CN113980884B - 用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法。按照源头控制、过程防范的原则，采用物理清洗+复合抗生素药浴法，去除细胞系源藻上附着的杂藻和微生物；微细管法分离并建立单配子细胞系，进一步减少杂藻污染概率；定期药浴和营养加富，清除细胞系培养过程中的微生物。本发明从配子释放、细胞系建立、细胞系扩培到发育诱导各环节，系统性防控杂藻和微生物，以净化细胞系。一方面有利于细胞系长期保存和健康快速生长；另一方面为附苗后长时间地静止培养，减少杂藻滋生，提供了条件。无污染的细胞系是萱藻细胞工程苗种繁育的根本保证。
Description
技术领域
本发明属于海藻栽培技术领域，具体涉及一种用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法。
背景技术
萱藻(Scytosiphon lomentaria)，隶属褐藻门(Phaeophyta)、萱藻科(Scytosiphonaceae)、萱藻属(Scytosiphon)，分布于温带地区沿岸海域，是一种泛温性大型海藻。富含氨基酸、岩藻多糖、类胡萝卜素、膳食纤维等营养成分，长期以来就是沿海居民喜爱的美食。萱藻还具有良好的抗肿瘤、抗病毒、抗氧化活性，尤其在抗血小板凝聚和抑制血栓方面作用独特，是纯天然的保健品及海洋药物原料。此外，作为一种近岸海域的大型藻类，是海洋生态环境中的重要初级生产力，在海洋牧场物质供应、营养盐调控及海洋生物栖息场提供等方面发挥着重要作用。因此，开展萱藻人工栽培，既是提供产品创造经济效益的需要，也是光合固碳、降低海水生源要素，改善海洋环境的需要。“细胞系建立—细胞系扩增—细胞系发育诱导—幼苗—养成”的技术工艺是一种运用细胞工程技术的萱藻栽培方法，具有能耗低、出苗稳定的特点，具有广泛的应用前景。
萱藻细胞工程苗种繁育就是根据植物细胞全能性原理，建立萱藻细胞系，将细胞系直接诱导成苗种进行培育的过程。无污染的细胞系是该体系的关键，一是有利于细胞系长期保存和健康快速生长；另一方面为附苗后长时间地静止培养，减少杂藻滋生，提供了条件。用于放散配子建立细胞系的种藻，通常附着大量的杂藻和微生物，是细胞系的污染源。这些杂藻和微生物在细胞系长期的培养过程中能够大量繁殖，不仅掠夺培养液中的营养物质，还会分泌有害的次生代谢产物，从而抑制细胞系的生长。因此，在萱藻细胞工程苗种繁育中，细胞系建立、细胞系培养以及生殖诱导各环节需要采取无损净化技术去除杂藻和微生物。
发明内容
为达到萱藻细胞系净化的目的，本发明提供了一种用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法，包括如下步骤：
(1) 种藻采集：采集成熟健康的萱藻叶状体，剪取具有配子囊的藻段，无损净化处理。
(2) 配子放散和附着：在超净工作环境下，阴干刺激藻段，放散配子，于培养皿中完成附着。
(3) 细胞系建立和净化：分离单配子细胞系，培养后镜检，剔除污染细胞系。
(4) 细胞系培养：在细胞系扩增培养和发育诱导过程中，定期药浴并冲洗，去除微生物。
用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法，具体步骤的实现方法如下：
在上述步骤(1)中种藻的采集方法为：1) 选择成熟健康、具配子囊斑的萱藻叶状体，海水冲洗表面附着的杂质，鲜活运至实验室。2) 剪取带有配子囊斑的藻段3-5 cm，使用灭菌脱脂棉和海水充分擦洗，擦洗过程中勤换脱脂棉。
在上述步骤(2)中配子放散和附着的方法为：1) 将充分清洗的步骤（1）的藻段置于含复合抑菌剂的18 ºC灭菌海水中药浴2 h。2) 药浴后的藻段移至培养皿中，在室温18℃的超净环境中阴干刺激2 h。3) 阴干后的藻段置入15 ℃海水中放散配子，当配子浓度达到3-5个/200×时，结束放散。4) 分装于培养皿中附着，控制室温15 ℃，培养皿底部配子密度达到1-2个/200×，结束附着。5) 完成附着后，更换加富 NO3-N 72 mg/L、PO4 3-P 6 mg/L的海水，在温度18 ℃、光周期L:D 10:14 h、光强2200 lx条件下培养。
在上述步骤(3)中细胞系建立和净化的方法为：附着于培养皿底部的配子，经过20天培养，形成80-100 μm大小的簇状细胞系。用微细管将单配子细胞系分离到盖玻片上，显微观察无污染后，置入试管中，脱脂棉封口培养，培养条件：温度20 ℃、光周期L:D 12:12h、光强3500 lx、培养液为加富NO3-N 72 mg/L、PO4 3-P 6 mg/L的海水。培养一个月后，逐一镜检，剔除有杂藻或明显微生物污染的细胞系。
在上述步骤(4)中萱藻细胞系培养的方法为：在细胞系扩增培养和发育诱导过程中，每月药浴一次，即采用400目筛绢收集细胞系，置于含有复合抑菌剂的海水中药浴2 h，再以海水充分冲洗，连续药浴三天。
上述步骤中有关萱藻细胞系的操作均在无菌超净工作台内进行。
上述步骤中所使用的器材都经过高温高压灭菌处理。
上述步骤中所使用的海水为自然海水经过脱脂棉和400目筛绢双重过滤，再以高温高压灭菌处理。
上述步骤中含有复合抑菌剂的海水的制备方法如下：采用市售的用于水产养殖的复合抑菌剂，其成分包含：氟甲砜霉素、盐酸多西环素、硫酸庆大霉素、细菌溶菌酶、抗菌肽、粘膜修复剂、增效剂，配制30 mg/L浓度复合抑菌剂的灭菌海水。
本方法的优点主要体现在以下几个方面：1) 本发明采用了系统性防控策略，从种藻采集、配子释放、细胞系建立和净化、细胞系扩培到发育诱导各环节都采取了适宜的净化处理，确保了细胞系全过程的健康。2) 采用的净化处理为无损技术，包括物理清洗和抗生素药浴，不会对细胞系造成明显损伤。3) 采用的净化技术，简便易行，便于生产推广应用。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步的解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1、用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法
选择成熟健康、具配子囊斑的萱藻叶状体，海水冲洗表面附着的杂质，置于15-18℃保温箱中，快速运回实验室。剪取5段长3-5 cm具有配子囊斑的藻段，置于培养皿中，以灭菌脱脂棉和灭菌海水充分擦洗，去除附着在藻体表面的杂藻和微生物。
将充分清洗的藻段置于30 mg/L复合抑菌剂的18 ℃灭菌的海水中药浴2 h，药浴后置于培养皿中，在室温18 ℃的超净环境中阴干刺激2 h。阴干后的藻段置入盛有15 ℃灭菌海水的培养皿中放散配子，每隔10 min，滴管吸取配子水，显微观察，配子浓度达到3-5个/200×时，结束放散。
配子水分装于20个9×9 cm培养皿中附着，控制室温15 ℃，显微观察，培养皿底部配子密度达到1-2个/200×，结束附着。更换加富 NO3-N 72 mg/L、PO4 3-P 6 mg/L的灭菌海水，置于温度18 ℃、光周期L:D 10:14 h、光强2200 lx的光照培养箱培养。
经过20天培养，附着于培养皿底部的配子形成80-100 μm大小的细胞系。以微细管将单配子细胞系分离到盖玻片上，显微观察无污染后，移至试管中，脱脂棉封口，置于温度20 ℃、光周期L:D 12:12 h、光强3500 lx培养箱中，培养一个月后，逐一镜检，剔除有杂藻或明显微生物污染的细胞系，得到100个无污染细胞系。
实施例2、用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法
取自实验室保存的萱藻细胞系，在超净环境中，手动玻片将簇状细胞系碾碎，移至三角培养瓶中，在温度22 ℃、光强3500 lx、光照周期L:D 12:12 h、培养液为加富NO3-N 72mg/L、PO4 3-P 6 mg/L灭菌海水的条件下扩增培养，每日手动摇瓶数次。
每15天更换一次培养液，采用400目筛绢收集细胞系，冲洗后，移入新配制的灭菌海水中。
每月药浴一次，筛绢收集细胞系，浸泡于30 mg/L复合抑菌剂的海水中2 h，再以海水充分冲洗，连续药浴三天。为保证细胞系快速生长，药浴结束后，将丛生成簇状的细胞系离解成50-200 μm的单列丝状，分瓶培养，控制密度在1 g/L以下。
经扩增培养的细胞系，生殖诱导前采用上述方法药浴处理一次。药浴后，转移至温度15 ℃、光强3500 lx、光照周期L:D 9:15 h、培养液为加富NO3-N 72 mg/L、PO4 3-P 6 mg/L、Fe3+ 0.6 mg/L 无菌海水的条件下诱导培养，每日手动摇瓶数次。每隔两天，显微观察细胞系发育状态，15天后，完成发育诱导过程。
实施例1和2采用了物理清洗、抗生素暴露、单配子细胞系构建以及抗生素药浴、营养盐加富等手段，系统性防控杂藻和微生物，以维持细胞系健康、快速地生长，从而保证萱藻细胞工程苗种繁育的顺利开展。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (4)
1.用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法，其特征在于它包括以下步骤：
（1）种藻采集：采集成熟健康的萱藻叶状体，剪取具有配子囊的藻段，无损净化处理；
（2）配子放散和附着：在超净工作环境下，阴干刺激藻段，放散配子，于培养皿中完成附着；
（3）细胞系建立和净化：分离单配子细胞系，培养后镜检，剔除污染细胞系；
（4）细胞系培养：在细胞系扩增培养和发育诱导过程中，定期药浴并冲洗，去除微生物；
其中，步骤(2)所述配子放散和附着步骤如下：1) 将充分清洗的步骤（1）的藻段置于含复合抑菌剂的海水18 ºC中药浴2 h；2) 药浴后的藻段移至培养皿中，在室温18 ℃的超净环境中阴干刺激2 h；3) 阴干后的藻段置入15 ℃海水中放散配子，当配子浓度达到3-5个/200×时，结束放散；4) 分装于培养皿中附着，控制室温15 ℃，培养皿底部配子密度达到1-2个/200×，结束附着；5) 完成附着后，更换加富 NO3-N 72 mg/L、PO4 3-P 6 mg/L的海水，在温度18 ℃、光周期L:D 10:14 h、光强2200 lx条件下培养；
步骤(3)所述细胞系建立和净化步骤如下：1)附着于培养皿底部的配子，经过20天培养，形成80-100 μm大小的簇状细胞系；2）用微细管将单配子细胞系分离到盖玻片上，显微观察无污染后，置入试管中，脱脂棉封口培养，培养条件：温度20 ℃、光周期L:D 12:12 h、光强3500 lx、培养液为加富NO3-N 72 mg/L、PO4 3-P 6 mg/L的海水；3）培养一个月后，逐一镜检，剔除有杂藻或微生物污染的细胞系；
步骤(4)所述细胞系培养步骤如下：在细胞系扩增培养和发育诱导过程中，每月药浴一次；所述药浴步骤如下：采用400目筛绢收集细胞系，置于含有复合抑菌剂的海水中药浴2h，再以海水充分冲洗，连续药浴3天。
2.根据权利要求1所述用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法，其特征在于步骤(1)所述种藻采集的步骤如下：1) 选择成熟健康、具配子囊斑的萱藻叶状体，海水冲洗表面附着的杂质，鲜活运至实验室；2) 剪取带有配子囊斑的藻段3-5 cm，使用灭菌脱脂棉和海水充分擦洗，擦洗过程中换脱脂棉4-10次。
3.根据权利要求1所述用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法，其特征在于有关萱藻细胞系的操作均在无菌超净工作台内进行；所使用的器材都经过高温高压灭菌处理；使用的海水为自然海水经过脱脂棉和400目筛绢双重过滤、再以高温高压灭菌处理的海水。
4.根据权利要求1所述用于萱藻细胞工程苗种繁育的细胞系净化方法，其特征在于所述含有复合抑菌剂的海水的制备方法如下：采用市售的用于水产养殖的复合抑菌剂，其成分包含氟甲砜霉素、盐酸多西环素、硫酸庆大霉素、细菌溶菌酶、抗菌肽、粘膜修复剂、增效剂，配制30 mg/L浓度复合抑菌剂的灭菌海水。
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