CN113621089A - 一种海藻多糖提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无需色谱柱分离的海藻多糖提取物及其制备方法和应用。海藻多糖提取物，通过如下步骤制备得到：（1）海藻粉碎后，超声，过滤出浸泡液，减压蒸干；（2）将预处理后的海藻原料按固液比加入提取剂，浸提后过滤，滤液减压浓缩，再用离子渗析法脱盐得海藻多糖粗品；（3）发酵培养；（4）水解反应，减压浓缩，超滤和渗滤并回收渗透物，纳米过滤并回收渗余物，烘干，粉碎，即得海藻多糖。本发明所得的海藻多糖无需经过色谱柱分离，本发明的方法成本低、操作简便，大大提高了生产效率。

Description

一种海藻多糖提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种海藻多糖提取物及其制备方法和应用。

背景技术

海藻储量丰富且海藻中含有多种有效成分，在食品、药品、日化、肥料、饲料等领域有重要的应用。因此海藻的综合利用越来越受到人们的关注。海藻中主要含有脂质、蛋白质、多糖等多种有效成分，若能将海藻中的有效成分分别分离纯化，则能大大提高海藻的利用率。在海藻所含的成分中以海藻多糖及海藻蛋白的含量最高，其应用也最为广泛。

海藻生物活性物质大致可分为两种：一种是分子量较小，吸收后能直接或间接影响体内代谢物质，主要包括卤族化合物、萜类化合物、溴酚类化合物、对苯二酚、海藻单宁、昆布氨酸等；另一种是难以被消化吸收的细胞间粘性多糖，主要包括褐藻中的藻酸、褐藻糖胶、硫酸多糖、红藻中的琼胶、卡拉胶等。多糖是所有生命有机体的重要组分，并在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机体正常代谢等方面具有重要作用。

海藻多糖主要来自海带、鹿尾菜(羊栖菜)、巨藻、泡叶藻、墨角藻等海藻。海藻多糖主要包括褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉。从海带中分离得到的褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉粗品均为白色略带黄色的粉末。经纯化得到的褐藻酸钠为白色丝状物；褐藻糖胶为乳白色粉末；二者均溶于水、不溶于乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂。

海藻多糖主要来源可分为褐藻多糖、红藻多糖、绿藻多糖3大类。海藻多糖具有免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、能与金属离子络合、抗菌消炎等作用，在食品、化妆品、药物等领域有重要意义。海藻蛋白在海藻中的含量为20％左右，在一些食用藻类如紫菜、掌藻、石莼中含量更高，海藻蛋白具有免疫调节、抗肿瘤、做药物载体、凝集、护肤润肤等作用，在护肤品、医药、饲料等领域有广泛的应用。

从浸提液中提取分离海洋生物活性多糖目前几乎都是采用沉淀法，如乙醇沉淀、氯化十六烷基吡啶(CPC)或溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)沉淀等。而海藻多糖的提取分离现在几乎都是乙醇沉淀法，如浒苔多糖、螺旋藻多糖、螺旋藻粘多糖、褐藻多糖硫酸酯、蜈蚣藻卡拉胶等均采用乙醇沉淀法提取。

中国专利申请CN 104403018A公开了一种在高压下提取海藻多糖的方法，专利申请CN 04892785A公开了一种在超高压下提取海藻多糖的方法，这两种方法均在高压下进行，对设备要求高，成本较高；专利申请CN105580975A公布了一种利用微生物发酵提取海藻蛋白的方法，该方法利用微生物发酵提取海藻中的蛋白质，需要微生物培养，操作条件严格、复杂；专利申请CN104341536A公布了一种提取海藻中营养物质的方法，该方法以复合酶对海藻进行预处理提取褐藻酸钠，成本较高；专利申请CN103951737A公布了一种从海藻中提取亲糖蛋白的方法，该方法只从海藻中提取亲糖蛋白；专利申请CN103739726A公布了一种提取海藻多糖的方法，在常压下提取多糖以sevage法去蛋白，以流水透析纯化多糖，该方法虽然操作简便但是流水透析并不能将多糖中的小分子的杂质完全除去且sevage试剂毒性较强。已公布的方法中只涉及到一种提取海藻多糖或海藻蛋白的方法，不能同时得到高纯度的海藻多糖和海藻蛋白。

中国专利CN107722132B公开了一种从海藻中联产海藻多糖和海藻蛋白的方法，包括以下步骤：（1）原料预处理；（2）海藻蛋白的提取和纯化；（3）海藻多糖的提取和纯化。其中，海藻多糖的提取和纯化：向分离出粗蛋白的滤液中加入3～4倍体积的无水乙醇，静置沉淀后过滤，得到固体，向固体中加水，流水透析1～2天，透析液浓缩后进行冷冻干燥得粗多糖；向粗多糖中加水溶解用色谱柱分离纯化，得到精制后的海藻多糖。其所得的海藻多糖和海藻蛋白是直接从海藻中经过一步提取得到的，大大提高了海藻的利用率。

然而，从含有海藻多糖浸提液得到较高纯度的海藻多糖，通常都需要采用色谱柱进行纯化分离，影响了其在工业化生产中的应用。

发明内容

为解决现有技术的缺陷，本发明提出一种无需色谱柱分离的海藻多糖提取物及其制备方法和应用。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案：

本发明一方面涉及一种海藻多糖提取物，其特征在于，通过如下步骤制备得到：

（1）取干海藻，粉碎后，加入浓度为70-90％的乙醇1-3倍重量，超声，过滤出浸泡液，减压蒸干；

（2）将预处理后的海藻原料按固液比1：4-6(g/mL)加入pH为3.5-4.5的邻苯二甲酸氢钾溶液作为提取剂，浸提后过滤，滤液减压浓缩；然后再按固液比1：4-6(g/mL)加入pH为9-10的碳酸盐缓冲溶液，浸提后过滤，滤液减压浓缩，再用离子渗析法脱盐得海藻多糖粗品；

（3）将正常培养的屎肠球菌(Enterococcus faecium)接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，所述液体发酵培养基的配方含有8-12wt%海藻多糖粗品，发酵过程中，不通气培养，pH降至4.0-4.4，发酵结束；

（4）向发酵结束后的培养体系中加入胰蛋白酶进行水解反应，先进行减压浓缩，然后通过15kDa膜进行超滤和渗滤并回收渗透物，再通过2000Da膜对渗透物进行纳米过滤并回收渗余物，得分子量为2000～15000道尔顿的多糖，烘干，粉碎，即得海藻多糖。

在本发明的一个优选实施方式中，所述海藻多糖是海带多糖或者鼠尾藻多糖。

在本发明的另一个实施方式中，所述海藻多糖的纯度为96wt%以上。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述鼠尾藻多糖的纯度为93%以上。

本发明另一方面还涉及一种海藻多糖提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）取干海藻，粉碎后，加入浓度为70-90％的乙醇1-3倍重量，超声，滤布过滤出浸泡液，在减压蒸干；

（2）将预处理后的海藻原料按固液比1：4-6(g/mL)加入pH为3.5-4.5的邻苯二甲酸氢钾溶液作为提取剂，浸提后过滤，滤液减压浓缩；然后再按固液比1：4-6(g/mL)加入pH为9-10的碳酸盐缓冲溶液，浸提后过滤，滤液减压浓缩，再用离子渗析法脱盐得海藻多糖粗品；

（3）将正常培养的屎肠球菌(Enterococcus faecium)接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，所述液体发酵培养基的配方为含有8-12wt%海藻多糖粗品，发酵过程中，不通气培养，pH降至4.0-4.4，发酵结束；

（4）向发酵结束后的培养体系中加入胰蛋白酶进行水解反应，反应0.5-2h结束，然后进行减压浓缩，然后通过15kDa膜进行超滤和渗滤并回收渗透物，再通过2000Da膜对渗透物进行纳米过滤并回收渗余物，得分子量为2000～15000道尔顿的多糖，然后在70-90℃下烘干，粉碎烘干物，即得海藻多糖。

在本发明的一个优选实施方式中，所述液体发酵培养基的pH值为7。通过控制液体发酵培养基的pH值，有助于屎肠球菌的培养以及消化海藻多糖粗品。

在本发明的一个优选实施方式中，所述制备方法不进行色谱柱分离。

本发明另一方面还涉及上述海藻多糖提取物作为消毒液、洗手液等的应用。优选用于抑菌和清除自由基。

有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

（1）本发明所得的海藻多糖无需经过色谱柱分离，本发明的方法成本低、操作简便，大大提高了生产效率。

（2）使用本发明方法所提取的海藻多糖纯度高、提取率高，多糖产率高达10％以上，纯度高达90％wt以上，优选高达93wt%以上。

（3）本发明的海藻多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均有较好的抑菌效果，同时对羟基自由基有较好的清除作用。可作为洗手液，对皮肤产生一定的保护作用。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1

用本发明的方法絮凝提取海带中的海带多糖，其步骤如下：

（1）预处理：取干海带2公斤，粉碎后，加入浓度为95％的乙醇2倍量(重量)，超声1小时，滤布过滤出浸泡液，在80℃下减压蒸干, 除去海藻中含有的脂类、单糖及其他醇溶性成分(生物碱、黄酮苷、多酚、氨基酸等)；

（2）将预处理后的海藻原料按固液比1：5(g/mL)加入pH为4的邻苯二甲酸氢钾溶液作为提取剂，浸提后过滤，滤液在80℃下减压浓缩；然后再按固液比1：5(g/mL)加入pH为9.6的碳酸盐缓冲溶液，浸提后过滤，滤液在80℃下减压浓缩，再用离子渗析法脱盐得海藻多糖粗品；

（3）将正常培养的屎肠球菌(Enterococcus faecium)以1％的接种量接于装有10LpH为7.0的液体发酵培养基的发酵罐中，于37℃进行发酵培养，发酵过程中，转速控制在50rpm，不通气培养28h，pH降至4.2左右，发酵结束。所述液体发酵培养基的配方为：每1000mL水中含有：100g脱盐处理的海藻多糖粗品，5g三水合乙酸钠，0.2g七水合硫酸镁，0.05g一水合硫酸锰，2g三水合磷酸氢二钾，lg吐温80，pH值为7。

（4）培养体系中加入1000g胰蛋白酶，在37℃进行水解反应，反应1h结束，然后将水解反应的培养体系减压浓缩，先通过15kDa膜进行超滤和渗滤并回收渗透物，再通过2000Da膜对渗透物进行纳米过滤并回收渗余物，得分子量为2000～15000道尔顿的多糖，然后在80℃下烘干1小时，粉碎烘干物，即得本浅黄色海藻多糖256g，纯度为96.2%。

实施例2

用本发明的方法絮凝提取鼠尾藻中的海藻多糖，其步骤如下：

（1）预处理：取干鼠尾藻2公斤，粉碎后，加入浓度为85％的乙醇2倍量(重量)，超声1小时，滤布过滤出浸泡液，在80℃下减压蒸干, 除去海藻中含有的脂类、单糖及其他醇溶性成分(生物碱、黄酮苷、多酚、氨基酸等)；

（2）将预处理后的海藻原料按固液比1：5(g/mL)加入pH为4的邻苯二甲酸氢钾溶液作为提取剂，浸提后过滤，滤液在80℃下减压浓缩；然后再按固液比1：5(g/mL)加入pH为9.6的碳酸盐缓冲溶液，浸提后过滤，滤液在80℃下减压浓缩，再用离子渗析法脱盐得海藻多糖粗品；

（3）将正常培养的屎肠球菌(Enterococcus faecium)以1％的接种量接于装有10LpH为7.0的液体发酵培养基的50L发酵罐中，于37℃进行发酵培养，发酵过程中，转速控制在50rpm，不通气培养28h，pH降至4.2左右，发酵结束。所述液体发酵培养基的配方为：每1000mL水中含有：100g脱盐处理的海藻多糖粗品，5g三水合乙酸钠，0.2g七水合硫酸镁，0.05g一水合硫酸锰，2g三水合磷酸氢二钾，1g吐温80，pH值为7。

（4）培养体系中加入1000g胰蛋白酶，在37℃进行水解反应，反应1h结束，然后进行减压浓缩，浓缩物先通过15kDa膜进行超滤和渗滤并回收渗透物，再通过2000Da膜对渗透物进行纳米过滤并回收渗余物，得分子量为2000～15000道尔顿的多糖，然后在80℃下烘干1小时，粉碎烘干物，即得本浅黄色海藻多糖224g，纯度为93.3%。

比较例1：

与实施例1相同，其区别在于不进行微生物培养，直接将海藻多糖粗品先通过15kDa膜进行超滤和渗滤并回收渗透物，再通过2000Da膜对渗透物进行纳米过滤并回收渗余物，得分子量为2000～15000道尔顿的多糖，然后在80℃下烘干1小时，粉碎烘干物，即得浅黄色海藻多糖213g，纯度为32.5%。

比较例2：

与实施例2相同，其区别在于不进行微生物培养，直接将海藻多糖粗品先通过15kDa膜进行超滤和渗滤并回收渗透物，再通过2000Da膜对渗透物进行纳米过滤并回收渗余物，得分子量为2000～15000道尔顿的多糖，然后在80℃下烘干1小时，粉碎烘干物，即得浅黄色海藻多糖185g，纯度为29.8%。

实施例3：抑菌实验和自由基清除实验

实验1：本发明制备的海藻多糖的抑菌实验

将上述所制备的海藻多糖以5wt%的浓度溶解于去离子水中得到本发明制备的海藻多糖抑菌洗手液。用于大肠杆菌、金黄的葡萄球菌、白色念珠菌的抑制实验。

实验方法：

1)倍比稀释法

将大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、白色念珠菌(ATCC90028)用营养肉汤配置成0.5个麦氏浊度，再稀释1000倍备用；将实施列1、实施例2、比较例1和比较例2所制备的海藻多糖配置成50mg/mL的水溶液备用；在96孔板中进行抗菌药物稀释和接种，第1孔加入100μL洗手液水溶液，2-11孔每孔加液体培养基100μL，12孔加液体培养基200μL；倍比稀释至第10孔；1-11孔都加入100μL菌液；37℃培养箱过夜培养。

2)最小抑菌浓度测定

用酶标仪测定样品和菌液混合后的OD600值，以完全没有光吸收孔的样品浓度作为最小抑制浓度；并采用平板培养复测的方法检测最小抑制浓度，结果见表1所示。

实验2：本发明制备的海藻多糖对羟基自由基清除实验

实验方法：配置8.8mmol/L的H₂O₂、9mmol/L的FeSO₄、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，取配制好的1mg/mL的实施例1、实施例2、比较例1和比较例2海藻多糖抑菌洗手液水溶液各50μL置于96孔板中，加入50μL的9mmol/L的FeSO₄，加入50μL水杨酸-乙醇溶液，最后加入50μLH₂O₂启动反应。测定510nm处吸光度值，作为受试组A0；将水杨酸溶液替换为纯水作为阴性对照组A1；将50μL的纯水代替样品作为受试组A2；实验重复三次取平均值。自由基清除率(％)＝1-(A0-A1)/A2×100，结果见表2所示。

2、实验结果

表1本发明的海藻多糖的最小抑制浓度(MIC)

由实验结果可得，相比于比较例，实施例所制备的海藻多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均有更好的抑菌效果。

表2 本发明的海藻多糖对羟基自由基的清除率

从上述实验结果可得，相比于比较例所制备的海藻多糖，本发明实施例所制备的海藻多糖对羟基自由基有较好的清除作用。可作为洗手液，对皮肤产生一定的保护作用。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (9)

1.一种海藻多糖提取物，其特征在于，通过如下步骤制备得到：

（1）取干海藻，粉碎后，加入浓度为70-90％的乙醇1-3倍重量，超声，过滤出浸泡液，减压蒸干，得到预处理后的海藻原料；

（2）将预处理后的海藻原料按固液比1：4-6 g/mL加入pH为3.5-4.5的邻苯二甲酸氢钾溶液，浸提后过滤，滤液减压浓缩；然后再按固液比1：4-6 g/mL加入pH为9-10的碳酸盐缓冲溶液，浸提后过滤，滤液减压浓缩，再用离子渗析法脱盐得到海藻多糖粗品；

（3）将正常培养的屎肠球菌(Enterococcus faecium)接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，其中液体发酵培养基中含有8-12wt%海藻多糖粗品，发酵过程中，不通气培养，pH降至4.0-4.4，发酵结束；

（4）向发酵结束后的培养体系中加入胰蛋白酶进行水解，然后进行减压浓缩，超滤和渗滤并回收渗透物，再进行纳米过滤并回收渗余物，得到分子量为2000～15000道尔顿的多糖，然后烘干，粉碎，即得海藻多糖。

2.根据权利要求1所述的海藻多糖提取物，其中所述海藻多糖是海带多糖或者鼠尾藻多糖。

3.根据权利要求2所述的海藻多糖提取物，其中所述海带多糖的纯度为96wt%以上。

4.根据权利要求2所述的海藻多糖提取物，其中所述鼠尾藻多糖的纯度为93%以上。

5.一种海藻多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）取干海藻，粉碎后，加入浓度为70-90％的乙醇1-3倍重量，超声，过滤出浸泡液，减压蒸干，得到预处理后的海藻原料；

（2）将预处理后的海藻原料按固液比1：4-6 g/mL加入pH为3.5-4.5的邻苯二甲酸氢钾溶液，浸提后过滤，滤液减压浓缩；然后再按固液比1：4-6 g/mL加入pH为9-10的碳酸盐缓冲溶液，浸提后过滤，滤液减压浓缩，再用离子渗析法脱盐得海藻多糖粗品；

（3）将正常培养的屎肠球菌(Enterococcus faecium)接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，其中所述液体发酵培养基中含有8-12wt%海藻多糖粗品，发酵过程中，不通气培养，pH降至4.0-4.4，发酵结束；

（4）向发酵结束后的培养体系中加入胰蛋白酶进行水解反应，进行减压浓缩，超滤和渗滤并回收渗透物，再进行纳米过滤并回收渗余物，得到分子量为2000～15000道尔顿的多糖，烘干，粉碎，即得海藻多糖。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中所述液体发酵培养基的pH值为7。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其中不进行色谱柱分离。

8.权利要求1-5任意一项所述海藻多糖提取物作为消毒液或洗手液的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其中所述消毒液或洗手液具有抑菌和清除自由基的作用。