CN113552100A - 一种自动化荧光切片显微成像平台及其操作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种自动化荧光切片显微成像平台及其操作方法,包括半导体二极管激光器、用于调整发射激光狭缝的照明光路、探测相机、用于调整探测相机位置角度的探测光路、用于调整样品位置角度的样品控制单元和时序控制系统，半导体二极管激光器、照明光路和探测光路依次从左向右分布，样品控制单元设置在探测光路一侧，时序控制系统电连接探测相机和半导体二极管激光器，探测相机固定设置在探测光路上。半导体二极管激光器发射激光，沿着照明光路到达生物样品并激发荧光探针，照明光片每次仅照亮样品的一个切面并在此切面产生荧光信号；半导体二极管激光器发射激光，长时间高强度激发光照射不会严重损伤样品细胞，在低倍率高视场下对厚切组织给予理想的长时间荧光显微成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种自动化荧光切片显微成像平台及其操作方法，属于荧光显微成像技术领域。
背景技术
当前在细胞生物学、生命科学与相关医学研究领域中，细胞学实验是经常涉及到的环节。活细胞是生命体基本结构单位和功能单位，因此对单个活细胞的实时观测具有重要意义。而无论是传统宽场落射式荧光显微镜还是激光扫描共聚焦显微镜都是利用紫外光或可见光沿着显微镜内部光路系统到达样品并激发荧光探针，再结合显微物镜及时捕获信号光进行实时成像，但是这两种激发样品荧光探针的方式会在焦平面的两侧较大的空间范围内都产生荧光信号，即对焦平面以外的空间区域也激发出荧光信号，但实际上只采集了焦平面单侧或者仅焦平面一个面的荧光信号，造成了照明激发光功率的多余消耗；其二，两者都存在着光毒性与光漂白的影响，尤其是共聚焦激光扫描显微镜需要来回对样品进行照射扫描，长时间的高强度激发光照射会严重损伤样品细胞，导致无法对样品进行长时间成像，尤其是活细胞样品；其三，两者均难以在低倍率、高视场下对厚切组织给与理想的荧光显微成像。为了长时间实时观测细胞，需要利用光片荧光显微镜。
当前的光学荧光显微镜光片属性单一、控制软件复杂、通用化程度低、价格昂贵，占用体积大、外围设备较多光路复杂，且成像速度慢，难以满足不同尺寸生物样本的成像需求。因此，发明一种成本低廉、使用方便、灵活性和通用化程度高、可实现可变光片的自动切片面扫描显微观测装置显得非常必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种自动化荧光切片显微成像平台及其操作方法，半导体二极管激光器发射激光，沿着照明光路系统到达样品并激发荧光探针，这种激发样品荧光探针的方式不会在焦平面的两侧较大的空间范围内产生荧光信号，节省了光功率，由于几乎没有激发两侧旁边的区域，明显减少了两侧旁边区域带来的光散射干扰；半导体二极管激光器发射激光，不存在着光毒性与光漂白的影响，尤其是共聚焦激光扫描显微镜需要来回对样品进行照射扫描，长时间的高强度激发光照射不会严重损伤样品细胞，便于对样品进行长时间成像，可以在低倍率、高视场下对厚切组织给与理想的荧光显微成像；所述的照明光片尺寸可变，有利于实验者根据自身样品的大小来调节照明光片的厚度。
为达到上述目的，本发明提供一种自动化荧光切片显微成像平台，包括用于发射激光的半导体二极管激光器、用于调整发射激光狭缝的照明光路、用于获取样品图片的探测相机、用于调整探测相机位置角度的探测光路、用于调整样品位置角度的样品控制单元和时序控制系统，半导体二极管激光器、照明光路和探测光路依次从左向右分布，样品控制单元设置在探测光路一侧，时序控制系统电连接探测相机和半导体二极管激光器，探测相机固定设置在探测光路上。
优先地，照明光路包括若干个微调机构、可调孔径光阑、光扩束准直器、光学可调机械狭缝、柱面透镜、消色差透镜、照明物镜和光学实验平台，
半导体二极管激光器、可调孔径光阑、光扩束准直器、光学可调机械狭缝、柱面透镜、消色差透镜和照明物镜均分别通过微调机构可调节设置在光学实验平台上，半导体二极管激光器、可调孔径光阑、光扩束准直器、光学可调机械狭缝、柱面透镜、消色差透镜和照明物镜依次从左向右分布，半导体二极管激光器发射的光源的轴线、可调孔径光阑轴线、光扩束准直器轴线、光学可调机械狭缝轴线、柱面透镜轴线、消色差透镜轴线和照明物镜轴线均重合。
优先地，微调机构包括PHU调节支座和PD不锈钢镜架支杆，PHU调节支座固定设置在光学实验平台上，PHU调节支座上开设配合PD不锈钢镜架支杆的滑轨，PD不锈钢镜架支杆滑动设置在PHU调节支座上；
半导体二极管激光器、可调孔径光阑、光扩束准直器、光学可调机械狭缝、柱面透镜、消色差透镜和照明物镜均分别固定设置在PD不锈钢镜架支杆上；
PD不锈钢镜架支杆为伸缩杆。
优先地，探测光路包括成像物镜、转接镜筒、滑台支撑板和xyz固定调节支架，探测相机、转接镜筒和成像物镜依次适配连接，探测相机、转接镜筒和成像物镜可调节设置在滑台支撑板上，滑台支撑板固定设置在xyz固定调节支架上。
优先地，样品控制单元包括直线电机、滚珠丝杆、若干个光轴、样品工作台、直线轴承、联轴器二和辅助支撑板，
直线电机固定设置在辅助支撑板上，辅助支撑板上有容纳滚珠丝杆和光轴的凹槽，凹槽上开设配合联轴器二或滚珠丝杆的直线通孔，直线电机转轴通过联轴器二连接滚珠丝杆一端，滚珠丝杆另一端转动设置在凹槽上，若干个光轴平行于滚珠丝杆分布，若干个光轴两端固定设置在凹槽上，
直线轴承套设在滚珠丝杆上，样品工作台上开设配合直线轴承的直线轴承通孔，样品工作台上开设配合若干个光轴的光轴通孔，样品工作台套设并固定连接直线轴承，样品工作台的光轴通孔滑动连接若干个光轴。
优先地，样品控制单元包括透明石英微型容器、水槽、样品旋转放置台和玻璃，
样品工作台固定连接水槽，样品旋转放置台位于水槽中，透明石英微型容器位于样品旋转放置台上；
水槽靠近照明光路一侧上开设用于安装玻璃的玻璃通孔，玻璃通孔处固定安装用于光源通过的玻璃，照明物镜固定设置在玻璃外侧，成像物镜位于透明石英微型容器上方，玻璃与水槽之间密封容纳有不漏的内部液体。
优先地，样品控制单元包括旋转电机、联轴器一、旋转轴、深沟球轴承、平键、轴用弹性挡圈一、轴用弹性挡圈二、、密封圈和支撑板，旋转电机竖向固定设置在支撑板上且旋转电机位于光学实验平台上方，支撑板上端固定连接在水槽上，旋转电机转轴通过联轴器一固定连接到旋转轴下端，水槽底部开设配合深沟球轴承的轴承通孔，深沟球轴承内嵌在轴承通孔中，深沟球轴承下端与旋转轴之间内嵌限制轴向位移的轴用弹性挡圈一，旋转轴上端穿过深沟球轴承伸入水槽中，旋转轴与样品旋转放置台通过平键连接传递旋转运动，样品旋转放置台和旋转轴之间内嵌限制轴向位移的轴用弹性挡圈二，密封圈密封设置在深沟球轴承上端和旋转轴连接处。
优先地，时序控制系统包括上位机、控制处理器、电机控制器、开关电源和电解电容，控制处理器电连接电机控制器，电机控制器电连接直线电机和旋转电机，开关电源与电机控制器之间串联电解电容，上位机电连接控制处理器。
一种自动化荧光切片显微成像平台操作方法，以上述所述的自动化荧光切片显微成像平台为执行主体，包括：
步骤S、将半导体二极管激光器、可调孔径光阑、光扩束准直器、光学可调机械狭缝、柱面透镜、消色差透镜和照明物镜安装到光学实验平台上；
在样品旋转放置台中放入透明石英微型容器，透明石英微型容器中放入已染色处理的生物样品；
半导体二极管激光器发射激发光源，观察照明物镜镜面处光斑，根据该光斑调节半导体二极管激光器出射的光源的轴线、可调孔径光阑轴线、光扩束准直器轴线、光学可调机械狭缝轴线、柱面透镜轴线、消色差透镜和照明物镜轴线重合，直至光斑居中分布在照明物镜镜面处；
观察透明石英微型容器处的光斑厚度，调节可调孔径光阑的孔径大小与调节光学可调机械狭缝的缝刃宽度，直到从照明物镜出射的光片在透明石英微型容器处形成光亮均匀且厚度合适为止;
运行直线电机从而转动滚珠丝杆，调节水槽位置，使照明物镜出射的光片垂直照射到透明石英微型容器中生物样品；
重复多次调节xyz固定调节支架位置从而调整成像物镜位置和成像物镜焦距，直至能在上位机的成像窗口中清晰看见探测相机拍摄图像中的被光源激发的细胞；
控制处理器驱动直线电机运动从而带动样品工作台对生物样品的层析扫描，实现调整透明石英微型容器中生物样品被激发的位置，进而改变生物样品被光片照射的位置，并对每一次层析扫描进行荧光探测成像；
每进行若干次层析扫描后，判断至少3张照片的相似度，当相似度超过设定的上限阈值时，增大相邻层析扫描的空间间隔距离；当相似度小于设定的下限阈值时，增大相邻层析扫描的时间间距。
优先地，电机控制器控制旋转电机旋转一定角度，探测相机拍摄一组该角度的序列照片，重复该步骤直到旋转电机旋转达到设定的角度阈值。
本发明所达到的有益效果：
1.本发明中，半导体二极管激光器发射激光，沿着照明光路系统到达样品并激发荧光探针，这种激发样品荧光探针的方式不会在焦平面的两侧较大的空间范围内产生荧光信号，节省了光功率，由于几乎没有激发两侧旁边的区域，明显减少了两侧旁边区域带来的光散射干扰；半导体二极管激光器发射激光，不存在着光毒性与光漂白的影响，尤其是共聚焦激光扫描显微镜需要来回对样品进行照射扫描，长时间的高强度激发光照射不会严重损伤样品细胞，便于对样品进行长时间成像，可以在低倍率、高视场下对厚切组织给与理想的荧光显微成像；所述的照明光片尺寸可变，有利于实验者根据自身样品的大小来调节照明光片的厚度；
2.本发明中，成本低廉、使用方便、灵活性和通用化程度高、可实现可变光片的自动切片面扫描显微观测，有利于实验者在成像实验中从各个角度观测样品池的位姿；
3.本发明中，样品旋转放置台有与透明石英微型容器尺寸相配合的矩形沉槽，有利于在实验中对盛有样品的透明石英微型容器进行定位，使其不易移动，有利于对样品进行原位显微观测；
4.本发明中，通过控制样品扫描单元的旋转步进电机，实现对旋转放置台上方的透明石英微型容器照射角度进行控制，有利于实现对样品的多角度自动化荧光探测成像；控制处理器312驱动直线电机运动从而带动样品工作台对生物样品的层析扫描，实现调整透明石英微型容器中生物样品的位置，进而改变生物样品被光片照射的位置，并对每一次层析扫描进行荧光探测成像；
5.本发明中，所述的样品控制单元与探测光路均采用垂直安装，使得成像平台占用面积减小，所述时序控制系统采用由同一块开发板控制与开源化程序设计，使得成像平台有效减少外部辅助设备，增加平台的通用性与简便性；
6.本发明中，通过转接镜筒配置成像物镜，并搭配xyz固定调节支架使用，使得样品与成像物镜镜头距离得到灵活调节，以便于适应不同倍数的成像物镜；石英玻璃、密封圈与水槽之间密封容纳有不泄漏的内部液体例如水，液体将水槽中的空气排出，减小光程差对最终成像的影响；
7.本发明中，所述的基于Arduino的可变光片荧光显微成像平台可实现具体生物样品的切面扫描成像探测，同时可实现多角度不同深度的自动切片探测成像，具有操作方便、灵活性高、成本低、成像速度快等优势。
附图说明
图1为本发明的结构图；
图2为本发明中照明光路的结构图；
图3为本发明中探测光路的结构图；
图4为本发明中样品控制单元的结构图；
图5为本发明中柱面透镜的结构图；
图6为本发明中样品工作台与水槽的连接示意图；
图7为本发明中时序控制系统的电路示意图；
图8为本发明中样品控制单元的剖面示意图。
附图标记说明：1、PHU调节支座；2、PD不锈钢镜架支杆；3、半导体二极管激光器；4、可调孔径光阑；5、平凹透镜；6、平凸透镜；7、可调机械狭缝；8、柱面透镜；9、消色差透镜一；10、消色差透镜二；11、照明物镜；12、光学实验平台；13、透镜镜架；14、柱面透镜镜夹；001-样品控制单元；002-探测光路；003-时序控制系统；004、xyz固定调节支架；111、直线电机；112、电机法兰；113、辅助支撑板一；114、EF6固定座；115、滚珠丝杆；116、光轴；117、样品工作台；118、直线轴承；119、辅助支撑板二；120、EK6固定座；121、辅助支撑板三；122、辅助支撑板四；123、旋转电机；124、联轴器一；125、透明石英微型容器；126、旋转轴；127、联轴器二；128、水槽；129、深沟球轴承；130、样品旋转放置台；131、不锈钢直片；132、玻璃；133、支撑板；134、平键；135、轴用弹性挡圈一；136、轴用弹性挡圈二；137、密封圈；211、探测相机；212、相机固定板；213、转接镜筒；214、z轴手动调节滑台；215、滑台支撑板；216、xy轴手动调节滑台；217、成像物镜；218、镜筒辅助支撑板一；219、镜筒辅助支撑板二；220、滑台辅助支撑板一；221、滑台辅助支撑板二； 311、开关电源；312、控制处理器；313、电机控制器；314、杜邦线；315、100μF电解电容。
具体实施方式
以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要说明，若本发明实施例中有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后......)，则其仅用于解释在某一特定姿态下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
实施例一
一种自动化荧光切片显微成像平台，包括用于发射激光的半导体二极管激光器3、用于调整发射激光狭缝的照明光路000、用于获取样品图片的探测相机211、用于调整探测相机211位置角度的探测光路002、用于调整样品位置角度的样品控制单元001和时序控制系统003，半导体二极管激光器3、照明光路000和探测光路002依次从左向右分布，样品控制单元001设置在探测光路002一侧，时序控制系统003电连接探测相机211和半导体二极管激光器3，探测相机211固定设置在探测光路002上。
进一步地，照明光路000包括若干个微调机构、可调孔径光阑4、光扩束准直器、光学可调机械狭缝7、柱面透镜8、消色差透镜、照明物镜11和光学实验平台12，
半导体二极管激光器3、可调孔径光阑4、光扩束准直器、光学可调机械狭缝7、柱面透镜8、消色差透镜和照明物镜11均分别通过微调机构可调节设置在光学实验平台12上，半导体二极管激光器3、可调孔径光阑4、光扩束准直器、光学可调机械狭缝7、柱面透镜8、消色差透镜和照明物镜11依次从左向右分布，半导体二极管激光器3发射的光源轴线、可调孔径光阑4轴线、光扩束准直器轴线、光学可调机械狭缝7轴线、柱面透镜8轴线、消色差透镜轴线和照明物镜11轴线均重合。
进一步地，微调机构包括PHU调节支座1和PD不锈钢镜架支杆2，PHU调节支座1固定设置在光学实验平台12上，PHU调节支座1上开设配合PD不锈钢镜架支杆2的滑轨，PD不锈钢镜架支杆2滑动设置在PHU调节支座1上；
半导体二极管激光器3、可调孔径光阑4、光扩束准直器、光学可调机械狭缝7、柱面透镜8、消色差透镜和照明物镜11均分别固定设置在PD不锈钢镜架支杆2上；
PD不锈钢镜架支杆2为伸缩杆。
进一步地，探测光路002包括成像物镜217、转接镜筒213、滑台支撑板215和xyz固定调节支架004，探测相机211、转接镜筒213和成像物镜217依次适配连接，探测相机211、转接镜筒213和成像物镜217可调节设置在滑台支撑板215上，滑台支撑板215固定设置在xyz固定调节支架004上。
进一步地，样品控制单元001包括直线电机111、滚珠丝杆115、若干个光轴116、样品工作台117、直线轴承118、联轴器二127和辅助支撑板，
直线电机111固定设置在辅助支撑板上，辅助支撑板上有容纳滚珠丝杆115和光轴116的凹槽，凹槽上开设配合联轴器二127或滚珠丝杆115的直线通孔，直线电机111转轴通过联轴器二127连接滚珠丝杆115一端，滚珠丝杆115另一端转动设置在凹槽上，若干个光轴116平行于滚珠丝杆115分布，若干个光轴116两端固定设置在凹槽上，
直线轴承118套设在滚珠丝杆115上，样品工作台117上开设配合直线轴承118的直线轴承通孔，样品工作台117上开设配合若干个光轴116的光轴通孔，样品工作台117套设并固定连接直线轴承118，样品工作台117的光轴通孔滑动连接若干个光轴116。
进一步地，样品控制单元001包括透明石英微型容器125、水槽128、样品旋转放置台130和玻璃132，透明石英微型容器125可以是圆柱形，多棱柱形，且高度大于样品z轴扫描距离，
样品工作台117固定连接水槽128，样品旋转放置台130位于水槽128中，透明石英微型容器125位于样品旋转放置台130上；
水槽128靠近照明光路000一侧上开设用于安装玻璃132的玻璃通孔，玻璃通孔处固定安装用于光源通过的玻璃132，照明物镜11固定设置在玻璃132外侧，成像物镜217位于透明石英微型容器125上方。本实施例中石英微型容器125为石英比色皿。
进一步地，时序控制系统003包括上位机、控制处理器312、电机控制器313、开关电源311和电解电容315，控制处理器312电连接电机控制器313，电机控制器313电连接直线电机111，开关电源311与电机控制器313之间串联电解电容315，上位机电连接控制处理器312。
一种自动化荧光切片显微成像平台操作方法，以上述所述的自动化荧光切片显微成像平台为执行主体，包括：
步骤S1、将半导体二极管激光器3、可调孔径光阑4、光扩束准直器、光学可调机械狭缝7、柱面透镜8、消色差透镜和照明物镜11安装到光学实验平台12上；
在样品旋转放置台130中放入透明石英微型容器125，透明石英微型容器125中放入已染色处理的生物样品；
半导体二极管激光器3发射光源，观察照明物镜11镜面处光斑，根据该光斑调节半导体二极管激光器3出射的光源的轴线、可调孔径光阑4轴线、光扩束准直器轴线、光学可调机械狭缝7轴线、柱面透镜8轴线、消色差透镜和照明物镜11轴线重合，直至光斑居中分布在照明物镜11镜面处；
观察透明石英微型容器125处的光斑厚度，调节可调孔径光阑4的孔径大小与调节光学可调机械狭缝7的缝刃宽度，直到从照明物镜11出射的光片在透明石英微型容器125处形成光亮均匀且厚度合适为止;
运行直线电机111从而转动滚珠丝杆115，调节水槽128位置，使照明物镜11出射的光片垂直照射到透明石英微型容器125中生物样品；
重复多次调节xyz固定调节支架004位置从而调整成像物镜217位置和成像物镜217焦距，直至能在上位机的成像窗口中清晰看见探测相机211拍摄图像中的被光源激发的细胞；
控制处理器312驱动直线电机111运动从而带动样品工作台117对生物样品的层析扫描，实现调整透明石英微型容器125中生物样品的位置，进而改变生物样品被光片照射的位置，并对每一次层析扫描进行荧光探测成像；
控制处理器312首先编译并上传时序控制程序至Arduino开发板，然后在IDE的串口监视器输入串口控制指令，平台接收指令后开始自动化运行，即完成对生物样品的层析扫描，并对每一次层析扫描进行荧光探测成像；
每进行若干次层析扫描后，本实施例中判断3张照片的相似度，当相似度超过设定的上限阈值时，缩短相邻层析扫描的时间间距；当相似度小于设定的下限阈值时，增大相邻层析扫描的时间间距。
光扩束准直器包括平凹透镜5和平凸透镜6，平凹透镜5和平凸透镜6平行设置在可调孔径光阑4和光学可调机械狭缝7之间，消色差透镜包括消色差透镜一9和消色差透镜二10，消色差透镜一9和消色差透镜二10平行设置在柱面透镜8和照明物镜11之间，可调孔径光阑4、平凹透镜5、平凸透镜6、消色差透镜一9和消色差透镜二10轴线均重合。
辅助支撑板包括电机法兰112、辅助支撑板一113、辅助支撑板二119、辅助支撑板三121和辅助支撑板四122，辅助支撑板一113、辅助支撑板二119和辅助支撑板三121固定连接并组合形成一个U形凹槽，辅助支撑板四122固定设置在光学实验平台12上，电机法兰112位于辅助支撑板一113上方，直线电机111竖向固定设置在电机法兰112上，光轴116上端固定连接电机法兰112，光轴116中端依次贯穿辅助支撑板一113、样品工作台117和辅助支撑板三121，光轴116下端固定连接辅助支撑板四122；电机法兰112、辅助支撑板一113、辅助支撑板二119、辅助支撑板三121和辅助支撑板四122均为平面板材。
xyz固定调节支架004包括相机固定板212、滑台辅助支撑板二221、用于实现z轴方向上调节探测相机的z轴手动调节滑台214和用于实现X轴、Y轴方向上调节探测相机的xy轴手动调节滑台216，探测相机211通过六角螺栓竖向固定设置在相机固定板212上，相机固定板212和滑台辅助支撑板二221为平面板材，相机固定板212通过六角螺栓固定设置在滑台辅助支撑板二221上，滑台辅助支撑板二221通过六角螺栓固定设置在z轴手动调节滑台214上，z轴手动调节滑台214通过六角螺栓固定设置在滑台支撑板215上，滑台支撑板215通过六角螺栓固定设置在xy轴手动调节滑台216上，xy轴手动调节滑台216通过六角螺栓固定设置在滑台辅助支撑板一220上。
本实施例还包括透镜镜架13和用于固定柱面透镜8的柱面透镜镜夹14，透镜镜架13为圆环形塑料件。
本实施例还包括EF6固定座114和EK6固定座120，EF6固定座114和EK6固定座120均固定设置在凹槽内，EF6固定座114和EK6固定座120上均贯穿开设配合滚珠丝杆115的通孔，滚珠丝杆115上端转动连接EF6固定座114，滚珠丝杆115下端转动连接EK6固定座120，EF6固定座114和EK6固定座120外形均为规则块状物体。
本实施例水槽128为上下底面贯穿、内部中空的长方体，还包括镜筒辅助支撑板一218和镜筒辅助支撑板二219，镜筒辅助支撑板一218和镜筒辅助支撑板二219均为平面板材，镜筒辅助支撑板一218固定连接镜筒辅助支撑板二219，镜筒辅助支撑板二219固定连接滑台辅助支撑板二221，镜筒辅助支撑板一218和镜筒辅助支撑板二219连接处开设配合转接镜筒213的转接通孔。
半导体二极管激光器为488nm激光器，控制处理器为ArduinoUNOr3控制器，电机控制器为A4988控制器，开关电源311为24V开关电源，电解电容315为100μF电解电容，电机控制器通过杜邦线314电连接直线电机111。
滑台支撑板215包括L形板材和加强筋，L形板材上固定设置三角形的加强筋。
PHU调节支座1和样品旋转放置台130横截面为U形，直线电机111为直线步进电机，滚珠丝杆115为开设外螺纹的杆件，光轴116为光滑的杆件，样品工作台117为上下平行的两个片状板材，PD不锈钢镜架支杆2、半导体二极管激光器3、可调孔径光阑4、平凹透镜5和平凸透镜6、光学可调机械狭缝7、柱面透镜8、消色差透镜一9、消色差透镜二10、照明物镜11、直线电机111、直线轴承118、英比色皿125、联轴器二127、探测相机211、透镜镜架13、柱面透镜镜夹14、z轴手动调节滑台214、xy轴手动调节滑台216、成像物镜217、转接镜筒213、上位机、控制处理器312、电机控制器313、开关电源311和电解电容315上述部件在现有技术中可采用的型号很多，本领域技术人员可根据实际需求选用合适的型号，本实施例不再一一举例。
柱面透镜8置于柱面镜夹14，机械狭缝7通过调节螺旋旋钮改变缝刃宽度，孔径光阑4通过调节光圈大小改变孔径，光路元件位姿通过PHU调节支座1旋钮改变。
需要说明的是，当需要改变照明光路生成的光片厚度时，首先需要调节机械狭缝7的缝刃宽度大小与孔径光阑4光圈的大小，然后再通过调节PHU调节支座1旋钮重新调整照明光路000。
探测相机211通过C接口连接至转接镜筒213相机端并通过螺栓固定在相机固定板212上，成像物镜217与转接镜筒213通过螺纹连接，转接镜筒213通过螺栓固定在镜筒辅助支撑板一218和镜筒辅助支撑板二219上，镜筒辅助支撑板二219通过螺栓固定在滑台辅助支撑板221上，z轴手动调节滑台214固定在L型滑台支撑板215上，L型滑台支撑板215固定在xy轴手动调节滑台216上，xy轴手动调节滑台216固定在滑台辅助支撑板220上，滑台辅助支撑板220通过螺栓固定在光学实验平台12上，成像物镜217位置通过调节xy轴手动调节滑台216与z轴手动调节滑台214改变。
直线步进电机111安装在电机法兰112上，滚珠丝杠115通过EF固定座114、EK固定座120安装在辅助支撑板119上，如图6所示，样品工作台117外侧壁与水槽128外侧壁通过两个不锈钢直片131连接，透明石英微型容器125放置在样品旋转放置台130凹槽中
成像平台的相邻图像的间隔距离通过直线步进电机111的步进模式与滚珠丝杠115的导程P来控制。
时序控制系统003包括24V开关电源311、杜邦线314、A4988控制器313、ArduinoUNOR3控制器312和电解电容315，24V开关电源311通过杜邦线314串联电解电容315连接至A4988控制器313，24V开关电源311为步进电机111运动提供电源；ArduinoUNOR3控制器312通过杜邦线314连接至A4988控制器313，为步进电机111提供驱动信号，ArduinoUNOR3控制器312同时直接连接至探测相机211航空头，为相机提供外触发信号。
需要说明的是，探测相机211与直线步进电机111实现时序控制主要通过在串口程序中设置最佳的延迟等待时间来实现控制，主要任务为探测相机每拍摄一次图像后进入等待时间，在此等待时间内直线步进电机111开始工作，并驱动样品工作台117进行步进运动，直到直线步进电机111完成层析扫描后，进入等待时间，接着探测相机211结束等待时间开始拍摄此位置的荧光图像。
因为需要实现对样品的层析扫描，而且在拍摄过程中，平台的焦平面位置不会改变，改变的是生物样品被光片照射的位置，所以当需要观察样品的全部信息时，需要对样品进行层析扫描。而且当调整曝光时间时，为了能够保证每次层析扫描获取的图像都是清晰的，需要驱动样品工作台117进行步进层析扫描运动，从而调整透明石英微型容器125中样品的位置，进而改变生物样品被光片照射的位置。
本实例中，柱面透镜8与可调机械狭缝7以及可调孔径光阑4组合形成的高斯照明光片厚度规格可调节，所述光扩束准直器采用平凹透镜5与平凸透镜6搭建。
本实例中，辅助支撑板、水槽128和样品旋转放置台130均采用全透明亚克力硬质板，且水槽128侧壁上有供照明光片入射的矩形石英玻璃132；石英玻璃132、密封圈137与水槽128之间密封容纳有不漏的内部液体例如水，液体将水槽中的空气排出，减小光程差对最终成像的影响。所述水槽两端均采用两孔不锈钢直片连接到样品工作台117上，所述辅助支撑板内部相互采用螺栓与六角隔离螺柱固定，所述样品旋转放置台130位于水槽128中部且固定于旋转轴126顶部，旋转放置台130上开设的凹槽厚度为2mm，长宽略大于透明石英微型容器125尺寸。
本实例中，探测相机211、转接镜筒213以及成像物镜217安装于xyz固定调节支架004，所述xyz固定调节支架004采用M6螺栓垂直安装于光学实验平台12。
实施例二
进一步地，与实施例一不同的是，本实施例中样品控制单元001包括旋转电机123、联轴器一124、旋转轴126、深沟球轴承129、平键134、轴用弹性挡圈一135、轴用弹性挡圈二136、、密封圈137和支撑板133，旋转电机123竖向固定设置在支撑板133上且旋转电机123位于光学实验平台12上方，支撑板133上端固定连接在水槽128上，旋转电机123转轴通过联轴器一124固定连接到旋转轴126下端，水槽128底部开设配合深沟球轴承129的轴承通孔，深沟球轴承129内嵌在轴承通孔中，深沟球轴承129下端与旋转轴126之间内嵌限制轴向位移的轴用弹性挡圈一135，旋转轴126上端穿过深沟球轴承129伸入水槽128中，旋转轴126与样品旋转放置台130通过平键134连接传递旋转运动，样品旋转放置台130和旋转轴126之间内嵌限制轴向位移的轴用弹性挡圈二136，密封圈137密封设置在深沟球轴承129上端和旋转轴126连接处。
进一步地，旋转电机123为旋转步进电机，电机控制器313控制旋转电机123旋转一定角度，探测相机211拍摄一组该角度的序列照片，重复该步骤直到旋转电机123旋转达到设定的角度阈值。
若平台想实现多角度探测，可通过串口指令激活旋转电机，并上传对应控制程序，控制旋转电机进行角度旋转工作，然后才通过自动化层析扫描探测成型，拍摄一组该角度的序列照片。需要说明的是，当光片荧光显微成像平台需要实现多角度探测时，控制旋转电机123旋转运动，来间接改变透明石英微型容器在样品旋转放置台130的位置。
当需要对样品进行多角度探测时，通过串口指令激活旋转步进电机123，使其驱动旋转放置台130完成角度旋转，即间接控制透明石英微型容器125更换照明光片入射位置，实现多角度探测成像。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种自动化荧光切片显微成像平台，其特征在于，包括用于发射激光的半导体二极管激光器（3）、用于调整发射激光狭缝的照明光路（000）、用于获取样品图片的探测相机（211）、用于调整探测相机（211）位置角度的探测光路（002）、用于调整样品位置角度的样品控制单元（001）和时序控制系统（003），半导体二极管激光器（3）、照明光路（000）和探测光路（002）依次从左向右分布，样品控制单元（001）设置在探测光路（002）一侧，时序控制系统（003）电连接探测相机（211）和半导体二极管激光器（3），探测相机（211）固定设置在探测光路（002）上。
2.根据权利要求1所述的一种自动化荧光切片显微成像平台，其特征在于，
照明光路（000）包括若干个微调机构、可调孔径光阑（4）、光扩束准直器、光学可调机械狭缝（7）、柱面透镜（8）、消色差透镜、照明物镜（11）和光学实验平台（12），
半导体二极管激光器（3）、可调孔径光阑（4）、光扩束准直器、光学可调机械狭缝（7）、柱面透镜（8）、消色差透镜和照明物镜（11）均分别通过微调机构可调节设置在光学实验平台（12）上，半导体二极管激光器（3）、可调孔径光阑（4）、光扩束准直器、光学可调机械狭缝（7）、柱面透镜（8）、消色差透镜和照明物镜（11）依次从左向右分布，半导体二极管激光器（3）发射的光源的轴线、可调孔径光阑（4）轴线、光扩束准直器轴线、光学可调机械狭缝（7）轴线、柱面透镜（8）轴线、消色差透镜轴线和照明物镜（11）轴线均重合。
3.根据权利要求2所述的一种自动化荧光切片显微成像平台，其特征在于，
微调机构包括PHU调节支座（1）和PD不锈钢镜架支杆（2），PHU调节支座（1）固定设置在光学实验平台（12）上，PHU调节支座（1）上开设配合PD不锈钢镜架支杆（2）的滑轨，PD不锈钢镜架支杆（2）滑动设置在PHU调节支座（1）上；
半导体二极管激光器（3）、可调孔径光阑（4）、光扩束准直器、光学可调机械狭缝（7）、柱面透镜（8）、消色差透镜和照明物镜（11）均分别固定设置在PD不锈钢镜架支杆（2）上；
PD不锈钢镜架支杆（2）为伸缩杆。
4.根据权利要求3所述的一种自动化荧光切片显微成像平台，其特征在于，
探测光路（002）包括成像物镜（217）、转接镜筒（213）、滑台支撑板（215）和xyz固定调节支架（004），探测相机（211）、转接镜筒（213）和成像物镜（217）依次适配连接，探测相机（211）、转接镜筒（213）和成像物镜（217）可调节设置在滑台支撑板（215）上，滑台支撑板（215）固定设置在xyz固定调节支架（004）上。
5.根据权利要求4所述的一种自动化荧光切片显微成像平台，其特征在于，
样品控制单元（001）包括直线电机（111）、滚珠丝杆（115）、若干个光轴（116）、样品工作台（117）、直线轴承（118）、联轴器二（127）和辅助支撑板，
直线电机（111）固定设置在辅助支撑板上，辅助支撑板上有容纳滚珠丝杆（115）和光轴（116）的凹槽，凹槽上开设配合联轴器二（127）或滚珠丝杆（115）的直线通孔，直线电机（111）转轴通过联轴器二（127）连接滚珠丝杆（115）一端，滚珠丝杆（115）另一端转动设置在凹槽上，若干个光轴（116）平行于滚珠丝杆（115）分布，若干个光轴（116）两端固定设置在凹槽上，
直线轴承（118）套设在滚珠丝杆（115）上，样品工作台（117）上开设配合直线轴承（118）的直线轴承通孔，样品工作台（117）上开设配合若干个光轴（116）的光轴通孔，样品工作台（117）套设并固定连接直线轴承（118），样品工作台（117）的光轴通孔滑动连接若干个光轴（116）。
6.根据权利要求5所述的一种自动化荧光切片显微成像平台，其特征在于，
样品控制单元（001）包括透明石英微型容器（125）、水槽（128）、样品旋转放置台（130）和玻璃（132），
样品工作台（117）固定连接水槽（128），样品旋转放置台（130）位于水槽（128）中，透明石英微型容器（125）位于样品旋转放置台（130）上；
水槽（128）靠近照明光路（000）一侧上开设用于安装玻璃（132）的玻璃通孔，玻璃通孔处固定安装用于光源通过的玻璃（132），照明物镜（11）固定设置在玻璃（132）外侧，成像物镜（217）位于透明石英微型容器（125）上方，玻璃（132）与水槽（128）之间密封容纳有不泄漏的内部液体。
7.根据权利要求6所述的一种自动化荧光切片显微成像平台，其特征在于，
样品控制单元（001）包括旋转电机（123）、联轴器一（124）、旋转轴（126）、深沟球轴承（129）、平键（134）、轴用弹性挡圈一（135）、轴用弹性挡圈二（136）、、密封圈（137）和支撑板（133），旋转电机（123）竖向固定设置在支撑板（133）上且旋转电机（123）位于光学实验平台（12）上方，支撑板（133）上端固定连接在水槽（128）上，旋转电机（123）转轴通过联轴器一（124）固定连接到旋转轴（126）下端，水槽（128）底部开设配合深沟球轴承（129）的轴承通孔，深沟球轴承（129）内嵌在轴承通孔中，深沟球轴承（129）下端与旋转轴（126）之间内嵌限制轴向位移的轴用弹性挡圈一（135），旋转轴（126）上端穿过深沟球轴承（129）伸入水槽（128）中，旋转轴（126）与样品旋转放置台（130）通过平键（134）连接传递旋转运动，样品旋转放置台（130）和旋转轴（126）之间内嵌限制轴向位移的轴用弹性挡圈二（136），密封圈（137）密封设置在深沟球轴承（129）上端和旋转轴（126）连接处。
8.根据权利要求7所述的一种自动化荧光切片显微成像平台，其特征在于，
时序控制系统（003）包括上位机、控制处理器（312）、电机控制器（313）、开关电源（311）和电解电容（315），控制处理器（312）电连接电机控制器（313），电机控制器（313）电连接直线电机（111）和旋转电机（123），开关电源（311）与电机控制器（313）之间串联电解电容（315），上位机电连接控制处理器（312）。
9.一种自动化荧光切片显微成像平台操作方法，其特征在于，以权利要求1-8所述的自动化荧光切片显微成像平台为执行主体，包括：
步骤S1、将半导体二极管激光器（3）、可调孔径光阑（4）、光扩束准直器、光学可调机械狭缝（7）、柱面透镜（8）、消色差透镜和照明物镜（11）安装到光学实验平台（12）上；
在样品旋转放置台（130）中放入透明石英微型容器（125），透明石英微型容器（125）中放入已染色处理的生物样品；
半导体二极管激光器（3）发射激发光源，观察照明物镜（11）镜面处光斑，根据该光斑调节半导体二极管激光器（3）出射的光源的轴线、可调孔径光阑（4）轴线、光扩束准直器轴线、光学可调机械狭缝（7）轴线、柱面透镜（8）轴线、消色差透镜和照明物镜（11）轴线重合，直至光斑居中分布在照明物镜（11）镜面处；
观察透明石英微型容器（125）处的光斑厚度，调节可调孔径光阑（4）的孔径大小与调节光学可调机械狭缝（7）的缝刃宽度，直到从照明物镜（11）出射的光片在透明石英微型容器（125）处形成光亮均匀且厚度合适为止;
运行直线电机（111）从而转动滚珠丝杆（115），调节水槽（128）位置，使照明物镜（11）出射的光片垂直照射到透明石英微型容器（125）中生物样品；
重复多次调节xyz固定调节支架（004）位置从而调整成像物镜（217）位置和成像物镜（217）焦距，直至能在上位机的成像窗口中清晰看见探测相机（211）拍摄图像中的被光源激发的细胞；
控制处理器（312）驱动直线电机（111）运动从而带动样品工作台（117）对生物样品的层析扫描，实现调整透明石英微型容器（125）中生物样品被激发的位置，进而改变生物样品被光片照射的位置，并对每一次层析扫描进行荧光探测成像；
每进行若干次层析扫描后，判断至少3张照片的相似度，当相似度超过设定的上限阈值时，增大相邻层析扫描的空间间隔距离；当相似度小于设定的下限阈值时，增大相邻层析扫描的时间间距。
10.根据权利要求9所述的一种自动化荧光切片显微成像平台操作方法，其特征在于，
电机控制器（313）控制旋转电机（123）旋转一定角度，探测相机（211）拍摄一组该角度的序列照片，重复该步骤直到旋转电机（123）旋转达到设定的角度阈值。
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