CN113387951B - 一种喹啉类生物碱及其制备和应用 - Google Patents

一种喹啉类生物碱及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从药用植物菘蓝叶中分离得到的化合物及其提取方法和在作为抗神经氧化药物中的应用。生物碱类化合物为具有式1、式1a和式1b以及式2、式3、式4的结构，本发明涉及的化合物结构，并保护化合物可以作为开发新型神经抗氧化药物的活性先导化合物的医疗用途。
Figure DDA0003103339420000011

Description

一种喹啉类生物碱及其制备和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从药用植物菘蓝叶中分离得到的化合物及其提取方法和在作为抗神经氧化药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)和抑郁症等为代表的神经退行性疾病成为困扰人类的重要威胁之一。如何有效的治疗这类疾病一直是困扰神经科学工作者的难题，这类疾病的发生往往伴随着大量的自由基产生，使得神经细胞受到破坏性攻击，从而加剧脑组织损伤。所以，相关的药物研发成为当前的研究热点，然而报道的化合物往往不良反应较多而且容易导致耐药性，故应用前景相对较差。因此，研制出一种安全、有效、稳定的神经保护药物具有极大的临床意义。
中药是神经保护药物及其先导化合物的资源库，寻找小分子化合物能够模拟神经保护因子的作用，从而激活机体内源性保护机制，促进神经元生长及存活，对阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的治疗有重要意义。
菘蓝是十字花科菘蓝属二年生草本植物，原产我国，全国各地均有栽培。其干燥叶及根可入药，根入药称“板蓝根”，叶入药称“大青叶”，有清热解毒、凉血消斑的功效，常用于治疗风热感冒、咽喉肿痛、流行性乙型脑炎、肝炎和腮腺炎等多种疾病。本发明所涉及的具有活性化合物迄今为止尚未见有专利或文献报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种从药用植物菘蓝叶中分离得到的化合物及其提取方法和在作为神经抗氧化药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种生物碱类化合物，生物碱类化合物为具有式1、式1a和式1b以及式2、式3、式4的结构，
Figure BDA0003103339400000011
一种生物碱类化合物的制备方法，以菘蓝叶干燥药材为原料，以有机溶剂作为提取剂提取获得具有式1、式1a和式1b以及式2、式3、式4的结构的化合物。
具体为：
1)取干燥的菘蓝(Isatis indigotica Fortune)药材，经乙醇的水溶液反复提取，合并所有提取液减压浓缩，干燥得到粗提物；
2)取步骤1)中的粗提物进行聚酰胺柱层析，用体积比30～90％的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，收集60％洗脱液；
3)收集步骤2)中洗脱组分再依次进行经HP-20大孔树脂柱层析、ODS柱层析以及硅胶柱层析，进一步用高效液相色谱进行纯化，得式1、式2、式3、式4化合物。
所述步骤3)中收集洗脱液首先经HP-20大孔树脂柱层析，洗脱液为体积比为0～90％的乙醇-水，收集60％的乙醇-水洗脱液在经ODS柱层析，展开剂为体积比为10:90-90:0的乙醇-水，收集展开剂为体积比为40:60的乙醇-水部分再进行硅胶柱层析，展开剂为体积比为50:1-1:1的石油醚-乙酸乙酯；收集不同组分经高效液相色谱流动相为流动相为 1:3-1:10的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，即获得相应化合物。
所述当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为20:1的组分进行高效液相色谱，流动相为 1:3的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，即得到式 1化合物；
当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为10:1的组分进行高效液相色谱，流动相为1:5的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，即得到式2化合物；
当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为8:1的组分进行高效液相色谱，流动相为1:7的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，即得到式3化合物；
当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为5:1的组分进行高效液相色谱，流动相为1:10的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，即得到式4化合物。
所述收集式1化合物的洗脱组分后采用高效液相色谱拆分手性，以直链淀粉一三(3,5－二甲苯基氨基甲酸酯)作为固定相，流动相为3:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，在保留时间为16.2min即收集到的为式 1a化合物，以及在保留时间22.4min收集到1b化合物。
所述步骤1)取干燥的菘蓝(Isatis indigotica Fortune)药材，用其2倍体积量的乙醇水浸泡过夜，再用7倍体积量的乙醇水提取3次，其中，乙醇的体积浓度为75％，提取采用加热回流提取，合并所有提取液，进行减压浓缩，回收溶剂，减压浓缩完成后，干燥得到粗提物。
一种化合物的应用，所述化合物在制备神经抗氧化药物中的用途。
所述化合物在制备治疗阿尔治海默病或帕金森病的神经性退行性疾病药物中的用途。
本发明所具有的优点：
通过高效液相色谱、手性拆分色谱等分离手段从药用植物菘蓝叶中分离出四个结构新颖的生物碱。并对式1化合物进行了手性拆分，其拆分得到的式1a与式1b化合物对 H2O2诱导损伤的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系具有保护作用，并且对H2O2诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡具有抑制作用；抑制SH-SY5Y细胞中活性氧的增加；提高抗氧化酶(SOD、CAT、 GSH-Px)活性，具有增强SH-SY5Y细胞抗氧化能力。综上所述，式1a与式1b化合物具有抗神经氧化的药理活性，能够保护神经细胞因大量活性氧产生受到的破坏性攻击，进而避免脑组织损伤，具有治疗阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)等为代表的神经退行性疾病潜在的价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的式1a化合物和式1b化合物以及式2化合物、式3化合物、式4化合物的制备流程图。
图2为本发明实施例提供的式1化合物的结构
图3为本发明实施例提供的式1a化合物和式1b化合物的实测和计算ECD
图4为本发明实施例提供的式1化合物的HRESIMS
图5为本发明实施例提供的式1化合物的氢谱
图6为本发明实施例提供的式1化合物的碳谱
图7为本发明实施例提供的式1化合物的HMBC
图8为本发明实施例提供的式1化合物的HSQC
图9为本发明实施例提供的式1化合物的1H-1H COSY
图10为本发明实施例提供的式1a化合物的CD谱图
图11为本发明实施例提供的式1b化合物的CD谱图
图12为本发明实施例提供的式2化合物的HRESIMS
图13为本发明实施例提供的式2化合物的氢谱
图14为本发明实施例提供的式2化合物的碳谱
图15为本发明实施例提供的式2化合物的HMBC
图16为本发明实施例提供的式2化合物的HSQC
图17为本发明实施例提供的式3化合物的HRESIMS
图18为本发明实施例提供的式3化合物的氢谱
图19为本发明实施例提供的式3化合物的碳谱
图20为本发明实施例提供的式3化合物的HMBC
图21为本发明实施例提供的式3化合物的HSQC
图22为本发明实施例提供的式3化合物的实测和计算ECD
图23为本发明实施例提供的式3化合物的CD谱图
图24为本发明实施例提供的式4化合物的HRESIMS
图25为本发明实施例提供的式4化合物的氢谱
图26为本发明实施例提供的式4化合物的碳谱
图27为本发明实施例提供的式4化合物的HMBC
图28为本发明实施例提供的式4化合物的HSQC
图29为本发明实施例提供的式4化合物的实测和计算ECD
图30为本发明实施例提供的式4化合物的CD谱图
图31为本发明实施例提供的式1a化合物和式1b化合物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤保护作用柱状图，注：与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01；与空白组相比，##P<0.01。
图32为本发明实施例提供的式1a化合物和式1b化合物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞的细胞流式图，注：与空白组比较，##为P<0.01；与模型组相比，**为P<0.01。
图33为本发明实施例提供的式1a化合物和式1b化合物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞活性氧影响实验图，注：与空白组比较，##为P<0.01；与模型组相比，**为P<0.01。
图34为本发明实施例提供的式1a化合物和式1b化合物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞提高抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性的统计柱状图，注：与模型组相比，*P<0.05, **P<0.01；与空白组相比，#P<0.05,##P<0.01。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1：各化合物的制备，如图1所示：
1)取干燥的菘蓝(Isatis indigotica Fortune)药材，用其2倍体积量的乙醇水浸泡过夜，再用7倍体积量的乙醇水提取3次，其中，乙醇的体积浓度为75％，提取采用加热回流提取。合并所有提取液，进行减压浓缩，回收溶剂，减压浓缩完成后，干燥得到粗提物；
2)取步骤1)中的粗提物进行聚酰胺柱层析，用体积比30～90％的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，收集60％洗脱液；
3)收集上述60％洗脱液首先经HP-20大孔树脂柱层析，洗脱液为体积比为0～90％的乙醇-水，收集60％的乙醇-水洗脱液在经ODS柱层析，展开剂为体积比为10:90-90:0 的乙醇-水，收集展开剂为体积比为40:60的乙醇-水部分再进行硅胶柱层析，展开剂为体积比为50:1-1:1的石油醚-乙酸乙酯；
所述当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为20:1的组分进行高效液相色谱，流动相为 1:3的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，即得到式 1化合物(参见图4-8)；
当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为10:1的组分进行高效液相色谱，流动相为1:5 的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，即得到式2 化合物；
当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为8:1的组分进行高效液相色谱，流动相为1:7的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，即得到式3 化合物；
当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为5:1的组分进行高效液相色谱，流动相为1:10 的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，即得到式4 化合物。
所述收集式1化合物的洗脱组分后采用高效液相色谱拆分手性，以直链淀粉一三(3,5－二甲苯基氨基甲酸酯)作为固定相，流动相为3:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为210nm，在保留时间为16.2min即收集到的为式 1a化合物，以及在保留时间22.4min收集到1b化合物(参见图2-3)。
所得化合物经过系统结构鉴定结果如下：
主要利用高分辨质谱、二级质谱、核磁共振谱(1D NMR、2D NMR)、计算ECD。
化合物1a/1b
Figure BDA0003103339400000041
黄色油状物(甲醇)。[α]20D-1.5(c 0.1,MeOH)。HRESI-MS给出准分子离子峰227.1176[M+H]+(calcd for C14H15N2O 227.1179)，结合1H,13C NMR数据确定其分子式为C14H14N2O，计算其不饱和度为9(参见图4)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)谱中，δ7.73(1H,br d,J＝8.0Hz,H-5),7.12(1H,t,J＝8.0 Hz,H-6),7.44(1H,t,J＝8.0Hz,H-7),7.30(1H,br d,J＝8.0Hz,H-8)为邻位二取代苯环的特征信号，δ11.13(1H,s,H-1)为一个连氮的活泼氢信号，δ4.09(1H,m,H-5')为一个连氮的次甲基信号，δ3.75(1H,t,J＝8.0Hz,H-2')和3.27(1H,m,H-2'),1.93(1H,m,H-3')和1.86(1H, m,H-3'),1.99(1H,m,H-4')和1.35(1H,m,H-4'),2.88(1H,dd,J＝16.1,10.7Hz,H-6')和2.75 (1H,dd,J＝16.1,4.8Hz,H-6')提示为四个亚甲基的信号，且δ3.75(1H,t,J＝8.0Hz,H-2')和 3.27(1H,m,H-2')化学位移值向低场位移，表明这个亚甲基可能与氮相连。13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)谱中给出14个碳信号，低场区有9个双键碳信号，除了苯环的碳信号之外，还存在一个羰基碳信号δ160.6(C-2)和一组双键碳信号δ110.1(C-3),157.9(C-4)，其中δ157.9(C-4)的化学位移值向低场位移提示其可能与氮相连；在高场区，δ65.5(C-5') 为脂肪族次甲基碳信号，δ51.0(C-2'),26.2(C-3'),31.5(C-4'),31.0(C-6')为与氢信号相对应的四个脂肪族亚甲基碳信号。根据化合物不饱和度为9，提示该化合物包括苯环在内，一共有四个环(参见图5与图6)。
在HMBC谱中，苯环质子信号δ7.73(1H,br d,J＝8.0Hz,H-5)与苯环碳信号δ129.6(C-7),140.1(C-8a)以及双键碳δ157.9(C-4)相关，δ7.12(1H,t,J＝8.0Hz,H-6)与δ112.7(C-4a),115.7(C-8)相关，δ7.30(1H,br d,J＝8.0Hz,H-8)与δ112.7(C-4a),120.7(C-6)相关，并且氮氢δ11.13(1H,s,H-1)与δ110.1(C-3),112.7(C-4a)相关,以上相关信号说明化合物含有2(1H)-喹啉酮母核结构；在1H-1H COSY谱中，H-5/H-6/H-7/H-8,H-2'/H-3'/H-4'/H-5'/H-6' 存在同核质子偶合相关，由此推断出邻位质子偶合的片段，结合HMBC的相关信号δ3.75 (1H,t,J＝8.0Hz,H-2')与δ31.5(C-4'),65.5(C-5')相关，δ1.93(1H,m,H-3')与δ65.5(C-5')相关，δ2.88(1H,dd,J＝16.1,10.7Hz,H-6')与δ31.5(C-4')相关，表明结构中存在一个吡咯里西啶环的结构片段，根据δ3.75(1H,t,J＝8.0Hz,H-2')与δ157.9(C-4)，δ2.88(1H,dd,J ＝16.1,10.7Hz,H-6')与δ110.1(C-3),157.9(C-4)的相关信号，可以确定吡咯里西啶环与 2(1H)-喹啉酮母核骈合于C-3和C-4位(参见图8与图9)。因此，确定了化合物1的平面结构如下所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
通过手性色谱柱对化合物1进行拆分，得到1a{[α]20D-32.0(c 0.1,MeOH)}和1b{[α]20D+30.3(c 0.1,MeOH)}，比例约为4:3，它们的CD谱呈镜像关系(参见图2)。它们的绝对构型是通过比较计算和实测ECD来确定的。1a的实验CD曲线与预设为5'S构型的计算ECD曲线比较吻合，而1b的实验CD曲线与5'R构型的计算ECD曲线比较吻合(图 3)。因此确定了1a和1b的绝对构型分别为5'S和5'R(参见图3图9图10)。
综上所述，确定了化合物1a和1b的结构并对其全部碳氢信号进行了归属(表1)，经系统文献检索，两者均为未见文献报道的新化合物，分别命名为(-)-(5'S)-isatinoline Aand(+)-(5'R)-isatinoline A。
表1 1H(400MHz)and 13C NMR(100MHz)data for 1(DMSO-d6)
Figure BDA0003103339400000052
Figure BDA0003103339400000061
化合物2
Figure BDA0003103339400000062
黄色油状物(甲醇)。HRESI-MS给出准分子离子峰221.0836[M+Na]+(calcd forC12H10N2ONa 221.0840)，结合1H,13C NMR数据确定其分子式为C12H10N2O，计算其不饱和度为9(参见图12)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)谱中，δ9.27(1H,br d,J＝8.2Hz,H-5),7.65(1H,t,J＝8.2 Hz,H-6),7.74(1H,t,J＝8.2Hz,H-7),8.02(1H,br d,J＝8.2Hz,H-8)为邻位二取代苯环的特征信号，δ8.95(1H,s,H-2)为双键氢信号，δ8.42(1H,br s,H-2')为活泼的氮氢信号，δ3.43 (2H,m,H-3')和3.07(2H,t,J＝6.6Hz,H-4')提示为两个亚甲基。13C-NMR(100MHz,DMSO-d6) 谱中给出12个碳信号，低场区有10个双键碳信号，除了苯环的碳信号之外，还存在一个羰基碳信号δ164.0(C-1')和三个双键碳信号δ150.8(C-2),133.3(C-3),130.1(C-4)，其中δ150.8(C-2)的化学位移值向低场位移，提示其可能与氮相连；高场区只有两个脂肪族亚甲基的碳信号δ38.5(C-3'),25.9(C-4')。根据化合物不饱和度为9，提示该化合物包括苯环在内，一共含有三个环(参见图13与图14)。
在HMBC谱中，苯环质子信号δ9.27(1H,br d,J＝8.2Hz,H-5)与苯环碳信号δ147.8(C-8a)和双键碳信号δ130.1(C-4)相关，δ7.65(1H,t,J＝8.2Hz,H-6)与δ124.5(C-4a),129.4 (C-8)相关，δ7.74(1H,t,J＝8.2Hz,H-7)与δ126.2(C-5),147.8(C-8a)相关，并且氮氢δ11.13 (1H,s,H-1)与δ110.1(C-3),112.7(C-4a)相关,δ8.02(1H,br d,J＝8.2Hz,H-8)与δ112.7 (C-4a)相关，双键氢δ8.95(1H,s,H-2)与δ130.1(C-4),147.8(C-8a)相关，以上相关信号说明化合物含有喹啉的母核结构；此外，δ3.43(2H,m,H-3')与δ133.3(C-3),164.0(C-1')存在相关，δ3.07(2H,t,J＝6.6Hz,H-4')与δ150.8(C-2),130.1(C-4)存在相关，表明存在2- 哌啶酮结构片段，与喹啉环骈合于C-3和C-4位(参见图15与图16)。因此，确定了化合物2的结构如下所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
化合物2
综上所述，确定了化合物2的结构并对其全部碳氢信号进行了归属(表 2)，经系统文献检索，为一未见文献报道的新化合物，命名为isatinoline B。
表2 1H(400MHz)and 13C NMR(100MHz)data for compound 2(DMSO-d6)
Figure BDA0003103339400000071
化合物3
Figure BDA0003103339400000072
黄色针晶(甲醇)，
Figure BDA0003103339400000073
(c 0.1,MeOH)。HRESIMS给出准分子离子峰284.0533 [M+Na]+(calcd.for C13H11NO5Na,284.0529)，结合1H和13C-NMR数据确定其分子式为 C13H11NO5，不饱和度为9(参见图17)。δH 8.11(1H,br d,J＝8.2Hz,H-6),7.24(1H,t,J＝8.2 Hz,H-7),7.67(1H,t,J＝8.2Hz,H-8),7.49(1H,d,J＝8.2Hz,H-9)提示存在一个1,2-二取代苯环。δH3.56(2H,m,H-11)为亚甲基氢信号，δH 5.09(1H,t,J＝5.6Hz,11-OH),5.84(1H,d,J＝6.5Hz,12-OH)为羟基氢信号，δH 4.43(1H,m,H-10),5.19(1H,m,H-12)为次甲基氢信号，δH11.13(1H,s,H-1)为氮原子上的活泼氢信号。H-11的低场化学位移提示其应与氧相连。13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)谱共给出13个碳信号。δC 122.6,130.0,123.1,135.1,120.9, 138.7提示为苯环碳信号，两个羰基碳信号δC 160.9,177.8，两个双键碳信号δC 119.7, 157.7，一个亚甲基碳信号δC 60.8，两个次甲基碳信号δC 89.3,74.4。结合该化合物的分子式和不饱和度，提示结构中还存在两个环(参见图18图19)。
在HMBC谱中，可以观察到H-6与C-5,C-9a，H-7与C-5a,C-9，H-8与C-9a,C-6，H-9 与C-5a，H-1与C-5a,C-9,C-2和C-3之间存在相关信号，确定了七元环的存在，且该环与苯环在C-5a和C-9a处骈合。H-12与C-3和C-4之间存在相关，证明了五元环骈合在七元环的C-3和C-4处。羟基氢(δH 5.84)与C-3,C-10和C-12存在相关，确定了12-OH 的连接位置。羟基氢(δH5.09)与C-10和C-11存在相关，确定了羟甲基的连接位置(参见图20与图21)。因此，确定了该化合物的平面结构如所下。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
在NOESY谱中，观察到了H-11与H-12之间的相关信号，提示H-10与H-12朝向相反，从而确定了该化合物的相对构型。它的绝对构型是通过比较计算和实测ECD来确定的(参见图22)。3的实验ECD谱中的Cotton效应峰与预设为10R,12S构型的计算ECD 谱中的Cotton效应峰较为吻合(参见图21)，因此确定化合物3的绝对构型为10R,12S 构型(参见图22与图23)。
综上所述，确定了化合物3的结构并对其全部碳氢信号进行了归属(表3)，经系统文献检索，为未见文献报道的新化合物，并命名为isatinoline C。
表3 1H(400MHz)and 13C(100MHz)data for compound 3(DMSO-d6)
Figure BDA0003103339400000081
化合物4
Figure BDA0003103339400000082
橙色针晶(甲醇)，
Figure BDA0003103339400000083
(c 0.1,MeOH)。HRESIMS给出准分子离子峰280.0595[M+Na]+(calcd.for C14H11NO4Na,280.0580)，结合1H和13C-NMR数据确定其分子式为C14H11NO4，不饱和度为10。δH 7.80(1H,overlapped,H-4),7.38(1H,t,J＝7.8Hz,H-5),7.83(1H,overlapped,H-6),7.92(1H,d,J＝7.8Hz,H-7)提示存在一个1,2-二取代苯环。δH 3.58(2H,m,H-13)为亚甲基氢信号，δH 5.79(1H,d,J＝10.3Hz,12-OH),4.78(1H,t,J＝5.9Hz,13-OH)为羟基氢信号，δH 5.48(1H,dt,J＝6.0,10.3Hz,H-12)为次甲基氢信号，δH 8.64(1H,d,J＝7.6Hz,H-8),6.35(1H,d,J＝7.6Hz,H-9)为双键氢信号。13C-NMR(100MHz,DMSO-d6) 谱共给出14个碳信号。δC 146.6,137.4,126.4,125.1,122.9,112.1提示为苯环碳信号，两个羰基碳信号δC 185.5,181.1，四个双键碳信号δC 134.8,133.3,131.5,115.9，一个亚甲基碳信号δC 64.6，一个次甲基碳信号δC 68.2。结合该化合物的分子式和不饱和度，提示结构中还存在两个环。同时，以上数据还提示该化合物为3-吲哚酮的类似物(参见图25 与图26)。
在HMBC谱中，可以观察到H-8与C-2,C-7a,C-9,C-10，H-9与C-11之间存在相关，从而确定了4-吡啶酮片段的连接位置。H-12与C-2,C-10,C-11存在相关，H-13与C-11 和C-12存在相关，确定了–CHOH–CH2OH片段的连接位置(参见图27与图28)。因此，确定了该化合物的平面结构如下。
Figure 359387DEST_PATH_IMAGE001
化合物4的绝对构型是通过比较计算和实测ECD来确定的。实验ECD谱中的Cotton效应峰与预设为12S构型的计算ECD谱中的Cotton效应峰较为吻合(图24)，因此确定化合物4的绝对构型为12S构型(参见图29与图30)。
综上所述，确定了化合物4的结构并对其全部碳氢信号进行了归属(表4)，经系统文献检索，为未见文献报道的新化合物，并命名为iatinoline D。
表4 1H(400MHz)and 13C(100MHz)data for compound 4(DMSO-d6)
Figure BDA0003103339400000092
实施例2：MTT法检测式1a化合物和式1b化合物对H2O2诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞损伤的神经保护作用：
1、细胞培养
神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系(购自美国模式培养物集存库ATCC,Manassas,USA)以含10％FBS的DMEM培养基(购自美国洛根海克龙Hyclone,Logan,USA)，在37℃， 5％CO2的培养箱中培养，24h后细胞贴壁，弃掉旧培养液。
2、细胞分组
空白组：不含任何药物，仅用DMEM完全培养液培养。
模型组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入200μM H2O2，继续培养36小时,并置于显微镜下观察细胞形态。
对照组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、25μM、 50μM)式Trolox培养1小时，再加入25μM H2O2，继续培养36小时。
1a组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、25μM、50 μM)式1a化合物培养1小时，再加入25μM H2O2，继续培养36小时。
1b组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、25μM、50 μM)式1b化合物培养1小时，再加入25μM H2O2，继续培养36小时。
3、MTT检测
1)加入MTT溶液(0.5mg/mL)20μL孔，37℃继续孵育4h。2)弃掉废液，加入 DMSO 150μL/孔，恒温振荡器上振荡10min。
2)酶标仪(Thermo Scientific Multiskan MK3,Shanghai,China)。490nm处检测各孔吸光度值。
4、统计学处理
所有的结果和数据在至少三个独立的实验中得到证实。所有得出的数据结果均表示为平均值±标准差
Figure BDA0003103339400000101
使用GraphPad Prism 6(加利福尼亚，美国)软件对各组数据进行单因素方差分析，P<0.05被认为具有统计学意义。
5、实验结果
实验结果如图31所示，与空白组相比，H2O2诱导的细胞存活率降低(P<0.01)。与模型组相比，25μM式1a化合物和式1b化合物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤均有保护作用，细胞存活率分别提高了27.7％和14.1％。而阳性对照Trolox在相同浓度下可使细胞活力增加13.9％。因此选择25μM作为阳性药物浓度进行后续实验。
实施例3：Annexin V-FITC/PI双染法检测式1a化合物和式1b化合物对H2O2诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的影响。
1.细胞培养步骤同实施例2
2.细胞分组：具体步骤同实施例2，其中，式1a化合物和式1b化合物的浓度均为 25μM。
3.Annexin V-FITC/PI双染：应用Annexin V-FITC和PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。在室温下先用Annexin V-FITC染色，再用PI染色15分钟。采用流式细胞仪 (BectonDickinson，Franklin Lakes，USA)进行凋亡率定量。
4.统计学处理同实施例2
5.实验结果：实验结果如图32所示，与对照组相比，单用200μM H2O2处理时，细胞凋亡率明显升高(P<0.01)，达33.3％。而用25μM的式1a化合物和式1b化合物预处理后，H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡率降低(P<0.01)，分别为20.3％和31.5％。以上结果表明，式1a化合物和式1b化合物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有抑制作用。
实施例4：采用H2DCF-DA染色和流式细胞仪检测式1a和式1b对H2O2诱导的氧化应激的抵抗能力。
1.细胞培养步骤同实施例2
2.细胞分组具体步骤同实施例2，其中，式1a化合物和式1b化合物的浓度均为25 μM。
3.H2DCF-DA染色应用H2DCF-DA染色和流式细胞仪检测细胞凋亡率。在先用H2DCF-DA 染色，采用流式细胞仪(Becton Dickinson，Franklin Lakes，USA)进行凋亡率定量。
4.统计学处理同实施例2
5.实验结果实验结果如图33所示，与空白组相比，单用200μM H2O2所诱导的活性氧含量明显增加，达64.9％，具有显著性差异(P<0.01)。再用25μM的式1a 化合物和式1b化合物预处理之后，H2O2所诱导的活性氧含量明显降低，分别为39.3％与56.9％，具有显著性差异(P<0.01)。结果表明，式1a化合物和式1b化合物对 H2O2诱导的SH-SY5Y细胞活性氧的增加具有抑制作用。实施例5：通过检测抗氧化酶(SOD、 CAT、GSH-Px)活性，评估式1a化合物和式1b化合物增加SH-SY5Y细胞抗氧化能力。
实施例5：通过检测抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性，评估式1a化合物和式1b 化合物增加SH-SY5Y细胞抗氧化能力。
1.细胞培养步骤同实施例2
2.细胞分组：具体步骤同实施例2，其中，式1a化合物和式1b化合物的浓度均为 25μM。
3.检测抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性：应用抗氧化物酶试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)总活力。
4.统计学处理同实施例2
5.实验结果：实验结果如图34所示，与空白组相比，单用200μM H2O2所诱导的抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活力明显降低，具有显著性差异(P<0.05)。再用25μM 的式1a化合物和式1b化合物预处理之后，H2O2所诱导的抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px) 活力明显升高，具有显著性差异(P<0.05)。结果表明，式1a化合物和式1b化合物能对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞提高抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性，具有增强SH-SY5Y 细胞抗氧化能力。

Claims (9)

1.一种生物碱类化合物，其特征在于：生物碱类化合物为具有式1、式2、式3、式4的结构，
Figure 407491DEST_PATH_IMAGE001
Figure 133526DEST_PATH_IMAGE002
Figure 682319DEST_PATH_IMAGE004
。
2.一种权利要求1所述生物碱类化合物，其特征在于：所述式1的两种异构体1a和1b结构为：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 567098DEST_PATH_IMAGE006
。
3.一种权利要求1-2任一项所述生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：
1）取干燥的菘蓝（Isatis indigotica Fortune）药材，经乙醇的水溶液反复提取，合并所有提取液减压浓缩，干燥得到粗提物；
2）取步骤1）中的粗提物进行聚酰胺柱层析，用体积比30~90%的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，收集60％洗脱液；
3）收集步骤2）中洗脱组分再依次进行经HP-20大孔树脂柱层析、ODS柱层析以及硅胶柱层析，进一步用高效液相色谱进行纯化，得式1、式2、式3、式4化合物。
4.按权利要求3所述生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：
所述步骤3）中收集洗脱液首先经HP-20大孔树脂柱层析，洗脱液为体积比为0~90%的乙醇-水，收集60％的乙醇-水洗脱液再经ODS柱层析，展开剂为体积比为10:90-90:0的乙醇-水，收集展开剂为体积比为40:60的乙醇-水部分再进行硅胶柱层析，展开剂为体积比为50:1-1:1的石油醚-乙酸乙酯；收集不同组分经高效液相色谱分离，流动相为1:3-1:10的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3 mL/min，紫外检测器检测波长为210 nm，即获得相应化合物。
5.按权利要求4所述生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：
当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为20:1的组分进行高效液相色谱分离时，流动相为1:3的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3 mL/min，紫外检测器检测波长为210 nm，即得到式1化合物；
当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为10:1的组分进行高效液相色谱分离时，流动相为1:5的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3 mL/min，紫外检测器检测波长为210 nm，即得到式2化合物；
当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为8:1的组分进行高效液相色谱分离时，流动相为1:7的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3 mL/min，紫外检测器检测波长为210 nm，即得到式3化合物；
当收集硅胶柱层析展开剂为体积比为5:1的组分进行高效液相色谱分离时，流动相为1:10的乙腈-水混合溶剂，流速为0.3 mL/min，紫外检测器检测波长为210 nm，即得到式4化合物。
6.按权利要求4所述生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：收集式1化合物的洗脱组分后采用高效液相色谱拆分手性，以直链淀粉一三(3,5－二甲苯基氨基甲酸酯)作为固定相，流动相为3:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.3 mL/min，紫外检测器检测波长为210 nm，在保留时间为16.2min收集到式1a化合物，以及在保留时间22.4min收集到1b化合物。
7.按权利要求3所述生物碱类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤1）取干燥的菘蓝（Isatis indigotica Fortune）药材，用其2倍体积量的乙醇的水溶液浸泡过夜，再用7倍体积量的乙醇的水溶液提取3次，其中，乙醇的体积浓度为75%，提取采用加热回流提取，合并所有提取液，进行减压浓缩，回收溶剂，减压浓缩完成后，干燥得到粗提物。
8.一种权利要求1所述生物碱类化合物的应用，其特征在于：所述化合物在制备神经抗氧化药物中的用途。
9.按权利要求8所述生物碱类化合物的应用，其特征在于：所述化合物在制备治疗选自阿尔兹海默病或帕金森病的神经性退行性疾病药物中的用途。
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