CN113583886A - 一种辅酶q10的高表达重组菌株的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辅酶Q10的高表达重组菌株的构建方法及应用，包括以下步骤，S1：以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides2,4,1)为出发菌，提取其基因组DNA为目的基因；S2：将所述目的基因进行PCR同源扩增；S3：获得的PCR扩增产物经引物整合至载体pKLAC2中得外源目的基因；S4：以乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis GG799)为宿主菌，将所述外源目的基因组整合至所述乳酸克鲁维酵母菌的染色体LAC4位点上得到高表达重组菌株。本发明效果：一是本发明以PCR介导的同源置换，整合片段不需通过酶切，只需通过一对含有同源整合位点的引物，以含有目的基因的载体位模板，通过PCR就可简单的高拷贝扩增目的基因组；二是获得的高表达重组菌株在高产量的同时具有高遗传稳定性。

Description

一种辅酶Q10的高表达重组菌株的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程的技术领域，尤其涉及一种辅酶Q10的高表达重组菌株、高表达重组菌株的构建方法以及高表达重组菌株的应用。

背景技术

辅酶Q10是生物细胞呼吸链中的重要递氢体，是一种良好的生化药物，近年来已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗；此外，在治疗坏血病、十二指肠溃疡、坏死性牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。最近研究者发现CoQ10具有抗衰老作用，从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域，使其在国内外的需求进一步扩大。

辅酶Q10的制备方法主要有三种，即动植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。动植物组织提取法中动植物辅酶Q10含量低，而且各种化学成份复杂，并受原料和来源限制，因此产品成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。化学合成法技术上比较成熟，主要是以来源较丰富的茄尼醇为原料合成的，但其产物为顺反异构体的混合物，生物活性低，合成生物活性高的辅酶Q10尚未达到工业化生产的程度。微生物发酵法合成的辅酶Q10成本低、无光学异构体，生物学活性高，大规模生产应用效果好。

但近年来微生物生物合成辅酶Q10所用的菌类种类多，但高产稳产菌不多，国内市场仍以进口产品为主。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明目的在于提供一种构建辅酶Q10高表达重组菌株的方法和该菌株的应用。

为达上述目的，本发明提供如下技术方案：一种构建辅酶Q10高表达重组菌株的方法，包括以下步骤，S1：以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides2,4,1) 为出发菌，提取其基因组DNA为目的基因；S2：将所述目的基因进行PCR同源扩增；S3：获得的PCR扩增产物经引物整合至载体pKLAC2中得外源目的基因；S4：以乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactisGG799)为宿主菌，将所述外源目的基因组整合至所述乳酸克鲁维酵母菌的染色体LAC4位点上得到高表达重组菌株。

优选的，所述步骤S2中PCR同源扩增中包括一对含有同源整合位点的引物。

优选的，所述步骤S3中类球红细菌经PCR扩增、純化、鉴定后，在引物诱下整合到载体pKLAC2中。

优选的，所述步骤S3中pKLAC2载体中含强LAC4启动子和作为筛选标记的乙酰胺酶基因amds。

优选的，所述步骤S4中在半乳糖诱导的LAC4启动子控制下整合至所述乳酸克鲁维酵母菌的Ⅲ号染色体LAC4位点上，电转化至乳酸克鲁维酵母细胞中构建成重组菌株。

优选的，所述步骤S3中pKLAC2载体中融合增强型绿色荧光蛋白基因 (EGFP)报告基因。

一种高表达重组菌株的应用，包括如上述构建辅酶Q10高表达重组菌株的方法所得的高表达重组菌株，利用乳酸克鲁维酵母菌的高密度发酵，发酵液经酵母离心机作固液分离，虑液再由超虑膜作分子切割获得辅酶Q10。

优选的，包括对废弃的乳酸克鲁维酵母菌体提取核糖核酸(RNA)，还包括以下步骤，废弃酵母泥的预处理，得到干净酵母；采用浓盐酸法与稀碱法相结合提取核糖核酸，即以一定量的预处理好的废酵母配成10％的酵母溶液，在一定温度下，分别采用NaCl、NaOH溶液搅拌抽提一定时间后，离心分离上清液，调节pH值至等电点，经酒精沉淀获得所述核糖核酸。

本发明效果：一是本发明以PCR介导的同源置换，整合片段不需通过酶切，只需通过一对含有同源整合位点的引物，以含有目的基因的载体位模板，通过PCR就可简单的高拷贝扩增目的基因组；二是获得的高表达重组菌株在高产量的同时具有高遗传稳定性。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。应当说明的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

本实施例提出一种构建辅酶Q10高表达重组菌株的方法。

以类球红细菌(Rhodobactersphaeroides2,4,1)为出发菌，提取其基因组DNA 为目的基因，经PCR扩增，达到高拷贝大量的的效果；以乳酸克鲁维酵母菌(KluyveromyceslactisGG799)为宿主菌，含类球红细菌目的基因质粒DNA的PCR 扩增产物整合到载体pKLAC2中，可将外源目的基因组整合到乳酸克鲁维酵母的染色体LAC4位点上，在乳酸克维酵母整合型载体pKLAC2上融合目的基因 PCR扩增基因组和融合增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)报告基因，外源基因在乳酸克鲁维酵母细胞染色体中具有高稳定性和高拷贝数的效果。

更加具体的，包括以下步骤：

S1：以类球红细菌为出发菌，提取其基因组DNA为目的基因。

该出发菌是一类高产辅酶Q10的模式光合细菌，类球红细菌的细胞内需大量积累辅酶Q10才能消减光合作用产生的自由基，作为光合细菌的类球红细菌，由于辅酶Q10含量较高，是目前工业化大规模生产的主要菌株。

S2：将目的基因进行PCR同源扩增。

本步骤中PCR同源扩增中包括一对含有同源整合位点的引物。

对于该步骤的引物：采用引物数据库(primerBank)和常用引物软件Oligo7， PCR引物设计软件聚合酶链式反应(PCR)的扩增技术，目的是基因DNA受热变性后，解链成单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，PCR引物设计的目的是找一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

S3：获得PCR扩增目的基因组经引物整合至载体pKLAC2中得外源目的基因。

pKLAC2载体中含强LAC4启动子和作为筛选标记的乙酰胺酶基因amds (融合增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)报告基因)。pKLAC2载体使用强 LAC4启动子，pKLAC2属于通用表达载体。利用这载体既可使重组蛋白在细胞内表达，或通过与乳酸克鲁维酵母的融合实现分泌表达。pKLAC2的多克隆位点与其它表达系统相兼容。

同时，本步骤中以增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)为报告基因。报告基因是指遍码产物易与被鉴定及检测得一类基因，且宿主细胞中不存在该产物或类似物，具有实时性，易检测，可靠性，可重复等优点，绿色荧光蛋白基因 (EGFP)经紫外线激发而无需辅助因子及底物即可发射稳定的绿色荧光，具有检测方便，对细胞无毒害。

S4：以乳酸克鲁维酵母菌为宿主菌，将外源目的基因组整合至乳酸克鲁维酵母菌的染色体LAC4位点上得到高表达重组菌株。

需要说明的是，宿主菌为乳酸克鲁维酵母，其经美国FDA定位食品安全级酵母菌，具有营养要求简单，生长速度快，分泌蛋白能力强，蛋白适度糖基化等优点，适于基因工程领域的优良宿主菌。乳酸克鲁维酵母作为非常规酵母一钟，可实现200g/L的高密度发酵，与其它酵母相比，乳酸克鲁维酵母具有的优点是：超强的分泌能力，良好的大规模发酵特性，食品安全的级别及强整合表达能力。乳酸克鲁维酵母全基因组測序已完成，便于遗传操作，遗传背景与酿酒酵母接近，成本低廉，易放大，具备好的工业发酵规模特性，目前的商业化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)菌株GG799,是属野生单倍体菌株，而更具遗传稳定性。

进一步具体的说，本实施例采用乳酸克鲁维酵母蛋白表达试剂盒，提供了一种在乳酸克鲁维酵母中表达目的基因的简便方法。目的基因克隆到pKLAC2 整合载体中，也能独立存在于染色体外的载体，既可表达胞内蛋白，亦可表达分泌型蛋白。而乳酸克鲁维酵母具有高培养密度及整合多拷贝遗传物质的能力，使其可成功制备大量的高表达蛋白质。在乳酸克鲁维酵母GG799蛋白表达试剂盒中提供的基础菌株。其特点是细胞生长密度与异源蛋白表达效率极高，乳酸克鲁维酵母GG799细胞未经遗传修饰。

本实施例中引物PLa2-F/PLa2-R基因组如下，

PLa2-F:5’-CCGCTCGAGAAAAGAACGACTAAGATTTAAG-3’

PLa2-R:5’-GGAAGATCTTCAACCACCAAACAACTTATG-3’

PCR引物合成及基因测序委托由上海生工生物工程股份有限公司。

将乳酸克鲁维酵母整合载体pKLAC2为模板，以出发菌类球红细菌，经 PCR扩增，純化，鉴定后，在引物诱下整合到载体pKLAC2中,对增强型绿色荧光蛋白(egfp)整合到pKLAC2中，在半乳糖诱导的lAC4启动子控制下整合在Ⅲ号染色体LAC4位点上。电转化乳酸克鲁维酵母细胞中构建成重组菌。

需要说明的是，为达到本实施例的最佳效果，经过优选并整合为新的方法，实现辅酶Q10的高产和高稳定性，其优选包括如下：

(1)以类球红细菌为出发菌(Rhodobactersphaeroides2,4,1)，乳酸克鲁维酵母维为宿主菌(KluyveromyceslactisGG799)，构建高表达重组菌株，类球红细菌是一个高效的产膜蛋白的光合细菌。

(2)采用乳酸克鲁维酵母(KluyveromyceslactisGG799)为宿主菌，其整合型表达质粒载体为pKLAC2，目的基因(类球红细菌DNA基因组PCR产物)通常使载体插入乳酸克鲁维酵母染色体LAC4位点，也具有能独立存在于染色体外的整合型载体双重功能，同时利用lAC4启动子启动基因表达。

(3)以PCR介导的同源置换，整合片段不需通过酶切，只需通过一对含有同源整合位点的引物，以含有目的基因的载体位模板，通过PCR就可简单的大量的高拷贝整合目的产物。

(4)报告基因选用增强型绿色荧光蛋白(egfp)增强型绿色荧光蛋白，经紫外光激发无需辅助因子及底物即可发射稳定的绿色荧光，具有检测方便，活体表达，对细胞无毒害，无种族和组织特异性优点利用增强型绿色荧光蛋白(egfp)，整合到载体pKLAC2中,而无需要IPTG诱导和X-gal显色剂。利用绿色荧光蛋白EGFP；具有更强的转录能力。

本实施例的效果如下：

以PCR介导的同源置换，只需通过一对含有同源整合位点的引物，以含有目的基因的载体为模板，通过PCR就可简单的大量的整合目的基因产物。 PCR引物设计软件聚合酶链式反应(PCR)的扩增技术，克隆到载体pKLAC2中, 以PCR介导的同源置换，整合片段不需通过酶切，只需通过一对含有同源整合位点的引物，以含有目的基因的载体位模板，通过PCR就可简单的大量的整合产物。

根据乳酸克鲁维酵母GG799的偏爱性和类球红细菌DNA基因组序列，乳酸克鲁维酵母特点之一就是具有能独立存在于染色体外的整合型载体，也具有能够整合于酵母染色体的整合型载体,乳酸克鲁维酵母的整合载体pKLAC2，含强启动子lAC4，和乙酰胺酶基因amds为筛选标记，筛选标记为将目的基因发生正确整合的重组菌从源始菌中筛选出来。

实施例2

为验证本发明的实际效果，本实施例提出一种高表达重组菌株的应用，其利用乳酸克鲁维酵母菌的高密度发酵，发酵液经酵母离心机作固液分离，虑液再由超虑膜作分子切割获得辅酶Q10。

实施例3

本实施例提供一种对高表达重组菌株的应用，为高表达重组菌株的应用，为了菌株的不流失，本实施例为对废弃的乳酸克鲁维酵母废弃菌体提取核糖核酸(RNA)，

具体包括以下步骤：

废弃酵母泥的预处理，得到干净酵母；

采用浓盐酸法与稀碱法相结合提取核糖核酸，即以一定量的预处理好的废酵母配成10％的酵母溶液，在一定温度下，分别采用NaCl、NaOH溶液搅拌抽提一定时间后，离心分离上清液，调节pH值至等电点，经酒精沉淀获得核糖核酸。

其中浓盐酸法提取核糖核酸包括以下步骤，

称取预处理好的废酵母配成10％的酵母溶液，NaCl浓度为6％；

90℃抽提3h，离心分离上清液，调节pH值至等电点，经酒精沉淀获得核糖核酸；

用水定容至100mL，取1mL稀释50倍，调节pH＝7，当NaCl浓度为10％时，提取率为0.67％，对绝干酵母提取率不到1％，原料中核糖核酸含量为6.50％。

其中稀碱法提取核糖核酸包括以下步骤，

称取预处理好的废酵母配成10％的酵母溶液，加入10％的NaCl搅拌均匀，抽提pH值为7.5，NaCl用量为6.5％，抽提时间180min；

对废弃酵母中核糖核酸的提取率接近90％。

应当理解的是，本发明通过实施方式加以描述，实施例仅为针对本发明权利要求所提出技术方案能够实现所给出清楚完整的说明，即对权利要求的解释说明，因此当评判本发明说明书记载的技术方案是否公开充分时，应当予以充分考虑权利要求所限定方案的旨在核心要义，而在说明书中必然存在与本实施例所提出解决核心技术问题相无关的其他技术问题，其对应的技术特征、技术方案均不属于本实施例要义所指，属于非必要技术特征，故可参照隐含公开，本领域技术人员完全可以结合现有技术和公知常识进行实现，因此无任何必要做详述。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种构建辅酶Q10高表达重组菌株的方法，其特征在于：包括以下步骤，

S1：以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides2,4,1)为出发菌，提取其基因组DNA为目的基因；

S2：将所述目的基因进行PCR同源扩增；

S3：获得的PCR扩增产物经引物整合至载体pKLAC2中得外源目的基因；

S4：以乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis GG799)为宿主菌，将所述外源目的基因组整合至所述乳酸克鲁维酵母菌的染色体LAC4位点上得到高表达重组菌株。

2.如权利要求1所述的构建辅酶Q10高表达重组菌株的方法，其特征在于：所述步骤S2中PCR同源扩增中包括一对含有同源整合位点的引物。

3.如权利要求1或2所述的构建辅酶Q10高表达重组菌株的方法，其特征在于：所述步骤S3中类球红细菌经PCR扩增、純化、鉴定后，在引物诱下整合到载体pKLAC2中。

4.如权利要求3所述的构建辅酶Q10高表达重组菌株的方法，其特征在于：所述步骤S3中pKLAC2载体中含强LAC4启动子和作为筛选标记的乙酰胺酶基因amds。

5.如权利要求1～2或4任一所述的构建辅酶Q10高表达重组菌株的方法，其特征在于：所述步骤S4中在半乳糖诱导的LAC4启动子控制下整合至所述乳酸克鲁维酵母菌的Ⅲ号染色体LAC4位点上，电转化至乳酸克鲁维酵母细胞中构建成重组菌株。

6.如权利要求5所述的构建辅酶Q10高表达重组菌株的方法，其特征在于：所述步骤S3中pKLAC2载体中融合增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)报告基因。

7.一种高表达重组菌株的应用，其特征在于：包括如权利要求1～6所述构建辅酶Q10高表达重组菌株的方法所得的高表达重组菌株，利用乳酸克鲁维酵母菌的高密度发酵，发酵液经酵母离心机作固液分离，虑液再由超虑膜作分子切割获得辅酶Q10。

8.如权利要求7所述的高表达重组菌株的应用，其特征在于：包括对废弃的乳酸克鲁维酵母菌体提取核糖核酸(RNA)，还包括以下步骤，

废弃酵母泥的预处理，得到干净酵母；

采用浓盐酸法与稀碱法相结合提取核糖核酸，即以一定量的预处理好的废酵母配成10％的酵母溶液，在一定温度下，分别采用NaCl、NaOH溶液搅拌抽提一定时间后，离心分离上清液，调节pH值至等电点，经酒精沉淀获得所述核糖核酸。