，且一次成型，无需多余操作，图案阵列可以使接种上的细胞整齐排列，细胞一致性较高，为高通量单细胞力谱测试提供良好的基础。
本公开提供的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，主要制作环节为将光刻好的带有单细胞图案阵列的粘附“小岛”转印到聚丙烯酰胺凝胶表面，聚丙烯酰胺凝胶基底的制作通过采用将共聚焦培养皿的疏水性玻璃基底处理成亲水性，从而能牢牢粘附成胶后的聚丙烯酰胺水凝胶，紧密结合。
本公开提供的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，制得带有单细胞图案阵列的牵引力显微镜用的聚丙烯酰胺凝胶基底，能够将单细胞规则排列，以便进行高通量的细胞牵引力测量，一次性获得大量细胞的力学属性，进而实现细胞力谱分析，在高通量药物筛选等领域有较大应用潜力。
附图说明
为了更完整地理解本公开及其优势，现给出附图的具体描述，其中：
图1是依照本公开实施例的制作具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的方法流程图。
图2是依照本公开实施例的制作具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的工艺流程图。
图3是依照本公开实施例的细胞在聚丙烯酰胺水凝胶基底上贴附后的力场云图。
图4是依照本公开实施例的细胞牵引力的直方分布图。
具体实施方式
以下，将参照附图来描述本公开的实施例。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本公开的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本公开实施例的全面理解。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。
本公开实施例提出了一种制作具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的方法，该具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底是柔性聚丙烯酰胺水凝胶基底，能够将荧光标记颗粒均匀分布在聚丙烯酰胺水凝胶中，模拟体内环境下细胞粘附。在成胶前用设计有图案阵列的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板在聚丙烯酰胺水凝胶界面处压印出对应的图案阵列用以培养出单细胞图案阵列。由于细胞运动、粘附与解离等过程会引起凝胶基底的形变，进而引起荧光颗粒的位移变化，通过荧光显微镜拍摄这个过程中荧光颗粒位移发生变化的图像，并利用数字图像相关方法、傅里叶变换牵引力显微术等方式反演出细胞牵引力。本公开通过制作印有图案阵列的聚丙烯酰胺水凝胶基底，培养出单细胞图案阵列，进而运用细胞牵引力显微镜技术计算出细胞的牵引力，利于高通量细胞牵引力测试，形成细胞力学图谱，应用范围广泛。
如图1所示，图1是依照本公开实施例的制作具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的方法流程图，该方法包括如下步骤：
步骤S1：制作表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片，具体包括：
步骤S11：设计带有单细胞微图案阵列的光刻掩膜板；
在本公开实施例中，所述光刻掩膜板可以采用铬板材料或菲林材料。所述单细胞微图案阵列依据单细胞铺展面积具有不同的形状和尺寸，其中，所述单细胞微图案阵列的形状包括等边三角形、圆形、正方形中的至少一种，所述单细胞微图案阵列的面积为850-1500平方微米。
步骤S12：利用所述光刻掩膜板制备带有单细胞微图案阵列的硅片模板，采用聚二甲基硅氧烷翻膜复刻所述硅片模板上的单细胞微图案阵列，得到具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章；
在本公开实施例中，所述利用所述光刻掩膜板制备带有单细胞微图案阵列的硅片模板，是利用软光刻技术在高精度紫外曝光光刻机上制备带有单细胞微图案阵列的硅片模板，所述硅片模板的厚度为30-50微米。
在本公开实施例中，所述采用聚二甲基硅氧烷翻膜复刻所述硅片模板上的单细胞微图案阵列，得到具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章，是采用聚二甲基硅氧烷翻膜复刻所述硅片模板上的单细胞微图案阵列，并采用打孔器将聚二甲基硅氧烷模板处理成直径为18毫米的圆形片，以适应共聚焦培养皿玻璃衬底的大小。
步骤S13：将至少含有胶原和纤连蛋白的细胞外基质蛋白表衬在具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章上，并采用微接触印刷的方式将细胞外基质蛋白转印到盖玻片上，得到表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片。
在本公开实施例中，所述将至少含有胶原和纤连蛋白的细胞外基质蛋白表衬在具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章上，是将单细胞尺寸的细胞外基质微图案阵列通过微接触印刷技术转印到聚二甲基硅氧烷印章表面，采用的活化细胞外基质蛋白的试剂为高碘酸钠。
具体地，所述细胞外基质微图案阵列为细胞外基质微图案“小岛”阵列，采用质量百分比为3.6mg/mL高碘酸钠活化细胞外基质蛋白，并将活化的基质蛋白孵育在含有单细胞微图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章表面。
在本公开实施例中，所述采用微接触印刷的方式将细胞外基质蛋白转印到盖玻片上，是采用微接触印刷技术将聚二甲基硅氧烷印章表面的蛋白转印到直径为18毫米的盖玻片表面。
步骤S2：对培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理；
在本公开实施例中，所述对培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理，包括：在培养皿底部的玻璃衬底上依次修饰羟基、氨基和醛基，将培养皿底部的玻璃衬底由疏水性变为亲水性。具体地，所述在培养皿底部的玻璃衬底上依次修饰羟基、氨基和醛基，采用的处理试剂分别为甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和戊二醛。
具体地，所述培养皿采用共聚焦培养皿，采用甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和戊二醛对共聚焦培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理，包括：
步骤S21：将共聚焦培养皿用超声清洗，并冲洗干净，备用；
步骤S22：将共聚焦培养皿用质量百分比为0.1％氢氧化钠溶液或甲醇浸泡5分钟以上，之后室温晾干；
步骤S23：在共聚焦培养皿底部的玻璃衬底表面涂布一层亲和硅烷溶液，该亲和硅烷溶液为质量百分比1％-50％的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(APTES)丙酮溶液，丙酮挥发后，3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷覆盖在玻璃衬底表面，反应5-30分钟，使玻璃衬底接上氨基；
步骤S24：双蒸水清洗2-4次，每次3-5分钟；
步骤S25：加入体积浓度为0.5％戊二醛磷酸盐缓冲液，通风厨中放置30分钟，接上醛基；
步骤S26：用双蒸水清洗，晾干即可。
在本公开实施例中，所述培养皿底部的玻璃衬底可以采用共聚焦培养皿底部的玻璃衬底，也可以采用去底的普通塑料培养皿底部粘上盖玻片，底部的玻璃衬底以直径20毫米为最佳，玻璃基底易于取材，且成本适当。
由此可见，在本公开实施例中主要制作环节为将光刻好的带有单细胞图案阵列的粘附“小岛”转印到聚丙烯酰胺凝胶表面，聚丙烯酰胺凝胶基底的制作通过采用将共聚焦培养皿的疏水性玻璃基底处理成亲水性，从而能牢牢粘附成胶后的聚丙烯酰胺水凝胶，紧密结合。
步骤S3：在亲水化处理后的培养皿中加入含有荧光颗粒的聚丙烯酰胺预聚液，采用所述表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印所述聚丙烯酰胺预聚液，待聚丙烯酰胺溶液凝固后，得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底；
在本公开实施例中，所述聚丙烯酰胺预聚液中含有：质量百分比为10％的丙烯酰胺，质量百分比为0.01％-1％的甲叉双丙烯酰胺，质量百分比为0.05％的过硫酸铵，质量百分比为0.05％的四甲基乙二胺(TEMED)，以及质量百分比为0.8％的直径为0.2-1微米的荧光颗粒。
具体地，所述甲叉双丙烯酰胺的质量百分比为0.03％-0.26％。甲叉双丙烯酰胺含量的变化会带来制得的聚丙烯酰胺凝胶刚度的变化。本公开中制得的上述范围浓度的甲叉双丙烯酰胺含量的聚丙烯酰胺凝胶基底的一致性好。
在本公开实施例中，所述采用所述表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印所述聚丙烯酰胺预聚液，是采用“三明治”方法，采用表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印含有荧光颗粒的聚丙烯酰胺预聚液，将培养皿倒置，待聚丙烯酰胺预聚液凝固后，即得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底。
在本公开实施例中，利用预图案化的盖玻片压印聚丙烯酰胺凝胶预聚液，待凝胶固化后即可灭菌使用，若不立即使用，可在每个孔中加入双蒸水于低温储存。
在本公开实施例中，所述得到的含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的步骤中，根据实验需要，可以制作不同的凝胶厚度，凝胶的厚度至少为70微米。可选地，所述凝胶的厚度为70-100微米。
需要说明的是，在本公开实施例中，步骤S1是制作表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片，步骤S2是对培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理，步骤S3是在亲水化处理后的培养皿中加入含有荧光颗粒的聚丙烯酰胺预聚液，采用所述表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印所述聚丙烯酰胺预聚液，待聚丙烯酰胺溶液凝固后，得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底。在实际应用中，步骤S1可以是对培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理，步骤S2是制作表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片，这与本公开实施例提出的这种制作具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的方法在技术思路上是一致的，理应包含在本公开的保护范围内，这里就不再赘述。
至此，本公开实施例提供的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，通过微接触印刷技术在聚丙烯酰胺凝胶基底上实现单细胞图案阵列，制作出表面具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底，该方法具备在单一装置中规则排列大量细胞的特点，制备简便易行，且一次成型，无需多余操作，图案阵列可以使接种上的细胞整齐排列，细胞一致性较高，为高通量单细胞力谱测试提供良好的基础。
进一步地，本公开实施例提出的这种制作具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的方法，在得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底之后，还包括：对所述具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底进行灭菌，然后接种细胞实现高通量单细胞牵引力谱的测试。
采用本公开提供的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，制得带有单细胞图案阵列的牵引力显微镜用的聚丙烯酰胺凝胶基底，能够将单细胞规则排列，以便进行高通量的细胞牵引力测量，一次性获得大量细胞的力学属性，进而实现细胞力谱分析，在高通量药物筛选等领域有较大应用潜力。
其中，所述接种细胞实现高通量单细胞牵引力谱的测试，包括：
接种适当比例的各类细胞，待细胞黏附铺展后，依托激光共聚焦显微镜进行自动化图像识别和细胞相差与荧光图像扫描；
利用数字图像相关方法和傅里叶变换牵引力显微术反演出细胞牵引力及响应药物刺激后牵引力的变化，实现细胞力学图谱的绘制，对细胞进行力学分型。
实施例1
本公开的实施例1以具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作为例，进一步阐述本公开提供的这种具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法的实现过程。
如图2所示，图2是依照本公开实施例的制作具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的工艺流程图，具体包括以下步骤：
步骤1：玻璃板的活化；
1.1亲水性玻璃基底的制备，具体包括：
将共聚焦培养皿用超声清洗，并冲洗干净；
将共聚焦培养皿用质量百分比为0.1％氢氧化钠溶液或甲醇浸泡5分钟，之后室温晾干；
然后在共聚焦培养皿玻璃基底表面涂布一层体积浓度为4％的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液，丙酮蒸发后，3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷覆盖在玻璃基底表面，反应5-30分钟，使玻璃基底表面接上氨基；
双蒸水清洗2次，每次5分钟；
加入体积浓度为0.5％戊二醛磷酸盐缓冲液，通风厨中放置30分钟，接上醛基；
用双蒸水清洗，晾干即可。
1.2疏水性聚二甲基硅氧烷模板的制备，具体包括：
设计带有图案阵列的菲林材料的光刻模板，图案阵列可设计成不同形状，面积大小为850平方毫米至1500平方毫米的圆形、三角形、长方形等；
在光刻机上用掩膜来制作硅板，厚度为30-50微米；
以硅板为模板在匀胶机上制作聚二甲基硅氧烷压印模板，用打孔器将模板处理成直径18毫米的圆片；
步骤2：聚丙烯酰胺凝胶基底的制作；
按表1中的各成分混合，得到聚丙烯酰胺溶液。
表1聚丙烯酰胺溶液各成分
需要说明的是，由于用于长时间细胞培养的牵引力显微镜装置的无菌性要求较高，需将凝胶各组分提前进行过滤除菌，此步骤可在超净间或无菌操作台中进行。
将聚丙烯酰胺溶液滴在疏水玻璃基底上，将已制作的聚二甲基硅氧烷模板放在玻璃基底上，使聚丙烯酰胺溶液封闭在亲水玻璃基底和疏水聚二甲基硅氧烷模板之间，室温放置至凝固，一般放置30分钟。
取下聚二甲基硅氧烷模板，聚丙烯酰胺凝胶将与亲水玻璃基底以化学交联的形式结合在一起。
用双蒸水清洗2-3次，每次5分钟，清洗掉残留的荧光颗粒。
吸取sulfo-SANPAH覆盖于聚丙烯酰胺凝胶表面。
365纳米波长紫外灯管活化30分钟，玻璃基底离灯管距离为10厘米。
用50mM HEPES(pH8.5)清洗3次，每次5分钟，加入0.2mg/ml鼠尾I型胶原蛋白(typeI collagen)，4℃过夜，得到聚丙烯酰胺凝胶基底细胞培养装置。
聚丙烯酰胺凝胶基底细胞培养装置使用前紫外照射30分钟-2小时消毒。
图3是依照本公开实施例的细胞在聚丙烯酰胺水凝胶基底上贴附后的力场云图。如图3所示，细胞在聚丙烯酰胺水凝胶基底上贴附后的力场云图展示了细胞被限制成圆形之后牵引力的分布。细胞贴附基底后会呈现与基底图案一致的圆形，在拍摄细胞的荧光颗粒图像后，经计算得到细胞牵引力的力场云图。
图4是依照本公开实施例的细胞牵引力的直方分布图。如图4所示，在定量统计了大量细胞的牵引力数据之后，本公开绘制了细胞牵引力的直方分布图。其中，横坐标为牵引力的大小，纵坐标为一定牵引力范围的分布密度。
至此，已经结合附图对本公开进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本公开有了清楚的认识。
需要说明的是，在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，并未进行详细说明。此外，上述对各元件的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换。
当然，根据实际需要，本公开还可以包含其他的部分，由于同本公开的创新之处无关，此处不再赘述。
类似地，应当理解，为了精简本公开并帮助理解各个公开方面中的一个或多个，在上面对本公开的示例性实施例的描述中，本公开的各个特征有时被一起分组到单个实施例、图、或者对其的描述中。然而，并不应将该公开的方法解释成反映如下意图：即所要求保护的本公开要求比在每个权利要求中所明确记载的特征更多的特征。更确切地说，如下面的权利要求书所反映的那样，公开方面在于少于前面公开的单个实施例的所有特征。因此，遵循具体实施方式的权利要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本公开的单独实施例。
此外，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。说明书中示例的各个实施例中的技术特征在无冲突的前提下可以进行自由组合形成新的方案，另外每个权利要求可以单独作为一个实施例或者各个权利要求中的技术特征可以进行组合作为新的实施例。再者，附图中未绘示或描述的元件或实现方式，为所属技术领域中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。
除非存在技术障碍或矛盾，本公开的上述各种实施方式可以自由组合以形成另外的实施例，这些另外的实施例均在本公开的保护范围中。
虽然结合附图对本公开进行了说明，但是附图中公开的实施例旨在对本公开优选实施方式进行示例性说明，而不能理解为对本公开的一种限制。附图中的尺寸比例仅仅是示意性的，并不能理解为对本公开的限制。
虽然本公开总体构思的一些实施例已被显示和说明，本领域普通技术人员将理解，在不背离本总体公开构思的原则和精神的情况下，可对这些实施例做出改变，本公开的范围以权利要求和它们的等同物限定。
以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (20)
1.一种具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，该方法包括：
制作表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片；
对培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理；以及
在亲水化处理后的培养皿中加入含有荧光颗粒的聚丙烯酰胺预聚液，采用所述表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印所述聚丙烯酰胺预聚液，待聚丙烯酰胺溶液凝固后，得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底。
2.根据权利要求1所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述制作表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片，包括：
设计带有单细胞微图案阵列的光刻掩膜板；
利用所述光刻掩膜板制备带有单细胞微图案阵列的硅片模板，采用聚二甲基硅氧烷翻膜复刻所述硅片模板上的单细胞微图案阵列，得到具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章；
将至少含有胶原和纤连蛋白的细胞外基质蛋白表衬在具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章上，并采用微接触印刷的方式将细胞外基质蛋白转印到盖玻片上，得到表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片。
3.根据权利要求2所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述光刻掩膜板采用铬板材料或菲林材料。
4.根据权利要求2所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述单细胞微图案阵列依据单细胞铺展面积具有不同的形状和尺寸。
5.根据权利要求4所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述单细胞微图案阵列的形状包括等边三角形、圆形、正方形中的至少一种，所述单细胞微图案阵列的面积为850-1500平方微米。
6.根据权利要求2所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述利用所述光刻掩膜板制备带有单细胞微图案阵列的硅片模板，是利用软光刻技术在高精度紫外曝光光刻机上制备带有单细胞微图案阵列的硅片模板，所述硅片模板的厚度为30-50微米。
7.根据权利要求6所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述采用聚二甲基硅氧烷翻膜复刻所述硅片模板上的单细胞微图案阵列，得到具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章，是采用聚二甲基硅氧烷翻膜复刻所述硅片模板上的单细胞微图案阵列，并采用打孔器将聚二甲基硅氧烷模板处理成直径为18毫米的圆形片。
8.根据权利要求2所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述将至少含有胶原和纤连蛋白的细胞外基质蛋白表衬在具有单细胞图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章上，是将单细胞尺寸的细胞外基质微图案阵列通过微接触印刷技术转印到聚二甲基硅氧烷印章表面，采用的活化细胞外基质蛋白的试剂为高碘酸钠。
9.根据权利要求8所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述细胞外基质微图案阵列为细胞外基质微图案“小岛”阵列，采用质量百分比为3.6mg/mL高碘酸钠活化细胞外基质蛋白，并将活化的基质蛋白孵育在含有单细胞微图案阵列的聚二甲基硅氧烷印章表面。
10.根据权利要求2所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述采用微接触印刷的方式将细胞外基质蛋白转印到盖玻片上，是采用微接触印刷技术将聚二甲基硅氧烷印章表面的蛋白转印到直径为18毫米的盖玻片表面。
11.根据权利要求1所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述对培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理，包括：
在培养皿底部的玻璃衬底上依次修饰羟基、氨基和醛基，将培养皿底部的玻璃衬底由疏水性变为亲水性。
12.根据权利要求11所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述在培养皿底部的玻璃衬底上依次修饰羟基、氨基和醛基，采用的处理试剂分别为甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和戊二醛。
13.根据权利要求12所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述采用共聚焦培养皿，采用甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和戊二醛对共聚焦培养皿底部的玻璃衬底进行亲水化处理，包括：
将共聚焦培养皿用超声清洗，并冲洗干净，备用；
将共聚焦培养皿用质量百分比为0.1％氢氧化钠溶液或甲醇浸泡5分钟以上，之后室温晾干；
在共聚焦培养皿底部的玻璃衬底表面涂布一层亲和硅烷溶液，该亲和硅烷溶液为质量百分比1％-50％的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(APTES)丙酮溶液，丙酮挥发后，3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷覆盖在玻璃衬底表面，反应5-30分钟，使玻璃衬底接上氨基；
双蒸水清洗2-4次，每次3-5分钟；
加入体积浓度为0.5％戊二醛磷酸盐缓冲液，通风厨中放置30分钟，接上醛基；
用双蒸水清洗，晾干即可。
14.根据权利要求1所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述在亲水化处理后的培养皿中加入含有荧光颗粒的聚丙烯酰胺预聚液的步骤中，所述聚丙烯酰胺预聚液中含有：质量百分比为10％的丙烯酰胺，质量百分比为0.01％-1％的甲叉双丙烯酰胺，质量百分比为0.05％的过硫酸铵，质量百分比为0.05％的四甲基乙二胺(TEMED)，以及质量百分比为0.8％的直径为0.2-1微米的荧光颗粒。
15.根据权利要求14所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述甲叉双丙烯酰胺的质量百分比为0.03％-0.26％。
16.根据权利要求1所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述采用所述表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印所述聚丙烯酰胺预聚液，是采用“三明治”方法，采用表面具有单细胞微图案阵列的盖玻片压印含有荧光颗粒的聚丙烯酰胺预聚液，将培养皿倒置，待聚丙烯酰胺预聚液凝固后，即得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底。
17.根据权利要求1所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述得到的含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的步骤中，凝胶的厚度至少为70微米。
18.根据权利要求17所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述凝胶的厚度为70-100微米。
19.根据权利要求1所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，该方法在得到含有人造散斑且具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底之后，还包括：
对所述具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底进行灭菌，然后接种细胞实现高通量单细胞牵引力谱的测试。
20.根据权利要求19所述的具有单细胞图案阵列的聚丙烯酰胺凝胶基底的制作方法，其特征在于，所述接种细胞实现高通量单细胞牵引力谱的测试，包括：
接种适当比例的各类细胞，待细胞黏附铺展后，依托激光共聚焦显微镜进行自动化图像识别和细胞相差与荧光图像扫描；
利用数字图像相关方法和傅里叶变换牵引力显微术反演出细胞牵引力及响应药物刺激后牵引力的变化，实现细胞力学图谱的绘制，对细胞进行力学分型。
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Citations (7)
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|---|---|---|---|---|
| CN102680679A (zh) * | 2011-03-15 | 2012-09-19 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 检测单细胞特异性抗体分泌的细胞微孔芯片及其制备方法 |
| CN103998394A (zh) * | 2011-08-01 | 2014-08-20 | 德诺弗科学公司 | 细胞捕获系统和使用方法 |
| US20170145363A1 (en) * | 2015-11-20 | 2017-05-25 | National Health Research Institutes | Microfluidic dual-well device for highthroughput single-cell capture and culture |
| US20170350876A1 (en) * | 2016-08-19 | 2017-12-07 | Mohammad Abdolahad | Biosensor for single cell analysis |
| CN108546681A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-09-18 | 大连理工大学 | 细胞复刻表面及其应用 |
| CN112986063A (zh) * | 2021-01-18 | 2021-06-18 | 西北大学 | 高通量染色体和细胞骨架应变流式分析仪及实施方法 |
| CN113652389A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-11-16 | 北京大学 | 一种用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法 |
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2021
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102680679A (zh) * | 2011-03-15 | 2012-09-19 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 检测单细胞特异性抗体分泌的细胞微孔芯片及其制备方法 |
| CN103998394A (zh) * | 2011-08-01 | 2014-08-20 | 德诺弗科学公司 | 细胞捕获系统和使用方法 |
| US20170145363A1 (en) * | 2015-11-20 | 2017-05-25 | National Health Research Institutes | Microfluidic dual-well device for highthroughput single-cell capture and culture |
| US20170350876A1 (en) * | 2016-08-19 | 2017-12-07 | Mohammad Abdolahad | Biosensor for single cell analysis |
| CN108546681A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-09-18 | 大连理工大学 | 细胞复刻表面及其应用 |
| CN112986063A (zh) * | 2021-01-18 | 2021-06-18 | 西北大学 | 高通量染色体和细胞骨架应变流式分析仪及实施方法 |
| CN113652389A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-11-16 | 北京大学 | 一种用于药物筛选的三维水凝胶阵列的高通量制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JIANYONG HUANG: "Mechanical characterization of single cells based on microfluidic techniques", 《TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》, pages 47 - 57 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111154649A (zh) * | 2020-02-28 | 2020-05-15 | 苏州大学 | 用于制作多凹面凝胶片的印章及使用方法 |
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