CN113456630B - 血管生长因子受体抑制剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域，特别涉及血管生长因子受体抑制剂的用途。本发明证实了采用血管内皮生长因子受体抑制剂可有效的抑制成年卵巢中的生理性血管新生，从而延缓卵巢中卵巢储备即原始卵泡的损耗，最终达到延缓卵巢衰老以及提升生育寿命的目的。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及血管生长因子受体抑制剂的用途。
背景技术
卵巢是哺乳动物包括人类在内雌性的性腺，其主要功能包括：贮存以及支持卵母细胞发育，以及产生性激素维持女性正常的内分泌平衡。而女性的卵巢，是机体中最早老化的器官之一，大约在48岁左右，伴随着女性的绝经期到来，卵巢的主要功能随之终止。而现代社会，由于生活条件以及医疗的进步，女性平均寿命不断提升，这使得女性在绝经期后长时间失去卵巢功能进而带来诸多的生理病理隐患。
女性卵巢衰老的主要原因，是卵巢中的卵泡伴随年龄增长的逐步消耗。而在卵巢中，处于休眠状态的原始卵泡(又称为始基卵泡)则是卵巢最基本的功能单位，代表着卵巢储备的大小。休眠的原始卵泡，在卵巢中经过一个被称为卵泡激活的过程进入发育，转变为生长卵泡，并开始分泌激素贡献于女性内分泌。生长卵泡的发育过程中，卵巢发生大规模的血管新生，并且在卵泡周围构建新的血管网络，以连接卵巢与机体的有序内分泌循环。区别于大部分成体器官，卵巢是少数的存在生理性成年大规模血管新生的器官，但是，这种血管新生与休眠的原始卵泡之间的关系，一直并不清楚。
近年来，由于血管新生是肿瘤发生过程中的重要步骤，因而利用抑制血管新生控制肿瘤生长，被视为一种有效的肿瘤治疗手段。而大量的相关药物，如阿西替尼(Axitinib)及舒尼替尼(Sunitinib)等血管内皮生长因子受体相关抑制分子，被应用于临床中的肿瘤防治并取得了良好的效果。但在相关的报道中，血管生长因子受体抑制剂并不存在保护卵巢生殖储备的作用。并且通过干扰卵巢内血管新生，是否可影响卵巢衰老，进而调控雌性动物的生殖寿命，依然不清楚。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供血管抑制药物在延缓卵巢衰老中的应用，通过抑制卵巢内的血管新生进而抑制原始卵泡的激活从而保存卵巢生殖储备，以及相关方法在制备延缓卵巢衰老的试剂中的应用：
本发明提供了血管新生抑制剂在制备改善卵巢衰老试剂中的应用。
本发明中，所述改善卵巢衰老包括：提高抗衰老相关基因表达水平。一些实施中，所述抗衰老相关基因包括：PRDX4和/或ldh1。本发明所述提高抗衰老基因的表达包括提高mRNA水平或提高基因编码的蛋白水平。
本发明中，所述改善卵巢衰老包括：减少生长卵泡血管密度、降低卵巢的生长、抑制生长卵泡的消耗、降低原始卵泡消耗、抑制原始卵泡发育和/或提升卵巢总卵泡数量。
本发明中，所述改善卵巢衰老包括：调节生殖激素水平。一些实施例中，所述生殖激素包括：孕酮(P4)、雌激素(E2)、促卵泡生成素(FSH)。一些实施例中，所述调节生殖激素水平包括：降低FSH水平、提高E2水平和/或提高P4水平。
本发明还提供了血管新生抑制剂在改善雌性动物生殖力的药物中的应用。本发明中，所述改善雌性动物生殖力包括延长生育年限和/或增加产仔数量。所述雌性动物为雌性小鼠或人类女性。
本发明还提供了血管新生抑制剂在制备避孕药物中的应用。所述避孕包括抑制黄体形成或停止排卵。
本发明中，所述血管新生抑制剂选自血管内皮生长因子受体抑制剂。一些实施例中，采用的血管内皮生长因子受体抑制剂为舒尼替尼或阿西替尼。
本发明一些具体实施例中，以阿西替尼为实验对象，验证了血管生长因子受体抑制剂具有阻断卵巢血管新生并进一步保护卵巢储备以延缓卵巢衰老的作用。
本发明还提供了一种药物，该药物包括血管新生抑制剂和药学上可接受的辅料。该药物具有改善卵巢衰老、改善雌性动物生殖力和/或避孕的作用。
本发明还提供了一种改善卵巢衰老、改善雌性动物生殖力和/或避孕的方法，其为给予本发明所述的药物。所述给予的方法包括口服或注射。所述给予的剂量以血管新生抑制剂计算为50～200ng/kg动物体重。
本发明提供了通过血管新生抑制剂通过保护卵巢储备而达到延缓卵巢衰老，并提升雌性生育寿命的的应用。研究表明，采用血管内皮生长因子受体抑制剂可有效的抑制成年卵巢中的生理性血管新生，从而减缓卵巢中卵巢储备即原始卵泡的损耗，最终达到延缓卵巢衰老以及提升生育寿命的目的。
附图说明
图1所示为阿西替尼(Axitinib)处理后阻断小鼠正常发情周期的结果；其中，左图黑色线条为DMSO组随机3只小鼠发情周期的检测结果，右图红色线条为Axitinib组随机3只小鼠发情周期的检测结果，M为发情后期，D为间情期，P为发情前期，E为发情期，横坐标为药物处理后的阴道抹片时间，纵坐标为发情状态；
图2所示为阿西替尼(Axitinib)处理后显著减少生长卵泡血管密度的结果；其中，A为药物处理后卵泡、卵巢间质、肝脏的3D血管结构，B为药物处理后卵泡、卵巢间质、肝脏血管密度的量化统计结果，横坐标为不同组织，Follicle为卵泡组，Ovarian stroma为卵巢间质组，Liver为肝脏组，纵坐标为组织的相对血管密度；
图3所示为阿西替尼(Axitinib)处理对年轻小鼠体重变化无明显影响的结果；
图4所示为阿西替尼(Axitinib)处理后显著减小卵巢的大小和生长卵泡的数量的结果；
图5所示为阿西替尼(Axitinib)处理后的卵泡统计结果，其中青色柱子为DMSO组，红色柱子为阿西替尼(Axitinib)组，横坐标为处理前后，Initial为处理前，Aftertreatment为处理后，左图纵坐标为生长卵泡的数量，右图纵坐标为总卵泡的数量；
图6所示为阿西替尼(Axitinib)处理后卵母细胞DDX4，颗粒细胞FOXL2和细胞核Hoechst的免疫荧光染色结果；
图7为阿西替尼(Axitinib)处理后的卵泡统计结果，其中青色柱子为DMSO组，红色柱子为阿西替尼(Axitinib)组，横坐标为处理前后，Initial为处理前，After treatment为处理后，纵坐标为原始卵泡的数量；
图8所示为阿西替尼(Axitinib)处理对中年小鼠体重变化无明显影响的结果；
图9所示为中年小鼠经阿西替尼(Axitinib)处理后一个月对卵巢进行免疫荧光及苏木精染色并统计的结果，右图横坐标为卵泡级别，primordialfollicle为原始卵泡，totalfollicle为总卵泡，纵坐标为卵泡的数量；
图10所示为中年小鼠经阿西替尼(Axitinib)处理后六个月对卵巢进行免疫荧光及苏木精染色并统计的结果，右图横坐标为卵泡级别，primordialfollicle为原始卵泡，totalfollicle为总卵泡，纵坐标为卵泡的数量；
图11所示为中年小鼠经阿西替尼(Axitinib)处理后四个月的卵巢real time-PCR检测结果，横坐标为不同抗衰老相关基因，纵坐标为相对表达量；
图12所示为中年小鼠经阿西替尼(Axitinib)处理后四个月的卵巢与八个月龄未处理小鼠卵巢进行免疫荧光染色并量化抗衰老蛋白PRDX4相对表达量的结果，右图横坐标为处理组别，8months为中年对照组，Axitinib-old为中年小鼠经阿西替尼(Axitinib)处理后四个月组，DMSO-old为中年小鼠经DMSO处理后四个月组，纵坐标为抗衰老蛋白PRDX4的相对表达量；
图13所示为中年小鼠经阿西替尼(Axitinib)处理后的生殖力检测结果，左图为处理小鼠生育力的检测结果，横坐标为小鼠的月龄，纵坐标为平均每只雌鼠的产仔数；右图为处理小鼠在不同生殖阶段的产仔数，横坐标为小鼠的月龄阶段，纵坐标为平均每只雌鼠在相应月龄阶段的产仔数；
图14所示为中年小鼠经阿西替尼(Axitinib)处理后六个月与八个月龄未处理小鼠的激素水平检测结果，三个图的横坐标均为处理组别，8months为中年对照组，Axitinib-14months为中年小鼠经阿西替尼(Axitinib)处理后六个月组，DMSO-14months为中年小鼠经DMSO处理后六个月组，左图纵坐标为FSH的表达水平，中图纵坐标为E2的表达水平，右图纵坐标为P4的表达水平；
图15所示为阿西替尼(Axitinib)处理后六个月小鼠身体状态检测结果。
具体实施方式
本发明公开了血管内皮生长因子受体抑制药物处理以保护卵巢储备而达到延缓卵巢衰老，并提升雌性生育寿命的的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述处理策略及其相关应用已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述处理策略及其相关应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用血管生长因子受体抑制剂阿西替尼(Axitinib)(辉瑞公司)及舒尼替尼(Sunitinib)，通过体外培养卵泡检测了两种药物对卵泡血管新生的抑制效果。结果显示，血管内皮生长因子受体抑制剂处理可显著的抑制卵泡血管的生长；
上述结果预示着血管内皮生长因子受体相关通路介导了卵泡血管的新生过程，因此进一步的，本发明利用血管特异性内源荧光示踪小鼠，选取阿西替尼并采用腹腔注射的方式，对血管内皮生长因子受体抑制药物对卵巢储备的影响进行了相关的探索。我们的实验结果表明，腹腔注射适量的阿西替尼(Axitinib)，能够在不影响机体固有血管的前提下，显著抑制成年小鼠卵巢中生长卵泡的血管新生。
对小鼠卵巢的组织学分析显示，阿西替尼(Axitinib)处理组小鼠卵巢显著变小且从未发现黄体结构，表明阿西替尼(Axitinib)处理后的雌性小鼠停止排卵。
紧接着我们对小鼠卵巢卵泡进行统计学分析，统计结果表明适度抑制成年小鼠卵巢血管新生能够减少原始卵泡的消耗并保留雌性生殖储备。通过使用卵子特异性追踪小鼠模型，我们能够直接追踪生长卵泡的发育速度。研究表明阿西替尼(Axitinib)处理后的雌性小鼠生长卵泡发育速率显著变慢。
当我们使用中年小鼠开展小鼠临床验证试验时，我们发现阿西替尼(Axitinib)处理后的小鼠在停药后其原始卵泡数量始终显著高于对照组。通过对小鼠的生理指标进行检测我们也清晰的发现，阿西替尼(Axitinib)处理后的小鼠卵巢状态和激素水平都更加趋向年轻化，且小鼠的生殖寿命也得到显著延长。
在本发明具体实施例中，涉及到对比试验，各试验组除了应有的区别外，其余试验环境和原材料等均保持一致。
以下就本发明所提供的血管内皮生长因子受体抑制药物在延缓卵巢衰老，提升雌性生育寿命中的应用做进一步说明。
实施例1：本发明所述血管内皮生长因子受体抑制药物的方案(长时间给药)
有机溶剂DMSO
血管内皮生长因子受体抑制剂：阿西替尼(Axitinib)。
本发明所述试剂可将血管内皮生长因子受体抑制剂阿西替尼(Axitinib)和有机溶剂分别包装，使用时将血管内皮生长因子受体抑制剂阿西替尼(Axitinib)溶解于有机溶剂DMSO中配制浓度为10-30mg/ml的工作液置于-20℃冰箱分装保存，具体应用时采用10mg/ml。
实验操作如下：
1)将实验小鼠分为两组，分别为对照组(也称作DMSO组)和实验组(也称作Axitinib组)，每组各10只2月龄C57BL/6背景的Tek-Cre；mTmG雌性小鼠。
2)将工作试剂从-20℃冰箱中取出并置于37℃水浴中待其充分溶解方可使用；
3)通过腹腔注射的方式进行药物处理，给药剂量为25mg/kg.BW，每两天给药一次，可持续数月；
4)药物处理后，通过阴道抹片法定期检测受试鼠发情周期，当检测结果始终显示处在间情期(图1)则表明药效充分发挥作用。
5)药物处理后，通过定期称量受试鼠体重确定实验小鼠的健康状况。当受试鼠体重保持不变或低速增加则表明受试鼠状态良好(图3)，如果受试鼠体重明显减轻则可适度降低药物剂量。
6)药物处理1个月后，结合组织透明化技术检测卵巢及其他器官(例如肝脏)的血管密度变化情况。通过3D成像技术可以清楚呈现组织血管状态(图2)。统计结果显示受试鼠卵泡血管密度显著降低，肝脏血管密度未发生明显变化(图2)。
7)药物处理1个月后，对卵巢石蜡切片进行H&E染色，可见处理组卵巢显著变小(图4)。统计结果显示处理组小鼠卵巢中生长卵泡的数量显著减少，总卵泡数量显著增加(图5)。
8)药物处理1个月后，对卵巢石蜡切片进行免疫荧光染色，可见处理组卵巢皮质区密布荧光标记的原始卵泡(图6)。统计结果也显示处理组小鼠卵巢中原始卵泡的数量显著高于对照组(图7)。表明经过适量Axitinib处理后，在不影响机体正常血管发育的情况下，能够显著抑制卵巢血管新生，进而减缓雌性哺乳动物卵巢中原始卵泡的消耗，从而保留雌性哺乳动物的生殖储备。
实施例2：本发明所述血管内皮生长因子受体抑制药物的方案(间歇性给药)
有机溶剂DMSO
血管内皮生长因子受体抑制剂：阿西替尼(Axitinib)。
本发明所述试剂可将血管内皮生长因子受体抑制剂阿西替尼(Axitinib)和有机溶剂分别包装，使用时将血管内皮生长因子受体抑制剂阿西替尼(Axitinib)溶解于有机溶剂DMSO中配制浓度为10-30mg/ml的工作液置于-20℃冰箱分装保存，具体应用时采用15mg/ml。
实验操作如下：
1)将实验小鼠分为两组，分别为对照组(也称作DMSO组)和实验组(也称作Axitinib组)，每组各20只7月龄C57BL/6背景的Tek-Cre；mTmG雌性小鼠。
2)将工作试剂从-20℃冰箱中取出并置于37℃水浴中待其充分溶解后方可使用；
3)通过腹腔注射的方式进行药物处理，给药剂量为30mg/kg.BW，隔天药物处理一次，药物处理持续1个月后停药恢复1个月，然后重复上述给药方式，循环操作；
4)药物处理处理后，通过阴道抹片法定期检测受试鼠的发情周期，当检测结果始终显示处在间情期则表明药物处理效果良好(图1)。一旦出现发情周期(生理周期)波动，可适当增加药物处理剂量或者增加药物处理频率。
5)药物处理后，通过定期称量受试鼠体重确定实验小鼠的健康状况。当受试鼠体重保持不变或低速增加则表明受试鼠状态良好(图8)，如果受试鼠体重明显减轻则可适度降低药物剂量。
6)药物处理1个月后，检测卵巢及肝脏的血管密度变化情况。统计结果显示受试鼠卵泡血管密度显著降低，肝脏血管密度未发生明显变化(图2)。
7)药物处理1个月后停药恢复1个月，也就是在小鼠9个月龄时，对卵巢石蜡切片进行免疫荧光染色，可见处理组卵巢皮质区原始卵泡密度高于对照组(图9)。统计结果也显示处理组小鼠卵巢中原始卵泡的数量显著高于对照组(图9)。
8)在药物处理后6个月，即鼠龄14个月时，对实验小鼠卵巢石蜡切片进行免疫荧光染色，可见处理组卵巢皮质区原始卵泡密度高于对照组(图10)。统计结果也显示处理组小鼠卵巢中原始卵泡的数量显著高于对照组(图10)。
9)在药物处理后4个月，即鼠龄12个月时，通过RT-PCR和免疫荧光技术检测卵巢的衰老状态。可见处理组卵巢中Prdx4和Idh1的表达水平显著高于对照组(图11)。免疫荧光及其统计结果也显示处理组小鼠有腔卵泡颗粒细胞中PRDX4的表达水平显著高于对照组(图12)。
10)在药物处理1个月后，对小鼠的生育力进行测定，结果显示对照组小鼠在12个月龄时，全部失去生育能力，而实验组小鼠能够一直生育到14个月。也就是说，延长雌性小鼠生育寿命的20％(图13)。
11)在药物处理后6个月，即鼠龄14个月时，对实验小鼠的血清激素水平进行检测。统计结果显示处理组小鼠血清中FSH水平显著低于对照组，而E2和P4水平显著高于对照组(图14)。表明处理组雌性小鼠的生理状体更加年轻。
12)在生育力测定到6个月时，即鼠龄14个月时，可以观察到实验组小鼠依然具有生育后代和哺乳的能力(图15)。表明经过适度的Axitinib处理能够抑制卵巢活跃的血管新生，进而延长雌性哺乳动物的生育寿命。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.阿西替尼在制备改善卵巢衰老的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善卵巢衰老包括：提高抗衰老相关基因表达水平。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善卵巢衰老包括：减少生长卵泡血管密度、降低卵巢的生长、抑制生长卵泡的消耗、降低原始卵泡消耗、抑制原始卵泡发育和/或提升卵巢总卵泡数量。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善卵巢衰老包括：调节生殖激素水平。
5.阿西替尼在制备改善雌性动物生殖力的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述改善雌性动物生殖力包括延长生育年限和/或增加产仔数量。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions;Yi Feng等;《scientific reports》;第1-13页，尤其是第1页摘要 * |
| The Tyrosine Kinase Inhibitor Sunitinib Affects Ovulation but Not Ovarian Reserve in Mouse: A Preclinical Study;Valerie Bernard等;《PLOS ONE》;第1-12页，尤其是第7页最后一段、第10页第2段 * |
| Valerie Bernard等.The Tyrosine Kinase Inhibitor Sunitinib Affects Ovulation but Not Ovarian Reserve in Mouse: A Preclinical Study.《PLOS ONE》.2016, * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113456630A (zh) | 2021-10-01 |
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