CN113573736A - 经修饰的微rna和它们在治疗癌症中的用途 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了经修饰的微RNA核酸组合物，其具有分别被吉西他滨或5‑卤代尿嘧啶替换的一个或多个胞嘧啶和/或尿嘧啶碱基。更具体地，本公开内容揭示，用吉西他滨分子替换微RNA核苷酸序列内的胞嘧啶核苷酸会增加微RNA的抑制癌症进展和肿瘤发生的能力。另外，本公开内容揭示，用吉西他滨分子替换微RNA核苷酸序列内的胞嘧啶核苷酸和用5‑卤代尿嘧啶替换尿嘧啶碱基会增加微RNA的抑制癌症发展的能力。因此，本公开内容提供了具有掺入在其核酸序列中的吉西他滨分子的各种经修饰的核酸(例如，微RNA)组合物及其使用方法。本公开内容进一步提供了包含经修饰的核酸组合物的药物组合物，以及使用其治疗癌症的方法。

Description

经修饰的微RNA和它们在治疗癌症中的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年3月14日提交的美国临时申请号62/818,190的优先权权益，其整个内容通过引用并入本文。

政府支持

本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号CA197098下在政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。

序列表的通过引用并入

ASCII文本文件中的序列表通过引用并入本文，该序列表的名称为050_9017_PCT_SequenceListing.txt，大小为3 KB字节，并通过EFS-Web呈交至美国专利和商标局(UnitedStates Patent and Trademark Office)。

技术领域

本公开内容一般地涉及包含2’2’-二氟2’脱氧胞苷(吉西他滨)的核酸组合物。更具体地，本公开内容提供了含有一种或多种吉西他滨分子的经修饰的微RNA组合物及其使用方法。此外，本申请提供了包含本发明的核酸组合物的药物组合物和使用它们治疗癌症的方法。

背景技术

微RNA (miRNA, miR)是一类高度保守的非编码小核糖核酸(RNA)分子，其如下介导细胞或生物体中的翻译：负调节其靶基因的表达，并从而导致翻译停止、信使RNA (mRNA)切割或其组合。参见Bartel DP. Cell. (2009) 136(2):215-33。通过靶向多种转录物，miRNA调节广泛的生物学过程，包括细胞凋亡、分化和细胞增殖；因此，异常的微RNA功能可以导致癌症(参见Ambros V. Nature. (2004) 431第350-355页)，且因此，miRNA最近已被鉴定为生物标志物、癌基因或肿瘤抑制因子。参见，例如，Croce, CM. Nat Rev Genet.(2009) 10第704-714页。

根据世界卫生组织，癌症是全球主要的死亡原因，在2015年有880万人死于癌症。肺癌是美国男性和女性癌症死亡的主要原因，只有18.6%的诊断出肺癌的患者存活超过5年。Surveillance, Epidemiology, and End Results Program.SEER Cancer StatFacts: Lung and Bronchus Cancer. National Cancer Institute. Bethesda, MD(2018)。肺癌主要有两大类：非小细胞肺癌和小细胞肺癌。非小细胞肺癌通过在组织中存在的癌细胞类型进一步描述。因此，非小细胞肺癌分为以下肺癌子类：鳞状细胞癌(也称为表皮样癌)，大细胞癌，腺癌(即起源于肺泡内衬细胞的癌症)，多形性癌，类癌瘤，和唾液腺癌。同时，小细胞肺癌有两种主要类型：小细胞癌和组合小细胞癌。SEER Cancer Stat Facts:Lung and Bronchus Cancer. National Cancer Institute. Bethesda, MD (2018)。非小细胞肺癌的最常见治疗是吉西他滨(2', 2'-二氟2'脱氧胞苷)、泰素(例如，紫杉醇)、顺铂(DNA交联剂)和它们的组合。但是，许多类型的基于抗体的治疗剂也用于治疗非小细胞肺癌(例如，吉非替尼、派姆单抗、阿来替尼)。小细胞肺癌通常通过基于甲氨蝶呤、盐酸多柔比星和托泊替康的化学治疗剂来治疗。

乳腺癌是女性中第二最常见的癌症，最常见的乳腺癌类型是导管癌。导管癌始于导管细胞。相比之下，经常在两个乳房中发现的小叶癌起源于叶或小叶。许多化学治疗剂被用于治疗乳腺癌，包括但不限于，细胞毒性的药物诸如泰素(例如，紫杉醇、多西他赛)、盐酸多柔比星、5-FU、盐酸吉西他滨、甲氨蝶呤和枸橼酸他莫昔芬。此外，施用许多基于抗体的治疗剂来治疗不同类型的乳腺癌，诸如曲妥珠单抗、奥拉帕尼和培妥珠单抗。

胰腺癌是一种非常难以治疗的致命癌症。参见Siegel, RL等人. Cancer J. Clin. (2015) 65第5-29页。胰腺癌的独特方面包括小于7%的非常低的5年存活率、较晚显现、较早转移以及对化学疗法和辐射的不良应答。参见Maitra A和Hruban RH, Annu Rev. Pathol. (2008) 3第157-188页。迄今为止，基于吉西他滨的化学疗法(2', 2'-二氟2'脱氧胞苷)是治疗胰腺癌的黄金标准，但由于耐药性，治疗干预的效果有限。Oettle, H等人.JAMA (2013) 310第1473-1481页。

膀胱癌是在男性和女性中非常普遍的癌症形式。在2015年，在美国估计有708,444人患有膀胱癌，其中大约2.3%的男性和女性在他们生命中的某个时点被诊断出膀胱癌。Noone AM, 等人(编). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2015, National Cancer Institute. Bethesda, MD (2018)。膀胱癌的主要类型是：移行细胞癌；鳞状细胞癌；和腺癌。被批准用于治疗膀胱癌的药物包括，例如，盐酸多柔比星、顺铂、盐酸吉西他滨和戊柔比星。某些抗体也被批准用于治疗膀胱癌，包括阿特朱单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、派姆单抗和纳武单抗。

在美国有大约225,000名女性患有卵巢癌，每年大约12/100,000的女性被新诊断出卵巢癌。Noone AM, 等人(编). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2015,National Cancer Institute. Bethesda, MD (2018)。卵巢癌有三种主要形式。即，卵巢上皮癌、输卵管癌和原发性腹膜癌，它们分别形成于覆盖卵巢、衬在输卵管或腹膜的组织中。许多化学治疗剂被用于治疗卵巢癌，包括但不限于，细胞毒性的药物诸如泰素(例如，紫杉醇)、盐酸多柔比星、盐酸拓扑替康、盐酸吉西他滨、卡铂和顺铂。此外，施用许多基于抗体的治疗剂来治疗卵巢癌，诸如贝伐珠单抗、奥拉帕尼和樟脑磺酸芦卡帕尼。

吉西他滨(即，2’2’-二氟2’脱氧胞苷，dFdC，dFdCyd，二氟脱氧胞苷盐酸盐，或更具体地，盐酸吉西他滨)是一种众所周知的嘧啶核苷。吉西他滨是抗代谢物核苷脱氧胞苷的类似物的盐酸盐，其具有抗肿瘤活性。吉西他滨在细胞内转化为活性代谢物二氟脱氧胞苷二磷酸和二氟脱氧胞苷三磷酸(dFdCDP, dFdCTP)。dFdCDP抑制核糖核苷酸还原酶，从而减少可用于DNA合成的脱氧核苷酸库；dFdCTP掺入DNA，从而导致DNA链终止和细胞凋亡。吉西他滨具有化学结构1-(2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基)-2-脱氧-2,2-二氟核糖盐酸盐。

5-氟尿嘧啶(即，5-FU，或更具体地，5-氟-1H-嘧啶-2,4-二酮)是一种众所周知的嘧啶拮抗剂，其被用于许多辅助化疗药物，诸如Carac®乳膏剂、Efudex®、Fluoroplex®和Adrucil®。众所周知，5-FU靶向一种关键酶胸苷酸合酶(TYMS或TS)，该酶催化脱氧尿苷单磷酸(dUMP)向脱氧胸苷单磷酸(dTMP)的甲基化，这是DNA生物合成的重要步骤。DanenbergP. V., Biochim. Biophys. Acta. (1977) 473(2):73-92。

尽管如此，现有的癌症疗法仍处于其起步阶段，仍有许多障碍有待改进或克服。例如，众所周知，尽管在治疗多种癌症方面相当有效，但5-FU和吉西他滨具有显著的毒性并可能引起许多不利的副作用。此外，已知肿瘤细胞通过对常见治疗剂(诸如5-FU和吉西他滨)产生抗性来绕过细胞凋亡途径。参见Gottesman M. M. 等人, Nature Reviews Cancer,(2002) 2(1):48-58。因此，更有效、更稳定且更低毒性的药物对于癌症的治疗将具有显著益处。

发明内容

不受任何一种特定理论束缚，本公开内容的前提是下述发现：当与某些已知的单独化学治疗剂和/或天然微RNA分子相比时，用吉西他滨替换微RNA的核苷酸序列内的胞嘧啶碱基会增加微RNA作为抗癌治疗剂的效力。本公开内容证实，本公开内容的核酸组合物(即，微RNA，其用吉西他滨分子替换至少一个胞嘧啶碱基)具有作为抗癌剂的特殊效力。此外，本文中的数据表明，使细胞与本公开内容的经修饰的微RNA组合物接触会通过例如降低癌细胞生长和生存力来降低肿瘤发生。此外，表明本公开内容的经修饰的微RNA保留了靶标特异性，可以在不使用有害和无效递送媒介物(例如，纳米颗粒)的情况下进行递送，并且在不消除天然微RNA的天然功能的情况下表现出增强的效能和稳定性。因此，本公开内容提供了用于治疗癌症的具有增强的稳定性、效能和靶标特异性的新颖的经修饰的微RNA组合物。

因此，在本公开内容的一个方面，描述了包含经修饰的微RNA核苷酸序列的核酸组合物，所述序列具有至少一个已经被吉西他滨分子替换的胞嘧啶碱基(C, C-碱基)。在某些实施方案中，所述经修饰的微RNA具有超过一个或刚好一个已经被吉西他滨替换的胞嘧啶。在某些实施方案中，所述经修饰的微RNA核苷酸序列用吉西他滨分子替换2、3、4、5个或更多个胞嘧啶碱基。在具体实施方案中，天然微RNA的所有胞嘧啶碱基各自已经被吉西他滨分子替换。

在一个具体实施方案中，所述核酸组合物包含经修饰的天然miR-194核苷酸序列，其已经通过用吉西他滨分子替换至少一个胞嘧啶碱基而进行修饰。更具体地，所述核酸组合物至少含有下述天然miR-194核苷酸序列：UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA [SEQ ID NO. 1]，其中至少1、2、3、4个或所有胞嘧啶碱基被吉西他滨分子替换。在一种情况中，经修饰的miR-194核苷酸序列中的精确一个胞嘧啶碱基被吉西他滨分子替换。在其它情况中，经修饰的miR-194核苷酸序列中的精确两个或至少两个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换。在再其它情况中，经修饰的miR-194核苷酸序列中的精确三个或至少三个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换。在另一种情况中，经修饰的miR-194核苷酸序列中的精确4个或至少4个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换。在具体实施方案中，经修饰的miR-194序列中的所有胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换。可以在天然微RNA的指导链或乘客链中进行对miR-194的修饰。在一个优选的实施方案中，对指导链进行对miR-194分子的修饰。

在一个示例性实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有经修饰的miR-194核苷酸序列UGUAANAGNAANUNNAUGUGGA [SEQ ID NO. 2]，其中N是吉西他滨分子。

本公开内容也表明，当与单独的天然微RNA或通过用5-FU替换至少一个尿嘧啶碱基而修饰的微RNA相比时，具有至少一个被5-卤代尿嘧啶诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)替换的尿嘧啶碱基(U, U-碱基)和至少一个被吉西他滨分子替换的胞嘧啶碱基的微RNA表现出改善的对癌细胞的治疗效果。

因此，在本公开内容的另一个方面，描述了包含经修饰的微RNA核苷酸序列的核酸组合物，所述序列具有至少一个被5-卤代尿嘧啶替换的尿嘧啶碱基和至少一个被吉西他滨分子替换的胞嘧啶碱基。在某些实施方案中，所述经修饰的微RNA具有超过一个或刚好一个已经被5-卤代尿嘧啶替换的尿嘧啶以及超过一个或刚好一个已经被吉西他滨替换的胞嘧啶。在某些实施方案中，所述经修饰的微RNA核苷酸序列用5-卤代尿嘧啶替换2、3、4或5个尿嘧啶碱基且用吉西他滨分子替换2、3、4或5个胞嘧啶碱基。在具体实施方案中，天然微RNA的所有尿嘧啶碱基已经被5-卤代尿嘧啶替换，且天然微RNA的所有胞嘧啶碱基已经被吉西他滨分子替换。

在某些实施方案中，所述5-卤代尿嘧啶是，例如，5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。在具体实施方案中，所述5-卤代尿嘧啶是5-氟尿嘧啶。

在某些实施方案中，所述经修饰的微RNA核苷酸序列包括超过一个5-卤代尿嘧啶，其中每个5-卤代尿嘧啶是相同的。在其它实施方案中，所述经修饰的微RNA核苷酸序列包括超过一个5-卤代尿嘧啶，其中每个5-卤代尿嘧啶是不同的。在其它实施方案中，所述经修饰的微RNA核苷酸序列包括超过两个5-卤代尿嘧啶，其中所述经修饰的微RNA核苷酸序列包括不同的5-卤代尿嘧啶的组合。

在本公开内容的一个示例性实施方案中，提供了含有miR-194核苷酸序列的核酸组合物，所述序列已经通过用5-卤代尿嘧啶替换至少一个尿嘧啶核苷酸碱基和用吉西他滨分子替换至少一个胞嘧啶核苷酸碱基进行了修饰。

在一种情况中，天然miR-194核苷酸序列中的精确一个胞嘧啶碱基被吉西他滨分子替换且精确一个尿嘧啶碱基被5-卤代尿嘧啶替换。在其它情况中，miR-194核苷酸序列中的精确两个或至少两个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换且精确两个或至少两个尿嘧啶碱基各自被5-卤代尿嘧啶替换。在再其它情况中，miR-194核苷酸序列中的精确三个或至少三个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换且精确三个或至少三个尿嘧啶碱基各自被5-卤代尿嘧啶替换。在另一种情况中，miR-194核苷酸序列中的精确4个或至少4个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换且精确4个或至少4个尿嘧啶碱基各自被5-卤代尿嘧啶替换。在具体实施方案中，miR-194序列中的所有胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换且所有尿嘧啶碱基各自被5-卤代尿嘧啶诸如5-FU替换。

在一个示例性实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有经修饰的miR-194核苷酸序列U^FGU^FAANAGNAANU^FNNAU^FGU^FGGA [SEQ ID NO. 3]，其中N是吉西他滨分子且U^F是卤代尿嘧啶，特别是5-氟尿嘧啶。

本公开内容也涉及本文描述的经修饰的微RNA组合物的制剂或包含其组合(即，至少两种不同的经修饰的微RNA)的制剂。在某些实施方案中，所述制剂可以包括药物制品，所述药物制品包含上述的核酸组合物和其它已知的药理学试剂，诸如一种或多种药学上可接受的载体。

本公开内容揭示，经修饰的微RNA各自表现出作为抗癌治疗剂的有效效力。值得注意的是，所测试的每种经修饰的微RNA核酸组合物都降低了癌细胞生存力、肿瘤生长和发展。

因此，本公开内容的另一个方面涉及一种治疗癌症的方法，其包括给受试者施用有效量的一种或多种本文描述的核酸组合物。在本发明方法的某些实施方案中，所述核酸组合物包含经修饰的miR-194，其中至少1、2、3、4个或更多个胞嘧啶碱基被吉西他滨分子替换。

在具体实施方案中，所述方法包括给具有癌症或癌症倾向的受试者施用本公开内容的核酸组合物，其中所述核酸组合物是具有核酸序列UGUAANAGNAANUNNAUGUGGA [SEQ IDNO. 2]的经修饰的miR-194分子，其中N是吉西他滨分子。

在另一个实施方案中，本发明方法包括施用经修饰的miR-194，其具有至少1、2、3、4个或更多个被吉西他滨分子替换的胞嘧啶碱基和至少1、2、3、4个或更多个被卤代尿嘧啶诸如5-氟尿嘧啶替换的尿嘧啶碱基。在一个具体实施方案中，本发明方法包括施用经修饰的mir-194，其具有被吉西他滨分子替换的每个胞嘧啶碱基和被5-卤代尿嘧啶替换的每个尿嘧啶核苷酸碱基。

在具体实施方案中，本发明方法包括给具有癌症或癌症倾向的受试者施用本公开内容的核酸组合物，其中所述核酸组合物是具有核酸序列U^FGU^FAANAGNAANU^FNNAU^FGU^FGGA[SEQ ID NO. 3]的经修饰的miR-194分子，其中N是吉西他滨分子且U^F是卤代尿嘧啶，特别是5-氟尿嘧啶。

在某些情况下，通过本发明方法治疗的受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，被治疗的受试者是人、狗、马、猪、小鼠或大鼠。在一个具体实施方案中，受试者是已被诊断出癌症的人，或已被鉴定为具有发生癌症的倾向的人。在某些实施方案中，被治疗的癌症可以是例如胰腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌或膀胱癌。在一个具体实施方案中，被治疗的癌症是胰腺癌。

附图说明

图1A-1D. 本公开内容的示例性的经修饰的微RNA核苷酸序列的化学表示。(A)天然miR-194核苷酸序列的化学表示，其中没有C碱基或U碱基分别被吉西他滨或卤代尿嘧啶替换(SEQ ID NO: 1)。(B)天然miR-194核苷酸序列的化学表示，其中所有U碱基都被卤代尿嘧啶(即，U^F)替换，如在SEQ ID NO: 4 (U^FGU^FAACAGCAACU^FCCAU^FGU^FGGA)中所示。(C) miR-194的化学表示，其中所有胞嘧啶碱基都被吉西他滨分子(X)替换，如在SEQ ID NO: 2中所示。(D) miR-194核苷酸序列的化学表示，其中所有胞嘧啶碱基被吉西他滨分子替换，且每个尿嘧啶碱基被5-FU分子替换，如在SEQ ID NO: 3中所示。所描述的每种示例性的经修饰的微RNA的取向按5’至3’或3’至5’指示来提供。

图2A-D. 示例性的经修饰的微RNA核酸进入癌细胞并有效降低靶蛋白表达。(A)蛋白质印迹表明，miR-194靶向SET8，和与对照经修饰的miR-194 (5-FU-miR-194，如在SEQ IDNO: 4中所示)和未修饰的miR-194核酸相比，在有转染剂存在下具有被5-FU替换的所有U碱基和被吉西他滨替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194组合物(5-FU-Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 3中所示)和具有被吉西他滨替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194组合物(Gem-mir-194，如在SEQ ID NO: 2中所示)进入细胞并抑制靶标(SET8)表达的能力。(B)蛋白质印迹表明，在没有转染剂存在下用本公开内容的示例性的经修饰的微RNA转染的细胞进入细胞并抑制SET8表达，而对照核酸不能抑制靶标表达。(C)蛋白质印迹表明，另一种示例性的miR-194靶向(BMI1)，和与对照经修饰的miR-194 (5-FU-miR-194，如在SEQ ID NO: 4中所示)和未修饰的miR-194核酸相比，在有转染剂存在下具有被5-FU替换的所有U碱基和被吉西他滨替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194组合物(5-FU-Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 3中所示)和具有被吉西他滨替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194组合物(Gem-mir-194，如在SEQ ID NO: 2中所示)进入细胞并抑制靶标(BMI1)表达的能力。(D)蛋白质印迹表明，在没有转染剂存在下用本公开内容的示例性的经修饰的微RNA转染的细胞进入细胞并抑制BMI1表达，而未修饰的miR-194对照核酸不能抑制靶标表达。

图3A-3C. 图显示了示例性的经修饰的miR-194分子在3种不同的胰腺癌细胞系(A) ASPC1、(B) PANC1和(C) HS766T中以剂量依赖性方式抑制胰腺癌细胞生存力。当与外源地表达的天然miR-194对照和经修饰的miR-194 (5-FU-miR-194，如在SEQ ID NO: 4中所示)相比时，具有被5-FU替换的所有U碱基和被吉西他滨替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194组合物(5-FU-Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 3中所示)和具有被吉西他滨替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194组合物(Gem-mir-194，如在SEQ ID NO: 2中所示)抑制胰腺癌细胞生存力。

图4. 使用示例性的经修饰的微RNA核酸组合物的体内全身治疗抑制胰腺癌转移和肿瘤生长。通过转移性人胰腺癌细胞的尾静脉注射，建立胰腺癌转移小鼠模型。在建立转移后4天，以每隔一天注射一次的治疗频率持续两周，通过静脉内注射递送80µg经修饰的miR-194核酸组合物，如在SEQ ID NO: 2中所示。与对照相比，示例性的经修饰的miR-194核酸能够抑制转移性胰腺癌生长。用经修饰的miR-194核酸治疗的小鼠没有表现出任何毒性。

表1. 每种示例性的经修饰的微RNA在胰腺癌细胞系中的IC50。在ASPC1胰腺癌细胞中，具有被5-FU替换的所有U碱基的经修饰的miR-194(5-FU-mIR-194，SEQ ID NO: 4)的IC50为6.06 nM；具有被吉西他滨替换的所有C碱基的经修饰的miR-194(Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 2中所示)的IC50为4.29 nM，和具有被5-FU替换的所有U碱基和被吉西他滨替换的所有C碱基的经修饰的miR-194(5-FU-Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 3中所示)的IC50为2.88 nM。在PANC1胰腺癌细胞中，具有被5-FU替换的所有U碱基的经修饰的miR-194(5-FU-mIR-194, SEQ ID NO: 4)的IC50为16 nM；具有被吉西他滨替换的所有C碱基的经修饰的miR-194 (Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 2中所示)的IC50为1.92 nM，和具有被5-FU替换的所有U碱基和被吉西他滨替换的所有C碱基的经修饰的miR-194(5-FU-Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 3中所示)的IC50为0.93 nM。在HS766T胰腺癌细胞中，具有被5-FU替换的所有U碱基的经修饰的miR-194(5-FU-mIR-194，SEQ ID NO: 4)的IC50为26.45 nM；具有被吉西他滨替换的所有C碱基的经修饰的miR-194 (Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 2中所示)的IC50为3.57 nM，和具有被5-FU替换的所有U碱基和被吉西他滨替换的所有C碱基的经修饰的miR-194(5-FU-Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 3中所示)的IC50为2.46 nM。

具体实施方式

本公开内容提供了掺入一种或多种吉西他滨分子的核酸组合物。不受任何一种特定理论束缚，令人惊奇地，本公开内容揭示，用吉西他滨分子替换微RNA寡核苷酸序列内的胞嘧啶核苷酸会增加微RNA抑制癌症发展、进展和肿瘤发生的能力。此外，本文中的数据表明，当与单独的天然微RNA或通过用5-FU替换尿嘧啶碱基而修饰的微RNA相比时，使癌细胞与本公开内容的经修饰的微RNA组合物接触会以剂量依赖性的方式降低癌细胞的生存力。此外，表明本公开内容的经修饰的微RNA保留了靶标特异性，可以在不使用有害和无效的递送媒介物(例如，纳米颗粒)的情况下进行递送，并且在不消除天然微RNA的天然功能的情况下表现出增强的效能和稳定性。因此，本公开内容提供了在其核酸序列中掺入了一个或多个吉西他滨分子的各种核酸(例如，微RNA)组合物以及使用其治疗癌症的方法。本公开内容进一步提供了制剂，诸如包含经修饰的核酸组合物的药物组合物，以及用于治疗癌症的方法，包括将其施用给有此需要的受试者。

核酸组合物.

术语“微RNA”或“miRNA”或“miR”互换使用以表示能够通过与信使RNA分子(mRNA)、DNA或蛋白相互作用来调节基因表达的小非编码核糖核酸(RNA)分子。通常，微RNA由大约19-25个核苷酸(碱基)的核酸序列组成，并存在于哺乳动物细胞中。成熟的微RNA分子是由形成局部发夹结构的双链前体转录物加工而成的单链RNA分子。发夹结构通常被Dicer酶切割以形成双链微RNA双链体。参见，例如，Bartel, Cell, (2004) 116第281-297页。本文中使用的术语微RNA包含在5' 到3' 方向的双链体(即，双链miR)和单链miR (即，成熟的miR)和在3' 到5' 方向的互补链。在具体实施方案中，本公开内容的修饰的miR由单链成熟MiR组成。

通常，微RNA双链体的两条链之一被包装在微RNA核糖核蛋白复合物(微RNP)中。例如，人类中的微RNP还包括蛋白eIF2C2/Argonaute (Ago2)、解螺旋酶Gemin3和Gemin 4。Argonaute蛋白家族的其它成员，诸如Ago1、3和4，也与微RNA结合并形成微RNP。

术语“经修饰的微RNA”、“经修饰的miRNA”、“经修饰的miR”或“模仿物”在本文中互换地用于表示不同于天然或内源性微RNA (未修饰的微RNA)多核苷酸的微RNA。更具体地，在本公开内容中，经修饰的微RNA与未改变的或未修饰的微RNA核酸序列的差别在于一个或多个碱基。在本公开内容的某些实施方案中，本公开内容的经修饰的微RNA包括至少一个被吉西他滨分子替换的胞嘧啶(C)核苷酸碱基。在其它实施方案中，本公开内容的经修饰的微RNA包括至少一个被5-卤代尿嘧啶替换的尿嘧啶(U)核苷酸碱基和至少一个被吉西他滨分子替换的胞嘧啶(C)核苷酸碱基。

本文中使用的术语“吉西他滨”与2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷、2',2'-二氟脱氧胞苷、4-氨基-1-((2R,4R,5R)-3,3-二氟-4-羟基-5-(羟基甲基)-四氢呋喃-2-基)嘧啶-2(1H)-酮、盐酸吉西他滨、dFdC、dFdCyd和二氟脱氧胞苷盐酸盐是同义的。吉西他滨是用作化学疗法的核苷(嘧啶)类似物。吉西他滨作为Gemzar®销售。吉西他滨具有以下结构：

。

已知吉西他滨通过在复制过程中掺入DNA内来阻止肿瘤生长。吉西他滨被批准用于治疗不同类型的癌症，包括非小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌和卵巢癌。

在本公开内容的一个方面, 描述了包含经修饰的微RNA核苷酸序列的核酸组合物，所述序列具有至少一个已经被吉西他滨分子替换的胞嘧啶碱基(C)。如在本文中进一步讨论的，本公开内容的核酸组合物至少可用于治疗癌症。具体地，本公开内容的示例性的经修饰的微RNA在本文中已经被证实可有效地治疗胰腺癌。

在某些实施方案中，所述经修饰的微RNA具有超过一个或刚好一个已经被吉西他滨替换的胞嘧啶。在某些实施方案中，所述经修饰的微RNA核苷酸序列用吉西他滨分子替换2、3、4或5个胞嘧啶碱基。在具体实施方案中，天然微RNA的所有胞嘧啶碱基各自已经被吉西他滨分子替换。

在一个具体实施方案中，所述核酸组合物包含经修饰的天然miR-194核苷酸序列，该序列已经通过用吉西他滨分子替换至少一个胞嘧啶碱基进行了修饰。

本文中使用的术语“miR-194”意在与术语“微RNA-194”或“miRNA-194”同义，且表示具有下述核苷酸序列的寡核苷酸：UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA [SEQ ID NO. 1]。前述核苷酸序列在本文中被称作miR-194未修饰的(即，“天然的”)序列，除非另外指出。在某些实施方案中，miR-194在本领域中可以称作：具有登录号MI0000488或MI0000732的hsa-miR-194，对于含有双链微RNA的茎环；hsa-miR-194-5p，对于如在登录号MIMAT0000460中所示的成熟的miR 5’至3’链；和hsa-miR-194-3p，对于如登录号MIMAT0004671所示的双链体分子的3’至5’互补链。MiR-194是众所周知的并且已经被详细研究过。参见，例如，Lagos-QuintanaM, 等人, RNA. 9: 第175-179页(2003)。与上述情况一样，经修饰的微RNA、产生miR-194模仿物的方法是本领域普通技术人员已知的。除非另有说明，否则所有这样的修饰的miR-194核酸形式在本文中均被视为在本文所用术语“miR-194模仿物”的范围内。

通常，经修饰的miR-194 (即，miR-194模仿物)含有不超过1、2、3、4或5个共价地附加至miR-194天然序列的额外核苷酸，其中额外碱基独立地选自C、U、G和A，或额外碱基可以排它地是C、U、G或A之一。通常，miR-194模仿物以单链形式使用，但本文也考虑双链形式。

更具体地，经修饰的微RNA组合物至少含有天然miR-194核苷酸序列，其中至少1、2、3、4个或所有胞嘧啶碱基被吉西他滨分子替换。在一种情况中，天然miR-194核苷酸序列中的精确一个胞嘧啶碱基被吉西他滨分子替换。在其它情况中，天然miR-194核苷酸序列中的精确两个或至少两个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换。在再其它情况中，天然miR-194核苷酸序列中的精确三个或至少三个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换。在另一种情况中，miR-194核苷酸序列中的精确4个或至少4个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换。在具体实施方案中，天然miR-194序列的指导链中的所有胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换。

在一个示例性实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有经修饰的miR-194核苷酸序列UGUAANAGNAANUNNAUGUGGA [SEQ ID NO. 2]，其中N是吉西他滨分子。

本公开内容也表明，当与单独的天然微RNA或通过用5-FU替换至少一个尿嘧啶碱基而修饰的微RNA相比时，具有至少一个被5-卤代尿嘧啶诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)替换的尿嘧啶碱基和至少一个被吉西他滨分子替换的胞嘧啶碱基的微RNA表现出改善的对癌细胞的治疗效果。

因此，在本公开内容中也提供了包含经修饰的微RNA的核酸组合物，所述经修饰的微RNA具有至少一个被5-卤代尿嘧啶替换的尿嘧啶碱基和至少一个被吉西他滨分子替换的胞嘧啶碱基。在某些实施方案中，所述经修饰的微RNA具有超过一个或刚好一个已经被5-卤代尿嘧啶替换的尿嘧啶和超过一个或刚好一个已经被吉西他滨替换的胞嘧啶。在某些实施方案中，所述经修饰的微RNA核苷酸序列用5-卤代尿嘧啶替换2、3、4或5个尿嘧啶碱基且用吉西他滨分子替换2、3、4或5个胞嘧啶碱基。在具体实施方案中，天然微RNA的所有尿嘧啶碱基已经被5-卤代尿嘧啶替换且天然微RNA的所有胞嘧啶碱基已经被吉西他滨分子替换。

在某些实施方案中，所述5-卤代尿嘧啶是，例如，5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。在具体实施方案中，所述5-卤代尿嘧啶是5-氟尿嘧啶。

在某些实施方案中，所述经修饰的微RNA核苷酸序列包括超过一个5-卤代尿嘧啶，其中每个5-卤代尿嘧啶是相同的。在其它实施方案中，所述经修饰的微RNA核苷酸序列包括超过一个5-卤代尿嘧啶，其中每个5-卤代尿嘧啶是不同的。在其它实施方案中，所述经修饰的微RNA核苷酸序列包括超过两个5-卤代尿嘧啶，其中所述经修饰的微RNA核苷酸序列包括不同的5-卤代尿嘧啶的组合。

在某些实施方案中，核酸组合物含有已经如下修饰的核苷酸序列：用提供与卤素原子类似的效果的基团在5-位置衍生化至少一个尿嘧啶核碱基。在某些实施方案中，提供类似效果的基团具有与卤素原子类似的重量或空间维度大小，例如，至多或小于20、30、40、50、60、70、80、90或80 g/mol的分子量。在某些实施方案中，提供与卤素原子类似的效果的基团可以是例如甲基、三卤甲基(例如，三氟甲基)基团、假卤化物(例如，三氟甲磺酸酯、氰基或氰酸酯)或氘(D)原子。在微RNA核苷酸序列中不存在5-卤代尿嘧啶碱基的情况下或在存在之外，可以存在提供与卤素原子类似的效果的基团。

在本公开内容的一个示例性实施方案中，提供了含有miR-194核苷酸序列的核酸组合物，该序列已经通过用5-卤代尿嘧啶替换至少一个尿嘧啶核苷酸碱基和用吉西他滨分子替换至少一个胞嘧啶核苷酸碱基进行了修饰。在一种情况中，天然miR-194核苷酸序列的精确一个胞嘧啶碱基被吉西他滨分子替换且精确一个尿嘧啶碱基被5-卤代尿嘧啶替换。在其它情况中，天然miR-194核苷酸序列中的精确两个或至少两个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换且精确两个或至少两个尿嘧啶碱基各自被5-卤代尿嘧啶替换。在再其它情况中，天然miR-194核苷酸序列中的精确三个或至少三个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换且精确三个或至少三个尿嘧啶碱基各自被5-卤代尿嘧啶替换。在另一种情况中，天然miR-194核苷酸序列中的精确4个或至少4个胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换且精确4个或至少4个尿嘧啶碱基各自被5-卤代尿嘧啶替换。在具体实施方案中，天然miR-194序列的指导链中的所有胞嘧啶碱基各自被吉西他滨分子替换且所有尿嘧啶碱基各自被5-卤代尿嘧啶诸如5-FU替换。

在一个示例性实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有经修饰的miR-194核苷酸序列U^FGU^FAANAGNAANU^FNNAU^FGU^FGGA [SEQ ID NO. 3]，其中N是吉西他滨分子且U^F是卤代尿嘧啶，特别是5-氟尿嘧啶。

使用众所周知的合成核酸的方法中的任一种，可以合成本文描述的经修饰的微RNA核酸组合物。在特定实施方案中，通过自动化的寡核苷酸合成，诸如众所周知的使用氨基亚磷酸酯化学的方法中的任一种，产生核酸组合物。为了在经修饰的miR序列(例如，miR-194序列)中引入一个或多个吉西他滨分子或5-卤代尿嘧啶碱基，可以包括吉西他滨或5-卤代尿嘧啶核苷氨基亚磷酸酯作为前体碱基，以及要包含在核酸序列中的含有天然碱基(例如，A、U、G和C)的核苷的氨基亚磷酸酯衍生物。

在某些实施方案中，可以通过生物合成产生本公开内容的核酸组合物，诸如通过使用从质粒、PCR片段或合成的DNA模板的体外RNA转录，或通过使用重组(体内) RNA表达方法。参见，例如，C. M. Dunham等人, Nature Methods, (2007) 4(7), 第547-548页。可以进一步化学修饰本公开内容的经修饰的微RNA序列(例如，miR-194序列)，诸如通过本领域众所周知的技术用聚乙二醇(PEG)或烃或靶向试剂、特别是癌细胞靶向试剂诸如叶酸酯官能化。为了包含这样的基团，可以首先在寡核苷酸序列中包含可用于附加期望的官能团的反应基团(例如，氨基、醛、硫醇或羧酸酯基)。尽管这样的反应基团或官能团可以掺入到所产生的核酸序列上，但可通过使用自动化的寡核苷酸合成更容易地包含反应基团或官能团，其中包括含有反应基团或反应性前体基团的非核苷氨基亚磷酸酯。

经修饰的核酸制剂

本公开内容揭示，经修饰的微RNA各自表现出作为抗癌治疗剂的有效效力。值得注意的是，所测试的每种经修饰的微RNA核酸组合物以剂量依赖性方式降低癌细胞生存力、肿瘤生长和发展。

因此，本公开内容还涉及本文描述的经修饰的微RNA核酸组合物的制剂。例如，本发明的核酸组合物可以配制用于药物用途。在某些实施方案中，制剂是含有本文描述的核酸组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包含：具有至少一个被吉西他滨分子替换的胞嘧啶碱基的经修饰的miR-194核酸，具有至少一个被吉西他滨分子替换的胞嘧啶碱基和至少一个被卤代尿嘧啶替换的尿嘧啶碱基的经修饰的miR-194核酸，或其组合，和药学上可接受的载体。

更具体地，可以配制在以下核苷酸序列中所示的经修饰的微RNA核酸中的一种或多种用于药物应用和用途；UGUAAXAGXAAXUXXAUGUGGA [SEQ ID NO. 2]或U^FGU^FAAXAGXAAXU^FXXAU^FGU^FGGA [SEQ ID NO. 3]。

术语“药学上可接受的载体”在本文中用作药学上可接受的稀释剂、媒介物或赋形剂的同义词。取决于药物组合物的类型和预期的施用模式，可以将核酸组合物溶解或悬浮(例如，作为乳剂)在药学上可接受的载体中。药学上可接受的载体可以是在合理的医学判断范围内适合用于与受试者的组织接触的那些液体或固体化合物、材料、组合物和/或剂型中的任一种。载体应当是“可接受的”，其含义是，对其被提供的受试者无害并且与制剂的其它成分相容，即不改变它们的生物或化学功能。

可充当药学上可接受的载体的材料的一些非限制性例子包括：糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；明胶；滑石；蜡类；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，诸如乙二醇和丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂；水；等张盐水；pH缓冲溶液；和在药物制剂中采用的其它无毒的相容物质。药学上可接受的载体还可以包括生产助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)、溶剂或包囊材料。如果需要的话，可以加入某些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。其它合适的赋形剂可以在标准药学教科书中找到，例如“Remington's Pharmaceutical Sciences”, The Science andPractice of Pharmacy, 第19版Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1995)。

在某些实施方案中，药学上可接受的载体可以包括增加固体药物组合物的体积和使药物剂型更易于患者和护理人员处理的稀释剂。固体组合物的稀释剂包括，例如，微晶纤维素(例如Avicel^®)、微细纤维素、乳糖、淀粉、预胶化淀粉、碳酸钙、硫酸钙、糖、葡聚糖结合剂、糊精、右旋糖、磷酸氢二钙二水合物、磷酸三钙、高岭土、碳酸镁、氧化镁、麦芽糊精、甘露醇、聚甲基丙烯酸酯(例如Eudragit^®)、氯化钾、粉末状纤维素、氯化钠、山梨醇和滑石。

可以根据本领域已知的方法将本公开内容的核酸组合物配制成组合物和剂型。在某些实施方案中，配制的组合物可以特别配制用于以固体或液体形式施用，包括适于以下的那些：(1)口服施用，例如，片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、用于舌部施用的糊剂、水性或非水性溶液或混悬液、灌服剂或糖浆剂；(2)胃肠外施用，例如，通过皮下、肌肉内或静脉内注射，例如，作为无菌溶液或混悬液；(3)局部施用，例如，作为应用于皮肤、肺或粘膜的乳膏剂、软膏剂或喷雾剂；或(4)阴道内地或直肠内地，例如，作为子宫托、乳膏剂或泡沫；(5)舌下地或含服地；(6)经眼地；(7)透皮地；或(8)鼻地。

在某些实施方案中，本公开内容的制剂包括压制成剂型(诸如片剂)的固体药学试剂，可以包括赋形剂，其功能包括在压制后帮助活性成分和其它赋形剂粘合在一起。固体药物组合物的粘合剂包括阿拉伯胶、海藻酸、卡波姆(例如聚羧乙烯)、羧甲纤维素钠、糊精、乙基纤维素、明胶、瓜尔胶、氢化植物油、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如Klucel^®)、羟丙基甲基纤维素(例如Methocel^®)、液体葡萄糖、硅酸镁铝、麦芽糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮(例如Kollidon^®、Plasdone^®)、预胶化淀粉、海藻酸钠和淀粉。

通过向组合物中添加崩解剂，可以增加压实的固体药物组合物在受试者的胃中的溶出速率。崩解剂包括海藻酸、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠(例如Ac-Di-Sol^®、Primellose^®)、胶体二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮(例如Kollidon^®、Polyplasdone^®)、瓜尔胶、硅酸镁铝、甲基纤维素、微晶纤维素、波拉克林钾、粉末状纤维素、预胶化淀粉、海藻酸钠、淀粉羟乙酸钠(例如Explotab^®)和淀粉。

因此，在某些实施方案中，可以将助流剂添加到制剂中以改善未压实的固体剂的流动性并改善剂量的准确度。可作为助流剂起作用的赋形剂包括胶体二氧化硅、三硅酸镁、粉末状纤维素、淀粉、滑石和磷酸三钙。

当通过压制粉末状组合物来制备剂型诸如片剂时，该组合物经受来自冲头和模具的压力。一些赋形剂和活性成分具有粘附在冲头和模具的表面的趋势，这可以造成产品出现麻点和其它表面不规则。可以将润滑剂添加到组合物中以减少粘附并促进产品从模具的释放。润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕榈酸甘油酯、氢化蓖麻油、氢化植物油、矿物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、滑石和硬脂酸锌。

通过湿法制粒可以制备用于压片或胶囊填充的经配制的药物组合物。在湿法制粒中，将一些或所有的粉末形式的活性成分和赋形剂掺合，并然后在有液体存在下进一步混合，所述液体通常是水，其导致粉末结块成颗粒。将颗粒过筛和/或研磨，干燥，并然后过筛和/或研磨至所需的粒度。然后可以将颗粒压片，或者在压片之前可以添加其它赋形剂，诸如助流剂和/或润滑剂。可以常规地通过干混制备压片组合物。例如，可以将活性剂和赋形剂的掺合组合物压制成块状或片状，并然后粉碎成压实的颗粒。随后可以将压实的颗粒压制成片剂。

在其它实施方案中，作为干法制粒的替换方案，可以使用直接压片技术将掺合的组合物直接压制成压实的剂型。直接压片产生更均匀的无颗粒片剂。特别适合直接压片的赋形剂包括微晶纤维素、喷雾干燥的乳糖、磷酸二钙二水合物和胶态二氧化硅。这些和其它赋形剂在直接压片中的适当使用是具有经验和技能(尤其是直接压片的制剂挑战方面)的本领域技术人员已知的。胶囊填充可以包括参考压片描述的任何上述掺合物和颗粒；但是，它们没有经过最后的压片步骤。

在本公开内容的液体药物组合物中，将药剂和任何其它固体赋形剂溶解或悬浮在液体载体诸如水、注射用水、植物油、醇、聚乙二醇、丙二醇或甘油中。液体药物组合物可以含有乳化剂以将活性成分或其它不溶于液体载体的赋形剂均匀地分散在整个组合物中。液体制剂可以用作可注射、肠溶或润肤剂类型的制剂。可用于本发明的液体组合物中的乳化剂包括例如明胶、蛋黄、酪蛋白、胆固醇、阿拉伯胶、黄蓍胶、鹿角菜胶、果胶、甲基纤维素、卡波姆、鲸蜡硬脂醇和鲸蜡醇。

在某些实施方案中，本公开内容的液体药物组合物还可以含有粘度增强剂以改善产品的口感和/或覆盖胃肠道的衬里。这样的试剂包括阿拉伯胶、海藻酸、皂粘土、卡波姆、羧甲纤维素钙或钠、鲸蜡硬脂醇、甲基纤维素、乙基纤维素、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚乙烯醇、聚维酮、碳酸亚丙酯、丙二醇、海藻酸盐、海藻酸钠、淀粉羟乙酸钠、淀粉黄蓍胶和黄原胶。在其它实施方案中，本公开内容的液体组合物还可以含有缓冲剂，诸如葡糖酸、乳酸、柠檬酸或乙酸、葡萄糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠或醋酸钠。

甜味剂，诸如山梨醇、糖精、糖精钠、蔗糖、阿司帕坦、果糖、甘露醇和转化糖，可以添加到本公开内容的某些制剂中以改善味道。矫味剂和增味剂可以使剂型更适合患者。可以被包含在本公开内容的组合物中的用于药物产品的常见矫味剂和增味剂包括麦芽酚、香草醛、乙基香草醛、薄荷醇、柠檬酸、富马酸、乙基麦芽酚和酒石酸。

防腐剂和螯合剂，诸如酒精、苯甲酸钠、丁基化的羟基甲苯、丁羟茴香醚和乙二胺四乙酸，可以以摄入安全水平添加，以提高储存稳定性。固体和液体组合物也可以使用任何药学上可接受的着色剂染色，以改善它们的外观和/或促进患者对产品和单位剂量水平的识别。

本公开内容的剂量制剂可以是在硬壳或软壳内含有所述组合物(例如，本公开内容的粉末状或颗粒状固体组合物)的胶囊。壳可以由明胶制成，并且任选地含有塑化剂诸如甘油和山梨醇，和遮光剂或着色剂。

治疗癌症的方法

如上所述，当与相应的未修饰的天然微RNA的外源表达和/或其它已知的癌症疗法所表现出的抗癌活性相比时，本公开内容的经修饰的微RNA核酸组合物及其制剂显示出意外的和异常的抗癌活性。因此，本公开内容的另一个方面提供了通过向哺乳动物施用有效量的本公开内容的一种或多种经修饰的微RNA核酸组合物或其制剂来治疗哺乳动物癌症的方法。

如图2A至2D所示，本公开内容的示例性的经修饰的微RNA核酸，即，经修饰的miR-194，抑制癌细胞中的SET8蛋白表达(图2A和2B)、BMI1蛋白表达(图2C和2D)和活性。更具体地，图2A-2D显示，具有被吉西他滨替换的所有C碱基的经修饰的微RNA (Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 2中所示)在有或没有转染剂的情况下进入癌细胞并抑制SET8和BMI1。此外，具有被吉西他滨替换的所有C碱基和被5-FU替换的所有U碱基的经修饰的微RNA (5-FU-Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 3中所示)能够在有或没有转染剂的情况下进入癌细胞以抑制SET8或BMI1。

此外和如图3A-3C所示，本文描述的所有示例性的经修饰的微RNA都降低了胰腺癌细胞生存力。更具体地，具有被吉西他滨替换的所有C碱基的经修饰的微RNA (Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 2中所示)以剂量依赖性方式降低了3种不同的胰腺癌细胞系(即，PANC1、ASPC1和HS766T)中的胰腺癌细胞生存力。类似地，具有被吉西他滨替换的所有C碱基和被5-FU替换的所有U碱基的经修饰的微RNA (5-FU-Gem-miR-194，如在SEQ ID NO: 3中所示)以剂量依赖性方式抑制了测试的所有胰腺癌模型中的胰腺癌细胞生存力。

此外，测试了本发明经修饰的miR组合物并发现其在体内是治疗上有效的。例如，图4显示，用本公开内容的两种示例性的经修饰的微RNA(例如，如在SEQ ID NO: 2中所示的经修饰的miR-194)的静脉内治疗通过在体内抑制肿瘤生长而有效治疗癌症(例如，胰腺癌)。

因此，所公开的用于治疗癌症的方法包括向受试者施用本公开内容的一种或多种经修饰的核酸组合物(例如，经修饰的微RNA，诸如经修饰的miR-194核酸)。在某些实施方案中，核酸组合物可以作为包括核酸组合物和一种或多种药物载体的制剂施用。

在具体实施方案中，本公开内容的核酸组合物可以在没有递送媒介物或药物载体存在下施用(即，裸的)。参见，例如，图2B和2D。

本文中使用的术语“受试者”表示任何哺乳动物。哺乳动物可以是任何哺乳动物，尽管本文的方法更典型地针对人类。本文中使用的短语“有此需要的受试者”被包括在术语受试者内，并且表示需要治疗(特别是癌症)或具有医学上确定的癌性或癌前病症风险升高的任何哺乳动物受试者。在具体实施方案中，受试者包括人类癌症患者。

术语“治疗”与术语“施用有效量”是同义的。这些术语应当指以治愈、改善、稳定、减轻疾病、病理学状况或障碍(诸如癌症)的一种或多种症状或预防疾病、病理学状况或障碍(诸如癌症)为目的对受试者的医学管理。这些术语可互换使用，并包括积极治疗，即专门针对疾病、病理学状况或障碍的改善的治疗，并且还包括病因治疗，即针对有关疾病、病理学状况或障碍的原因的消除的治疗。此外，治疗包括姑息治疗，即旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理学状况或障碍的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或者部分地或完全地抑制相关疾病、病理学状况或障碍的发展的治疗；和支持性治疗，即用于补充另一种旨在改善相关疾病、病理学状况或障碍的特定疗法的治疗。应当理解，治疗虽然旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理学状况或障碍，但不需要实际上导致治愈、改善、稳定或预防。可以如本文所述和本领域已知的测量或评估治疗效果，对涉及的疾病、病理学状况或障碍的适合性也是如此测量或评估。这样的测量和评估可以以定性和/或定量的方式进行。因此，例如，疾病、病理学状况或障碍的特性或特征和/或疾病、病理学状况或障碍的症状可以降低至任何效果或任何量。在一个具体的实施方案中，疾病诸如癌症的治疗包括抑制癌细胞的增殖。在某些实施方案中，通过检测受试者中增殖性癌细胞的量的减少、肿瘤生长或肿瘤大小的减小，可以确定癌症的治疗。

在某些实施方案中，本公开内容的核酸组合物用于治疗癌症。

本文中使用的术语“癌症”包括由异常细胞不受控制的分裂和生长(包括、例如，肿瘤的恶性和转移性生长)引起的任何疾病。术语“癌症”还包括癌前病症或以癌性或癌前病症风险升高为特征的病症。癌症或癌前病变(赘生性病症)可以位于身体的任何部位，包括内脏器官和皮肤。众所周知，癌症通过淋巴结和血管以及通过血液(在肿瘤侵入受试者的静脉、毛细血管和动脉以后)侵入肿瘤周围的正常非癌性组织，从而在受试者中扩散。当癌细胞脱离原发肿瘤(“转移”)时，继发性肿瘤会在整个受累受试者中出现，从而形成转移性病变。

适合使用本发明方法治疗的癌细胞的一些非限制性例子包括肺、乳房、胰腺、膀胱和卵巢。癌症或赘生物还可以包括一种或多种癌、肉瘤、淋巴瘤、母细胞瘤或畸胎瘤(生殖细胞肿瘤)的存在。

在某些实施方案中，受试者患有胰腺癌，或者具有医学上确定的患胰腺癌的风险升高，例如被诊断出慢性胰腺炎。

在某些实施方案中，本公开内容的受试者患有乳腺癌，或具有医学上确定的患乳腺癌的风险升高。在具体的实施方案中，乳腺癌是三重阴性的乳腺癌、导管癌或叶癌。

在其它实施方案中，受试者患有卵巢癌，或具有医学上确定的患卵巢癌的风险升高。

在再其它实施方案中，受试者患有膀胱癌，或具有医学上确定的患膀胱癌的风险升高。

在一个具体实施例中，本公开内容的经修饰的微RNA用于治疗胰腺癌。如图3A-C和4所示，每种经修饰的miR-194微RNA可以用于治疗胰腺癌。胰腺癌起源于称为胰腺上皮内瘤形成或PanIN的前体病变。这些病变通常位于外分泌胰腺的小导管中，并根据细胞非典型性的程度可分为低度发育异常、中度发育异常或高度发育异常病变。这样的病变通常表明存在KRAS基因中的激活突变，以及CDKN2A、TP53和SMAD4中的某些失活突变。共同地，这些基因突变导致浸润性癌症的形成。胰腺癌分期是基于：原发肿瘤的大小以及它是否已经生长到胰腺外的周围器官中；肿瘤是否已经扩散到附近的淋巴结，以及它是否已经转移到身体的其它器官(例如，肝、肺、腹部)。然后将该信息组合并用于提供具体期，即，0、1A、1B、2A、2B、3和4。对于第零(0)期，胰腺肿瘤局限于胰管细胞的顶层并且没有侵入更深的组织。原发肿瘤没有扩散到胰腺外，诸如在原位胰腺癌或胰腺上皮内瘤形成III中。1A期胰腺肿瘤通常局限于胰腺，且直径为2厘米或更小。此外，1A期胰腺肿瘤还没有扩散到附近的淋巴结或远端部位。1B期胰腺肿瘤局限于胰腺且直径大于2厘米。1B期胰腺肿瘤尚未扩散到附近的淋巴结或远端部位。2A期胰腺肿瘤表现出肿瘤生长到胰腺外但未进入主要血管或神经，但癌症尚未扩散到附近的淋巴结或远端部位。表现出2B期胰腺癌的受试者所呈现的肿瘤要么局限于胰腺，要么生长到胰腺外但未进入主要血管或神经，但已经扩散到附近的淋巴结。表现出3期胰腺癌的受试者所呈现的肿瘤生长到胰腺外进入主要血管或神经中，但已经扩散到远端部位。4期胰腺癌已经转移至远处部位、淋巴结和器官。

根据本公开内容，治疗癌症的方法包括通过本领域公知的任何途径施用本发明的一种或多种核酸组合物。这包括，例如，(1)口服施用；(2)胃肠外施用，例如，通过皮下、肌肉内或静脉内注射；(3)局部施用；或(4)阴道内或直肠内施用；(5)舌下或含服施用；(6)眼部施用；(7)透皮施用；(8)鼻施用；和(9)直接施用于有此需要的器官或细胞。

在具体实施方案中，通过注射将本公开内容的经修饰的微RNA组合物施用给受试者。在一个实施方案中，静脉内注射治疗有效量的经修饰的微RNA组合物。在另一个实施方案中，腹膜内地注射治疗有效量的经修饰的微RNA组合物。

施用的本公开内容的核酸组合物的量(剂量)取决于若干因素，包括癌症的类型和阶段、辅助或佐剂药物的存在或不存在、以及受试者的重量、年龄、健康和对药剂的耐受性。取决于这些不同的因素，剂量可以是，例如，约2 mg/kg体重、约5 mg/kg体重、约10 mg/kg体重、约15 mg/kg体重、约20 mg/kg体重、约25 mg/kg体重、约30 mg/kg体重、约40 mg/kg体重、约50 mg/kg体重、约60 mg/kg体重、约70 mg/kg体重、约80 mg/kg体重、约90 mg/kg体重、约100 mg/kg体重、约125 mg/kg体重、约150 mg/kg体重、约175 mg/kg体重、约200 mg/kg体重、约250 mg/kg体重、约300 mg/kg体重、约350 mg/kg体重、约400 mg/kg体重、约500mg/kg体重、约600 mg/kg体重、约700 mg/kg体重、约800 mg/kg体重、约900 mg/kg体重或约1000 mg/kg体重，其中术语“约”通常理解为在指示值的±10%、5%、2%或1%内。剂量也可以在由上述值中的任意两个限定的范围内。可以如下使用例行实验为每位患者确定适当的剂量方案：监测化合物对癌性或癌前病症的影响，或对微RNA表达水平或活性(例如，miR-194)的影响，或对其靶标(诸如SET8和/或BMI1水平或活性)的影响，或疾病病理学，它们都可以根据本领域已知的方法频繁地且容易地监测。根据以上讨论的各种因素，可以每天一次、两次或多次施用核酸的以上示例性剂量中的任一种。

使用本领域众所周知的药理学模型，诸如细胞毒性测定、细胞凋亡染色测定、异种移植物测定和结合测定，可以确定本文描述的核酸组合物和任选的用于与当前方法一起使用的任何额外化学治疗剂的能力。

本文描述的核酸组合物也可以与或不与一种或多种化学治疗剂共同施用，所述化学治疗剂可以是不同于本文描述的核酸组合物的辅助或佐剂药物。

本文中使用的“化学疗法”或短语“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的药剂。可与本文所述方法结合使用的化学治疗剂包括，例如，直接地或间接地调节BMI1的任何药剂。化学治疗剂的例子包括：抗代谢药诸如甲氨蝶呤和基于氟嘧啶的嘧啶拮抗剂，5-氟尿嘧啶(5-FU) (Carac®乳膏剂，Efudex®，Fluoroplex®，Adrucil®)和S-1；抗叶酸剂，包括可聚谷氨酸的(polyglutamatable)抗叶酸化合物；雷替曲塞(Tomudex®)，GW1843和培美曲塞(Alimta®)和非可聚谷氨酸的(non-polyglutamatable)抗叶酸化合物；诺拉曲塞(Thymitaq®)，plevitrexed，BGC945；叶酸类似物诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；和嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷。在本公开内容的一个具体实施方案中，化学治疗剂是能够抑制基因或基因产物的表达或活性的化合物，所述基因或基因产物参与涉入异常细胞增殖或细胞凋亡的信号传递途径，例如，YAP1、BMI1、SET8、DCLK1、BCL2、胸苷酸合酶或E2F3；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在其它实施方案中，化学疗法可以是以下癌症药物中的任一种，诸如甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、顺铂、奥沙利铂、博来霉素、长春碱、吉西他滨、长春新碱、表柔比星、亚叶酸、紫杉醇和多西他赛中的一种或多种。可以在开始用核酸组合物治疗之前、期间或之后施用化学治疗剂。

在某些实施方案中，化学治疗剂是抗癌药物或抗癌药物的组织敏化剂或其它促进剂。在某些实施方案中，辅助药物可以是另一种核酸或另一种miRNA，诸如本公开内容的微RNA模仿物、吉西他滨或游离5-FU。

在一个具体实施方案中，其它核酸是短发夹RNA (shRNA)、siRNA、或与BCL2 3’UTR的一部分互补的核酸。

在某些实施方案中，化学治疗剂是辅助药物。

含有Set结构域的蛋白8、SET8或SETD8 (GenBank AF287261)是一种赖氨酸甲基转移酶，其主要单甲基化组蛋白H5的赖氨酸-20。SET8调节转录调控、异染色质形成、基因组稳定性、细胞周期进展和发育。参见Yang, F., 等人. EMBO J. (2012) 31: 第110-123页。因此，抑制SET8的表达的任何药物在本文中都可被视为辅助药物。

多梳蛋白复合物蛋白BMI-1、BMI1 (RefSeq、NM_005180.8、NP_005171.4)编码环指蛋白，该环指蛋白是多梳蛋白组复合物1 (PRC1)的主要组分。该复合物如下起作用：通过染色质重塑作为参与胚胎发育和成体干细胞中的自我更新的多种调节基因的重要表观遗传阻遏物。BMI1蛋白在DNA损伤修复中起核心作用。BMI1基因是一种癌基因，且异常表达与多种癌症相关，并且与对某些化学疗法的耐药性相关。因此，抑制SET8表达的任何药物在本文中都可被视为辅助药物。

E2F转录因子3、E2F3 (RefSeq NG_029591.1、NM_001243076.2、NP_001230005.1)是结合DNA并与效应蛋白(包括但不限于，视网膜母细胞瘤蛋白)相互作用以调节在细胞周期调节中涉及的基因的表达的转录因子。因此，抑制E2F3表达的任何药物在本文中都可被视为辅助药物。

B-细胞淋巴瘤2 (BCL2) (RefSeq NG_009361.1、NM_000633、NP_000624)(包括其同种型α(NM_000633.2、NP_000624.2)和βNM_000657.2、NP_000648.2)由Bcl-2基因编码，它是调节线粒体调节的细胞死亡(通过固有细胞凋亡途径)的BCL2调节物蛋白家族的成员。BCL2是一种完整的线粒体外膜蛋白，它通过结合BAD和BAK蛋白来阻断细胞的细胞凋亡性死亡。BCL2抑制剂的非限制性例子包括反义寡核苷酸，诸如奥利美生(Genasense; GentaInc.,)，BH3模拟物小分子抑制剂，包括ABT-737 (Abbott Laboratories, Inc.)、ABT-199(Abbott Laboratories, Inc.)和奥巴克拉(Cephalon Inc.)。抑制BCL2表达的任何药物在本文中都可被视为辅助药物。

胸苷酸合酶(RefSeq: NG_028255.1, NM_001071.2, NP_001062.1)是一种遍在的酶，其催化dUMP的必要甲基化以生成dTMP，dTMP是构成DNA的四种碱基之一。该反应需要CHH₄-叶酸作为辅因子，既作为甲基供体，又独特地作为还原剂。对CH H₄-叶酸的恒定需求意味着，胸苷酸合酶活性与负责补充细胞叶酸库的两种酶的活性密切相关：二氢叶酸还原酶和丝氨酸转羟甲基酶。胸苷酸合酶是30-35kDa亚基的同型二聚体。活性位点同时结合叶酸辅因子和dUMP底物，dUMP通过亲核半胱氨酸残基与酶共价键合(参见，Carreras等人, Annu.Rev. Biochem., (1995) 64:721-762)。胸苷酸合酶反应是嘧啶生物合成途径的关键部分，其产生用于掺入DNA的dCTP和dTTP。这种反应是DNA复制和细胞生长所必需的。因此，所有快速分裂的细胞(诸如癌细胞)都需要胸苷酸合酶活性。由于其与DNA合成相关，并因此与细胞复制相关，胸苷酸合酶多年来一直是抗癌药物的靶标。胸苷酸合酶抑制剂的非限制性例子包括叶酸和dUMP类似物，诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)。抑制胸苷酸合酶表达的任何药物在本文中都可被视为辅助药物。

如果需要的话，本文描述的核酸组合物的施用可以与一种或多种非药物疗法(例如，放射疗法和/或外科手术)组合。如本领域众所周知的，可以在外科手术前提供辐射疗法和/或化学治疗剂(在这种情况下，本文描述的核酸组合物，以及任选地，任何额外的化学治疗剂)的施用，以例如在外科手术前缩小肿瘤或阻止癌症的扩散。也如本领域众所周知的，可以在外科手术后提供辐射疗法和/或化学治疗剂的施用以破坏任何残留的癌症。

为了说明和描述本发明的某些具体实施方案的目的，下面已经阐述了实施例。但是，本发明的范围不以任何方式受限于本文所述的实施例。

实施例

实施例1. 材料和方法.

经修饰的微RNA. 所有经修饰的微RNA均通过自动化的寡核苷酸合成方法合成，并通过HPLC纯化。将两条链退火以制备本公开内容的成熟的经修饰的5-FU-miR和/或经修饰的miR-194，其具有被吉西他滨分子替换的胞嘧啶碱基。对于含有5-卤代尿嘧啶的经修饰的微RNA-194，使用了被称作“2'-ACE RNA合成”的方法。2'-ACE RNA合成是基于保护基方案，其中使用甲硅烷基醚来保护5'-羟基，并组合在2'-羟基上的酸不稳定的原酸酯保护基(2'-ACE)。然后将保护基团的这种组合与标准氨基亚磷酸酯固相合成技术一起使用。参见，例如，S.A. Scaringe, F.E. Wincott,和M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 120 (45),11820-11821 (1998)；国际PCT申请WO/1996/041809; M.D. Matteucci, M.H. Caruthers,J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191 (1981)；S.L. Beaucage, M.H. Caruthers,Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862 (1981)，其中每篇的整个内容明确地并入本文。示例性的经修饰的miR-194核酸或用5-卤代尿嘧啶替换尿嘧啶的任何其它经修饰的微RNA可以以与本文所述相同的方式合成。

目前使用的受保护和官能化的核糖核苷氨基亚磷酸酯的一些示例性结构如下所示：

如下合成通过用吉西他滨(2’, 2’-二氟2’-脱氧胞苷)替换其指导链中的胞嘧啶残基而将吉西他滨掺入miR-194中的经修饰的miR。将5’-二甲氧基三苯甲基-N₄-苯甲酰基-2’, 2’-二氟-2’-脱氧胞苷(1当量, 0.4 mM, 270 mg)溶解在无水乙腈(6 ml)中。加入乙基硫基四唑(1.6当量, 0.65 mM, 1.3 ml)在无水乙腈和2-氰基乙基-二-(N,N’-二异丙基(diisopropropyl))氨基亚磷酸酯(1.43当量, 0.57 mmol, 0.2 ml)中的0.5 M溶液，并将反应混合物在室温搅拌1 h。通过TLC和³¹P NMR监测反应进程。当5’-二甲氧基三苯甲基-N₄-苯甲酰基-2’,2’-二氟-2’-脱氧胞苷在约2小时内消耗完时，将混合物应用于硅胶柱，并将产物用20%己烷的CH₂Cl₂溶液洗脱，随后用MeOH在CHCl₃中的溶液(0-5%梯度)洗脱。通过³¹PNMR (CDCl₃)鉴定期望的产物：δ154.1，152.1。如在K. Sipa, 等人, RNA (2007) 13, 第1301-1316页(其整个内容通过引用并入本文)中所述，在Gene World DNA合成仪上根据氨基亚磷酸酯方案合成所有未修饰的和含有吉西他滨单元的RNA寡核苷酸。使用胸苷、胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和2’, 2’-二氟-2’-脱氧胞苷的适当保护的氨基亚磷酸酯衍生物、LCA-CPG(作为固体支持物)和5-苄基巯基四唑在无水乙腈中的溶液(0.25 M)(作为活化剂)，在200nmol规模进行合成。对于经修饰的单元，合成具有延长的偶联时间(至多600秒)。通过DMT-阳离子测定确定偶联效率。

细胞培养. 人胰腺癌细胞系ASPC-1、HS766T和Panc-1得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)并维持在不同类型的培养基中。具体而言，将HS766T和PANC1细胞在含有DMEM的培养基中培养，并将APSC-1细胞维持在RPMI培养基(Thermo Fischer)中。给培养基补充了10%胎牛血清(Thermo Fischer)。

蛋白免疫印迹分析. 在转染前24小时，将1x10⁵个细胞铺板在6孔板中。使用Oligofectamine (Thermo Fischer)或不使用转染媒介物转染细胞，使用50 nM对照miRNA(Thermo Fischer)、miR-194或三种miR-194模仿物中的一种。转染后三天，将蛋白收集在含有蛋白酶抑制剂(Sigma)的RIPA缓冲液中。如Laemmli UK. Nature. 1970; 227(5259)第680-685页(其整个内容通过引用并入本文)所述，在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的蛋白(15µg)。用抗-SET8或BMI-1 (1:500) (Cell Signaling Technologies)和抗-GAPDH (1:100000)抗体探测蛋白。辣根过氧化物酶缀合的小鼠或兔抗体(1:5000,Santa Cruz Biotech Inc.)用作第二抗体。使用SuperSignal West PicoChemiluminescent Substrate (Thermo Fischer)用放射自显影胶片使蛋白条带可视化。

细胞生存力测定. 将细胞以每孔1000个细胞铺板在96孔板中。24小时后，将细胞培养基更换为补充了DFBS的培养基，含有50、25、12.5、6.25、3.125或1.5625 nM对照miRNA(Thermo Fischer)、miR-194、5-FU-miR-194、Gem-mIR-194或5-FU-Gem-miR-194。24小时后，再次将培养基更换为补充了DFBS的新鲜培养基。处理后6天，使用WST-1染料(Roche)评估细胞数目。将细胞与每100 μl培养基中的10 μl WST-1染料一起温育1小时，并在450和630 nm读出吸光度。通过从在450 nm的吸光度减去在630 nm的吸光度来计算光密度(O.D.)。使用CompuSyn软件(ComboSyn, Inc)计算IC⁵⁰值。

小鼠皮下肿瘤植入模型. 对于体内miRNA递送实验，通过用重组慢病毒感染亲本胰腺癌细胞来创建表达lenti-luc报道基因的胰腺癌细胞。将表达萤光素酶的HS766T细胞(每只小鼠2.0x10⁶个细胞)悬浮于0.1 mL PBS溶液中，并通过每只小鼠的尾静脉注射。注射胰腺癌细胞后四天，通过尾静脉注射80µg阴性对照或用体内喷射PEI (PolyplusTransfection)包装的经修饰的miR来治疗小鼠。每隔一天对小鼠进行一次治疗，持续2周(8次)。治疗后，使用IVIS Spectrum体内成像系统(IVIS) (PerkinElmer)筛选小鼠。

统计分析. 所有实验重复至少3次。用SigmaPlot软件进行所有统计分析。使用Student氏t-检验(临床样品的配对t检验，以及所有其它样品的不成对t检验)确定两组之间的统计显著性。为了对比超过两个的组，使用单因素方差分析和随后的Bonferroni-Dunn检验。将数据表示为平均值±平均值标准误差(SEM)。在图例中描述或用星号(*)指示统计显著性。*=P <0.05；**=P<0.01；***=P< 0.001。

实施例2: 经修饰的miR-194核酸具有抗癌活性.

在以下实验中，天然miR-194 (SEQ ID NO:1)的指导链中的所有5个胞嘧啶碱基都被吉西他滨替换以形成SEQ ID NO:2所示的示例性的经修饰的微RNA。参见图1C。通过用5-FU分子替换天然miR-194核酸的指导链中的所有尿嘧啶碱基而形成另一种经修饰的微RNA，如在SEQ ID NO. 4中所示。参见图1B。在一个实验中，miR-194中的所有U碱基被5-FU替换，且所有胞嘧啶(C碱基)被吉西他滨分子替换，如在图1D所提供的结构中所示和如在SEQ IDNO: 3中所示。

靶标特异性分析：胰腺细胞中蛋白免疫印迹实验的结果证实，本公开内容的示例性的经修饰的miR-194多核苷酸能够保持它们对SET8和BMI1的靶标特异性。结果显示在图2A至2D中，其显示了以下核酸的结果：具有被5-FU替换的所有U碱基的示例性的经修饰的miR-194核酸，如在SEQ ID. NO: 4中所示(5-FU-miR-194)；具有被5-FU替换的所有U碱基和被吉西他滨替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194核酸，如在SEQ ID. NO: 3中所示(5-FU-Gem-miR-194)；和具有被吉西他滨分子替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194核酸，如在SEQ ID. NO: 2中所示(Gem-miR-194)。更重要的是，发现示例性的经修饰的miR-194核酸在降低SET8(如在图2A中所示)和BMI1(如在图2C中所示)的表达水平方面比未修饰的(对照) miR-194更有效。当不使用转染媒介物时，上述经修饰的miR-194分子中的每一种都保留了抑制SET8 (图2B)和BMI1表达(图2D)的能力。该数据证实，5-FU修饰和吉西他滨修饰都允许经修饰的miR-194在没有任何转染媒介物的情况下进入细胞，并且这些修饰不会破坏miR-194的调节靶标表达的能力。

本公开内容的示例性的经修饰的微RNA抑制肿瘤发展和细胞生存力. 在三种不同的胰腺癌细胞系ASPC1、PANC1和HS766T中测试了每种经修饰的miR-194分子的作用，并且这样的实验的结果显示在图3A-3C中。如在图3A中所示，当在ASPC1细胞中外源表达时，与外源表达的天然miR-194相比，所有三种经修饰的miR-194模仿物都表现出抑制细胞生存力的功效。在ASPC1细胞中，如在SEQ ID. NO: 4中所示的具有被5-FU替换的所有U碱基的示例性的经修饰的miR-194核酸(5-FU-miR-194)的IC50为6.06 nM。如在SEQ ID. NO: 2中所示的具有被吉西他滨分子替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194核酸(Gem-miR-194)的IC50为4.29 nM，且如在SEQ ID. NO: 3中所示的具有被5-FU替换的所有U碱基和被吉西他滨替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194核酸(5-FU-Gem-miR-194)的IC50为2.88nM (表1)。

如在图3B中所示，当在PANC1细胞中外源表达时，具有被5-FU替换的所有U碱基的示例性的经修饰的miR-194核酸(5-FU-miR-194)与以下两种核酸相比的作用存在明显差异：如在SEQ ID. NO: 2中所示的具有被吉西他滨分子替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194核酸(Gem-miR-194)，和如在SEQ ID. NO: 3中所示的具有被5-FU替换的所有U碱基和被吉西他滨替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194核酸(5-FU-Gem-miR-194)。具体地，5-FU-miR-194的IC50为16 nM，而Gem-miR-194和5-FU-Gem-miR-194的IC50分别为1.92和0.93 (表1)。

此外和如在图3C中所示，当在HS766T细胞中外源表达时，观察到5-FU修饰的miR-194与以下两种核酸之间的最大差异：如在SEQ ID. NO: 2中所示的具有被吉西他滨分子替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194核酸(Gem-miR-194)，和如在SEQ ID. NO: 3中所示的具有被5-FU替换的所有U碱基和被吉西他滨替换的所有C碱基的示例性的经修饰的miR-194核酸(5-FU-Gem-miR-194)。在这里，5-FU-miR-194的IC50为26.45 nM，而Gem-mir-194和5-FU-Gem-miR-194的IC50分别为3.57和2.46 nM (表1)。

表1: 每种示例性的经修饰的miR-194核酸在3种不同的胰腺癌细胞系中的IC50(nM).

总之，这些数据表明，与通过单独用5-FU替换U碱基修饰的微RNA相比，吉西他滨在miR-194中的掺入会增强其抑制胰腺癌细胞的生存力的作用。此外，数据揭示，如在SEQ ID.NO: 3中所示的具有被5-FU替换的所有U碱基和被吉西他滨替换的所有C碱基的miR-194(5-FU-Gem-miR-194)在治疗胰腺癌方面具有最大效力。

经修饰的miR-194在体内抑制癌症生长. 如在图4中所示，建立了包括胰腺癌细胞的小鼠异种移植物模型。在建立转移后四天，以每隔一天注射一次治疗频率通过静脉内注射递送80µg经修饰的miR-194核酸组合物(SEQ ID NO: 2, Gem-miR-194)或阴性对照微RNA(对照)，持续2周。如在图4中所示，与对照相比，示例性的经修饰的miR-194核酸能够抑制转移性胰腺癌生长。此外，用经修饰的miR-194核酸治疗的小鼠没有表现出任何毒性。

本文呈现的数据支持一种新修饰的可行性，其中将吉西他滨掺入miRNA核酸序列中以增强在使用或不使用其它化学治疗剂的情况下天然微RNA分子的化学治疗功能。

Claims (26)

1.包含经修饰的微RNA核苷酸序列的核酸组合物，所述序列包含至少一个胞嘧啶核酸，其中所述至少一个胞嘧啶核酸中的一个或多个被吉西他滨分子替换。

2.权利要求1的核酸组合物，其中所述核苷酸序列中的至少两个胞嘧啶核酸各自被吉西他滨分子替换。

3.权利要求2的核酸组合物，其中所述核苷酸序列中的至少三个胞嘧啶核酸各自被吉西他滨分子替换。

4.权利要求3的核酸组合物，其中所述核苷酸序列中的至少四个胞嘧啶核酸各自被吉西他滨分子替换。

5.权利要求4的核酸组合物，其中所述核苷酸序列中的所有胞嘧啶核酸被吉西他滨分子替换。

6.权利要求1的核酸组合物，其中所述经修饰的微RNA核苷酸序列包含miR-194的微RNA核苷酸序列。

7. 权利要求6的核酸组合物，其中所述经修饰的miR-194包含在SEQ ID NO: 2中所示的序列。

8. 权利要求6的核酸组合物，其中所述经修饰的miR-194包含在SEQ ID NO: 4中所示的序列。

9.包含经修饰的微RNA核苷酸序列的核酸组合物，所述序列包含至少一个胞嘧啶核酸和至少一个尿嘧啶核酸，其中所述至少一个胞嘧啶核酸中的一个或多个被吉西他滨分子替换且所述至少一个尿嘧啶核酸中的一个或多个被5-卤代尿嘧啶替换。

10.权利要求9的核酸组合物，其中所述核苷酸序列中的至少两个胞嘧啶核酸各自被吉西他滨分子替换。

11.权利要求10的核酸组合物，其中至少两个尿嘧啶核酸各自被5-卤代尿嘧啶替换。

12.权利要求9的核酸组合物，其中所述核苷酸序列中的所有胞嘧啶核酸被吉西他滨分子替换。

13.权利要求12的核酸组合物，其中所有尿嘧啶核酸各自被5-卤代尿嘧啶替换。

14.权利要求9的核酸组合物，其中所述经修饰的微RNA核苷酸序列包含miR-194的微RNA核苷酸序列。

15. 权利要求14的核酸组合物，其中所述经修饰的miR-194包含在SEQ ID NO: 2中所示的序列。

16. 权利要求14的核酸组合物，其中所述经修饰的miR-194包含在SEQ ID NO: 4中所示的序列。

17.权利要求9的核酸组合物，其中所述5-卤代尿嘧啶是5-氟尿嘧啶。

18.一种药物组合物，其包含权利要求1或权利要求9的至少一种核酸组合物。

19. 权利要求18的药物组合物，其中所述核酸组合物包含选自SEQ ID NO: 2和SEQ IDNO: 4的经修饰的微RNA核苷酸序列。

20.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的权利要求1或权利要求9的核酸组合物，其中所述受试者患有癌症，且其中所述癌症的进展被抑制。

21.权利要求20的方法，其中所述受试者是人。

22.权利要求20的方法，其中所述受试者患有选自胰腺癌、膀胱癌、肺癌和卵巢癌的癌症。

23.权利要求22的方法，其中所述受试者患有胰腺癌。

24. 权利要求20的方法，其中所述核酸组合物包含选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4和它们的组合的经修饰的微RNA核苷酸序列。

25.权利要求20的方法，其中通过注射将核酸组合物施用给受试者。

26.权利要求25的方法，其中静脉内注射核酸组合物。

Images