CN113789320A - 以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及固定化酶领域，公开了一种以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，向磁性Fe3O4纳米粒子水溶液中加入可溶性淀粉，持续搅拌后，冷却至室温得沉淀，经多次洗涤沉淀后冷冻干燥得磁性淀粉纳米粒子；向所述磁性淀粉纳米粒子中加入磷酸缓冲液A和戊二醛，于室温下交联后多次洗涤获得沉淀，然后加入磷酸缓冲液B及游离酶液，固定化期间不停搅拌，固定化结束后将体系冷却至室温获取沉淀，冷冻干燥即得磁性淀粉纳米粒子固定化酶。通过本发明制备的磁性淀粉纳米粒子固定化酶粒径小、酶活高，具有比游离酶更好的热稳定及pH稳定性，并具有较好的有机溶剂耐受性，将其用于相应的酶催化反应，体现出了具有较好的催化活性。
Description
技术领域
本发明涉及纳米复合材料领域，特别涉及一种以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法。
背景技术
酶是一类具有高效性、高专一性等特点的生物催化剂，它可以在生物体内和体外进行生物转化，但游离酶在与自然环境分离后结构不稳定、作用范围狭窄、对微量抑制剂较为敏感，严重阻碍了酶的工业化应用。因此，为了满足工业生产的要求，通过技术手段，提高酶的稳定性和环境耐受性，实现酶的回收利用成了研究的热点。
TRY及TLL被广泛地应用于食品、医药、生物等领域，但游离酶存在在有机溶剂体系中易失活，反应过后难与底物分离，且不可循环利用等局限，因此选择一种生物相容性较好的载体对其进行固定化是解决上述问题的有效途径之一。
利用化学或物理的方法，将游离酶固定在载体的表面或内部，以此对酶进行固定化是提高游离酶的稳定性和环境耐受性的有效方法。载体材料是决定固定化酶催化活性的一个关键部分，对酶的结构也有着深远的影响。磁性Fe3O4纳米粒子尺寸微小，可提供较高的比表面积，是近年来作为固定化酶载体的研究热点，但高表面能纳米颗粒在没有任何表面保护的情况下容易发生团聚，要保持磁性纳米颗粒的特异性，就需要对其进行表面保护，使其不会在空气中聚集和氧化。
磁性纳米粒子作为一种新型材料被广泛应用，其比表面积大，分离简单，因此也成为固定化酶载体的候选材料，但若将其直接用作载体往往会导致酶固定化效率不高。为了增强固定化过程中载体对酶的亲和力，往往需要对其表面进行修饰，使其具有更多的活性基团。淀粉分子结构中含有丰富的羟基基团，具有良好的亲水性和可修饰性能，是修饰包覆Fe3O4纳米粒子的良好生物材料。其作为Fe3O4表面改性剂己经应用于生物医学、核磁共振等领域材料的制备。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的游离酶在与自然环境分离后结构不稳定、作用范围狭窄、对微量抑制剂较为敏感，不适于工业化应用的问题，本发明提供一种以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，所得到的固定化酶相比游离酶具有粒径小、酶活回收率高、可重复利用、耐有机溶剂及热稳定性、pH稳定性好等优点。
技术方案：本发明提供了一种以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，包括如下步骤：磁性淀粉纳米粒子的制备：向磁性Fe3O4纳米粒子水溶液中加入可溶性淀粉，于80~110°C下持续搅拌0.5~3.0 h后，冷却至室温得沉淀，经多次洗涤沉淀后冷冻干燥得磁性淀粉纳米粒子；磁性淀粉纳米粒子固定化酶的制备：向所述磁性淀粉纳米粒子中加入磷酸缓冲液A和戊二醛，于室温下交联0.5~4.0 h后多次洗涤获得沉淀，然后加入磷酸缓冲液B及游离酶液，于20~55 °C固定化1.0~10.0h，期间不停搅拌，固定化结束后将体系冷却至室温获取沉淀，冷冻干燥即得磁性淀粉纳米粒子固定化酶。
优选地，所述磁性Fe3O4纳米粒子与可溶性淀粉的质量比为6:1~2:1。
优选地，所述磁性淀粉纳米粒子与磷酸缓冲液A的料液比为1:10~1:30 g/mL。
优选地，所述游离酶液与磷酸缓冲液B的料液比为1:20~1:50 g/mL。
进一步地，所述磁性Fe3O4纳米粒子的制备方法如下：向装有去离子水的容器中通氮气20~60 min，按摩尔比1:2~1:0.5分别加入Fe2+及Fe3+，在温度为40~100 °C下不停搅拌直至溶解，向容器中滴加已通氮气20~60 min的NaOH溶液，并不停搅拌，当pH到达9~12时停止滴加，继续通氮气搅拌一段时间，待体系稳定后使反应体系冷却至室温，多次洗涤后获得沉淀，对其进行冷冻干燥即得所述磁性Fe3O4纳米粒子。
优选地，所述NaOH溶液的摩尔浓度为1.0~3.0 mol/L。
优选地，所述 Fe2+来源于FeSO4·7H2O，所述Fe3+来源于FeCl3·6H2O。
优选地，所述游离酶液中的酶为胰蛋白酶Trypsin，TRY或脂肪酶，所述脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶Thermomyces lanuginosus lipase，TLL。
优选地，所述磷酸缓冲液A和磷酸缓冲液B的pH均为6.0~9.0；所述戊二醛的浓度为0.5~4.0% v/v。
优选地，所述固定化酶的制备过程中，搅拌转速为150~300 r/min。
优选地，在磁性淀粉纳米粒子的制备过程中，所述多次洗涤沉淀的洗涤方式为用去离子水清洗；在磁性淀粉纳米粒子固定化酶的制备过程中，所述多次洗涤沉淀的洗涤方式为用去离子水和相应pH的磷酸缓冲液交替清洗。
本发明中磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，具体包括如下步骤：
（1）磁性Fe3O4纳米粒子的制备：量取20~100 mL去离子水于三口瓶中，通氮气（纯度>99.9%）20~60 min，按摩尔比1:2~1:0.5分别加入Fe2+及Fe3+，在温度为40~100 °C的油浴锅中不停搅拌直至溶解。待完全溶解后，向三口瓶中滴加已通氮气（纯度>99.9%）20~60 min的1.0~3.0 mol/L的NaOH溶液，并不停高速搅拌，当到达一定pH时停止滴加，继续通氮气（纯度>99.9%）搅拌一段时间，待体系稳定后，利用其磁性获取沉淀，多次去离子水洗涤至上层清液透明，冷冻干燥后4 °C密封保存备用。
（2）磁性淀粉纳米粒子的制备：取0.5~2.0 g上述制备的Fe3O4溶于10~80 mL去离子水中并超声10~30 min以充分分散，将Fe3O4溶液转移到500 mL三口烧瓶中，加入与Fe3O4一定质量比的淀粉，于70~120 °C油浴锅中100~800 r/min的转速持续搅拌0.5~3.0 h后，冷却至室温，利用其磁性获取沉淀，多次洗涤至上层清液透明，冷冻干燥后4 °C密封保存备用。
（3）磁性淀粉纳米粒子固定化酶的制备：称取0.5~3.0 g 磁性淀粉纳米粒子加入5~30 mL一定pH磷酸缓冲液及一定浓度的戊二醛，于室温下100~500 r/min交联一段时间后利用其磁性获取沉淀，并用去离子水洗涤多次至上层清液透明。然后按一定料液比将游离酶液添加入反应瓶中，加入5~30 mL一定pH的磷酸缓冲液，在4~60 °C固定化0.5~24 h，期间不停搅拌，固定化结束后将体系冷却至室温，利用其磁性获取沉淀，多次洗涤至上层液体透明，冷冻干燥后4 °C密封保存备用。
有益效果：可溶性淀粉是由α-D-吡喃葡萄糖残基通过糖苷键连接而成的高聚物，因其具有较强的力学性能、较高的表面能和较高的生物相容性等无机纳米颗粒所不具备的特性，可用于对磁性Fe3O4纳米粒子进行修饰，既保护了内部的磁性Fe3O4纳米粒子，也在材料表面修饰了不同的官能基团，可用于TRY及TLL的固定化。本发明通过加入不同量可溶性淀粉对磁性Fe3O4纳米粒子进行表面修饰得到表面含有大量羟基、可用于TRY及TLL固定化的磁性淀粉载体（Fe3O4@Starch），再采用戊二醛交联的方式对TRY及TLL进行固定化，通过本发明制备的固定化TRY（Fe3O4@Starch@TRY）及固定化TLL（Fe3O4@Starch@TLL）粒径较小，酶活回收率高，具有比游离酶更好的热稳定及pH稳定性，并具有较强的有机溶剂耐受性。将Fe3O4@Starch@TRY用于催化酪蛋白的水解，所得水解液具有明显的DPPH自由基清除能力；将Fe3O4@Starch@TLL用于催化天麻苷与辛酸乙烯酯的酰化反应，转化率最高可达97.04%，具有较好的催化活性。
附图说明
图1为实施方式1至4中Fe3O4、Fe3O4@Starch、Fe3O4@Starch@TRY及Fe3O4@Starch@TLL的透射电镜图；
图2为实施方式1至4中TRY、Fe3O4@Starch@TRY及TLL、Fe3O4@Starch@TLL的热稳定性；
图3为实施方式1至4中TRY、Fe3O4@Starch@TRY及TLL、Fe3O4@Starch@TLL的pH稳定性；
图4为实施方式1至4中Fe3O4@Starch@TRY及Fe3O4@Starch@TLL的XPS图；其中A为Fe3O4、B为Fe3O4@Starch、C为Fe3O4@Starch@TRY、D为Fe3O4@Starch@TLL；
图5为实施方式1至4中酪蛋白样品的HPLC分析图谱；
图6为实施方式1至4中酪蛋白经Fe3O4@Starch@TRY酶解后的HPLC分析图谱；
图7为实施方式1至4中 Fe3O4@Starch@TRY酶解液的DPPH自由基清除率柱状图；
图8 为实施方式1至4中磁性淀粉及磁性淀粉固定化酶磁强（VSM）图；
图9 为实施方式1至4中磁性淀粉及磁性淀粉固定化酶的FT-IR图；
图10为实施方式1至4中 Fe3O4@Starch@TLL在水溶液中的分散（A）及外加磁场吸附作用（B）图；
图11为 实施方式1至4中TRY、Fe3O4@Starch@TRY及TLL、Fe3O4@Starch@TLL的有机溶剂耐受性图；
图12为实施方式1至4中天麻苷的HPLC分析图谱；
图13为实施方式1至4中天麻苷经Fe3O4@Starch@TLL催化酰化后的HPLC分析图谱；
图14为实施方式1至4中 Fe3O4@Starch@TLL的操作稳定性图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细的介绍。
实施方式1
磁性Fe3O4纳米粒子的制备：
取50 mL去离子水于三口瓶中，通纯度＞99.9%的氮气20 min，按摩尔比1:2加入Fe2+及Fe3+，在温度为50 °C的油浴锅中不停搅拌直至溶解。待完全溶解后，向三口瓶中滴加已通氮气20 min的1.0 mol/L的NaOH溶液，并不停高速搅拌，当溶液到达pH 10时停止滴加，继续通氮气搅拌1 h，待体系稳定后，利用其磁性获取沉淀，多次洗涤沉淀至上层清液透明，冷冻干燥后4 °C密封保存磁性Fe3O4纳米粒子备用。
磁性淀粉纳米粒子Fe3O4@Starch的制备：
取0.5 g上述制备的磁性Fe3O4纳米粒子溶于10 mL去离子水中并超声20 min以充分分散，将磁性Fe3O4纳米粒子溶液转移到500 mL三口烧瓶中，加入与磁性Fe3O4纳米粒子质量比为20%的可溶性淀粉，于90 °C油浴锅中200 r/min的转速持续搅拌1.0 h后，冷却至室温，利用其磁性获取沉淀，多次洗涤至上层清液透明，冷冻干燥后4 °C密封保存Fe3O4@Starch备用。
磁性淀粉纳米粒子固定化酶Fe3O4@Starch@TRY（或Fe3O4@Starch@TLL）的制备：
称取0.5 g磁性淀粉纳米粒子加入10 mL pH 7.0的磷酸缓冲液及浓度为2.0% v/v的戊二醛1.0 mL，于室温下200 r/min交联1.0 h后，利用其磁性获取沉淀，并用去离子水洗涤多次至上层清液透明。取5.0 mL游离TRY酶液（或TLL酶液）加入反应瓶中，再加入10 mLpH 7.0的磷酸缓冲液，在25 °C下固定化2 h，期间不停搅拌，固定化结束后将体系冷却至室温，利用其磁性获取沉淀，多次洗涤至上层液体透明，冷冻干燥后4 °C密封保存Fe3O4@Starch@TRY（或Fe3O4@Starch@TLL）备用。
实施方式2：
本实施方式与实施方式1大致相同，不同点仅在于：在磁性Fe3O4纳米粒子的制备过程中，Fe2+与Fe3+的摩尔比为1:1.5，制备温度为70 °C。
在磁性淀粉纳米粒子Fe3O4@Starch的制备过程中，加入与磁性Fe3O4纳米粒子质量比为30%的可溶性淀粉。
在磁性淀粉纳米粒子固定化酶Fe3O4@Starch@TRY（或Fe3O4@Starch@TLL）的制备过程中，戊二醛浓度为3.0% v/v，加入量为2.0 mL，交联时间为2.0 h，固定化温度为40 °C。
除此之外，本实施方式与实施方式1完全相同，此处不做赘述。
实施方式3：
本实施方式与实施方式1大致相同，不同点仅在于：在磁性Fe3O4纳米粒子的制备过程中，Fe2+与Fe3+的摩尔比为1:1，制备温度为60 °C。
在磁性淀粉纳米粒子Fe3O4@Starch的制备过程中，加入与磁性Fe3O4纳米粒子质量比为40%的可溶性淀粉。
在磁性淀粉纳米粒子固定化酶Fe3O4@Starch@TRY（或Fe3O4@Starch@TLL）的制备过程中，磷酸缓冲液的pH值为7.5，固定化温度为35 °C，固定化时间为4.0 h。
除此之外，本实施方式与实施方式1完全相同，此处不做赘述。
实施方式4：
本实施方式与实施方式1大致相同，不同点仅在于：在磁性Fe3O4纳米粒子的制备过程中，Fe2+与Fe3+的摩尔比为1:0.5，制备温度为80 °C。
在磁性淀粉纳米粒子Fe3O4@Starch的制备过程中，加入与磁性Fe3O4纳米粒子质量比为25%的可溶性淀粉，时间为1.5 h。
在磁性淀粉纳米粒子固定化酶Fe3O4@Starch@TRY（或Fe3O4@Starch@TLL）的制备过程中，戊二醛浓度为2.5% v/v，加入量为2.5 mL，交联时间为1.5 h，磷酸缓冲液的pH值为7.5，固定化温度为45 °C，固定化时间为8.0 h。
除此之外，本实施方式与实施方式1完全相同，此处不做赘述。
对上述实施方式1至4中制备得到的的磁性Fe3O4纳米粒子进行透射电镜分析，结果如图1（A）所示：Fe3O4的粒径约为7.3±2.1 nm，呈现出清晰的较为规则的球型。对其进行X射线元素分析，结果如图2（A）所示：在529.97 eV和709.97 eV出现了Fe3O4的O 1s和Fe 2p特征峰，且没有其他元素，表明本发明制备的磁性Fe3O4纳米粒子纯度较高。
对上述实施方式1至4中制备得到的Fe3O4@Starch进行透射电镜分析，结果如图1（B）所示：Fe3O4@Starch的粒径约为12.5±3.7 nm，在包覆可溶性淀粉以后，由Fe3O4较为规则的球型变为了具有棱角的方形，这可能是由于可溶性淀粉的结晶结构导致的，其形状的改变也表明了可溶性淀粉的成功包覆。对其进行X射线元素分析，结果如图2（B）所示：在284.97 eV处出现了C 1s峰，且O 1s的峰面积比Fe3O4更大，由此推断出可溶性淀粉已经成功包覆在Fe3O4表面。
对上述实施方式1至4中制备得到的Fe3O4@Starch@TRY及Fe3O4@Starch@TLL进行透射电镜分析，结果如图1（C）及1（D）所示：Fe3O4@Starch@TRY的粒径约为16.6±3.2 nm，Fe3O4@Starch@TLL的粒径约为18.3±4.1 nm，颗粒的形状又由方形变为了不规则的球型，颗粒表面变得粗糙，且颗粒轮廓相对变得模糊，这直观的体现出了酶的成功固定化。对其进行X射线元素分析，结果如图2（C）及2（D）所示：在132.97 eV处出现了P 2p峰，190.97 eV处出现了S 2p峰，392.97 eV处出现了N 1s峰，证明了TRY及TLL的成功固定化。
对上述实施方式1至4中制备的Fe3O4@Starch@TRY及Fe3O4@Starch@TLL进行热稳定性及pH稳定性分析，结果如图2及图3所示，在30-60 °C温度范围内，固定化酶的热稳定性显著高于游离酶更高。当温度上升到60 °C时，TRY保留了其初始酶活的50.84±2.42%，而Fe3O4@Starch@TRY则保留了其初始酶活的68.33±2.17%；TLL保留了其初始酶活的53.44±2.61%，Fe3O4@Starch@TLL则保留了其初始酶活的73.71±2.09%。在pH 5.0-9.0范围内，固定化酶的酶活回收率都显著高于游离酶，说明对酶进行固定化可以有效提高其在极端pH环境下的稳定性，减少蛋白分子的变性。
对上述实施方式1至4中制备的Fe3O4@Starch@TRY及Fe3O4@Starch@TLL进行磁强分析，结果如图8所示，磁滞回线均通过原心曲线，表明淀粉的包覆不影响Fe3O4的晶格结构，且Fe3O4@Starch、Fe3O4@Starch@TRY及Fe3O4@Starch@TLL皆具有良好的超顺磁性，可通过外加磁场对Fe3O4@Starch@TRY及Fe3O4@Starch@TLL进行有效的分离。而Fe3O4@Starch@TRY及Fe3O4@Starch@TLL的磁场强度比Fe3O4@Starch稍小，这是因为Fe3O4@Starch对TRY及TLL的固定化在一定程度上覆盖了磁场信号，侧面证明了TRY及TLL的成功负载。
对上述实施方式1至4中制备的Fe3O4@Starch及Fe3O4@Starch@TLL进行红外分析，结果如图9所示，可以看到Fe-O伸缩振动的特征吸收带位于567 cm-1处，而Fe3O4@Starch在3430 cm-1处出现了淀粉的特征峰，该峰是属于羟基的吸收峰，同时，Fe3O4@Starch在1630cm-1和1020 cm-1左右也出现了淀粉的特征峰，1630 cm-1处的吸光度是由于淀粉中的C-O-C伸缩振动引起的，1020 cm-1处的吸光度是由于淀粉骨架的C-C和C-O伸展方式所致，这些都表明淀粉的成功负载。在708-978 cm-1波束范围内，在Fe3O4@Starch的基础上多了TRY的特征峰，Fe3O4@Starch@TLL相比Fe3O4@Starch在1650 cm-1处峰面积明显增大，这是因为多了脂肪酶的酰胺Ⅰ带特征峰，证明了TRY及TLL的成功固定化。
对上述实施方式1至4中制备的Fe3O4@Starch分散性进行分析，结果如图10所示，A显示出Fe3O4@Starch在水溶液中具有较好的分散性，有效解决了Fe3O4的自团聚问题，B显示出Fe3O4@Starch在外加磁场的作用下于溶液中快速分离，表明了Fe3O4@Starch良好的重复利用率。
对上述实施方式1至4中制备的TRY、Fe3O4@Starch@TRY及TLL、Fe3O4@Starch@TLL分别于甲醇、无水乙醇、乙腈、丙酮、DMSO及THF 6种有机溶剂中孵育12 h后进行有机溶剂耐受性分析，结果如图12所示，在各有机溶剂中，固定化酶的剩余酶活明显高于游离酶，说明酶的固定化能有效提高其在有机溶剂中的耐受性，这为酶的工业化应用拓宽了渠道。
对上述实施方式1至4中制备得到的磁性淀粉纳米粒子固定化酶Fe3O4@Starch@TRY催化酪蛋白水解的催化活性进行验证，过程如下：
配制一定浓度的酪蛋白标准液50 mL，调节pH至Fe3O4@Starch@TRY的最适值，于各自最适温度条件下预热15 min，加入0.1 g Fe3O4@Starch@TRY，酶解2.0 h后升温至100 °C并保持10 min对酶进行灭活，冷却至室温后即对酶解液过膜进行HPLC分析。
采用上述制备的Fe3O4@Starch@TRY对酪蛋白进行酶解，将酶解液进行RP-HPLC分析，结果如图5和图6所示：酪蛋白在0-60 min保留时间内有两个特征峰，其中在2.170 min时有主要特征峰。而经过酶解后，在0-60 min保留时间内出现了9个特征峰，说明在Fe3O4@Starch@TRY的催化下，酪蛋白被成功水解。对水解液进行DPPH自由基的清除实验，结果如图7所示：经Fe3O4@Starch@TRY酶解得到的水解液清除DPPH自由基的能力仅比20 μg/mL Vc溶液稍弱，说明其具有一定的抗氧化能力。
对上述实施方式1至4中制备得到的Fe3O4@Starch@TLL催化天麻苷与辛酸乙烯酯的酰化反应的催化活性进行验证，过程如下：
在带聚四氟乙烯盖的反应瓶中加入一定体积四氢呋喃，向反应瓶加入天麻苷，于漩涡震荡仪上震荡使底物充分溶解至肉眼不可见，取样50 μL留待HPLC分析。然后各加入酰基供体及Fe3O4@Starch@TLL，混匀后200 r/min启动反应，反应一段时间取样，供HPLC分析。按峰面积的变化求得天麻苷的转换率。
对上述磁性淀粉固定化脂肪酶酶催化活性验证，HPLC分析如图12、图13所示，天麻苷的转化率可达97.04%，可知本发明制备的Fe3O4@Starch@TLL具有良好的催化活性。
在上述两个反应结束后，通过外加磁场对Fe3O4@Starch@TRY及Fe3O4@Starch@TLL进行回收，干燥后继续进行下一次反应，重复反应10次后，Fe3O4@Starch@TRY仍保持其初始酶活的43.52±2.90%，Fe3O4@Starch@TLL仍保持其初始酶活的40.81±2.38%，结果如图14所示，可知本发明制备的磁性淀粉固定化脂肪酶酶具有良好的重复利用性。
上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
磁性淀粉纳米粒子的制备：向磁性Fe3O4纳米粒子水溶液中加入可溶性淀粉，于80~110°C下持续搅拌0.5~3.0 h后，冷却至室温得沉淀，经多次洗涤沉淀后冷冻干燥得磁性淀粉纳米粒子；
磁性淀粉纳米粒子固定化酶的制备：向所述磁性淀粉纳米粒子中加入磷酸缓冲液A和戊二醛，于室温下交联0.5~4.0 h后多次洗涤获得沉淀，然后加入磷酸缓冲液B及游离酶液，于20~55 °C固定化1.0~10.0 h，期间不停搅拌，固定化结束后将体系冷却至室温获取沉淀，冷冻干燥即得磁性淀粉纳米粒子固定化酶。
2.根据权利要求1所述的以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，其特征在于，所述磁性Fe3O4纳米粒子与可溶性淀粉的质量比为6:1~2:1。
3. 根据权利要求1所述的以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，其特征在于，所述磁性淀粉纳米粒子与磷酸缓冲液A的料液比为1:10~1:30 g/mL。
4. 根据权利要求1所述的以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，其特征在于，所述游离酶液与磷酸缓冲液B的料液比为1:20~1:50 g/mL。
5.根据权利要求1所述的以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，其特征在于，所述磁性Fe3O4纳米粒子的制备方法如下：
向装有去离子水的容器中通氮气20~60 min，按摩尔比1:2~1:0.5分别加入Fe2+及Fe3+，在温度为40~100 °C下不停搅拌直至溶解，向容器中滴加已通氮气20~60 min的NaOH溶液，并不停搅拌，当pH到达9~12时停止滴加，继续通氮气搅拌一段时间，待体系稳定后使反应体系冷却至室温，多次洗涤后获得沉淀，对其进行冷冻干燥即得所述磁性Fe3O4纳米粒子。
6. 根据权利要求5所述的以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，其特征在于，所述NaOH溶液的摩尔浓度为1.0~3.0 mol/L。
7. 根据权利要求5所述的以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，其特征在于，所述Fe2+来源于FeSO4·7H2O，所述Fe3+来源于FeCl3·6H2O。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，其特征在于，所述游离酶液中的酶为胰蛋白酶Trypsin，TRY或脂肪酶，所述脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶Thermomyces lanuginosus lipase，TLL。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液A和磷酸缓冲液B的pH均为6.0~9.0；
所述戊二醛的浓度为0.5~4.0% v/v。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的以磁性淀粉为载体的固定化酶制备方法，其特征在于，在磁性淀粉纳米粒子的制备过程中，所述多次洗涤沉淀的洗涤方式为用去离子水清洗；
在磁性淀粉纳米粒子固定化酶的制备过程中，所述多次洗涤沉淀的洗涤方式为用去离子水和相应pH的磷酸缓冲液交替清洗。
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