CN113527460A - 一种感应爆炸物分子的Arac突变体AraCmt1及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种感应爆炸物分子的Arac突变体AraCmt1及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种感应爆炸物分子的Arac突变体AraCmt1及其筛选方法和应用。所述Arac突变体AraCmt1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述Arac突变体AraCmt1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，或者与SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的且能编码如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列的核苷酸序列。所述的突变体AraCmt1能够特异性结合爆炸物分子2,4‑二硝基甲苯（2,4‑DNT），并受其诱导而激活PBAD启动子，从而表达下游报告基因，进而通过荧光强度或者颜色反应检测微量的2,4‑DNT，因此适用于制备感应2,4‑DNT的微生物传感器。

Description

一种感应爆炸物分子的Arac突变体AraCmt1及其筛选方法和 应用
技术领域
本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及一种感应爆炸物分子的Arac突变体AraCmt1及其筛选方法和应用。
背景技术
战区残留爆炸物（例如地雷）对于生命安全和生态系统造成了不可修复的危害，针对爆炸物进行安全有效的检测具有重要的战略意义。爆炸物的有效成份为TNT，TNT可分解为多种化合物，如1,3-二硝基苯（1,3-DNB）和2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT）。
爆炸物分子2,4-DNT，CAS号为121-14-2，其结构式如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
以色列科学家Shimshon Belkin报道了对爆炸物分子2,4-DNT的感应元件，即yqjF启动子，利用GFP基因作为报告元件，构建了检测2,4-DNT的微生物传感器。在此研究中，2,4-DNT及其代谢物能够直接诱导yqjF启动子，yqjF启动子被诱导后，转录下游GFP基因，这种直接诱导的感应系统灵敏度低，不能满足野外检测的要求。
野生型的AraC-PBAD系统：转录因子AraC能够天然响应L-阿拉伯糖，在没有L-阿拉伯糖的情况下，AraC二聚体的结合I1和O2位点，在PBAD启动子上游形成DNA环而抑制转录；结合L-阿拉伯糖后，AraC二聚体改变构象，使得与相邻的I1和I2半位点结合，激活转录。据报道，通过突变获得的AraC突变体，可以与L-阿拉伯糖之外的化合物进行结合，从而激活PBAD启动子的转录活性，使得AraC突变体受其他化合物的诱导。相比于直接感应2,4-DNT的启动子，这种AraC-PBAD系统具有放大效应，其信号更强。
发明内容
本发明的目的在于提供一种感应爆炸物分子的Arac突变体AraCmt1及其筛选方法和应用，突变体AraCmt1具有明显的感应爆炸物分子2,4-DNT的作用，且呈剂量依赖性。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种感应爆炸物分子的Arac突变体AraCmt1，所述Arac突变体AraCmt1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
本发明还提供了所述的Arac突变体AraCmt1的编码基因，所述Arac突变体AraCmt1的编码基因具有下列核苷酸序列之一：
（1）SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
（2）与SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的，且能编码如SEQ IDNO.13所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明还提供了所述的Arac突变体AraCmt1的筛选方法，包括以下步骤：
（1）以质粒pEGFP-1为模板，扩增构建重组质粒p-AraC-PBAD-eGFP；
（2）通过简并引物获得AraC多位点饱和突变片段ABC，将所述重组质粒p-AraC-PBAD-eGFP扩增后与ABC片段进行组装，转化感受态细胞，获得AraC突变体文库；
（3）将所述AraC突变体文库利用含有爆炸物分子的培养基进行初筛，筛选得到具有明显荧光的单菌落；
（4）将所述单菌落置于含有不同浓度爆炸物分子的培养基上进行复筛，检测实时荧光，最终筛选得到一株荧光强度最强的菌株，即为含有AraC突变体的目标菌株；
（5）将所述含有AraC突变体的目标菌株培养后，提取质粒，测序鉴定，即可得到Arac突变体。
进一步的，所述步骤（1）中扩增引物为
PBAD-EGFP-F：5’- TTGGGCTAGCAGGAGGAATTCTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAAATGG-3’；
PBAD-EGFP-R：5’- CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCTTACTTGTACA GCTCGTCCATG-3’。
进一步的，所述步骤（3）的初筛步骤为：将含有AraC突变体文库的平板通过硝酸微孔膜进行转膜，转移至含有100 mg/L氨苄青霉素和50 mg/L 爆炸物分子的M9Y平板上，继续37℃恒温培养箱放置12小时；当有明显菌落生长时，通过紫外灯对平板进行荧光观察，筛选得到具有明显荧光的单菌落。
进一步的，所述步骤（4）的复筛步骤为：将具有明显荧光的单菌落置于含有100mg/L氨苄青霉素的200 μL M9Y培养基的96深孔板中活化培养，37℃摇床过夜培养；按照1%接种量转接至含M9Y培养基的96微孔板中，培养至OD600=0.2时，分别加入0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L浓度的爆炸物分子，置于酶标仪中进行震荡培养，恒温30℃实时监测荧光强度，每10 min进行一次检测，共监测10 h，激发光485 nm，发射光528 nm，每组测三个平行。
进一步的，所述M9Y培养基的成分包括磷酸氢二钠 6g/L，磷酸二氢钾 3g/L，氯化铵 1g/L，氯化钠 0.5g/L，硫酸镁 1 mM，0.05% 酵母粉。
本发明还提供了所述的Arac突变体AraCmt1的编码基因的重组表达载体。
本发明还提供了所述的Arac突变体AraCmt1的编码基因的重组菌株。
本发明还提供了所述的Arac突变体AraCmt1、所述的重组表达载体或者所述的重组菌株在制备用于检测爆炸物分子的微生物传感器中的应用。
进一步的，所述爆炸物分子为2,4-DNT。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
本发明通过构建AraC突变体的方法筛选得到了一个全新的突变体AraCmt1，其具有感应爆炸物分子2,4-DNT的作用，能够用于微生物传感器的构建，可以与L-阿拉伯糖结合并响应。本发明的AraC突变体的筛选方法同样也能够适用于筛选其他能够感应爆炸物分子的AraC突变体，且方法简单、快捷。利用突变体AraCmt1或者其构建的微生物传感器具有很好的感应2,4-DNT的效果，能够通过荧光强度或者颜色反应检测不同浓度的且微量的2,4-DNT，且呈剂量依赖性，因此其具有很大的应用前景。
附图说明
图1为构建的载体p-AraC-PBAD-eGFP的过程中的产物纯化结果图。
图2为构建的载体p-AraC-PBAD-eGFP质粒图谱及其相应菌株在阿拉伯糖诱导条件下的荧光产生结果图。
图3为AraC突变体的筛选流程图。
图4为AraC突变株的部分平板初筛结果。
图5为AraCmt1突变体在检测爆炸物分子2,4-DNT的中作用结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。
实施例1：AraC突变体的筛选
1、基础载体p-AraC-PBAD-eGFP的构建及其相应菌株的构建
以质粒pEGFP-1（Clontech，货号6086_1）为模版，引物pBAD-EGFP-F和引物pBAD-EGFP-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增eGFP片段，其PCR扩增体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
PCR程序为：95 ºC 3 min；30 ×（95ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 1 min）；72ºC 5min；16ºC ∞。
引物序列如下所示：
PBAD-EGFP-F：5’- TTGGGCTAGCAGGAGGAATTCTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAAATGG-3’ （SEQ ID NO.1）；
PBAD-EGFP-R：5’- CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’ （SEQID NO.2）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化（图1A）。
利用限制性内切酶1 EcoRІ（TaKaRa，货号1611）和限制性内切酶2 KpnІ（TaKaRa，货号1618）双酶切 pBAD24质粒，其酶切体系为：
质粒或PCR产物 3 μg
10 ×Q.Cut Buffer 10 μL
限制性内切酶1 5 μL
限制性内切酶2 5 μL
超纯水 补至100 μL
酶切体系置于37 ºC孵育1h，进行胶回收纯化（图1B）。
利用2×Clon Express Mix（Vazyme，货号C115）通过无缝克隆的方法将两个PCR产物进行连接，其体系如下所示：
载体的PCR片段 0.03 pmol
插入基因的PCR片段 0.06 pmol
2×Clon Express Mix 5 μL
超纯水 补至10 μL
体系置于50 ºC孵育30 min。产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含100 mg/L氨苄青霉素的LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆（图1C），从阳性克隆中提取重组质粒p-AraC-PBAD-eGFP（图2），再通过限制性酶切和测序进行鉴定，该质粒p-AraC-PBAD-eGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
将构建好的p-AraC-PBAD-eGFP质粒转化至E. coli BL21(DE3)感受态，涂布到含100 mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上，过夜培养，获得单菌。挑取四个阳性克隆单菌，分别划线至含100 mg/L氨苄青霉素的M9Y（1 L培养基中含有磷酸氢二钠 6g，磷酸二氢钾 3g，氯化铵 1g，氯化钠 0.5g，硫酸镁 1 mM，0.05% 酵母粉）固体平板上和含100 mg/L氨苄青霉素加阿拉伯糖1 mM的M9Y固体平板上，37℃恒温培养箱放置12小时，发现有明显菌落生长时，将平板通过紫外灯进行荧光观察。结果（图2）显示，加阿拉伯糖的平板上菌落有明显的绿色荧光，不加阿拉伯糖的平板没有荧光，说明含有p-AraC-PBAD-eGFP质粒的工程细菌可以与L-阿拉伯糖结合并响应。
2、AraC突变文库的构建（流程如图3所示）
（1）进行聚合酶链式反应（PCR），以载体p-AraC-PBAD-eGFP为模板，通过引物AraC-P8-F、AraC-T24-R扩增获得片段A，通过引物araC-comp-T24-F、araC-H80-Y82-R扩增获得片段B，通过引物AraC-H93-F、AraC-rev-4扩增获得片段C，其PCR扩增体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
PCR程序为：95ºC 3 min；30 ×（95ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 30 s）；72ºC 5 min；16ºC ∞。
引物序列为：
AraC-P8-F：5’-tggctgaagcgcaaaatgatNNSctgctgccg-3’ （SEQ ID NO.4）；
AraC-T24-R：5’-taaccgttggcctcaatcggSNNtaaacccgc-3’ （SEQ ID NO.5）；
araC-comp-T24-F：5’-ccgattgaggccaacggtta-3’ （SEQ ID NO.6）；
araC-H80-Y82-R：5’-cgagcctccggatgacgaccSNNgtgSNNaatctctcc-3’ （SEQ IDNO.7）；
AraC-H93-F：5’-ggtcgtcatccggaggctcgcgaatggtatNNScagtgggtt-3’ （SEQ IDNO.8）；
AraC-rev-4：5’-attgctgtctgccaggtgatc-3’ （SEQ ID NO.9）。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化。
对回收后的A、B、C片段通过重叠延伸PCR，获得多位点饱和突变的片段ABC，其PCR扩增体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
PCR程序为：95ºC 3 min；10循环 ×（95ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 30 s）；72ºC 5min；16ºC ∞。
然后加入引物：
AraC-P8-F： 0.5 μM
AraC-rev-4 0.5 μM
继续进行PCR扩增反应程序：95ºC 3 min；30 ×（95ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 30s）；72ºC 5 min；16ºC ∞。
片段ABC的PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化。
（2）以p-AraC-PBAD-eGFP质粒为模版，引物AraC-I-F和引物AraC-I-R，进行PCR，扩增载体片段，其PCR扩增体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
PCR程序为：95ºC 3 min；30循环 ×（95ºC 15 s，55ºC 15 s，72ºC 5 min）；72ºC 5min；16ºC ∞。
引物序列为：
AraC-I-F：5’-GATCACCTGGCAGACAGCAA-3’ （SEQ ID NO.10）；
AraC-I-R：5’-ATCATTTTGCGCTTCAGCCA-3’ （SEQ ID NO.11）。
PCR产物加1 μL限制性内切酶Dpn І（TaKaRa，货号1609）37 ℃消解1 h，利用回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行液体回收纯化。
（4）利用无缝克隆将ABC片段克隆至载体片段上，其体系如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
连接体系置于50ºC孵育30 min。连接产物转化E. coli BL21-ΔAraC感受态，涂布到含100 mg/L氨苄青霉素的LB 固体平板上，过夜培养，获得突变文库。
3、感应2,4-DNT的AraC突变文库的大规模筛选
（1）利用紫外灯照射法对突变文库进行初筛
将上述得到的平板通过硝酸微孔膜进行转膜，转移至含有100 mg/L氨苄青霉素和50 mg/L 2,4-DNT的M9Y平板上，继续37℃恒温培养箱放置12小时。转膜的LB固体平板有明显菌落生长时，将平板通过紫外灯进行荧光观察，筛选得到具有明显荧光的单菌落，即为感应2,4-DNT的Arac突变体。结果如图4所示，本发明在5000个克隆中共初筛了20个较为明显的突变株。
（2）通过96微孔板进行复筛
用无菌牙签挑取初筛得到的单菌落，置于含有100 mg/L氨苄青霉素的200 μL M9Y培养基的96深孔板中活化培养，37℃摇床过夜培养。按照1%接种量转接至同样培养基的96微孔板中，培养至OD600=0.2时，分别加入0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L浓度的2,4-DNT，置于酶标仪（Biotek）中进行震荡培养，恒温30℃实时监测荧光强度（RFU），每10 min进行一次检测，共监测10 h，激发光485 nm，发射光528 nm，每组测三个平行。初筛的20个菌株中，筛选出1个菌株8-10，其荧光强度（RFU）表现出如下变化：在不同浓度2,4-DNT的作用下，RFU值呈现出不同的变化，2,4-DNT浓度越高，其RFU值越高。
4、感应2,4-DNT的AraC突变体的鉴定
将荧光效果显著的菌株转接至10 mL 加入100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养，37℃摇床过夜培养。利用质粒提取试剂盒（Vazyme，货号DC201-01）进行质粒提取。将提取的质粒送至测序公司进行测序，最终确定AraC突变体的突变序列。测序结果显示，获得的AraC突变体AraCmt1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
实施例2：AraC突变体在检测爆炸物分子2,4-DNT中的应用
用无菌牙签挑取含AraCmt1突变体的单菌落，置于含有100 mg/L氨苄青霉素的10mL M9Y培养基的中活化培养，37℃摇床过夜培养。按照1%接种量转接至同样培养基的96微孔板中，培养至OD600=0.2时，分别加入0 mg/L、5 mg/L、 10 mg/L浓度的2,4-DNT，置于酶标仪（Biotek）中， 30℃监测荧光强度（RFU），结果如图5所示， 5 mg/L和 10 mg/L组的RFU值均明显高于0 mg/L组，且2,4-DNT的浓度越高，RFU值越高，说明本发明筛选到的 AraCmt1突变体具有明显感应爆炸物分子2,4-DNT的作用，且灵敏度好。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种感应爆炸物分子的Arac突变体AraCmt1及其筛选方法和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgggctagc aggaggaatt ctttgtttaa ctttaagaag gagatataca aatgg 55
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctctagagga tccccgggta ccttacttgt acagctcgtc catg 44
<210> 3
<211> 5287
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcgatgcat aatgtgcctg tcaaatggac gaagcaggga ttctgcaaac cctatgctac 60
tccgtcaagc cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg acaacttgac ggctacatca 120
ttcacttttt cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc tggccccggt gcatttttta 180
aatacccgcg agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat tgcgaccgac ggtggcgata 240
ggcatccggg tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga tacgttggtc ctcgcgccag 300
cttaagacgc taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg acagacgcga cggcgacaag 360
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accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca aagccatgac aaaaacgcgt 1140
aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg attatttgca cggcgtcaca 1200
ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg atcctacctg acgcttttta 1260
tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg tttttttggg ctagcaggag gaattctttg 1320
tttaacttta agaaggagat atacaaatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg 1380
tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg 1440
gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg 1500
gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct 1560
tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag 1620
gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg 1680
aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca 1740
aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct 1800
atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca 1860
tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg 1920
gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc 1980
ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc 2040
tcggcatgga cgagctgtac aagtaaggta cccggggatc ctctagagtc gacctgcagg 2100
catgcaagct tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata cagattaaat 2160
cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc 2220
cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt 2280
ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa 2340
gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 2400
ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc 2460
ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt 2520
gcgtttctac aaactctttt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 2580
gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 2640
acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 2700
cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 2760
catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 2820
tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtgttgacgc 2880
cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 2940
accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 3000
cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 3060
ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 3120
accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat 3180
ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 3240
attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 3300
ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 3360
tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 3420
tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 3480
gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt tacgcgccct 3540
gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 3600
ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 3660
gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 3720
ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 3780
gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 3840
tccaaacttg aacaacactc aaccctatct cgggctattc ttttgattta taagggattt 3900
tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 3960
ttaacaaaat attaacgttt acaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 4020
ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 4080
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 4140
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 4200
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 4260
tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 4320
ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 4380
cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 4440
agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 4500
gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 4560
ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 4620
tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 4680
tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 4740
cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 4800
tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 4860
gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 4920
atagggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 4980
gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 5040
agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagca aggagatggc gcccaacagt 5100
cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat gagcccgaag 5160
tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct 5220
gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatctgctc atgtttgaca 5280
gcttatc 5287
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggctgaagc gcaaaatgat nnsctgctgc cg 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taaccgttgg cctcaatcgg snntaaaccc gc 32
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgattgagg ccaacggtta 20
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgagcctccg gatgacgacc snngtgsnna atctctcc 38
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtcgtcatc cggaggctcg cgaatggtat nnscagtggg tt 42
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
attgctgtct gccaggtgat c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatcacctgg cagacagcaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atcattttgc gcttcagcca 20
<210> 12
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggctgaag cgcaaaatga tgggctgctg ccgggatact cgtttaatgc ccatctggtg 60
gcgggtttaa gcccgattga ggccaacggt tatctcgatt tttttatcga ccgaccgctg 120
ggaatgaaag gttatattct caatctcacc attcgcggtc agggggtggt gaaaaatcag 180
ggacgagaat ttgtttgccg accgggtgat attttgctgt tcccgccagg agagattgtc 240
cacggcggtc gtcatccgga ggctcgcgaa tggtatcacc agtgggttta ctttcgtccg 300
cgcgcctact ggcatgaatg gcttaactgg ccgtcaatat ttgccaatac ggggttcttt 360
cgcccggatg aagcgcacca gccgcatttc agcgacctgt ttgggcaaat cattaacgcc 420
gggcaagggg aagggcgcta ttcggagctg ctggcgataa atctgcttga gcaattgtta 480
ctgcggcgca tggaagcgat taacgagtcg ctccatccac cgatggataa tcgggtacgc 540
gaggcttgtc agtacatcag cgatcacctg gcagacagca attttgatat cgccagcgtc 600
gcacagcatg tttgcttgtc gccgtcgcgt ctgtcacatc ttttccgcca gcagttaggg 660
attagcgtct taagctggcg cgaggaccaa cgtatcagcc aggcgaagct gcttttgagc 720
accacccgga tgcctatcgc caccgtcggt cgcaatgttg gttttgacga tcaactctat 780
ttctcgcggg tatttaaaaa atgcaccggg gccagcccga gcgagttccg tgccggttgt 840
gaagaaaaag tgaatgatgt agccgtcaag ttgtcataa 879
<210> 13
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Ala Glu Ala Gln Asn Asp Gly Leu Leu Pro Gly Tyr Ser Phe Asn
1 5 10 15
Ala His Leu Val Ala Gly Leu Ser Pro Ile Glu Ala Asn Gly Tyr Leu
20 25 30
Asp Phe Phe Ile Asp Arg Pro Leu Gly Met Lys Gly Tyr Ile Leu Asn
35 40 45
Leu Thr Ile Arg Gly Gln Gly Val Val Lys Asn Gln Gly Arg Glu Phe
50 55 60
Val Cys Arg Pro Gly Asp Ile Leu Leu Phe Pro Pro Gly Glu Ile Val
65 70 75 80
His Gly Gly Arg His Pro Glu Ala Arg Glu Trp Tyr His Gln Trp Val
85 90 95
Tyr Phe Arg Pro Arg Ala Tyr Trp His Glu Trp Leu Asn Trp Pro Ser
100 105 110
Ile Phe Ala Asn Thr Gly Phe Phe Arg Pro Asp Glu Ala His Gln Pro
115 120 125
His Phe Ser Asp Leu Phe Gly Gln Ile Ile Asn Ala Gly Gln Gly Glu
130 135 140
Gly Arg Tyr Ser Glu Leu Leu Ala Ile Asn Leu Leu Glu Gln Leu Leu
145 150 155 160
Leu Arg Arg Met Glu Ala Ile Asn Glu Ser Leu His Pro Pro Met Asp
165 170 175
Asn Arg Val Arg Glu Ala Cys Gln Tyr Ile Ser Asp His Leu Ala Asp
180 185 190
Ser Asn Phe Asp Ile Ala Ser Val Ala Gln His Val Cys Leu Ser Pro
195 200 205
Ser Arg Leu Ser His Leu Phe Arg Gln Gln Leu Gly Ile Ser Val Leu
210 215 220
Ser Trp Arg Glu Asp Gln Arg Ile Ser Gln Ala Lys Leu Leu Leu Ser
225 230 235 240
Thr Thr Arg Met Pro Ile Ala Thr Val Gly Arg Asn Val Gly Phe Asp
245 250 255
Asp Gln Leu Tyr Phe Ser Arg Val Phe Lys Lys Cys Thr Gly Ala Ser
260 265 270
Pro Ser Glu Phe Arg Ala Gly Cys Glu Glu Lys Val Asn Asp Val Ala
275 280 285
Val Lys Leu Ser
290

Claims (10)

1.一种感应爆炸物分子的Arac突变体AraCmt1，其特征在于，所述Arac突变体AraCmt1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
2.权利要求1所述的Arac突变体AraCmt1的编码基因，其特征在于，所述Arac突变体AraCmt1的编码基因具有下列核苷酸序列之一：
（1）SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
（2）与SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的，且能编码如SEQ IDNO.13所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的Arac突变体AraCmt1的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：
（1）以质粒pEGFP-1为模板，扩增构建重组质粒p-AraC-PBAD-eGFP；
（2）通过简并引物获得AraC多位点饱和突变片段ABC，将所述重组质粒p-AraC-PBAD-eGFP扩增后与ABC片段进行组装，转化感受态细胞，获得AraC突变体文库；
（3）将所述AraC突变体文库利用含有爆炸物分子的培养基进行初筛，筛选得到具有明显荧光的单菌落；
（4）将所述单菌落置于含有不同浓度爆炸物分子的培养基上进行复筛，检测实时荧光，最终筛选得到一株荧光强度最强的菌株，即为含有AraC突变体的目标菌株；
（5）将所述含有AraC突变体的目标菌株培养后，提取质粒，测序鉴定，即可得到Arac突变体。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）中扩增引物为
PBAD-EGFP-F：5’- TTGGGCTAGCAGGAGGAATTCTTTGTTTAACTTTA AGAAGGAGATATACAAATGG-3’；
PBAD-EGFP-R：5’- CTCTAGAGGATCCCCGGGTACCTTACTTGTACA GCTCGTCCATG-3’。
5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤（3）的初筛步骤为：将含有AraC突变体文库的平板通过硝酸微孔膜进行转膜，转移至含有100 mg/L氨苄青霉素和50mg/L 爆炸物分子的M9Y平板上，继续37℃恒温培养箱放置12小时；当有明显菌落生长时，通过紫外灯对平板进行荧光观察，筛选得到具有明显荧光的单菌落。
6.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤（4）的复筛步骤为：将具有明显荧光的单菌落置于含有100 mg/L氨苄青霉素的200 μL M9Y培养基的96深孔板中活化培养，37℃摇床过夜培养；按照1%接种量转接至含M9Y培养基的96微孔板中，培养至OD600=0.2时，分别加入0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L浓度的爆炸物分子，置于酶标仪中进行震荡培养，恒温30℃实时监测荧光强度，每10 min进行一次检测，共监测10 h，激发光485 nm，发射光528nm，每组测三个平行。
7.含有权利要求2所述的Arac突变体AraCmt1的编码基因的重组表达载体。
8.含有权利要求2所述的Arac突变体AraCmt1的编码基因的重组菌株。
9.权利要求1所述的Arac突变体AraCmt1、权利要求7所述的重组表达载体或者权利要求8所述的重组菌株在制备用于检测爆炸物分子的微生物传感器中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述爆炸物分子为2,4-DNT。
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