CN113444698A

CN113444698A - 连接酶突变体

Info

Publication number: CN113444698A
Application number: CN202110307117.4A
Authority: CN
Inventors: 小西美和; 梶本祥平; 萩原佑介; 三原康博; 中野祥吾; 本山智晴; 伊藤创平
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2021-03-23
Publication date: 2021-09-28
Also published as: US20210301280A1; US11525132B2; EP3885434A1

Abstract

本发明的课题是提供具有优异性质的连接酶突变体。本发明的解决手段是下述(1)、(2)或(3)的连接酶突变体：(1)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示95%以上的同一性的氨基酸序列且具有核酸的连接活性的连接酶突变体；(2)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列显示90%以上的同一性的氨基酸序列且具有核酸的连接活性的连接酶突变体；或者(3)包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列显示97%以上的同一性的氨基酸序列且具有核酸的连接活性的连接酶突变体。

Description

连接酶突变体

技术领域

本发明涉及连接酶突变体。

背景技术

T4 RNA连接酶2是在ATP的存在下具有核糖核苷酸的连接能力的RNA连接酶(EC6.5.1.3)的一种，是来源于具有对埃希氏菌(Escherichia)的感染能力的T4噬菌体的酶(NP_049790)。T4 RNA连接酶2具有通过形成磷酸二酯键而将核酸的5'末端的磷酸基(供体)连接于3'末端的羟基(受体)的能力。T4 RNA连接酶2被用于具有突出末端的双链RNA的连接、和双链RNA中的切口(nick)的连接等的反应。已知对于T4 RNA连接酶2而言，不仅限于RNA，而且DNA以及除DNA和RNA以外的修饰核酸也可用作底物。此外，还已知T4RNA连接酶2有数种突变体。关于T4RNA连接酶2的现有技术，可参照下述文献。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2008/094599号。

非专利文献

非专利文献1：[在线],互联网,NCBI蛋白数据库(NCBI Protein Database),2018年8月13日,NP_049790,检索日:2020年2月27日,URL,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_049790非专利文献2：Chauleau,M.,&Shuman,S.(2013).Kinetic mechanismof nick sealing by T4 RNA ligase 2and effects of3'-OH base mispairs anddamaged base lesions.RNA,19(12):1840-1847.；

非专利文献3：Nandakumar,J.,Shuman,S.,Lima,C.D.(2006).RNA ligasestructures reveal the basis for RNA specificity and conformational changesthat drive ligation forward.Cell,6；127(1):71-84.；

非专利文献4：Ho,C.K.,&Shuman,S.(2002).Bacteriophage T4 RNA ligase 2(gp24.1)exemplifies a family of RNA ligases found in all phylogeneticdomains.PNAS,1；99(20):12709-14.；

非专利文献5：Nandakumar,J.,Ho,C.K.,Lima,C.D.,Shuman,S.(2004).RNAsubstrate specificity and structure-guided mutational analysis ofbacteriophage T4 RNA ligase 2.J.Biol.Chem.,23；279(30):31337-47.；

非专利文献6：Nandakumar,J.&Shuman,S.(2004).How an RNA ligasediscriminates RNA versus DNAdamage.Mol.Cell.,22；16(2):211-21.；

非专利文献7：Nandakumar,J.&Shuman,S.(2005).Dual mechanisms whereby abroken RNA end assists the catalysis of its repair by T4 RNA ligase2.J.Biol.Chem.,24；280(25):23484-9.；

非专利文献8：Yin,S.,Ho,C.K.,Shuman,S.(2003).Structure-functionanalysis of T4 RNA ligase 2.J.Biol.Chem.,16；278(20):17601-8.；

非专利文献9：Yin,S.,Kiong Ho,C.,Miller,E.S.,Shuman,S.(2004).Characterization of bacteriophage KVP40 and T4 RNA ligase 2.Virology,5；319(1):141-51。

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明的目的是提供具有优异性质的连接酶突变体。

解决技术问题所采用的技术方案

本发明人等进行了认真研究，结果成功地开发出与T4 RNA连接酶2(NP_049790)分别显示93％、87％和95％的氨基酸序列同一性(参照后述的表1)且具有比该T4 RNA连接酶2更优异的性质的3种连接酶突变体Mut1～3(SEQ ID NO:1～3)，从而完成了本发明。在上述现有技术中关于这样的3种连接酶突变体没有启示或教导。

即，本发明如下；

[1]下述(1)、(2)或(3)的连接酶突变体：

(1)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示95％以上的同一性的氨基酸序列且具有核酸的连接活性的连接酶突变体；

(2)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列且具有核酸的连接活性的连接酶突变体；或者

(3)包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列显示97％以上的同一性的氨基酸序列且具有核酸的连接活性的连接酶突变体；

[2]根据[1]的连接酶突变体，其中，核酸是可包含DNA和/或修饰核酸的单链RNA或双链RNA；

[3]一种核酸产物的制造方法，其中，包括在[1]或[2]的连接酶突变体的存在下连接核酸材料而生成核酸产物，

核酸材料选自单链核酸材料、双链核酸材料、及它们的混合物；

[4]根据[3]的方法，其中，核酸材料为RNA；

[5]根据[3]或[4]的方法，其中，核酸材料为4条以上的单链RNA；

[6]根据[3]～[5]中任一项的方法，其中，核酸产物包含长度为12～27个碱基的互补部分；

[7]根据[3]～[6]中任一项的方法，其中，核酸材料包含DNA和/或修饰核酸；

[8]根据[3]～[7]中任一项的方法，其中，核酸材料的浓度为1μM以上；

[9]根据[3]～[8]中任一项的方法，其中，核酸产物为siRNA；

[10]一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码[1]或[2]的连接酶突变体；

[11]一种表达载体，其中，所述表达载体包含[10]的多核苷酸；

[12]一种转化微生物，其中，包含表达单元，

所述表达单元包含：编码[1]或[2]的连接酶突变体的多核苷酸、以及与其可操作地连接的启动子；

[13]一种连接酶突变体的制造方法，其中，包括使用[12]的转化微生物生成[1]或[2]的连接酶突变体。

发明的效果

根据本发明，可有效地由核酸材料制造核酸产物(例如，siRNA或异源双链核酸等修饰核酸)。

附图的简单说明

图1是表示本发明的连接酶突变体(Mut1～3)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1～3)的图；

图2是表示通过4个片段的单链寡核苷酸的连接反应生成的双链寡核苷酸的图。修饰核苷酸残基的表示法与表2中相同；

图3是表示(A)通过4个片段的单链寡核苷酸的连接反应生成的双链寡核苷酸、和(B)该双链寡核苷酸的生成的时间过程的图。修饰核苷酸残基的表示法与表4中相同；

图4是表示(A)通过3个片段的单链寡核苷酸的连接反应生成的双链寡核苷酸、和(B)该双链寡核苷酸的量(反应时间15分钟)的图。将从连接点起处于-2位、-1位、+1位、+2位的核苷酸残基的2'位被氟原子(F)、O-甲基(Ome)、O-甲氧基乙基(MOE)修饰、或被取代为氢原子(DNA)的寡核苷酸用作底物。

具体实施方式

1.连接酶突变体

本发明提供下述(1)、(2)或(3)的连接酶突变体：

(3)包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列显示97％以上的同一性的氨基酸序列且具有核酸的连接活性的连接酶突变体。

SEQ ID NO:1的氨基酸序列与公知的T4 RNA连接酶2(NP_049790)的氨基酸序列显示93％的同一性。(1)的连接酶突变体被鉴定为与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示95％以上的同一性的氨基酸序列，因此相对于公知的T4 RNA连接酶2而言有足够的差别。(1)的连接酶突变体中与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的同一性％的程度可较好是96％以上，更好是97％以上，进一步更好是98％以上，最好是99％以上。

SEQ ID NO:2的氨基酸序列与公知的T4 RNA连接酶2(NP_049790)的氨基酸序列显示87％的同一性。(2)的连接酶突变体被鉴定为与SEQ ID NO:2的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列，因此相对于公知的T4 RNA连接酶2而言有足够的差别。(2)的连接酶突变体中与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的同一性％的程度可较好是91％以上，更好是92％以上，进一步更好是93％以上，最好是94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。

SEQ ID NO:3的氨基酸序列与公知的T4 RNA连接酶2(NP_049790)的氨基酸序列显示95％的同一性。(3)的连接酶突变体被鉴定为与SEQ ID NO:3的氨基酸序列显示97％以上的同一性的氨基酸序列，因此相对于公知的T4 RNA连接酶2而言有足够的差别。(3)的连接酶突变体中与SEQ ID NO:3的氨基酸序列的同一性％的程度可较好是97.5％以上，更好是98％以上，进一步更好是98.5％以上，最好是99％以上或99.5％以上。

氨基酸序列的同一性％的计算可采用如下数值来进行：使用株式会社GENETYX的软件GENETYX Ver13.1.1，采用ORF所编码的多肽部分全长，进行Muscle比对或ClustalW比对或多序列比对后，以考虑到空位(Gaps are take into account)的设定计算时所得的数值。关于SEQ ID NO:1(全长332个氨基酸残基)、SEQ ID NO:2(全长330个氨基酸残基)、和SEQ ID NO:3(全长332个氨基酸残基)中可实现如上所述的同一性％的氨基酸残基的修饰(例如，取代、缺失、添加或插入、或者它们的组合)的个数，对于90％以上而言可以为1～33个，对于91％以上而言可以为1～29个，对于92％以上而言可以为1～26个，对于93％以上而言可以为1～23个，对于94％以上而言可以为1～19个，对于95％以上而言可以为1～16个，对于96％以上而言可以为1～13个，对于97％以上而言可以为1～9个，对于98％以上而言可以为1～6个，对于99％以上而言可以为1～3个。

本发明的连接酶突变体具有核酸的连接活性。作为核酸，可举出例如单链核酸和双链核酸。作为核酸，还可举出例如RNA、DNA、除RNA和DNA以外的修饰核酸、以及它们的混合型的核酸。优选地，核酸可以是可包含DNA和/或修饰核酸的单链RNA或双链RNA。核酸的详细情况与后述的核酸产物的制造方法中的核酸材料相同。

本发明的连接酶突变体所具有的核酸的连接活性，只要比T4 RNA连接酶2(NP_049790)更优异则无特别限定，可具有与T4 RNA连接酶2相比较好是1.2倍以上、更好是1.5倍以上、进一步更好是1.8倍以上、特别好是2.0倍以上的核酸的连接活性。这样的核酸的连接活性可通过如实施例记载的规定的反应来进行测定。例如，这样的反应可通过下述a)～c)的步骤来进行(参照例如实施例2)：

a)制备20μL反应液，该反应液包含以最终浓度计为10μM的核酸材料(例如，单链RNA)、50mM Tris-HCl(pH7.5)、2mM MgCl₂、1mM二硫苏糖醇、0.4mMATP；

b)向该反应液中添加含纯化连接酶突变体的溶液50μL使得最终浓度成为0.36μg/mL而开始反应；

c)在25℃反应1小时。

本发明的连接酶突变体还可具有优异的温度稳定性。例如，包含本发明的氨基酸序列的连接酶突变体，在进行热处理并于其后进行活性测定的情况下，以无热处理的条件下测定的活性为基准，较好是具有30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上的残余活性。这样的条件可以是如下的条件：进行25℃下23小时的保温、或37℃下4小时的保温(例如，在包含54mM Tris-HCl(pH7.5)、2.2mM MgCl₂、1.1mM二硫苏糖醇、0.43mM ATP和0.78μg/mL酶的溶液中的保温)、以及其后的活性测定。活性测定可以在上述段落中的a)～c)的条件下进行。或者，活性测定可以是在25℃或37℃下15分钟的反应中测定活性的条件。在这样的条件下所使用的反应液组成可以是例如10μM寡核苷酸、50mM Tris-HCl(pH7.5)、2mM MgCl₂、1mM二硫苏糖醇、0.4mM ATP和0.72μg/mL酶。酶的温度稳定性与液态稳定性和/或长期保存稳定性一般可具相关性，所以具有优异的温度稳定性的本发明的连接酶突变体可认为液态稳定性和/或长期保存稳定性优异。因此，本发明的连接酶突变体可用作试剂。

本发明的连接酶突变体可在维持所期望的同一性％和连接活性的范围内具有1个以上的氨基酸残基的突变。可引入突变的氨基酸残基的位置对于本领域技术人员是显而易见的。例如，本领域技术人员因以下方式而能够识别结构和功能的相关性：1)比较具有同种特性的多种蛋白质的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1～3)，2)明确相对保守的区域和相对不保守的区域，接着3)由相对保守的区域和相对不保守的区域可分别预测能发挥对于功能重要的作用的区域和不能发挥对于功能重要的作用的区域。因此，本领域技术人员能够鉴定本发明的连接酶突变体的氨基酸序列中可引入突变的氨基酸残基的位置。这样的位置中的突变后的氨基酸残基为与突变前的氨基酸残基不同的所期望的天然α-氨基酸残基。作为这样的所期望的天然α-氨基酸残基为L-丙氨酸(A)、L-天冬酰胺(N)、L-半胱氨酸(C)、L-谷氨酰胺(Q)、L-异亮氨酸(I)、L-亮氨酸(L)、L-蛋氨酸(M)、L-苯丙氨酸(F)、L-脯氨酸(P)、L-丝氨酸(S)、L-苏氨酸(T)、L-色氨酸(W)、L-酪氨酸(Y)、L-缬氨酸(V)、L-天冬氨酸(D)、L-谷氨酸(E)、L-精氨酸(R)、L-组氨酸(H)、L-赖氨酸(K)、或甘氨酸(G)的残基。例如，在与SEQ IDNO:1的氨基酸序列显示95％以上的同一性的氨基酸序列中，可向SEQ ID NO:1的氨基酸序列中引入1～16个氨基酸残基的突变。在与SEQ ID NO:2的氨基酸序列显示90％以上的同一性的氨基酸序列中，可向SEQ ID NO:2的氨基酸序列中引入1～33个氨基酸残基的突变。在与SEQ ID NO:3的氨基酸序列显示97％以上的同一性的氨基酸序列中，可向SEQ ID NO:3的氨基酸序列中引入1～9个氨基酸残基的突变。氨基酸残基的突变选自氨基酸残基的取代、缺失、添加及插入。

氨基酸残基通过取代突变的情况下，氨基酸残基的取代可以是保守性取代。在本说明书中使用的情况下，术语“保守性取代”是指将规定的氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基进行取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在该领域中是周知的。例如，作为这样的家族，可举出：具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有非电荷性(不带电荷)极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β位支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)、具有含羟基(例如醇式、酚式)侧链的氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、及具有含硫侧链的氨基酸(例如半胱氨酸、蛋氨酸)。较好的是，氨基酸的保守性取代可以是：天冬氨酸和谷氨酸之间的取代；精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的取代；色氨酸和苯丙氨酸之间的取代；苯丙氨酸和缬氨酸之间的取代；亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸之间的取代；以及甘氨酸与丙氨酸之间的取代。

本发明的连接酶突变体还可在C末端或N末端包含其他肽成分(例如，标签部分)。作为本发明的连接酶突变体中可包含的其他肽成分，可举出例如：使目标蛋白(targetprotein)的纯化容易的肽成分(例如，组氨酸标签、Strep-tag II等标签部分；谷胱甘肽S-转移酶、麦芽糖结合蛋白等广泛用于目标蛋白的纯化的蛋白质)、使目标蛋白的可溶性提高的肽成分(例如，Nus-tag)、发挥伴侣(chaperone)的作用的肽成分(例如，触发因子)、具有其他功能的蛋白质或蛋白质的结构域或作为将它们与连接酶突变体连接的接头的肽成分。

2.可与本发明的连接酶突变体的制造相关的发明

本发明的连接酶突变体可使用包含表达单元的转化微生物、或使用无细胞体系等来制备，所述表达单元包含编码本发明的连接酶突变体的多核苷酸、以及与其可操作地连接的启动子。本发明还提供这样的多核苷酸及转化微生物、以及可用于转化子的制作的表达载体。

本发明的多核苷酸是编码本发明的连接酶突变体的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA，较好是DNA。

本发明的转化微生物可通过例如使用包含本发明的多核苷酸的表达载体的方法(例如，感受态细胞法、电穿孔法)、或基因组编辑技术来制作。当表达载体是与宿主细胞的基因组DNA发生同源重组的整合型(integrative)载体的情况下，表达单元可通过转化而整合到宿主细胞的基因组DNA。另一方面，当表达载体是不与宿主细胞的基因组DNA发生同源重组的非整合型载体的情况下，表达单元不会通过转化整合到宿主细胞的基因组DNA，并且在宿主细胞内可保持表达载体的状态、独立于基因组DNA而存在。或者，根据基因组编辑技术(例如，CRISPR/Cas系统、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN))，可将表达单元整合到宿主细胞的基因组DNA，并且能够编辑宿主细胞固有具备的表达单元。

本发明还提供包含本发明的多核苷酸的表达载体。本发明的表达载体进而可包含：在宿主细胞中起作用的终止子、核糖体结合部位、和耐药性基因等元件。作为耐药性基因，可举出例如：对四环素、氨苄西林、卡那霉素、潮霉素、草铵膦等药物具有耐药性的基因。

关于表达载体，还可以进而包含能够实现与宿主细胞的基因组的同源重组的区域，以用于与宿主细胞的基因组DNA的同源重组。例如，表达载体可设计成其所含的表达单元位于一对同源区域(例如，与宿主细胞的基因组中的特定序列为同源的同源臂、loxP、FRT)之间。作为要引入表达单元的宿主细胞的基因组区域(同源区域的靶标)，无特别限定，可以是在宿主细胞中大量表达的基因的基因座。

表达载体可以是质粒、病毒载体、噬菌体、或人工染色体。表达载体还可以是整合型(integrative)载体或非整合型载体。整合型载体可以是其整体整合入宿主细胞的基因组中的类型的载体。或者，整合型载体也可以是仅其一部分(例如，表达单元)整合入宿主细胞的基因组中的类型的载体。表达载体还可以是DNA载体或RNA载体(例如，逆转录病毒)。表达载体还可以是广泛使用的表达载体。作为这样的表达载体，可举出例如：pUC(例如，pUC19、pUC18)、pSTV、pBR(例如，pBR322)、pHSG(例如，pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398)、RSF(例如，RSF1010)、pACYC(例如，pACYC177、pACYC184)、pMW(例如，pMW119、pMW118、pMW219、pMW218)、pQE(例如，pQE30)、及其衍生物。

作为用于表达本发明的连接酶突变体的宿主，可使用例如：以大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属细菌、棒状杆菌属细菌[例如，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)]、和芽孢杆菌属细菌[例如，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)]为代表的各种原核细胞；以酵母菌属细菌[例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)]、毕赤酵母菌属细菌[例如，树干毕赤酵母(Pichia stipitis)]、曲霉菌属细菌[例如，米曲霉(Aspergillus oryzae)]为代表的各种真核细胞。作为宿主，可使用缺失规定基因的株。作为转化微生物，可举出例如在细胞质中保有表达载体的转化微生物、和在基因组上引入有目的基因(靶基因)的转化微生物。

本发明的转化微生物可使用规定的培养装置(例如，试管、烧瓶、发酵罐)在具有例如后述的组成的培养基中进行培养。培养条件可适当设定。具体来说，培养温度可以为10℃～37℃，pH可以为6.5～7.5，培养时间可以为1h～100h。此外，可在管理溶解氧浓度的同时进行培养。该情况下，有时使用培养液中的溶解氧浓度(DO值)作为控制的指标。可对通气、搅拌条件进行控制，使得将大气中的氧浓度设为21％时的相对溶解氧浓度DO值例如不低于1～10％、较好是3％～8％。此外，培养可以是分批培养，也可以是补料分批培养。补料分批培养的情况下，也可将成为糖源的溶液或含磷酸的溶液连续或不连续地逐次添加于培养液，持续进行培养。

所转化的宿主如上所述，若对大肠杆菌进行具体说明，可选自大肠杆菌K12株亚种的大肠杆菌JM109株、DH5α株、HB101株、BL21(DE3)株等。进行转化的方法和选择转化微生物的方法在《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第三版、冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harborpress)(2001/01/15)等中也有记载。以下，将制作转化的大肠杆菌并使用其制造规定的酶的方法作为一例进行更具体的说明。

作为表达本发明的多核苷酸的启动子，可使用通常用于大肠杆菌(E.coli)中的异源蛋白质生产的启动子，可举出例如：PhoA、PhoC、T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子、PL启动子、T5启动子等强力的启动子，较好是PhoA、PhoC、lac。此外，作为载体，可使用例如：pUC(例如，pUC19、pUC18)、pSTV、pBR(例如，pBR322)、pHSG(例如，pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398)、RSF(例如，RSF1010)、pACYC(例如，pACYC177、pACYC184)、pMW(例如，pMW119、pMW118、pMW219、pMW218)、pQE(例如，pQE30)、及其衍生物等。作为其他载体，可使用噬菌体DNA的载体。另外，还可使用包含启动子且能够表达插入DNA序列的表达载体。优选地，载体可以是pUC、pSTV、pMW。

此外，可在本发明的多核苷酸的下游连接作为转录终止序列的终止子。作为这样的终止子，可举出例如T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因的终止子、大肠杆菌trpA基因的终止子。

作为用于将本发明的多核苷酸引入大肠杆菌的载体，较好是所谓的多拷贝型的载体，可举出具有来源于ColE1的复制起点的质粒、例如pUC系的质粒或pBR322系的质粒或者其衍生物。在此，“衍生物”是指通过碱基的取代、缺失、插入和/或添加等对质粒进行修饰而得的衍生物。

此外，为了筛选转化微生物，较好是载体具有氨苄西林抗性基因等标记物。作为这样的质粒，市场上销售有具有强力的启动子的表达载体[例如，pUC系(Takara Bio株式会社制)、pPROK系(Clontech制)、pKK233-2(Clontech制)]。

使用所得的本发明的表达载体转化大肠杆菌，对该大肠杆菌进行培养，从而可获得本发明的连接酶突变体。

作为培养基，可使用M9-酪蛋白氨基酸培养基、LB培养基等通常用于培养大肠杆菌的培养基。培养基可含有规定的碳源、氮源、辅酶(例如，盐酸吡哆醇)。具体来说，可使用蛋白胨、酵母提取物、NaCl、葡萄糖、MgSO₄、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸铁、硫酸锰等。此外，培养条件、生产诱导条件根据使用的载体的标记物、启动子、宿主菌等的种类适当选择。

回收本发明的连接酶突变体有以下的方法等。关于本发明的连接酶突变体，可在回收本发明的转化微生物后，将菌体破碎(例如，超声波处理、均质化)或溶解(例如，溶菌酶处理)，从而作为破碎物和溶解物而获得。将这样的破碎物和溶解物供于提取、沉淀、过滤、柱层析等手段，从而可获得本发明的连接酶突变体。

3.核酸产物的制造方法

本发明还提供核酸产物的制造方法，其中，包括在本发明的连接酶突变体的存在下连接核酸材料而生成核酸产物。作为核酸材料，可使用选自单链核酸材料、双链核酸材料、及它们的混合物中的材料。

(核酸)

核酸材料和核酸产物中的核酸可分类为天然核酸和修饰核酸。天然核酸是指由构成细胞所含的多核苷酸的核苷酸残基(腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)、脱氧腺苷(dA)、脱氧鸟苷(dG)、脱氧胞苷(dC)、胸苷(dT)。以下称为“天然核苷酸残基”)构成的核酸(RNA和DNA)。修饰核酸是指除天然核酸以外的核酸，是包含除天然核苷酸残基以外的核苷酸残基(以下称为“修饰残基”)的核酸。作为修饰残基，可举出例如修饰核苷酸残基、氨基酸残基、接头。作为修饰核苷酸残基，可举出例如包含后述的修饰的核苷酸残基。氨基酸中包括氨基酸的衍生物。作为氨基酸，可举出例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、及它们的衍生物。氨基酸的衍生物是指氨基酸中的任意的原子或基团被其他的原子或基团取代而得的氨基酸，可举出例如：氨基酸中的氢原子、羧基中的氢原子、氧原子、羟基、侧链中的任意的原子或基团、或者结合于骨架碳原子(例如，α-、β-、γ-、δ-碳原子)的氢原子被其他的原子(例如，氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等卤素原子)或基团(例如，后述的化学修饰中的取代后的取代基)取代而得的氨基酸。

修饰核苷酸残基中的修饰包括：核苷酸残基的糖部分(核糖或脱氧核糖)的原子或基团的取代、核苷酸残基的糖部分本身(糖骨架)的取代、以及核苷酸残基的核酸碱基部分的修饰(例如，核酸碱基部分的取代基的取代)。

作为核苷酸残基的糖部分的原子或基团的取代，可举出例如1'-H、2'-OH(仅核糖)、2'-H、3'-OH、3'-NH₂、3'-H、3'-磷酸基、4'-H、5'-磷酸基、或它们的组合的取代。在此，磷酸基不仅包括-O-P(O)(OH)₂，还包括氧原子替换为硫原子或NH的基团，例如，-O-P(S)(OH)₂、-NH-P(O)(OH)₂、-NH-P(S)(OH)₂。此外，磷酸基中的羟基(-OH)被取代为OR^*的基团(例如被保护的磷酸基)也包括在磷酸基内，式中，R^*表示磷酸基的保护基等有机基团。作为这样的取代，可举出例如：1'、2'、3'或4'-化学修饰(在1'、2'、3'或4'部位取代为其他取代基)、5'-或3'-磷酸基修饰(5'-或3'-磷酸基取代为其他取代基)、桥连修饰(1'、2'、3'或4'部位的2个彼此桥连的取代)、和载体(carrier)添加修饰(在1'、2'、3'、4'或5'部位取代为载体)。

例如可以引入化学修饰以使寡核苷酸的耐分解性提高。作为化学修饰中的取代后的取代基，可举出例如：C_1～6烷基氧基C_1～6亚烷基(例如，甲氧基乙基：MOE)、-O-C_1～6烷基(例如，-O-Me)、-O-C_6～14芳基(例如，-O-苯基)、-C-芳基(例如，-C-苯基)、卤素原子(例如，氟原子)、-O-C_1～6烷基N-酰胺C_1～6亚烷基(例如，-O-N-甲基乙酰胺、-O-NMA)、-O-C_1～6烷基-(C_1～6烷基-)氨基-C_1～6亚烷基(例如，-O-二甲基氨基乙氧基乙基、-O-DMAEOE)、和-O-氨基C_1～6烷基(例如，-O-氨基丙基、-O-AP)。化学修饰较好是2'-化学修饰(2'部位的取代)、3'-化学修饰(3'部位的取代)，其中，更好是2'-化学修饰(2'部位的取代)。作为2'-化学修饰中的取代后的取代基，可举出例如：2'-C_1～6烷基氧基C_1～6亚烷基(例如，2'-甲氧基乙基)、2'-O-C_1～6烷基(例如，2'-O-Me)、2'-O-C_6～14芳基(例如，2'-O-苯基)、2'-C-芳基(例如，2'-C-苯基)、2'-卤素原子(例如，2'-F)、2'-O-C_1～6烷基N-酰胺C_1～6亚烷基(例如，2'-O-N-甲基乙酰胺、2'-O-NMA)、2'-O-C_1～6烷基-(C_1～6烷基-)氨基-C_1～6亚烷基(例如，2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基、2'-O-DMAEOE)、和2'-O-氨基C_1～6烷基(例如，2'-O-氨基丙基、2'-O-AP)。作为3'-化学修饰中的取代后的取代基，可举出例如3'-O-P(O)(OH)₂、3'-O-P(S)(OH)₂、3'-NH-P(O)(OH)₂、3'-NH-P(S)(OH)₂、和磷酸基中的羟基(-OH)被取代为OR^*的基团，式中，R^*表示后述的磷酸基的保护基等有机基团。

例如可引入5'-或3'-磷酸基修饰以使寡核苷酸的耐分解性提高。作为5'-或3'-磷酸基修饰，可举出例如由磷酸基(-O-P(O)(OH)₂)向在磷酸基中将氧原子替换为硫原子或NH而成的基团的取代。作为这样的基团，可举出例如：-O-P(S)(OH)₂(硫代磷酸基:硫代磷酸酯修饰)、-NH-P(O)(OH)₂、-NH-P(S)(OH)₂。此外，5'-或3'-磷酸基修饰中也包括磷酸基中的羟基(-OH)取代为OR^*的基团(例如被保护的磷酸基)，式中，R^*表示磷酸基的保护基等有机基团。作为磷酸基的保护基，可举出例如三苯甲基(Tr)、对甲氧基苯基二苯基甲基(MMTr)、二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)、氰基乙基(CN-C₂H₄-)。

例如可引入桥连修饰(bridging modification)以使核苷酸残基的立体结构稳定性提高。作为桥连修饰，可举出例如：2'4'-桥连修饰(将2'-OH与4'-H桥连的取代)、3'5'-桥连修饰(将3'-H与5'-H桥连的取代)等。作为2'4'-桥连修饰，可举出例如：2'-OH与4'-H取代为2'-O-C_1～6亚烷基-4'(例如，2'-O-亚甲基-4'(锁核酸:LNA)、2'-O-亚乙基-4'(亚乙基桥连核酸(ethylene-bridged nucleic acid):ENA)、取代为2'-O-甲基取代亚甲基-4'(约束的乙基桥连化核酸(constrained ethyl bridged nucleic acid):BNA的一种(cEt-BNA))、2'-OH与4'-H取代为2'-O-C_1～6亚烷基-O-C_1～6亚烷基-4'(例如，2'-O-亚甲基-O-亚甲基-4'(桥连化核酸:BNA的一种(BNA^COC))、2'-OH与4'-H取代为2'-O-N(R)-C_1～6亚烷基-4'(例如，2'-O-N(R)-亚甲基-4'(桥连化核酸:BNA的一种(BNA^NC)，在此，R表示甲基、氢原子或苄基)、2'-NH₂与4'-H取代为2'-N(R)-C(O)-4'(例如，2'-N(甲基)-C(O)-4'(酰胺桥连核酸:AmNA))、2'-NH₂与4'-H取代为2'-NH-C_1～6亚烷基-4'(例如，2'-NH-亚甲基-4')、2'-H与4'-H取代为2'-C_1～6亚烷基-4'(例如，2'-甲基取代亚乙基-4')。此外，作为3'5'-桥连修饰，可举出例如：3'-H与5'-H取代为3'-C_1～6亚烷基-5'(例如，3'-亚乙基-5'(双环核酸:Bc核酸)，Bc核酸的一种:tc核酸等))。

载体添加修饰中的载体可以是用于对目标的修饰寡核苷酸提高或赋予稳定性、靶向性、药效等性能的载体。这样的载体可根据使用目的从公知的载体中适当选择。作为载体，可举出例如：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、肽、磷酸、胆固醇、生育酚、脂肪链、叶酸。载体添加修饰中的添加部位较好是：相当于目标的修饰寡核苷酸的末端的3'或5'位(部位)。

作为包含核苷酸残基的糖部分本身的取代的核苷酸残基，可举出例如：包含由五元环的糖向六元环的拟糖(pseudo-sugar)的取代的修饰核苷酸残基。作为这样的修饰核苷酸残基，可举出例如己糖醇核酸(HNA)、环己烯基核酸(CeNA)。此外，作为包含核苷酸残基的糖部分本身的取代的核苷酸残基，还可举出作为具有不被生物体内的酶(例如，RNase等核酸酶)分解且不诱导免疫应答的吗啉环结构的核苷酸类似人工化合物的吗啉代核酸(morpholino nucleic acid)(PMO)残基。

作为核苷酸残基的核酸碱基部分的修饰，可举出例如核苷酸残基的核酸碱基部分进行了烷基取代(例如，在胞嘧啶基的5位取代为甲基)。

(核酸材料)

核酸材料可以为单一，也可以为多种。例如，作为单一的核酸材料使用具有突出末端的双链核酸的情况下，本发明的方法可用于该双链核酸的环化。使用多种核酸材料的情况下，本发明的方法可用于如下的连接：具有突出末端的多种双链核酸的连接、具有突出末端的单一或多种双链核酸与单一或多种单链核酸的连接、多种单链核酸的连接等。作为使用多种核酸材料的情况下的核酸材料的条数，只要是2条以上则无特别限定，可以是例如2～10条、2～8条、3～7条、4～6条等较少的条数，但也可以是超过10条的条数。

核酸材料的长度无特别限定。例如，可使用长度超过1000个碱基的较长的核酸材料。或者，在希望制造较短的核酸产物的情况下，可使用较短的核酸材料。对于较短的核酸材料而言，例如可以是长度为5个碱基以上，较好是长度为6个碱基以上，更好是长度为7个碱基以上，进一步更好是长度为8个碱基以上，特别好是长度为9个碱基以上。此外，对于较短的核酸材料而言，还可以是长度为19个碱基以下，较好是长度为18个碱基以下，更好是长度为17个碱基以下，进一步更好是长度为16个碱基以下，特别好是长度为15个碱基以下。

连接中可利用突出末端。作为连接中所利用的突出末端，可举出例如：具有突出末端的双链核酸(核酸材料)中的突出末端、以及由核酸材料间(例如，双链核酸与单链核酸之间、或单链核酸间)的退火(复性)而形成的突出末端。突出末端的长度无特别限定，在希望制造较短的核酸产物的情况下，对于突出末端而言，例如可以是长度为1～10个碱基，较好是长度为1～8个碱基，更好是长度为1～6个碱基，进一步更好是长度为2～6个碱基、长度为3～6个碱基或长度为4～6个碱基。因此，作为核酸材料，可选择这样的具有突出末端的双链核酸、或者多种核酸材料的组合(例如，双链核酸与单链核酸的组合、多种单链核酸的组合)。

核酸材料可以是游离的形态，也可以固定于固相。此外，在希望将核酸产物与功能性部分形成复合物的情况下，核酸材料可在其对应部分与功能性部分形成复合物。

核酸材料可通过化学合成法(例如，固相合成法、液相合成法)或酶促合成法来制造。作为这样的合成法，可举出例如国际公开第2012/157723号、国际公开第2005/070859号中记载的方法。

优选地，核酸材料可以是可包含DNA和/或修饰核酸的单链RNA或双链RNA。更优选地，这样的核酸材料可以是如上所述的具有突出末端的双链RNA、或者如上所述的由退火形成突出末端那样的多种RNA材料的组合(例如，双链RNA与单链RNA的组合、多种单链RNA的组合)。

(核酸产物)

核酸产物包含碱基配对的互补部分。作为这样的核酸产物，可举出例如双链核酸、包含双链样结构(double-stranded-like structure)部分的单链核酸(例如，发夹型核酸、哑铃型核酸等环状核酸)。双链核酸可以是各链为上述核酸的双链核酸，可举出例如：双链RNA、双链DNA、由RNA和DNA形成的异源双链核酸、由RNA和RNA-DNA杂交核酸形成的双链核酸、由DNA和RNA-DNA杂交核酸形成的双链核酸、以及由RNA-DNA杂交核酸相互形成的双链核酸。作为双链核酸，可举出例如siRNA和异源双链核酸。

特定的实施方式中，核酸产物可在互补部分包含上述的修饰残基。作为这样的核酸产物，可举出例如：包含修饰型核苷酸残基的双链核酸或环状核酸(例如，在互补部分包含修饰型核苷酸残基的双链核酸或环状核酸)、在环状部分包含修饰型核苷酸残基或除核苷酸残基以外的残基(例如，氨基酸残基、接头等)的环状核酸(例如，国际公开第2012/005368号)。这样的核酸产物中，可以是一部分核苷酸残基为修饰型核苷酸残基，也可以是全部核苷酸残基为修饰型核苷酸残基，在修饰核苷酸残基为吗啉代核酸(PMO)残基的情况下，目标的修饰核酸中，较好是一部分核苷酸残基为吗啉代核酸(PMO)残基。此外，这样的核酸产物中包括：作为在其序列两端具有修饰型核苷酸残基且在其序列中央部具有接受RNase的识别的间隙(gap)区域的核酸的间隙体(gapmer)，进而所述核酸产物中还包括：作为在其序列中混杂有修饰型核苷酸残基的核酸的混合体(mixmer)、作为其序列中的全部核苷酸残基为修饰型核苷酸残基的核酸的全修饰型核酸等的不诱导RNase活性的核酸。

核酸产物可以是仅由碱基配对的互补部分形成的核酸，也可以是除包含互补部分之外还包含碱基未配对的非互补部分的核酸。互补部分和/或非互补部分的长度无特别限定，互补部分和/或非互补部分可以较短。例如，较短的互补部分可以是长度为11～27个碱基、长度为12～27个碱基、长度为15～27个碱基、或者长度为18～27个碱基。例如，较短的非互补部分可以是长度为1～16个碱基、长度为1～10个碱基、长度为1～5个碱基、或者长度为1、2或3个碱基。核酸产物除具有互补部分之外还具有非互补部分的情况下，互补部分可以是连续形态，也可以是被非互补部分隔断的非连续形态。核酸产物的长度无特别限定，核酸产物可以较短。较短的核酸产物例如可以是长度为20～80个碱基、或者长度为24～74个碱基。

优选地，核酸产物可以是可包含DNA和/或修饰核酸的单链RNA或双链RNA。更优选地，这样的核酸产物可在互补部分包含如上所述的修饰残基。

(用于连接的反应条件)

作为反应体系，可使用水溶液。作为水溶液，较好是缓冲液。作为缓冲液，可举出例如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液。pH例如可以为约5～9。例如，在特别希望有效地大量生产目标的核酸产物的情况下，pH可以为7.5～9.0(例如，8.0～8.5)。

连接反应中的各核酸材料的浓度只要是核酸材料溶解且足以生成目标的核酸产物的浓度即可。各核酸材料的浓度例如可以为1μM以上、10μM以上、50μM以上、100μM以上、300μM以上、500μM以上或1000μM以上。此外，各核酸材料的浓度例如可以为1M、100mM或10mM以下。在特别希望有效地大量生产目标的核酸产物的情况下，上述浓度中，较好是以100μM以上的浓度使用各核酸材料。

在连接反应中使用多种核酸材料的情况下，从通过减少未反应的核酸材料量而使制造效率提高的观点来看，所有核酸材料的摩尔数较好是大致等量。为了使所有核酸材料的摩尔数大致等量，选自多种核酸材料的任意2个核酸材料的总摩尔比例如可以在0.5～2、较好是1/1.8～1.8、更好是1/1.5～1.5、进一步更好是1/1.2～1.2、特别好是1/1.1～1.1的范围内。

连接反应中的本发明的连接酶突变体的浓度只要是足以生成目标的核酸产物的浓度即可。连接酶突变体的浓度例如可以为0.01U/μL以上，较好是0.02U/μL以上，更好是0.03U/μL以上，进一步更好是0.04U/μL以上。此外，连接酶突变体的浓度例如可以为1U/μL以下，较好是0.5U/μL以下，更好是0.2U/μL以下，进一步更好是0.1U/μL以下。在此，将1单位(U)定义为在实施例2记载的反应中在1小时生成1μmol的核酸产物所需的酶量。

反应体系可包含辅因子。作为辅因子，可举出例如ATP、二价金属盐(例如，氯化镁等镁盐)。反应体系可包含连接酶的稳定剂。作为连接酶的稳定剂，可举出例如抗氧化剂(例如，二硫苏糖醇、巯基乙醇等还原剂)。为了保持酶的稳定和提高反应速度等目的，反应体系可包含表面活性剂。作为表面活性剂，可举出例如非离子性表面活性剂(例如，Triton X-100等Triton系列的表面活性剂)、以及离子性表面活性剂。作为离子性表面活性剂，可举出例如阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、两性表面活性剂(两性离子表面活性剂)。此外，为了提高反应速度等目的，反应体系可包含聚乙二醇。

反应体系可包含低浓度的一价阳离子盐，或实质上不含一价阳离子盐。反应体系包含一价阳离子盐的情况下，反应体系中的一价阳离子盐的浓度例如可以为10mM以下，较好是1mM以下，更好是0.1mM以下，进一步更好是0.01mM以下。特别优选地，反应体系可实质上不含一价阳离子盐。作为一价阳离子盐，可举出例如锂离子、钠离子、钾离子、铷离子、铯离子、铵离子等一价阳离子与氟离子、氯离子、溴离子、碘离子等阴离子的盐。

反应温度只要是足以使本发明的连接酶突变体活化的温度即可。这样的温度例如可以为2～50℃，较好是16～50℃，更好是25～50℃。

反应时间只要是足以生成目标的核酸产物的时间即可。这样的时间例如可以为1～72小时。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于这些实施例。

[实施例1]RNA连接酶的设计及制备

1)RNA连接酶的设计

将功能已知的T4 RNA连接酶2(NP_049790.1)作为模板，由Blastp获得了425个相似序列。应予说明，作为Blastp的分析条件，将Max target sequences(最大目标序列)设定为10000、将Expected threshold(期望阈值)的值设定为1.0E^-6。分析获得的相似序列，去除重复的序列和序列长度明显与模板不同的序列，从而筛选至172个序列。将其作为序列文库(sequence library)。然后，通过适用文献1(Nakano,S.,Motoyama,T.,Miyashita,Y.,Ishizuka,Y.,Matsuo,N.,Tokiwa,H.,Shinoda,S.,Asano,Y.,and Ito,S.(2018)BenchmarkAnalysis of Native and Artificial NAD+-Dependent Enzymes Generated by aSequence-Based Design Method with or without Phylogenetic Data,Biochemistry57,3722-3732.)和文献2(Nakano,S.,Niwa,M.,Asano,Y.,and Ito,S.(2019)Followingthe Evolutionary Track of a Highly Specific l-Arginine Oxidase byReconstruction and Biochemical Analysis of Ancestral and Native Enzymes,ApplEnviron Microbiol 85，e00459-00419.)中采用的方法，从而鉴定了T4 RNA连接酶2的模体样序列(motif-like sequence)(32位为Ala，116位为Phe，170位为Ser，274位为Ile)。序列文库中，仅筛选这些具有模体样序列的序列，最终获得了21个序列的数据。使用21个序列进行人工设计，设计了被命名为Mut1、Mut2和Mut3的以SEQ ID NO：1～3的氨基酸序列表示的人工RNA连接酶序列(图1)。

[表1]

表1.与T4 RNA连接酶2(NP_049790)的氨基酸序列同一性(％)

	同一性(％)
		Mut1(SEQ ID NO：1)	93
Mut2(SEQ ID NO：2)	87
		Mut3(SEQ ID NO：3)	95

。

2)人工RNA连接酶的表达菌株的构建

将设计的RNA连接酶进行大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子优化，并由EurofinsGenomics公司合成了连接于pET-16b(默克密理博，Merck Millipore)的Nde I和Bam HI位点的表达质粒。将作为与Mut1、Mut2和Mut3对应的ORF具有SEQ ID NO：4～6的碱基序列的各人工设计RNA连接酶表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)株，涂布于含100mg/L氨苄西林的LB琼脂平板，将在37℃培养一夜所得的菌落分离而获得了各RNA连接酶的表达菌株。该表达菌株中，表达在N末端带有His标签(His-tag)的各RNA连接酶。

3)人工RNA连接酶的表达

将各RNA连接酶的表达菌株涂布于含100mg/L氨苄西林的LB琼脂平板，在37℃培养一夜。用接种环刮取生长的菌体(bacterial cell)，并接种到添加了150mL含100mg/L氨苄西林的LB培养基的容积500ml的坂口烧瓶(Sakaguchi flask)中。在37℃以120rpm进行3小时的振荡培养直到OD₆₀₀成为0.5，然后以最终浓度成为0.1mM的条件添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，进而在37℃以120rpm继续培养3小时。培养结束后，从150ml所得的培养液通过8000rpm、30分钟的离心分离回收了菌体。

4)RNA连接酶的纯化

将回收的菌体悬浮于包含250mM NaCl、10％蔗糖、15mM咪唑的50mM三(羟甲基)氨基甲烷-HCl缓冲液(pH7.5)15mL中。进而以最终浓度为50μg/mL的条件添加溶菌酶(Sigma-Aldrich)、及以最终浓度成为0.1％的条件添加10％Triton-X100，在冰上静置30分钟。30分钟后，通过超声波破碎机(Insonator 201M)(久保田株式会社，KUBOTA Corporation)破碎菌体，通过10000×g、10分钟的离心分离除去菌体残渣，将上清液作为可溶性组分。

将所得的可溶性组分用AKTA Pure(GE Healthcare Life Sciences)添加至用上述缓冲液平衡了的HisTALON Superflow Cartridge(5mL)(Takara Bio Inc.)并进行吸附。将未吸附蛋白质用30mL含250mM NaCl、10％蔗糖、15mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)缓冲液清洗后，用含250mM NaCl、10％甘油、200mM咪唑的50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液洗脱。

以在280nm的吸收来检测蛋白质的洗脱，收集作为His标签融合蛋白表达的包含RNA连接酶的组分(级分)。对于4mL的洗脱组分，用Amicon Ultra-1510kDa(默克密理博)进行浓缩，将缓冲液置换为含50mM KCl、35mM(NH₄)₂SO₄、0.1mM EDTA、0.1mM DTT、50％甘油的10mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液，制成50μL的溶液。将纯化酶以这样的缓冲溶液的形式在-20℃保存。将由以SEQ ID NO:1～3表示的氨基酸序列形成的各人工RNA连接酶分别命名为Mut1、Mut2和Mut3。从150mL的培养液分别获得4.2mg人工RNA连接酶Mut1、1.1mg人工RNA连接酶Mut2、和0.65mg人工RNA连接酶Mut3。

[实施例2]采用各人工RNA连接酶的4个片段的连接反应(Ligation Reaction)

1)RNA连接反应条件

按照以下的条件对制备的3种人工RNA连接酶的连接酶活性进行了测定。作为底物使用表2的4个片段的寡核苷酸，如图2所示将4个片段的寡核苷酸连接，进行了生成互补的2个片段的核苷酸的反应。作为对照使用市售的T4 RNA连接酶2(New England Biolabs)。为了方便，将由MOD1-S-12U和MOD1-S-12D的连接反应生成的寡核苷酸记作有义链，将由MOD1-A-13U和MOD1-A-13D生成的寡核苷酸记作反义链。

在冰上制备包含以最终浓度计为10μM的各寡核苷酸、50mM Tris-HCl(pH7.5)、2mMMgCl₂、1mM二硫苏糖醇、0.4mM ATP的反应液20μL，并加入容积200μL的微试管中，以最终浓度成为0.36μg/mL的条件添加50μL各纯化酶溶液开始(引发)反应。通过热循环仪保温于25℃，反应开始1小时后，升温至80℃，加热5分钟，从而停止反应。按照下述的条件通过HPLC对连接产物的浓度进行了定量。

[表2]

表2. 4个片段的连接反应中所用的寡核苷酸

Pho：表示利用磷酸基的5'末端的修饰、

(F)：表示利用2'-氟基的修饰、

(Me)：表示利用2'-O-甲基的修饰、

^：表示将磷酸基取代为硫代磷酸基。

2)采用HPLC的分析

使用ACQUITY UPLC(注册商标)寡核苷酸BEH C18柱(Waters，1.7μm 2.1×50mm)通过HPLC对连接产物的寡核苷酸进行了定量。关于HPLC，采用柱温60℃、检测波长260nm、进样量10μL、流速0.4mL/分钟的条件，作为流动相使用含100mM六氟异丙醇、8mM三乙胺、0.004％磷酸的洗脱液A和含10％甲醇的洗脱液B，利用表3所示的线性梯度进行了分析。另外合成与各连接中所合成的产物具有相同序列的寡核苷酸，将其作为标准品对连接产物的浓度进行了定量。

[表3]

表3.梯度条件

时间(min)	A％	B％	曲线
				0.00	95	5	-
8.00	75	25	6
				8.10	10	90	6
10.50	10	90	6
				10.60	95	5	6
14.00	95	5	6

。

3)结果

结果示于表4。为了方便，将由MOD1-S-12U和MOD1-S-12D的连接反应生成的寡核苷酸记作有义链。在使用对照的T4 RNA连接酶2的反应中，通过1小时的反应生成了0.47μM有义链的连接产物。对于人工RNA连接酶而言，均反应速度上升，在Mut1的反应中，与T4 RNA连接酶2的情形相比，生成了1.98μM的连接产物，大幅提高至约4.2倍。此外，Mut2和Mut3的情形也观察到活性提高，与T4 RNA连接酶2相比，由1小时反应生成的连接产物量提高至约2.2倍。若将本反应中1小时生成1μmol的连接产物所需的酶量定义为1单位(U)，则活性最高的Mut1的情形被计算为5.50单位/mg。

[表4]

表4.利用人工RNA连接酶的连接产物量和比活性

[实施例3]底物高浓度条件下的利用人工RNA连接酶的4个片段的连接反应提高底物浓度，进行了利用活性提高最多的Mut1 RNA连接酶的连接反应。作为底物使用表5的4个片段的寡核苷酸。作为对照使用T4 RNA连接酶2(New England Biolabs)进行了反应。如图3(A)所示，将由MOD5-S-11U和MOD5-S-11D的连接反应生成的寡核苷酸记作有义链，将由MOD5-A-12U和MOD5-A-12D生成的寡核苷酸记作反义链；

将包含以最终浓度计为500μM的各寡核苷酸、50mM Tris-HCl(pH8.0)、2mM MgCl₂、1mM二硫苏糖醇、1.4mM ATP和7.2μg/mL各酶的10μL反应液加入容积200μL的微试管中，通过热循环仪保温于25℃。反应开始后0.5、1、2、4、6和24小时采样1μL的反应液，添加49μL的10mM EDTA溶液停止反应。按照实施例2中记载的条件通过HPLC对连接产物的浓度进行了分析；

连接产物的生成的时间进程示于图3(B)。对于对照的T4 RNA连接酶2而言，反义链侧的连接产物的生成速度慢，反应24小时后的反义链和有义链的连接产物量分别为320μM和120μ M，作为底物添加的4个片段的寡核苷酸的一部分以未反应的状态残留；

另一方面，对于连接活性提高的Mut1而言，有义链侧和反义链侧的寡核苷酸的连接速度大幅改善。反应24小时后的反义链和有义链的连接产物量分别为470μM和450μM，作为底物添加的4个片段的寡核苷酸基本上完全被消耗。

[表5]

表5.高浓度下的4个片段的连接反应中所用的寡核苷酸

片段	名称	序列	SEQ ID NO
				有义链5'侧	MOD5-S-11U	GU(Me)AAC(Me)C(Me)AAGAG	12
有义链3'侧	MOD5-S-11D	Pho_U(Me)AU(Me)U(Me)C(Me)C(Me)AU(Me)tt	13
				反义链5'侧	MOD5-A-12U	AUGGAAU(Me)ACUCU	14
反义链3'侧	MOD5-A-12D	Pho_UGGUU(Me)ACtt	-

Pho：表示利用磷酸基的5'末端的修饰、

(Me)：表示利用2'-O-甲基的修饰、

英文小写字母：表示DNA。

[实施例4]人工RNA连接酶的底物特异性

如图4(A)所示，将3个片段的寡核苷酸作为底物，在连接2个片段的寡核苷酸的反应中，考察了人工RNA连接酶的底物特异性的变化。使用将所连接的寡核苷酸的连接点附近取代为修饰型RNA的寡核苷酸、具体而言如表6所示从连接点起处于-2位、-1位、+1位、+2位的2'位被氟原子(F)或O-甲基、O-甲氧基乙基修饰、或者被取代为氢原子(DNA)的寡核苷酸作为底物。使用活性提高最多的Mut1 RNA连接酶和作为对照的T4 RNA连接酶2(NewEngland Biolabs)。将包含以最终浓度计为10μM的寡核苷酸、50mM Tris-HCl(pH7.5)、2mMMgCl₂、1mM二硫苏糖醇、0.4mM ATP、和1.78μg/mL各酶的20μL反应液加入容积200μL的微试管中，保温于25℃。反应开始后15分钟采样3μL的反应液，添加27μL的10mM EDTA溶液停止反应。按照实施例2中记载的条件通过HPLC对反应液中所含的连接产物的浓度进行分析，以不含修饰核酸的连接产物作为标准品，对产物进行了定量。

由15分钟的反应生成的连接产物的量示于图4(B)。对于对照的T4 RNA连接酶2而言，与将全部包含天然型RNA的片段作为底物的情况相比，在将-2位被取代为2'-F、2'-MOE、DNA、或-1位被取代为2'-O-Me、2'-MOE、DNA的寡核苷酸作为底物的情况下，连接产物量大幅减少至5～50％。另一方面，对于连接活性提高了的Mut1而言，即使在将-2位被取代为2'-F和DNA的寡核苷酸作为底物的情况下，连接产物量也与将全部包含天然型RNA的片段作为底物的情况为同等程度。此外，对于Mut1而言，不论以何种寡核苷酸作为底物，均显示出T4RNA连接酶2的2倍以上的连接产物量。

[表6]

表6. 3个片段的连接反应中所用的寡核苷酸

Pho：表示利用磷酸基的5'末端的修饰、

(F)：表示利用2'-氟基的修饰、

(Me)：表示利用2'-O-甲基的修饰、

(m)：表示利用2'-O-甲氧基乙基的修饰、

英文小写字母：表示利用DNA的修饰。

[实施例5]人工RNA连接酶的温度稳定性

对人工设计RNA连接酶的温度稳定性进行了评价。使用活性提高最多的Mut1 RNA连接酶和作为对照的T4 RNA连接酶2(New England Biolabs)。作为底物使用表7的4个片段的寡核苷酸。如表7所示，将由RNA1-A-13U和RNA1-A-13D生成的寡核苷酸记作反义链。将包含54mM Tris-HCl(pH7.5)、2.2mM MgCl₂、1.1mM二硫苏糖醇、0.43mM ATP、和0.78μg/mL各酶的9.2μL溶液在容积200μL的微试管中保温于25℃。自保温开始23小时后，添加500μM的底物各0.2μL，开始连接反应。反应液组成为10μM寡核苷酸、50mM Tris-HCl(pH7.5)、2mM MgCl₂、1mM二硫苏糖醇、0.4mM ATP和0.72μg/mL各酶。反应开始后15分钟采样3μL，通过添加27μL的10mM EDTA而停止反应。按照实施例2中记载的条件通过HPLC对反义链的产物量进行了定量。

由15分钟的反应生成的连接产物量和残余活性示于表8。对于对照的T4 RNA连接酶2而言，在25℃保温了23小时的情况下，与未处理相比，连接产物量大幅降低至19％。另一方面，对于连接活性提高了的Mut1而言，即使在25℃保温了23小时的情况下，连接产物量也为未处理的89％，稳定性提高。

还同样地对在37℃保温4小时后的活性进行了测定。如表9所示，对于对照的T4RNA连接酶2而言，在37℃保温了4小时的情况下，无法确认连接产物量，活性大幅下降。另一方面，对于连接活性提高了的Mut1而言，即使在37℃保温了4小时的情况下，连接产物量也为未处理的83％，稳定性提高。

[表7]

表7.关于温度稳定性的4个片段的连接反应中所用的序列

用途	名称	序列	SEQ ID NO
				有义链5'侧片段	RNA1-S-12U	AACAGUGUUCUU	17
有义链3'侧片段	RNA1-S-12D	Pho-GCUCUAUAA	-
				反义链5'侧片段	RNA1-A-13U	UUAUAGAGCAAGA	28
反义链3'侧片段	RNA1-A-13D	Pho-ACACUGUUUU	29

Pho：表示利用磷酸基的5'末端的修饰、

英文大写字母：表示RNA。

[表8]

表8.基于关于温度稳定性的连接反应的产物量和残余活性(25℃·23h)

[表9]

表9.基于关于温度稳定性的连接反应的产物量和残余活性(37℃·4h)

序列表

<110> 味之素株式会社

<120> 连接酶突变体

<130> PAMA-20897

<150> JP2020-055033

<151> 2020-03-25

<150> JP2021-010565

<151> 2021-01-26

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接酶突变体

<400> 1

Met Phe Lys Lys Tyr Ser Ser Leu Glu Asn His Tyr Asn Ser Lys Phe

1 5 10 15

Ile Glu Lys Leu Tyr Ser Leu Gly Leu Thr Gly Gly Glu Trp Val Ala

20 25 30

Arg Glu Lys Ile His Gly Thr Asn Phe Ser Leu Ile Ile Glu Arg Asp

35 40 45

Lys Val Thr Cys Ala Lys Arg Thr Gly Pro Ile Leu Pro Ala Glu Asp

50 55 60

Phe Tyr Gly Tyr Glu Ile Val Leu Lys Lys Tyr Asp Asp Ser Ile Lys

65 70 75 80

Ala Val Gln Asp Ile Met Glu Thr Ser Ala Ala Val Ser Tyr Gln Val

85 90 95

Phe Gly Glu Phe Ala Gly Gly Gly Ile Gln Lys Gly Val Asp Tyr Gly

100 105 110

Glu Lys Asp Phe Tyr Val Phe Asp Ile Ile Val Asn Thr Glu Ser Gly

115 120 125

Asp Val Thr Tyr Val Asp Asp Tyr Met Met Glu Ser Phe Cys Asn Thr

130 135 140

Phe Gly Phe Lys Met Ala Pro Leu Leu Gly Arg Gly Thr Phe Glu Glu

145 150 155 160

Leu Ile Lys Leu Pro Asn Asp Leu Asp Ser Val Val Gln Asp Tyr Asn

165 170 175

Val Thr Val Asp Ala Asp Leu Val Glu Ala Asn Lys Cys Val Phe Asp

180 185 190

Ala Glu Ala Lys Gly Glu Asn Thr Ala Glu Gly Tyr Val Leu Lys Pro

195 200 205

Cys Tyr Pro Lys Trp Leu Pro Asn Gly Asn Arg Val Ala Ile Lys Cys

210 215 220

Lys Asn Ser Lys Phe Ser Glu Lys Lys Lys Ser Asp Lys Pro Ile Lys

225 230 235 240

Ala Lys Val Glu Leu Ser Glu Ala Asp Asn Lys Leu Val Gly Ile Leu

245 250 255

Ala Cys Tyr Val Thr Leu Asn Arg Val Asn Asn Val Ile Ser Lys Ile

260 265 270

Gly Glu Ile Gly Pro Lys Asp Phe Gly Lys Val Met Gly Leu Thr Val

275 280 285

Gln Asp Ile Leu Glu Glu Thr Ser Arg Glu Gly Ile Thr Leu Thr Gln

290 295 300

Ala Asp Asn Pro Ser Leu Ile Lys Lys Glu Leu Val Lys Met Val Gln

305 310 315 320

Asp Val Leu Arg Pro Ala Trp Ile Glu Leu Val Ser

325 330

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接酶突变体

<400> 2

Met Phe Lys Lys Tyr Ser Ser Leu Glu Asn His Tyr Asn Ser Lys Phe

1 5 10 15

Ile Glu Lys Leu Tyr Ser Leu Gly Leu Thr Ser Gly Glu Trp Val Ala

20 25 30

Arg Glu Lys Ile His Gly Thr Asn Phe Ser Leu Ile Ile Glu Arg Asp

35 40 45

Lys Val Thr Cys Ala Lys Arg Thr Gly Pro Ile Leu Pro Ala Glu Asp

50 55 60

Phe Tyr Gly Tyr Glu Ile Ile Met Lys Lys Tyr Asp Asp Ala Ile Lys

65 70 75 80

Ala Val Gln Asp Ile Met Glu Thr Ser Ala Ala Val Ser Tyr Gln Val

85 90 95

Phe Gly Glu Phe Ala Gly Gly Gly Ile Gln Lys Gly Val Asp Tyr Gly

100 105 110

Asp Lys Asp Phe Tyr Val Phe Asp Ile Ile Val Thr Thr Glu Asp Gly

115 120 125

Glu Val Ser Tyr Met Asp Asp Tyr Glu Met Glu Ser Phe Cys Asn Thr

130 135 140

Phe Gly Phe Lys Met Ala Pro Leu Leu Gly Arg Gly Ser Phe Glu Asp

145 150 155 160

Leu Ile Lys Leu Pro Asn Asp Leu Asp Ser Val Val Asn Asp Tyr Asn

165 170 175

Val Thr Val Asp Ala Asp Leu Val Glu Ala Asn Lys Cys Val Phe Asp

180 185 190

Ala Glu Ala Lys Gly Glu Asn Thr Ala Glu Gly Tyr Val Leu Lys Pro

195 200 205

Cys Tyr Pro Lys Trp Leu Pro Asn Gly Asn Arg Val Ala Ile Lys Cys

210 215 220

Lys Asn Ser Lys Phe Ser Glu Lys Lys Lys Ser Asp Lys Pro Ile Lys

225 230 235 240

Ala Lys Val Glu Leu Ser Glu Ala Asp Asn Asp Leu Val Gly Ile Leu

245 250 255

Ala Glu Tyr Val Thr Trp Asn Arg Val Ser Asn Val Ile Ser Lys Ile

260 265 270

Gly Glu Val Gly Pro Lys Asp Phe Gly Lys Val Met Gly Leu Thr Val

275 280 285

Gln Asp Ile Leu Glu Glu Ala Ser Arg Glu Gly Ile Thr Leu Thr Gln

290 295 300

Ala Glu Asn Pro Ser Leu Val Lys Lys Glu Leu Val Lys Met Val Met

305 310 315 320

Asp Thr Leu Arg Glu Ala Trp Ile Glu Leu

325 330

<210> 3

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接酶突变体

<400> 3

Met Phe Lys Lys Tyr Ser Ser Leu Glu Asn His Tyr Asn Ser Lys Phe

1 5 10 15

Ile Glu Lys Leu Tyr Ser Leu Gly Leu Thr Gly Gly Glu Trp Val Ala

20 25 30

Arg Glu Lys Ile His Gly Thr Asn Phe Ser Leu Ile Ile Ser Asp Asp

35 40 45

Lys Val Thr Cys Ala Lys Arg Ser Gly Pro Ile Leu Pro Ala Glu Asp

50 55 60

Phe Phe Gly Tyr Glu Ile Ile Val Lys Asn Tyr Ala Asp Ala Ile Arg

65 70 75 80

Ala Val Gln Asp Ile Met Glu Thr Ser Ala Val Val Ser Tyr Gln Val

85 90 95

Phe Gly Glu Phe Ala Gly Pro Gly Ile Gln Lys Asn Val Asp Tyr Gly

100 105 110

Asp Lys Asp Phe Tyr Val Phe Asp Ile Ile Val Thr Thr Glu Ser Gly

115 120 125

Asp Val Thr Tyr Val Asp Asp Tyr Met Met Glu Ser Phe Cys Asn Thr

130 135 140

Phe Lys Phe Lys Met Ala Pro Leu Leu Gly Arg Gly Lys Phe Glu Glu

145 150 155 160

Leu Ile Lys Leu Pro Asn Asp Leu Asp Ser Val Val Asn Asp Tyr Asn

165 170 175

Phe Thr Val Asp His Ala Gly Leu Val Asp Ala Asn Lys Cys Val Phe

180 185 190

Asn Ala Glu Ala Lys Gly Glu Val Phe Thr Ala Glu Gly Tyr Val Leu

195 200 205

Lys Pro Cys Tyr Pro Ser Trp Leu Arg Asn Gly Asn Arg Val Ala Ile

210 215 220

Lys Cys Lys Asn Ser Lys Phe Ser Glu Lys Lys Lys Ser Asp Lys Arg

225 230 235 240

Ile Lys Ala Lys Val Glu Leu Ser Glu Ala Asp Asn Glu Leu Val Gly

245 250 255

Ile Leu Ala Cys Tyr Val Thr Leu Asn Arg Val Asn Asn Val Ile Ser

260 265 270

Lys Ile Gly Glu Val Gly Pro Lys Asp Phe Gly Lys Val Met Gly Leu

275 280 285

Thr Val Gln Asp Ile Leu Glu Glu Ala Ser Arg Glu Gly Ile Thr Leu

290 295 300

Thr Gln Ala Asp Asn Trp Ser Leu Ile Lys Lys Glu Leu Val Lys Met

305 310 315 320

Val Gln Asp Val Val Arg Glu Ala Trp Ile Glu Leu

325 330

<210> 4

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码连接酶突变体的核苷酸序列

<400> 4

atgttcaaga aatacagtag ccttgagaat cactacaaca gcaaattcat cgaaaaactc 60

tactccttag gcctcactgg tggtgaatgg gttgcgcgtg agaaaatcca tggtacgaac 120

ttctctctta tcattgaacg cgataaagtg acctgtgcga aacgcacggg acctattctg 180

ccggctgaag acttttatgg gtatgagatt gtgctgaaga aatacgacga ctcgataaaa 240

gccgtacagg atatcatgga aacctctgca gcagtgagct atcaggtctt tggcgaattt 300

gcagggggtg gtattcagaa aggcgtggat tacggagaga aagacttcta cgtgttcgat 360

attatcgtga acacagaatc aggggatgtg acctatgtcg atgactatat gatggagtcg 420

ttttgcaaca cctttggctt caaaatggct ccgctgttag gtcgtggcac gtttgaagag 480

ctgatcaaac tgccgaatga tctggactct gttgtacagg attataacgt caccgttgat 540

gcggacttgg tagaagcgaa taaatgtgtg tttgatgccg aagcgaaagg tgagaatacc 600

gctgaagggt atgttctgaa accgtgctat ccgaaatggc tgccaaatgg caatcgcgtt 660

gccatcaaat gcaagaactc caagtttagc gaaaagaaaa aatcggacaa accgattaaa 720

gcgaaagttg aactgagtga agcagacaat aaactggtag gaatcttggc ctgttatgtt 780

accctcaatc gggtaaacaa cgtgatttcc aagattggcg aaattggtcc caaggatttt 840

ggcaaagtga tgggccttac agttcaggat atactggaag aaacgtcacg tgaaggcatt 900

actctgactc aagccgataa ccctagcctg atcaaaaagg aattagtcaa aatggtgcaa 960

gatgtcttgc gaccagcgtg gattgagcta gtcagt 996

<210> 5

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码连接酶突变体的核苷酸序列

<400> 5

atgtttaaaa agtacagttc cctggaaaac cactacaact ctaagttcat cgagaaactg 60

tatagccttg gactgacttc tggtgaatgg gttgctcggg agaaaattca tggcaccaac 120

ttctccctga ttattgagcg cgataaagtc acgtgtgcaa aacgcacagg tccgatactt 180

cctgccgaag atttctatgg ctacgagatc atcatgaaaa agtacgacga tgcgatcaaa 240

gccgtgcagg atattatgga gacaagcgca gcagtgagtt atcaggtctt tggcgaattt 300

gcgggtggag gaatccagaa aggggtagat tatggcgaca aagacttcta tgtctttgac 360

atcatcgtta ctacggaaga tggcgaagtt tcgtacatgg atgattacga gatggaatcc 420

ttctgtaaca cctttgggtt caaaatggct ccgttattag gtcgtggtag ctttgaggat 480

ctgattaaac tcccaaacga cttggatagc gtagtgaatg actataacgt gaccgtggat 540

gcggatctag tggaagccaa caaatgcgtg tttgatgcgg aagccaaagg cgaaaacacg 600

gctgaaggct atgtcctcaa gccatgctat ccgaaatggt tgcccaatgg caatcgagtg 660

gcaattaagt gcaaaaattc gaaatttagc gaaaagaaaa aaagcgataa gcctatcaaa 720

gcgaaagtag agctgtcaga agccgataat gacttggttg gtattctggc cgagtatgtt 780

acctggaatc gcgtgtctaa cgttatctcg aaaattgggg aagtaggtcc gaaagacttt 840

ggcaaagtta tgggcttaac cgtccaagac atactggaag aagcgtcacg tgaaggtatt 900

accctgaccc aagcggaaaa tccgagtctg gtgaagaaag aactcgtcaa aatggtgatg 960

gatacgctgc gtgaagcgtg gattgaactg 990

<210> 6

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码连接酶突变体的核苷酸序列

<400> 6

atgttcaaga aatatagcag cctcgagaat cactacaact ctaagttcat agagaaactg 60

tattctctgg gactcacagg tggtgaatgg gtagctcggg agaaaatcca tggcacgaat 120

ttttcgctga tcatttccga tgataaagtc acctgtgcaa aacgcagtgg tccaatactt 180

ccagcagagg acttttttgg gtacgaaatc atcgtcaaaa attacgccga tgcgattcga 240

gcagtccaag acattatgga aactagtgcg gttgtttcgt atcaggtgtt cggtgagttt 300

gccggacctg gcattcagaa aaacgtcgac tatggcgata aagacttcta cgtgtttgat 360

atcattgtta ccacggaatc cggagatgtc acctatgtag atgactacat gatggagagc 420

ttctgcaata cgttcaaatt caaaatggct ccgttgttag gtcgtgggaa atttgaagaa 480

ctgatcaaac tgccgaatga cctggatagt gtagtgaacg actacaactt taccgtggat 540

catgcgggct tagttgatgc caacaaatgc gtgtttaatg ccgaagcgaa aggcgaagtg 600

tttaccgctg aaggctatgt actgaaaccg tgttatccgt catggttgcg taacggtaat 660

cgtgtggcca ttaaatgcaa gaacagcaaa ttcagcgaga aaaagaaatc cgataagcgc 720

atcaaagcga aagtggaact gtctgaagcg gataacgagc ttgtaggcat tttagcgtgt 780

tatgtgactc taaatcgcgt gaacaacgtg atctcgaaaa ttggcgaagt tggccccaaa 840

gactttggga aagttatggg tctgacggtt caggacattc tggaagaagc ctcacgcgaa 900

ggtattacct tgacacaggc ggataattgg agcctgatta agaaggaact cgtcaaaatg 960

gtgcaagatg ttgtccgtga agcatggatc gaactg 996

<210> 7

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 7

aacaguguuc uu 12

<210> 8

<211> 13

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 8

uuauagagca aga 13

<210> 9

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 9

acacuguuuu 10

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 10

aacaguguuc uugcucuaua a 21

<210> 11

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 11

uuauagagca agaacacugu uuu 23

<210> 12

<211> 11

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 12

guaaccaaga g 11

<210> 13

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 13

uauuccautt 10

<210> 14

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 14

auggaauacu cu 12

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 15

guaaccaaga guauuccaut t 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 16

auggaauacu cuugguuact t 21

<210> 17

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 17

aacaguguuc uu 12

<210> 18

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 18

uuauagagca agaacacugu uuu 23

<210> 19

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 19

aacaguguuc uu 12

<210> 20

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 20

aacaguguuc uu 12

<210> 21

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 21

aacaguguuc uu 12

<210> 22

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 22

aacaguguuc tu 12

<210> 23

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 23

aacaguguuc uu 12

<210> 24

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 24

aacaguguuc uu 12

<210> 25

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 25

aacaguguuc uu 12

<210> 26

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 26

aacaguguuc ut 12

<210> 27

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 27

aacaguguuc uugcucuaua a 21

<210> 28

<211> 13

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 28

uuauagagca aga 13

<210> 29

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 29

acacuguuuu 10

Claims

1.下述(1)、(2)或(3)的连接酶突变体：

(1)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列显示95%以上的同一性的氨基酸序列且具有核酸的连接活性的连接酶突变体；

(2)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列显示90%以上的同一性的氨基酸序列且具有核酸的连接活性的连接酶突变体；或者

(3)包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列显示97%以上的同一性的氨基酸序列且具有核酸的连接活性的连接酶突变体。

2.根据权利要求1所述的连接酶突变体，其中，核酸是可包含DNA和/或修饰核酸的单链RNA或双链RNA。

3.一种核酸产物的制造方法，其中，该方法包括：在权利要求1或2所述的连接酶突变体的存在下连接核酸材料而生成核酸产物，

核酸材料选自单链核酸材料、双链核酸材料、及它们的混合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，核酸材料为RNA。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，核酸材料为4条以上的单链RNA。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，核酸产物包含长度为12～27个碱基的互补部分。

7.根据权利要求3所述的方法，其中，核酸材料包含DNA和/或修饰核酸。

8.根据权利要求3所述的方法，其中，核酸材料的浓度为1μM以上。

9.根据权利要求3所述的方法，其中，核酸产物为siRNA。

10.一种多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的连接酶突变体。

11.一种表达载体，其包含权利要求10所述的多核苷酸。

12.一种转化微生物，其包含表达单元，

所述表达单元包含：编码权利要求1或2所述的连接酶突变体的多核苷酸、以及与其可操作地连接的启动子。

13.一种连接酶突变体的制造方法，该方法包括：使用包含表达单元的转化微生物，该表达单元包含编码权利要求1或2所述的连接酶突变体的多核苷酸以及与其可操作地连接的启动子，以生成所述连接酶突变体。