CN113749086A - DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释的药物中的应用 - Google Patents

DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释的药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113749086A
CN113749086A CN202110994223.4A CN202110994223A CN113749086A CN 113749086 A CN113749086 A CN 113749086A CN 202110994223 A CN202110994223 A CN 202110994223A CN 113749086 A CN113749086 A CN 113749086A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dnase
nets
semen
pharmaceutically acceptable
sperms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110994223.4A
Other languages
English (en)
Inventor
魏正凯
杨正涛
姜立强
徐京楠
刘炜
高鑫鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Foshan University
Original Assignee
Foshan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan University filed Critical Foshan University
Priority to CN202110994223.4A priority Critical patent/CN113749086A/zh
Publication of CN113749086A publication Critical patent/CN113749086A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于畜禽繁殖技术领域，具体公开了DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释药物中的应用。本发明通过对NETs捕获精子的形态学观察、NETs的结构分析、LDH的释放、精子活力的检测及NETs释放水平的定量，以研究DNase I及其药学上可接受的盐在作为功能性精液稀释的药物以提高配种成功率的应用。经验证：山羊中性粒细胞能够释放典型的NETs结构捕获精子，同时可以剂量依赖性地降低精子活力，而DNase I可以极显著的降解捕获山羊精子的NETs结构，且DNase I具有降解山羊精子诱导NETs释放的应用效果，DNase I可应用于制备功能性精液稀释的药物中，以提高反刍动物配种成功率。

Description

DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释的药物中的 应用
技术领域
本发明属于畜禽繁殖技术领域，具体涉及DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释的药物中的应用。
背景技术
反刍动物是偶蹄目中的一个亚目，反刍是指进食经过一段时间以后将在胃中半消化的食物返回嘴里再次咀嚼，反刍动物就是有反刍这种消化方式的动物，反刍动物的消化生理与单胃哺乳动物截然不同，要比单胃哺乳动物复杂得多。
山羊是反刍动物的一种，其生殖道病原感染、无菌性炎症以及物理损伤等均会直接导致配种成功率大幅下降或个体屡配不孕问题，究其原因与山羊生殖道天然免疫状况密切相关。中性粒细胞是天然免疫系统的重要细胞类型，中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)则是中性粒细胞除吞噬、降解以外的第三种抗病原机制。山羊授精过程中，无论何种方式影响生殖道健康，大量中性粒细胞均会出现在生殖道黏膜抗病原感染或参与生殖道组织损伤，而NETs是否同时参与捕获山羊精子而造成配种成功率的大幅下降尚未见报道。
因此，如何在解析山羊生殖道对精子免疫机制的基础上，研制一种新型山羊功能性精液稀释药物，对于提升配种成功率以及防治繁殖障碍性疾病均具有重要兽医实践意义。
发明内容
本发明提出DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释的药物中的应用，以解决现有技术中存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
为克服上述技术问题，本发明的第一方面提供了DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释药物中的应用。
具体的，DNase I又称为脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶，也是一种内源性脱氧核糖核酸酶，能够降解DNA而被用作NETs标准降解剂，蛋白激酶(P38)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)等分子或信号通路均参与调控NETs的释放。本发明通过原代分离山羊中性粒细胞，建立NETs的形态学观察模型，证实了山羊NETs能够捕获精子，且具有典型的胞外诱捕网结构特征，NETs主要由组蛋白、髓过氧化物酶与DNA骨架构成；同时，NETs捕获精子过程与细胞坏死无关，可显著降低精子活力；且DNase I极显著降解捕获精子的NETs，可用于制备功能性精液稀释药物。
作为上述方案的进一步改进，所述DNase I药学上可接受的盐为可增强酶亲和力或直接催化磷酸氧键断裂的盐类。
优选的，所述盐类的阳离子，选自钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、铁离子、亚铁离子、钴离子、铜离子、镍离子、锰离子、铵离子或锌离子中的任一种。
优选的，所述盐类的阴离子，选自硫酸根离子、醋酸根离子、氯离子、磷酸根离子、草酸根离子、马来酸根离子、富马酸根离子、苹果酸根离子、酒石酸根离子、柠檬酸根离子或苯甲酸根离子中的任一种。
具体的，所述药学上可接受的盐容易分离，可采用常规分离方法提纯，如溶剂萃取、稀释、重结晶、柱色谱和制备薄层色谱等。
作为上述方案的进一步改进，所述精液稀释药物适用于反刍动物精液稀释药物。具体的，反刍动物的生理特征与单胃哺乳动物截然不同，要比单胃哺乳动物复杂得多，适用于哺乳动物的精液稀释药物不能直接应用于反刍动物。
作为上述方案的进一步改进，所述反刍动物包括山羊或牛。
作为上述方案的进一步改进，所述DNase I及其药学上可接受的盐用于降解反刍动物精子诱导的NETs，所述NETs具有典型胞外诱捕网的结构特征，所述NETs的组成包括组蛋白、髓过氧化物酶与DNA骨架。
作为上述方案的进一步改进，所述DNase I及其药学上可接受的盐用于降解精子诱导的NETs释放。
本发明的第二方面提供了一种精液稀释的药物。
具体的，一种精液稀释的药物，所述精液稀释药物包含DNase I和/或其药学上可接受的盐。
作为上述方案的进一步改进，所述DNase I药学上可接受的盐为可增强酶亲和力或直接催化磷酸氧键断裂的盐类。
优选的，所述盐类的阳离子，选自钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、铁离子、亚铁离子、钴离子、铜离子、镍离子、锰离子、铵离子或锌离子中的任一种。
优选的，所述盐类的阴离子，选自硫酸根离子、醋酸根离子、氯离子、磷酸根离子、草酸根离子、马来酸根离子、富马酸根离子、苹果酸根离子、酒石酸根离子、柠檬酸根离子或苯甲酸根离子中的任一种。
具体的，所述药学上可接受的盐容易分离，可采用常规分离方法提纯，如溶剂萃取、稀释、重结晶、柱色谱和制备薄层色谱等。
作为上述方案的进一步改进，所述精液稀释药物还包括在药学上可接受的辅料。
进一步的，所述辅料包括载体、稀释剂和赋形剂。
具体的，所述载体和赋形剂主要用于使粉针剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、散剂、滴丸剂、栓剂等形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的载体和赋形剂，如乳糖、淀粉、椰子油、淀粉、碳酸钙、高岭土等；所述载体和稀释剂主要用于注射剂和口服剂形式的药物组合物，可使用本领域内任何常用的载体和稀释剂，如水、乙醇、丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇等。
作为上述方案的进一步改进，所述精液稀释药物的剂型包括注射剂、粉针剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、散剂、滴丸剂、口服液或栓剂。
作为上述方案的进一步改进，所述精液稀释药物中DNase I及其药学上可接受的盐的给药浓度为450-900U/mL。
本发明的上述技术方案相对于现有技术，至少具有如下技术效果或优点：
本发明通过对NETs捕获精子的形态学观察、NETs的结构分析、LDH的释放、精子活力的检测及定量分析NETs的释放水平，以研究DNase I及其药学上可接受的盐在作为功能性精液稀释药物以提高配种成功率的应用。经验证：山羊中性粒细胞能够释放典型的NETs结构捕获精子，同时可以剂量依赖性地降低精子活力，而DNase I可以极显著的降解捕获山羊精子的NETs结构，且DNase I具有降解捕获山羊精子的NETs的应用效果，DNase I可应用于功能性精液稀释药物中，用于提高反刍动物配种成功率。
附图说明
图1为NETs捕获精子的形态学观察；
图2为组蛋白与DNA共定位于捕获精子的NETs结构；
图3为髓过氧化物酶与DNA共定位于捕获精子的NETs结构；
图4为NETs捕获精子过程中LDH水平检测；
图5为山羊中性粒细胞对精子活力的影响；
图6为DNase I显著降解山羊精子诱导NETs释放水平。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解，有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围，同时，下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品，未详细提及的工艺步骤或制备方法均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
实施例1
本实施例所采用的药品和试剂分别为：羊中性粒细胞分离试剂盒：天津灏洋；DNase I，DPI：二苯基氯化碘盐；UO126：1，4-二氨基-2，3-二氰基-1，4-双(邻-氨基苯硫醇)丁二烯单乙醇盐，用作ERK1/2抑制剂；SB202190：4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，用作p38 MAPK抑制剂：西格玛奥德里奇贸易有限公司；无酚红1640培养基：索莱宝，货号：90022；LDH试剂盒：碧云天，货号：C0017；抗组蛋白一抗：Life SpanBioSciences，货号：LS-C353149；抗髓过氧化物酶一抗：Biorbyt，货号：Orb16003；FITC标记羊抗兔二抗：PTG，货号：SA00003-2；Sytox Orange：Thermo；货号：C10493；Pico GreendsDNA：Thermo，货号：P11495。
5只山羊(40-50kg，雌性，未孕)用作供血动物，安置于适宜环境正常饲喂，适应环境3天，颈静脉采血，分离中性粒细胞；商品化销售的山羊颗粒冻精用作刺激物。
1.NETs捕获精子的形态学观察
无酚红RPMI培养基重悬中性粒细胞，2×10^5个/孔接种于13mm玻片(4％多聚赖氨酸预处理，放置于96孔培养板)，37℃培养箱，贴壁15min；按照中性粒细胞/精子(1:1)比例共孵育于37℃培养箱，时间为2h；样品经过：4.0％戊二醛固定、1.0％四氧化锇后固定、梯度脱水(梯度酒精溶液)、叔丁醇、抽真空及喷金后，电子扫描电镜(Hitachi S-3400 N,Japan)观察并采集图像，如图1所示，其中：图1A和图1B为中性粒细胞捕获精子图；图1C和图1D为中性粒细胞吞噬精子图。
由图1可知：山羊外周血中性粒细胞与颗粒冻精共孵育后，中性粒细胞不仅可以释放粗细不等的纤维结构捕获精子(图1A和图1B箭头所示)，而且也会吞噬精子(图1C和图1D所示)，结果初步证实山羊中性粒细胞能够释放NETs捕获精子。
2.NETs的结构分析
无酚红RPMI培养基重悬中性粒细胞，2×10^5个/孔接种于13mm玻片(置于96孔培养板)，37℃培养箱，贴壁15min；按照中性粒细胞/精子(1:1)比例共孵育于37℃培养箱，时间为2h；4.0％多聚甲醛固定20min；0.1％曲拉通-100，打孔15min；3％BSA封闭2h；封闭一抗(MPO和组蛋白)，4℃过夜孵育；孵育相应二抗；Sytox Orange室温25℃孵育10min；甘油封片，采用激光共聚焦(Olympus FluoView FV1000)观察样品并采集图像，如图2和图3所示，图中：箭头指示为形成的NETs；Optical image为光学图像；H3表示组蛋白3；DNA为脱氧核糖核酸；Merge为合成图像；PMN为中性粒细胞；PMN+Sperm为中性粒细胞+精子。
由图2和图3关于组蛋白、MPO与DNA骨架共定位于NETs结构所示，捕获精子的NETs具有典型胞外诱捕网的结构特征，主要由组蛋白、MPO与DNA骨架构成，同时也进一步证实山羊中性粒细胞能够释放NETs捕获精。
3.LDH释放检测
无酚红RPMI培养基重悬中性粒细胞，2×10^5个/孔接种于96孔培养板，37℃培养箱，贴壁15min；按照中性粒细胞/精子(1:1、1:3、1:6和1:12)比例共孵育于37℃培养箱，时间为2h；LDH试剂盒检测培养上清LDH释放水平；Lysis为试剂盒提供阳性对照，中性粒细胞释放LDH水平＝PMN+Sperm组数值-单独Sperm组数值，其结果如图4所示，图中：横坐标为不同处理组(Control:空白组；Lysis:最大裂解组；PMN+Sperm：中性粒细胞+精子)；纵坐标为波长在490nm处的检测值。
由图4可知：与空白对照组相比，Lysis组显著诱导LDH的释放，而精子刺激没有显著改变培养上清LDH水平，证实NETs捕获山羊精子过程与细胞坏死无关。
4.精子活力检测
无酚红RPMI培养基重悬中性粒细胞，10^6个/孔接种于12孔培养板，37℃培养箱；按照中性粒细胞/精子(1:4、2:4和4:4)比例共孵育于37℃培养箱；利用显微镜检查法在时间点0h，1.5h和3h检查精子活力的变化，其检测结果如图5所示，图中：横坐标为孵育时间；纵坐标为精子活力。
由图5可知：精子活力随着时间推移逐渐减低；与精子组相比，中性粒细胞刺激越多，精子活力越低，以上结果证实NETs可以显著降低精子活力。
5.定量分析NETs的释放水平
无酚红RPMI培养基重悬中性粒细胞，2×10^5个/孔接种于96孔培养板，37℃培养箱，贴壁15min；按照中性粒细胞/精子(1:1、1:3和1:6)比例共孵育于37℃培养箱，时间为2h；设置平行实验，精子刺激前，选择NADPH抑制剂(DPI)、ERK1/2抑制剂(UO126)、P38抑制剂(SB202190)和DNase I(90U/孔)预处理中性粒细胞20min；DNase I使用浓度为225U/mL-900U/mL；Zymosan(1mg/mL)为阳性对照；采用Pico Green dsDNA试剂盒和荧光酶标仪定量分析NETs的释放水平，其结果如图6所示，横坐标为不同处理组；纵坐标为荧光强度。
由图6可知：山羊精子可以剂量依赖性地诱导NETs的释放；UO126、SB202190和DPI可以降低精子诱导NETs的释放水平，但不具有显著性意义；低浓度DNase I能够降解精子诱导NETs的释放也不具有显著性，而高浓度DNase I(450U/mL-900U/mL)能够极显著降解精子诱导NETs的释放，以上结果进一步证实了DNase I可作为山羊精液功能稀释剂添加组分防治生殖道炎症、精子活力低等繁殖障碍性疾病。
本实施例的实验结果表明，山羊中性粒细胞能够释放典型的NETs结构捕获精子，同时可以剂量依赖性地降低精子活力，而DNase I可以极显著的降解捕获山羊精子的NETs结构，且DNase I具有降解捕获山羊精子的NETs的应用效果，且浓度为450U/mL-900U/mL的DNase I能够极显著降解精子诱导NETs的释放，从而也进一步证实了DNase I可应用于功能性精液稀释药物中，用于提高反刍动物配种成功率。
显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (10)

1.DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述精液稀释的药物适用于反刍动物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述反刍动物包括山羊或牛。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述DNase I及其药学上可接受的盐用于降解反刍动物精子诱导的NETs，所述NETs的组成包括组蛋白、髓过氧化物酶与DNA。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述DNase I及其药学上可接受的盐用于降解反刍动物精子诱导的NETs释放。
6.一种精液稀释的药物，其特征在于：所述精液稀释的药物包含DNase I和/或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的精液稀释药物，其特征在于：所述精液稀释药物还包括在药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的精液稀释药物，其特征在于：所述辅料包括载体、稀释剂和赋形剂。
9.根据权利要求7或8所述的精液稀释药物，其特征在于，所述精液稀释的药物的剂型包括注射剂、粉针剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、散剂、滴丸剂、口服液或栓剂。
10.根据权利要求9所述的精液稀释药物，其特征在于，所述精液稀释药物中DNase I及其药学上可接受的盐的给药浓度为450-900U/mL。
CN202110994223.4A 2021-08-27 2021-08-27 DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释的药物中的应用 Pending CN113749086A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110994223.4A CN113749086A (zh) 2021-08-27 2021-08-27 DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释的药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110994223.4A CN113749086A (zh) 2021-08-27 2021-08-27 DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释的药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113749086A true CN113749086A (zh) 2021-12-07

Family

ID=78791496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110994223.4A Pending CN113749086A (zh) 2021-08-27 2021-08-27 DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释的药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113749086A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1951185A (zh) * 2006-11-07 2007-04-25 山东农业大学 山羊精液液态保存方法
CN101686943A (zh) * 2007-02-20 2010-03-31 欧兰德制药有限公司 稳定的消化酶组合物
CN101816782A (zh) * 2010-04-09 2010-09-01 郑昌学 一种复合酶类化痰药
CN103920144A (zh) * 2013-01-15 2014-07-16 上海博戍生物科技有限公司 重组人的脱氧核糖核酸酶i的新应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1951185A (zh) * 2006-11-07 2007-04-25 山东农业大学 山羊精液液态保存方法
CN101686943A (zh) * 2007-02-20 2010-03-31 欧兰德制药有限公司 稳定的消化酶组合物
CN101816782A (zh) * 2010-04-09 2010-09-01 郑昌学 一种复合酶类化痰药
CN103920144A (zh) * 2013-01-15 2014-07-16 上海博戍生物科技有限公司 重组人的脱氧核糖核酸酶i的新应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
叶华虎等: "山羊精子结合和内化外源DNA的特征及影响因素", 《遗传》 *
戈新等: "生育相关性抗原对精子受精的影响", 《安徽农业科学》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60212964T2 (de) Zusammensetzungen zur behandlung von tierischen krankheiten und syndromen mit transferfaktor
Jarvie et al. Effect of halofuginone lactate on the occurrence of Cryptosporidium parvum and growth of neonatal dairy calves
Junkuszew et al. Effect of various antiparasitic treatments on lamb growth and mortality
AU2002311871A1 (en) Compositions for treating animal diseases and syndromes
DE60221539T2 (de) Verfahren und zusammensetzungen zur kontrolle von coccidiose
Semenov et al. Influence of biopreparations on the postnatal period of highly productive cows
Sah et al. A clinical study of anestrus buffaloes in Southern Nepal
CN113749086A (zh) DNase I及其药学上可接受的盐在制备精液稀释的药物中的应用
US20220226403A1 (en) Methods of improving reproductive and respiratory health
Sakaguchi Oestrous expression and relapse back into anoestrus at early postpartum ovulations in fertile dairy cows
Khaskheli et al. A mini review on the Lactic Acidosis in goats and its remedial approaches
Casarotto et al. Effect of feeding an immune modulator to multiparous Holstein cows during the dry period and early lactation on health, milk and reproductive performance
Mohammadi et al. Effects of prepartum monensin feeding on energy metabolism and reproductive performance of postpartum high-producing Holstein dairy cows
Hall Ionophore use and toxicosis in cattle
RS et al. Efficacy of clindamycin, yeast (Saccharomyces cerevisiae) and clindamycin-Saccharomyces cerevisiae combination versus toltrazuril on experimentally induced coccidiosis in lambs
Alzaidi et al. Study of Some Biochemical Changes Associated with Downer Cow Syndrome in Local Cattle
Savita et al. Clinico-therapeutic management of ketosis in a buffalo: A case report
Morwal et al. Clinicotherapeutic Management of Ketosis in a Cow
Meena et al. Prevalence and clinical findings of ketosis in postparturient cows in and around Bikaner.
US11806358B1 (en) Method of treating trypanosomiasis
Borş et al. Follicle deviation and oocyte recovering by ovum pick-up from endangered Romanian Grey cows
Gao et al. Direct Effect of Lipopolysaccharide and Histamine on Permeability Barrier of Rumen Epithelium
RU2177329C1 (ru) Способ коррекции гипотрофии плода при метаболическом ацидозе матери
Broadhead et al. Combined Analysis on the Effects of Late Gestation Supplementation in a Spring Calving Beef Herd
Ramadhanty et al. The effect of heatsynch protocol on repeat breeding dairy cows

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20211207