CN113307824A - 一种双亲性材料及其在制备脂质体中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双亲性材料及其在制备脂质体中的应用，具体地，本发明提供一种双亲性材料。本发明所述述的双亲性材料用于制备的载药纳米颗粒能够有效进入细胞如肿瘤细胞，从而增强药物的治疗效果。

Description

一种双亲性材料及其在制备脂质体中的应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种双亲性材料及其在制备脂质体中的应用。
背景技术
肿瘤是一种严重威胁生命健康的疾病，对抗肿瘤药物的研究成为当今的研究热点。
虽然现有技术中开发了许多抗癌药物，但抗肿瘤效果并不是太理想，其中，重要的原因是由于抗癌药物的肿瘤血管渗透性差和难以被肿瘤细胞吸收进，从而大大限制了抗肿瘤药物的治疗效果。
肿瘤血管内皮细胞组织良好且紧密堆积，即便是药物递送到这些肿瘤的血管时，药物由于受到组织良好且紧密堆积的血管内皮细胞的阻碍，难以有效的透过血管内皮细胞间隙到达肿瘤部位微环境中，因此，现有的抗肿瘤药物在肿瘤除的渗透性低，无法在肿瘤微环境进行有效聚集，进而无法有效的发挥抗肿瘤效果。此外，对肿瘤而言，即便抗肿瘤药物从肿瘤血管内皮细胞间隙渗透进入肿瘤部位，然而抗肿瘤药物从肿瘤血管中渗出后主要保留在血管附近，将迅速返回血流，在低渗透性肿瘤中被快速清除，阻碍抗肿瘤药物进入肿瘤细胞内，从而无法有效的发挥抗肿瘤效果。
因此，本领域迫切需要开发一种对肿瘤具有优异治疗效果的药物。
发明内容
本发明的目的在于开发一种双亲性材料，所述的双亲性材料用于制备的纳米颗粒如脂质体能够有效进入细胞(如肿瘤细胞)，增强药物的治疗效果。
本发明的第一个方面，提供一种双亲性材料，所述的双亲性材料的结构如下所示：
Figure BDA0003038983300000011
本发明第二个方面，提供一种如本发明第一个方面所述的双亲性材料的用途，用于制备纳米颗粒。
优选地，所述纳米颗粒的粒径为200-500nm，较佳地300-450nm，更佳地330-400nm，更佳地360-400nm，更佳地370-390nm。
优选地，所述的双亲性材料促进所述的纳米颗粒进入肿瘤细胞。
优选地，所述的双亲性材料促进所述的纳米颗粒通过胞吞转运进入肿瘤细胞。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括实体瘤。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性实体肿瘤。
优选地，所述的肿瘤选自下组：胰腺癌、胶质瘤，或其组合。
优选地，所述的胰腺癌为胰腺导管腺癌。
优选地，所述的胰腺癌为人胰腺导管腺癌。
优选地，所述的胶质瘤为脑神经胶质瘤。
优选地，所述的胶质瘤为人脑神经胶质瘤。
优选地，所述的纳米颗粒包括如本发明第一个方面所述的双亲性材料。
优选地，所述的纳米颗粒为纳米粒或脂质体。
优选地，所述的双亲性材料作为纳米粒的纳米材料。
优选地，所述的纳米粒还包括其它纳米材料。
优选地，所述的纳米材料包括双亲性纳米材料。
优选地，所述的其它纳米材料选自下组：聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)。
优选地，所述的双亲性材料作为脂质体的脂质材料。
优选地，所述的脂质体还包括其它脂质材料。
优选地，所述的脂质材料包括双亲性脂质材料。
优选地，所述的其它脂质材料选自下组：1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、大豆磷脂、磷脂酰胆碱(PC，卵磷脂)、胆固醇、磷脂酰乙醇胺(PE，脑磷脂)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油 (PG)、二鲸蜡磷酸酯(DCP)、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)和二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，或其组合。
优选地，所述的脂质材料包括1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、如本发明第一个方面所述的双亲性材料和1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)。
优选地，所述的1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)选自下组：DSPE-PEG600、DSPE-PEG800、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG4000、 DSPE-PEG6000，或其组合。
优选地，所述的纳米颗粒为负载药物的纳米颗粒。
优选地，所述的双亲性材料促进所述负载药物的纳米颗粒进入肿瘤细胞，增强药物对肿瘤的杀伤作用。
优选地，所述的双亲性材料促进所述负载药物的纳米颗粒通过胞吞转运进入肿瘤细胞，增强药物对肿瘤的杀伤作用。
优选地，所述的药物包括抗癌药物。
优选地，所述的抗癌药物包括化学药物。
优选地，所述的抗癌药物包括吉西他滨、阿糖胞苷、阿霉素、氟尿嘧啶，或其组合。
优选地，所述的抗癌药物包括吉西他滨。
优选地，所述的药物包括游离药物形式或前药形式。
优选地，所述的药物包括前药。
优选地，所述的前药包括游离药物修饰在前药载体上形成的前药。
优选地，所述的修饰包括化学修饰和/或物理修饰。
优选地，所述的前药包括游离药物与前药载体通过化学键连接。
优选地，所述的药物为疏水药物或亲水药物。
优选地，所述的游离药物为疏水药物或亲水药物。
优选地，所述的前药载体为疏水载体或亲水载体。
优选地，所述的前药载体为高级脂肪酸载体或高级脂肪醇载体。
优选地，所述的前药载体为含有12-26(优选为14-22，更选地16-20)个碳原子的高级脂肪酸。
优选地，所述的前药载体为含有12-26(优选为14-22，更选地16-20)个碳原子的高级脂肪醇。
优选地，所述的高级脂肪酸载体选自下组：棕榈酸(十六烷酸)、珠光脂酸(十七烷酸)、硬脂酸(十八烷酸)、油酸(十八烯酸)、亚油酸(十八碳二烯酸)、亚麻酸(十八碳三烯酸)、花生酸(二十烷酸)、二十碳五烯酸、山萮酸(二十二烷酸)、DHA (二十二碳六烯酸)、木质素酸(二十四烷酸)，或其组合。
优选地，所述的油酸包括反油酸。
优选地，所述的高级脂肪醇载体选自下组：棕榈醇、硬脂醇、油醇、亚油醇、亚麻醇、花生醇、二十碳五烯醇、山萮醇、二十二碳六烯醇，或其组合。
优选地，所述的前药为双亲性前药。
优选地，所述的双亲性前药作为纳米粒的纳米材料。
优选地，所述的双亲性前药作为脂质体的脂质材料。
优选地，所述的双亲性前药作为脂质双分子层。
优选地，所述的双亲性前药包括药物活性成分作为亲水部分和前药载体作为疏水部分；或
所述的双亲性前药包括药物活性成分作为疏水部分和前药载体作为亲水部分；
优选地，所述的前药包括：
D-C
其中，“D”为药物活性成分，“C”为前药载体，“-”连接键。
优选地，所述的前药包括：
Figure BDA0003038983300000031
其中，R为抗癌药物，所述的抗癌药物包括吉西他滨、阿糖胞苷、阿霉素、氟尿嘧啶，或其组合。
优选地，所述的药物包括吉西他滨反油酸酯。
优选地，所述的前药包括吉西他滨反油酸酯。
优选地，所述的吉西他滨反油酸酯结构如下：
Figure BDA0003038983300000032
优选地，所述药物通过选自下组的一种或多种方式负载在所述的纳米颗粒中：
(i)所述纳米颗粒包裹所述的游离药物；和/或
(ii)药物以双亲性前药形式作为纳米材料或脂质材料。
优选地，所述的纳米颗粒通过薄膜分散体、溶剂挥发法或超声法制备。
本发明第三个方面，提供一种纳米颗粒，所述的纳米颗粒包括如本发明第一个方面所述的双亲性材料。
优选地，所述纳米颗粒的粒径为200-500nm，较佳地300-450nm，更佳地330-400nm，更佳地360-400nm，更佳地370-390nm。
优选地，所述的纳米颗粒为纳米粒或脂质体。
优选地，所述的双亲性材料作为纳米粒的纳米材料。
优选地，所述的纳米粒还包括其它纳米材料。
优选地，所述的纳米材料包括双亲性纳米材料。
优选地，所述的其它纳米材料选自下组：聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)。
优选地，所述的双亲性材料作为脂质体的脂质材料。
优选地，所述的脂质体还包括其它脂质材料。
优选地，所述的脂质材料包括双亲性脂质材料。
优选地，所述的其它脂质材料选自下组：1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、大豆磷脂、磷脂酰胆碱(PC，卵磷脂)、胆固醇、磷脂酰乙醇胺(PE，脑磷脂)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油 (PG)、二鲸蜡磷酸酯(DCP)、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)和二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，或其组合。
优选地，所述的1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)选自下组：DSPE-PEG600、DSPE-PEG800、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG4000、 DSPE-PEG6000，或其组合。
优选地，所述的脂质材料包括1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、如本发明第一个方面所述的双亲性材料和1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)。
优选地，所述的纳米颗粒为未负载药物或负载药物的纳米颗粒。
本发明第四个方面，提供一种如本发明第三个方面所述的纳米颗粒的用途，用于负载药物。
优选地，所述的纳米颗粒促进药物(如抗癌药物)进入肿瘤细胞，增强药物对肿瘤的杀伤作用。
优选地，所述的纳米颗粒促进药物(如抗癌药物)通过胞吞作用进入肿瘤细胞，增强药物对肿瘤的杀伤作用。
优选地，所述的药物包括抗癌药物。
优选地，所述的抗癌药物包括化学药物。
优选地，所述的抗癌药物包括吉西他滨、阿糖胞苷、阿霉素、氟尿嘧啶，或其组合。
优选地，所述的抗癌药物包括吉西他滨。
优选地，所述的药物包括游离药物形式或前药形式。
优选地，所述的药物包括前药。
优选地，所述的前药包括游离药物修饰在前药载体上形成的前药。
优选地，所述的修饰包括化学修饰和/或物理修饰。
优选地，所述的前药包括游离药物与前药载体通过化学键连接。
优选地，所述的药物为疏水药物或亲水药物。
优选地，所述的游离药物为疏水药物或亲水药物。
优选地，所述的前药载体为疏水载体或亲水载体。
优选地，所述的前药载体为高级脂肪酸载体或高级脂肪醇载体。
优选地，所述的前药载体为含有12-26(优选为14-22，更选地16-20)个碳原子的高级脂肪酸。
优选地，所述的前药载体为含有12-26(优选为14-22，更选地16-20)个碳原子的高级脂肪醇。
优选地，所述的高级脂肪酸载体为棕榈酸(十六烷酸)、珠光脂酸(十七烷酸)、硬脂酸(十八烷酸)、油酸(十八烯酸)、亚油酸(十八碳二烯酸)、亚麻酸(十八碳三烯酸)、花生酸(二十烷酸)、二十碳五烯酸、山萮酸(二十二烷酸)、DHA(二十二碳六烯酸)或木质素酸(二十四烷酸)。
优选地，所述的油酸包括反油酸。
优选地，所述的高级脂肪醇载体选自下组：棕榈醇、硬脂醇、油醇、亚油醇、亚麻醇、花生醇、二十碳五烯醇、山萮醇、二十二碳六烯醇，或其组合。
优选地，所述的前药为双亲性前药。
优选地，所述的双亲性前药作为纳米粒的纳米材料。
优选地，所述的双亲性前药作为脂质体的脂质材料。
优选地，所述的双亲性前药作为脂质双分子层。
优选地，所述的双亲性前药包括药物活性成分作为亲水部分和前药载体作为疏水部分；或
所述的双亲性前药包括药物活性成分作为疏水部分和前药载体作为亲水部分；
优选地，所述的前药包括：
D-C
其中，“D”为药物活性成分，“C”为前药载体，“-”连接键。
优选地，所述的前药包括：
Figure BDA0003038983300000051
其中，R为抗癌药物，所述的抗癌药物包括吉西他滨、阿糖胞苷、阿霉素、氟尿嘧啶，或其组合。
优选地，所述的药物包括吉西他滨反油酸酯。
优选地，所述的前药包括吉西他滨反油酸酯。
优选地，所述的吉西他滨反油酸酯结构如下：
Figure BDA0003038983300000052
优选地，所述药物通过选自下组的一种或多种方式负载在所述的纳米颗粒中：
(i)所述纳米颗粒包裹所述的游离药物；和/或
(ii)药物以双亲性前药形式作为纳米材料或脂质材料。
本发明第五个方面，提供一种脂质体，所述的脂质体包括脂质材料和前药；
所述的脂质材料包括1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、如本发明第一个方面所述的双亲性材料和1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇 (DSPE-PEG)。
优选地，所述脂质体的粒径为200-500nm，较佳地300-450nm，更佳地330-400nm，更佳地360-400nm，更佳地370-390nm。
优选地，所述的脂质材料作为脂质双分子层。
优选地，所述前药作为脂质体的脂质材料。
优选地，所述前药作为脂质双分子层。
优选地，所述的1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)选自下组：DSPE-PEG600、DSPE-PEG800、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG4000、 DSPE-PEG6000，或其组合。
优选地，所述的前药包括游离药物修饰在前药载体上形成的前药。
优选地，所述的游离药物包括抗癌药物。
优选地，所述的抗癌药物包括化学药物。
优选地，所述的抗癌药物包括吉西他滨、阿糖胞苷、阿霉素、氟尿嘧啶，或其组合。
优选地，所述的抗癌药物包括吉西他滨。
优选地，所述的修饰包括化学修饰和/或物理修饰。
优选地，所述的前药包括游离药物与前药载体通过化学键连接。
优选地，所述的游离药物为疏水药物或亲水药物。
优选地，所述的前药载体为疏水载体或亲水载体。
优选地，所述的前药载体为高级脂肪酸载体或高级脂肪醇载体。
优选地，所述的前药载体为含有12-26(优选为14-22，更选地16-20)个碳原子的高级脂肪酸。
优选地，所述的前药载体为含有12-26(优选为14-22，更选地16-20)个碳原子的高级脂肪醇。
优选地，所述的高级脂肪酸载体选自下组：棕榈酸(十六烷酸)、珠光脂酸(十七烷酸)、硬脂酸(十八烷酸)、油酸(十八烯酸)、亚油酸(十八碳二烯酸)、亚麻酸 (十八碳三烯酸)、花生酸(二十烷酸)、二十碳五烯酸、山萮酸(二十二烷酸)、DHA (二十二碳六烯酸)、木质素酸(二十四烷酸)，或其组合。
优选地，所述的高级脂肪醇载体选自下组：棕榈醇、硬脂醇、油醇、亚油醇、亚麻醇、花生醇、二十碳五烯醇、山萮醇、二十二碳六烯醇，或其组合。
优选地，所述的油酸包括反油酸。
优选地，所述的前药为双亲性前药。
优选地，所述的双亲性前药包括药物活性成分作为亲水部分和前药载体作为疏水部分；或
所述的双亲性前药包括药物活性成分作为疏水部分和前药载体作为亲水部分；
优选地，所述的前药包括：
D-C
其中，“D”为药物活性成分，“C”为前药载体，“-”连接键。
优选地，所述的前药包括：
Figure BDA0003038983300000061
其中，R为抗癌药物，所述的抗癌药物包括吉西他滨、阿糖胞苷、阿霉素、氟尿嘧啶，或其组合。
优选地，所述的药物包括吉西他滨反油酸酯。
优选地，所述的前药包括吉西他滨反油酸酯。
优选地，所述的吉西他滨反油酸酯结构如下：
Figure BDA0003038983300000062
优选地，所述的脂质体还包括水、缓冲溶液和/或全氟正戊烷。
优选地，所述的脂质双分子层包裹水、缓冲溶液和/或全氟正戊烷。
优选地，所述的脂质体包裹水、缓冲溶液和/或全氟正戊烷。
优选地，所述的缓冲溶液包括甘油磷酸盐缓冲液。
优选地，所述的甘油磷酸盐缓冲液中，甘油的体积分数为5-15％，较佳地8-12 ％，更佳地10％。
优选地，所述的甘油磷酸盐缓冲液的浓度为5-15mM，较佳地8-12mM，更佳地 10mM，以磷酸根的浓度计。
优选地，所述的甘油磷酸盐缓冲液的pH为7.2-7.6，较佳地7.4。
优选地，所述的脂质双分子层包裹全氟正戊烷和/或甘油磷酸盐缓冲液。
优选地，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与如本发明第一个方面所述的双亲性材料的重量比为0.2-2:0.2-2，较佳地0.5-1.5:0.5-1.5，更佳地 0.8-1.2:0.8-1.2，最佳地1:1。
优选地，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与如本发明第一个方面所述的双亲性材料的摩尔比为0.5-3:1，较佳地1-2:1，更佳地1.3-1.7:1。
优选地，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与1,2-二硬脂基-sn- 甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的重量比为0.5-5:1，较佳地0.8-3:1，更佳地1-2:1，更佳地1.3-1.7:1，最佳地1.5:1。
优选地，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与1,2-二硬脂基-sn- 甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的摩尔比为3-10:1，较佳地5-7:1，更佳地5-6.5:1，更佳地5.5-6.3:1，最佳地5.6-6.0:1。
优选地，所述的如本发明第一个方面所述的双亲性材料与1,2-二硬脂基-sn-甘油-3- 磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的重量比为0.5-5:1，较佳地0.8-3:1，更佳地1-2:1，更佳地1.3-1.7:1，最佳地1.5:1。
优选地，所述的如本发明第一个方面所述的双亲性材料与1,2-二硬脂基-sn-甘油-3- 磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的摩尔比为3-7:1，较佳地4-6:1，更佳地3-5:1，更佳地3.3-4.5:1，最佳地3.6-4.0:1。
优选地，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与所述前药的重量比为0.5-5:1，较佳地0.8-3:1，更佳地1-2:1，更佳地1.3-1.7:1，最佳地1.5:1。
优选地，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与所述前药的摩尔比为0.5-3:1，较佳地0.5-1.5:1，更佳地0.8-1.5：1，更佳地0.9-1.3:1，最佳地1.0-1.2:1。
优选地，所述的如本发明第一个方面所述的双亲性材料与所述前药的重量比为0.5-5:1，较佳地0.8-3:1，更佳地1-2:1，更佳地1.3-1.7:1，最佳地1.5:1。
优选地，所述的如本发明第一个方面所述的双亲性材料与所述前药的摩尔比为0.5-1.5:1，更佳地，更佳地0.5-1.0:1，最佳地0.6-0.9:1。
优选地，所述的1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)与所述前药的重量比为0.2-2:0.2-2，较佳地0.5-1.5:0.5-1.5，更佳地0.8-1.2:0.8-1.2，最佳地 1:1。
优选地，所述的1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)与所述前药的摩尔比为1:2-8，更佳地1:3-7，最佳地1:4.5-6.5。
优选地，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与全氟正戊烷的质量体积比(mg:μl)为1:20-50，较佳地1:20-40，更佳地1:25-38，更佳地1:30-35，更佳地1:22-34。
优选地，所述的如本发明第一个方面所述的双亲性材料与全氟正戊烷的质量体积比 (mg:μl)为1:20-50，较佳地1:20-40，更佳地1:25-38，更佳地1:30-35，更佳地1:32-34。
优选地，所述的1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)与全氟正戊烷的质量体积比(mg:μl)为1:30-70，较佳地1:40-60，更佳地1:45-55，更佳地1:48-52。
优选地，所述的全氟正戊烷与所述缓冲溶液的体积比为1:40-80，较佳地1:50-70，更佳地1:55-65，更佳地1:58-62。
优选地，所述的全氟正戊烷与所述甘油磷酸盐缓冲液的体积比为1:40-80，较佳地1:50-70，更佳地1:55-65，更佳地1:58-62。
本发明第六个方面，提供一种制备如本发明第五个方面所述的脂质体的方法，所述的方法包括步骤：
(1)将脂质材料和前药溶于有机溶剂中，除去有机溶剂，得到脂质膜；
(2)用全氟正戊烷和缓冲溶液对脂质膜水化后，搅拌，得到脂质体。
优选地，所述步骤(1)中，所述的有机溶剂选自下组：氯仿、二氯甲烷，或其组合。
优选地，所述步骤(1)中，所述的脂质材料与所述有机溶剂的重量体积比(mg:ml)为较佳地1-5：1，更加地1-3：1，更加地1.5-2.5：1，更加地1.8-2.2：1。
优选地，所述步骤(1)中，所述的前药与所述有机溶剂的重量体积比(mg:ml) 为0.2-2：1，较佳地0.2-1.5：1，更加地0.2-0.8：1，更加地0.4-0.6：1。
优选地，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与所述有机溶剂的重量体积比(mg:ml)为0.3-5:1，较佳地0.3-3：1，更加地0.3-2：1，更加地0.5-1： 1，更加地0.6-0.8：1。
优选地，所述的全氟正戊烷与所述甘油磷酸盐缓冲液的体积比为1:40-80，较佳地1:50-70，更佳地1:55-65，更佳地1:58-62。
优选地，所述步骤(1)中，旋转减压蒸发除去有机溶剂。
优选地，所述步骤(1)中，在35-40℃下旋转减压蒸发除去有机溶剂。
优选地，所述步骤(2)中，所述全氟正戊烷和缓冲溶液依次加入到脂质膜中，对对脂质膜水化。
优选地，所述步骤(2)中，所述水化在低温下进行。
优选地，所述低温为2-10℃，较佳地2-6℃。
优选地，所述步骤(2)中，所述的搅拌包括步骤：
先在低温下搅拌，然后升高温度后进行搅拌。
优选地，所述低温为2-10℃，较佳地2-6℃。
优选地，所述低温下搅拌的时间为0.5-1.5h，较佳地0.8-1.2h，更佳地1h。
优选地，所述升高温度为20-40℃，较佳地25-35℃，更佳地28-32℃。
优选地，所述升高温度后的搅拌时间为0.5-1.5h，较佳地0.8-1.2h，更佳地1h。
优选地，所述搅拌包括磁力搅拌子搅拌。
优选地，所述升高温度后进行搅拌中，放置搅拌液的容器处于敞口状态。
优选地，所述的升高温度后进行搅拌能够将未包裹的全氟正戊烷除去。
优选地，所述脂质体为脂质体纳米液滴的形式。
优选地，所述脂质体的包封率≥90％，较佳地≥95％，较佳地≥99％，最佳地100％。
优选地，所述脂质体的载药量为8-15wt％，较佳地9-11wt％。
优选地，所述的方法包括步骤：
(i)DPPC、如本发明第一个方面所述的双亲性材料、DSPE-PEG和吉西他滨反油酸酯溶于氯仿中，旋转减压蒸发除去溶剂，在圆底烧瓶中形成脂质膜。
(ii)将脂质膜冷却至2-6℃，加入全氟正戊烷浸入脂质膜，然后加入甘油磷酸盐缓冲液进行水化，在2-6℃下搅拌0.8-1.2h后，然后圆底烧瓶在敞口和25-35℃条件下搅拌0.8-1.2h，得到脂质体。
优选地，所述的方法包括步骤：
(i)1.2-1.8mg DPPC、1.2-1.8mg如本发明第一个方面所述的双亲性材料、 0.8-1.2mg DSPE-PEG和0.8-1.2mg吉西他滨反油酸酯溶于氯仿中，旋转减压蒸发除去溶剂，在圆底烧瓶中形成脂质膜。
(ii)将脂质膜冷却至2-6℃，加入45-55μL全氟正戊烷浸入脂质膜，然后加入2.8-3.2mL甘油磷酸盐缓冲液进行水化，在2-6℃下搅拌0.8-1.2h后，然后圆底烧瓶在敞口和25-35℃条件下搅拌0.8-1.2h，得到脂质体。
本发明第七个方面，提供一种组合物，所述的组合物包括如本发明第三个方面所述的纳米颗粒和/或如本发明第五个方面所述的脂质体。
优选地，所述的组合物为药物组合物。
优选地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
优选地，所述的组合物为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
优选地，所述的组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。
优选地，所述的注射制剂为静脉注射制剂、瘤内注射制剂、肿瘤血管内注射制剂或肿瘤微环境注射制剂。
本发明第八个方面，提供一种如本发明第三个方面所述的纳米颗粒和/或如本发明第五个方面所述的脂质体用途，用于制备预防和/或治疗疾病的组合物。
优选地，所述的纳米颗粒为负载药物的纳米颗粒。
优选地，所述的疾病为所述的药物的适应症疾病。
优选地，所述疾病包括肿瘤。
优选地，所述的组合物为药物组合物。
优选地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
优选地，所述的组合物为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
优选地，所述的组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。
优选地，所述的注射制剂为静脉注射制剂、瘤内注射制剂、肿瘤血管内注射制剂或肿瘤微环境注射制剂。
优选地，所述的前药包括抗癌药物的前药，所述的疾病包括肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括实体瘤。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性实体肿瘤。
优选地，所述的肿瘤选自下组：胰腺癌、胶质瘤，或其组合。
优选地，所述的胰腺癌为胰腺导管腺癌。
优选地，所述的胰腺癌为人胰腺导管腺癌。
优选地，所述的胶质瘤为脑神经胶质瘤。
优选地，所述的胶质瘤为人脑神经胶质瘤。
优选地，所述的治疗包括抑制、减轻、缓解、逆转或根除。
本发明第九个方面，提供一种用于治疗疾病的系统或装置，所述的系统包括如本发明第三个方面所述的纳米颗粒和/或如本发明第五个方面所述的脂质体；和超声装置。
优选地，所述的系统或装置还包括或标签，所述的说明书或标签记载：
在给所需的对象施用如本发明第三个方面所述的纳米颗粒和/或如本发明第五个方面所述的脂质体预防和/或治疗疾病过程中，对病灶部位(如肿瘤部位)进行超声刺激。
优选地，所述的纳米颗粒为负载药物的纳米颗粒。
优选地，所述的超声装置包括超声仪。
优选地，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
优选地，所述的非人哺乳动物包括牛、马、羊、狗、猫或鼠。
优选地，所述的疾病为药物的适应症疾病。
优选地，所述疾病包括肿瘤。
优选地，所述的前药包括抗癌药物的前药，所述的疾病包括肿瘤；。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括实体瘤。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性实体肿瘤。
优选地，所述的肿瘤选自下组：胰腺癌、胶质瘤，或其组合。
优选地，所述的胰腺癌为胰腺导管腺癌。
优选地，所述的胰腺癌为人胰腺导管腺癌。
优选地，所述的胶质瘤为脑神经胶质瘤。
优选地，所述的胶质瘤为人脑神经胶质瘤。
优选地，所述的施用为注射施用、口服施用或外用施用。
优选地，所述注射施用为静脉施用、瘤内注射施用、肿瘤血管内注射施用或肿瘤微环境注射施用。
本发明第十个方面，提供一种预防和/或治疗疾病的方法，给所需的对象施用如本发明第三个方面所述的纳米颗粒和/或如本发明第五个方面所述的脂质体，从而治疗疾病。
优选地，所述的纳米颗粒为负载药物的纳米颗粒。
优选地，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
优选地，所述的非人哺乳动物包括牛、马、羊、狗、猫或鼠。
优选地，所述的疾病为药物的适应症疾病。
优选地，所述疾病包括肿瘤。
优选地，所述的前药包括抗肿瘤药物的前药，所述的疾病包括肿瘤；。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括实体瘤。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性实体肿瘤。
优选地，所述的肿瘤选自下组：胰腺癌、胶质瘤，或其组合。
优选地，所述的胰腺癌为胰腺导管腺癌。
优选地，所述的胰腺癌为人胰腺导管腺癌。
优选地，所述的胶质瘤为脑神经胶质瘤。
优选地，所述的胶质瘤为人脑神经胶质瘤。
优选地，在给所需的对象施用如本发明第三个方面所述的纳米颗粒和/或如本发明第五个方面所述的脂质体，对病灶部位(如肿瘤部位)进行超声刺激。
优选地，所述的施用为注射施用、口服施用或外用施用。
优选地，所述注射施用为静脉注射施用、瘤内注射施用、肿瘤血管内注射施用或肿瘤微环境注射施用。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
附图说明
图1为DOPE-DMA的合成路线。
图2为DOPE-DMA的1H-NMR的谱图。
图3为DOPE-DMA的MALDI-TOF-MS的谱图。
图4为DOPE-SA的合成路线。
图5为DOPE-SA的1H-NMR的谱图。
图6为DOPE-SA的MALDI-TOF-MS的谱图。
图7为脂质体纳米液滴的理化特性。(7A)在37℃的pH7.4 PBS缓冲液中，SCGLN 脂质体纳米液滴的冷冻透射电子显微镜图像；(7B)在37℃的pH7.4 PBS缓冲液中， SCGLN脂质体纳米液滴经过超声刺激20秒后的冷冻透射电子显微镜图像；(7C)在37 ℃的pH7.4 PBS缓冲液中，SCGLN脂质体纳米液滴经过超声刺激5分钟后的冷冻透射电子显微镜图像。
图8为不同脂质体纳米粒子的跨血管内皮细胞转。(8A)用于研究超声(US) 刺激下的血管通透性的Transwell模型。(8B)在Transwell模型中，在有或没有超声刺激下，在37℃的pH7.4培养基中穿过HUVEC血管的基底室中的SCGLNCy5和 SGLNCy5的平均荧光强度(MFI)。(8C)在Transwell模型中，在超声刺激后，在 37℃的基底室的pH7.4或6.5培养基培养1h后，SCGLNCy5和SGLNCy5在BxPC3细胞中的平均荧光强度(MFI)。
图9为细胞毒性和凋亡测试。(9A)超声刺激后，在37℃的pH 6.5培养基中， GEM、SCGLN和SGLN脂质体纳米粒子对3D球体培养的BxPC3细胞的细胞毒性的 IC50值。(9B)在超声刺激后，在37℃的pH6.5培养基中，经GEM或不同脂质体纳米粒子(均为0.1μM GEM当量)处理72h后，在BxPC3 3D球体中，通过光学显微镜观察的细胞形态和使用TUNEL染色观察的相应凋亡分析，比例尺＝500μm。
图10为3D多细胞BxPC3肿瘤球体的渗透结果。(10A)在超声刺激后，不同脂质体纳米粒子在pH7.4或6.5培养基中的BxPC3细胞3D球体中的肿瘤渗透，以及用胞吐抑制剂EXO1预处理后的肿瘤渗透。(10B)在超声刺激后，在37℃在pH6.5 的培养基中孵育3h后，SCGLN在BxPC3细胞中的亚细胞分布，细胞核(蓝色)用 Hoechst33342染色，溶酶体(绿色)用
Figure BDA0003038983300000111
GreenDND26染色，用Cy5标记的SCGLN(红色)，比例尺＝25μm。
图11为BxPC3异种移植小鼠静脉注射脂质体纳米滴的体内分布、渗透和体内成像。(11A)超声刺激设备用于肿瘤治疗；注射Cy5标记的脂质体纳米粒子后，进行 10min的超声刺激(强度：2W/cm2，频率：3MHz，占空比：50％)。(11B)静脉注射不同脂质体纳米粒子的血液清除曲线。(11C)静脉注射不同的Cy5标记的脂质体纳米粒子8h后，小鼠及其切除的组织的生物发光和荧光图像(1为肿瘤，2为心脏， 3为肝，4为脾，5为肺，6为肾脏，7为脑，8为小肠)。(11D)使用Living
Figure BDA0003038983300000112
-4.5 软件对图C中的切除肿瘤中的荧光强度进行定量分析。(11E)Cy5标记的SCGLN 在BxPC3肿瘤小鼠中的右胁腹(接受超声刺激)和左胁腹(无超声刺激)肿瘤的体内荧光成像和生物分布。(11F)不同脂质体纳米粒子的肿瘤渗透，使用FITC-LEL 进行体内血管染色和心脏灌注后，将肿瘤切除，冷冻并切成10μm厚的切片，并通过CLSM成像进行可视化。(11G)在图11F的白色箭头所示选定区域，从血管到深入的肿瘤实质的平均荧光强度梯度。
图12为静脉注射SCGLNCy5或SGLNCy5脂质体纳米粒子在超声刺激处理后的体内实时肿瘤积累和血管外渗。(12A)使用CLSM和超声设备组装成像装置，尾静脉注射Cy5标记的不同的脂质体纳米粒子后，在肿瘤部位进行10分钟的超声刺激(强度：2W/cm2，频率：3MHz，占空比：50％)。(12B)在尾静脉注射SCGLNCy5或 SGLNCy5脂质体纳米粒子后的不同时间时，从血管渗透到肿瘤区域，SCGLNCy5或 SGLNCy5脂质体纳米粒子的体内实时肿瘤积累和渗透。(12C)在图12B的10、30 和60min时，注射SCGLNCy5或SGLNCy5脂质体纳米粒子的荧光的积分光密度(IOD) 的定量分析。(12D)在图12B的SCGLNCy5脂质体纳米粒子注射后60min时，SEM 观察和分析来肿瘤血管的超微结构。(12E)根据SEM观察，模拟超声刺激诱导的 SCGLN肿瘤积累示意图。
图13为不同脂质体纳米粒子对原位负载BxPC3肿瘤小鼠的体内抗肿瘤活性。(13A)每只小鼠接种BxPC3-Luci细胞后的实验时间表和治疗时间表。(13B)实验期间，不同组的BxPC3-Luci荷瘤小鼠的体重变化。(13C)实验结束时切除的肿瘤的照片。(13D)实验结束时每组的平均肿瘤重量。*:P＜0.05：**:P＜0.01：***:P＜ 0.001。(13E)用Ki67的H&E染色和IHC染色的肿瘤的组织学分析。
图14不同脂质体纳米粒子对皮下负载U251胶质瘤小鼠的抗肿瘤活性。(14A) 实验期间，不同组的U251荷瘤小鼠的体重变化。(14B)实验期间，不同组的U251 荷瘤小鼠的肿瘤体积变化。(14C)实验结束时不同组的U251荷瘤小鼠的肿瘤形态。 (14D)实验结束时不同组的U251荷瘤小鼠切除的肿瘤的照片。(14E)实验结束时不同组的U251荷瘤小鼠的平均肿瘤重量。*:P＜0.05：**:P＜0.01：***:P＜0.001。
具体实施方式
本发明开发了一种结构新颖的双亲性材料，所述的双亲性材料用于制备的载药纳米颗粒(如载药脂质体)能够显著有效进入细胞(如肿瘤细胞)，从而增强药物的治疗效果。具体地，本发明的实验结果表明，本发明所述的双亲性材料作为载药脂质体的脂质材料，能够显著促进载药脂质体进入肿瘤细胞，增强药物的抗肿瘤效果。本发明的实验结果还表明，本发明所述的双亲性材料用于制备的载药脂质体具有优异的长时间血液清除半衰期，在超声刺激下能够显著扩大或增加血管内皮细胞中的开口，促进载药脂质体从血管渗入的肿瘤部位，并显著促进载药脂质体进入肿瘤细胞，且避免溶酶体的滞留和降解，增强药物的抗肿瘤效果。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
在本文中，相关术语如下表A所示：
表A
Figure BDA0003038983300000121
Figure BDA0003038983300000131
如本文所用，术语“IC50”是指半抑制浓度(50％inhibiting concentration)，即达到50％抑制效果时抑制剂的浓度。
如本文所用，术语“吉西他滨前药CP4126”与“CP4126”可互换使用，吉西他滨前药CP4126的结构式如下：
Figure BDA0003038983300000132
如本文所用，术语“甘油磷酸盐缓冲液”是指含有甘油的磷酸盐缓冲液，其中浓度(如mM)是指磷酸根的浓度。
在本发明中，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法。
本发明所述的“治疗”包括抑制、减轻、缓解、逆转或根除疾病的进展，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的负载药物的纳米颗粒和脂质体时观察到的水平相比，本发明所述负载药物的纳米颗粒和脂质体将相关疾病(如肿瘤)及其并发症减轻、抑制和/或逆转了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％，或至少约100％。
在本发明中，术语“肿瘤”、“癌”和“癌症”可互换使用。
双亲性材料及其用途
本发明提供一种双亲性材料，优选地，本发明所述的双亲性材料的结构如下所示：
Figure BDA0003038983300000133
本发明还提供一种本发明所述的双亲性材料的用途，用于制备纳米颗粒。
在本发明的一个优选例中，所述的双亲性材料促进所述的纳米颗粒进入肿瘤细胞。
优选地，所述的双亲性材料促进所述的纳米颗粒通过胞吞转运进入肿瘤细胞。
在本发明的另一优选例中，所述的纳米颗粒为负载药物的纳米颗粒。
优选地，所述的双亲性材料促进所述负载药物的纳米颗粒进入肿瘤细胞，增强药物对肿瘤的杀伤作用。
优选地，所述的双亲性材料促进所述负载药物的纳米颗粒通过胞吞转运进入肿瘤细胞，增强药物对肿瘤的杀伤作用。
优选地，所述的纳米颗粒通过薄膜分散体、溶剂挥发法或超声法制备。
药物
本发明所述的药物可以负载在纳米颗粒中，发挥对疾病的治疗效果。
本发明所述的药物并没有特别的限制，优选地，所述的药物包括抗癌药物。
优选地，所述的抗癌药物包括化学药物，例如所述的抗癌药物包括吉西他滨、阿糖胞苷、阿霉素、氟尿嘧啶，或其组合。
在本发明的一个优选例中，所述的药物包括游离药物形式或前药形式。
在本发明的一个优选例中，所述的药物包括前药。前药是指药物可以经过化学结构修饰或物理修饰后得到的，在体内经酶或非酶的转化释放出活性药物而发挥药效的化合物
在本发明的一个优选例中，所述的前药包括游离药物修饰在前药载体上形成的前药。
优选地，所述的修饰包括化学修饰和/或物理修饰。例如，所述的前药包括游离药物与前药载体通过化学键连接。
在本发明的一个优选例中，所述的药物为疏水药物或亲水药物。
在本发明的一个优选例中，所述的游离药物为疏水药物或亲水药物。
在本发明的一个优选例中，所述的前药载体为疏水载体或亲水载体。
在本发明的一个优选例中，所述的前药载体为高级脂肪酸载体或高级脂肪醇载体。
优选地，所述的前药载体为含有12-26(优选为14-22，更选地16-20)个碳原子的高级脂肪酸。
在本发明的一个优选例中，所述的前药载体为含有12-26(优选为14-22，更选地16-20)个碳原子的高级脂肪醇。
代表性地，所述的高级脂肪酸载体选自下组：棕榈酸(十六烷酸)、珠光脂酸(十七烷酸)、硬脂酸(十八烷酸)、油酸(十八烯酸)、亚油酸(十八碳二烯酸)、亚麻酸(十八碳三烯酸)、花生酸(二十烷酸)、二十碳五烯酸、山萮酸(二十二烷酸)、 DHA(二十二碳六烯酸)、木质素酸(二十四烷酸)，或其组合。
在本发明的一个优选例中，所述的油酸包括反油酸。
代表性地，所述的高级脂肪醇载体选自下组：棕榈醇、硬脂醇、油醇、亚油醇、亚麻醇、花生醇、二十碳五烯醇、山萮醇、二十二碳六烯醇，或其组合。
在本发明的一个优选例中，所述的前药为双亲性前药。
在本发明的一个优选例中，所述的双亲性前药作为纳米粒的纳米材料。
在本发明的一个优选例中，所述的双亲性前药作为脂质体的脂质材料。
优选地，所述的双亲性前药作为脂质双分子层。
在本发明的一个优选例中，所述的双亲性前药包括药物活性成分作为亲水部分和前药载体作为疏水部分。
在本发明的一个优选例中，所述的双亲性前药包括药物活性成分作为疏水部分和前药载体作为亲水部分；
在本发明的一个优选例中，所述的前药包括：
D-C
其中，“D”为药物活性成分，“C”为前药载体，“-”连接键。
在本发明的一个优选例中，所述的前药包括：
Figure BDA0003038983300000141
其中，R为抗癌药物，所述的抗癌药物包括吉西他滨、阿糖胞苷、阿霉素、氟尿嘧啶，或其组合。
代表性地，所述的前药包括吉西他滨反油酸酯。
典型地，所述的吉西他滨反油酸酯结构如下：
Figure BDA0003038983300000151
在本发明的一个优选例中，所述药物通过选自下组的一种或多种方式负载在所述的纳米颗粒中：
(i)所述纳米颗粒包裹所述的游离药物；和/或
(ii)药物以双亲性前药形式作为纳米材料或脂质材料。
肿瘤
本发明所述的肿瘤并没有特别的限制，例如可以是低渗透性肿瘤或实体瘤。
优选地，所述的肿瘤包括低渗透性实体肿瘤。
在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤选自下组：胰腺癌、胶质瘤，或其组合。
代表性地，所述的胰腺癌为胰腺导管腺癌。
代表性地，所述的胰腺癌为人胰腺导管腺癌。
代表性地，所述的胶质瘤为脑神经胶质瘤。
代表性地，所述的胶质瘤为人脑神经胶质瘤。
纳米颗粒及其用途
本发明所述的纳米颗粒指纳米量级的微观颗粒，例如，所述纳米颗粒的粒径为200-500nm，较佳地300-450nm，更佳地330-400nm，更佳地360-400nm，更佳地370-390nm。
在本发明的一个优选例中，本发明所述的纳米颗粒为纳米粒或脂质体。
在本发明的一个优选例中，本发明所述的纳米颗粒为纳米粒(Nanoparticles)。纳米粒由天然或合成的高分子材料制成的、粒度在纳米数量级(0.1～100nm)的固态胶体微粒
在本发明的一个优选例中，本发明所述的纳米颗粒为脂质体。脂质体是一种具有双分子层结构的颗粒，类似细胞膜。
在本发明的一个优选例中，本发明所述的双亲性材料作为纳米粒的纳米材料。
在本发明的一个优选例中，所述的纳米粒还包括其它纳米材料。
优选地，所述的纳米材料包括双亲性纳米材料。
代表性地，所述的其它纳米材料选自下组：聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)。
在本发明的一个优选例中，所述的双亲性材料作为脂质体的脂质材料。
优选地，所述的脂质体还包括其它脂质材料。
在本发明的一个优选例中，所述的脂质材料包括双亲性脂质材料。
代表性地，所述的其它脂质材料选自下组：1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、大豆磷脂、磷脂酰胆碱(PC，卵磷脂)、胆固醇、磷脂酰乙醇胺(PE，脑磷脂)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油 (PG)、二鲸蜡磷酸酯(DCP)、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)和二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，或其组合。
优选地，所述的1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)选自下组：DSPE-PEG600、DSPE-PEG800、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG4000、 DSPE-PEG6000，或其组合。
在本发明的一个优选例中，所述的纳米颗粒为未负载药物或负载药物的纳米颗粒。
本发明还提供一种本发明所述的纳米颗粒在用于负载药物中的用途。
在本发明的一个优选例中，所述的纳米颗粒促进药物(如抗癌药物)进入肿瘤细胞，增强药物对肿瘤的杀伤作用。
本发明还提供一种本发明所述的负载药物的纳米颗粒的用途，用于制备预防和/或治疗疾病的组合物。
在本发明的一个优选例中，所述的疾病为所述的药物的适应症疾病。
代表性地，所述疾病包括肿瘤。
在本发明的一个优选例中，所述的组合物为药物组合物。
优选地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
优选地，所述的组合物为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
优选地，所述的组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。
在本发明的一个优选例中，所述的注射制剂为静脉注射制剂、瘤内注射制剂、肿瘤血管内注射制剂或肿瘤微环境注射制剂。
在本发明的一个优选例中，所述的治疗包括抑制、减轻、缓解、逆转或根除。
脂质体、制备方法及其用途
本发明所述的纳米颗粒优选为负载药物的脂质体(Liposomes)。脂质体是一种具有双分子层结构的颗粒，类似细胞膜。
在本发明的一个优选例中，本发明所述的脂质体包括脂质材料和药物，所述的脂质材料作为脂质双分子层；
所述的脂质材料包括1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、本发明所述的双亲性材料和1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)。
在本发明的一个优选例中，本发明所述的脂质体中的药物为前药。
在本发明的一个优选例中，所述脂质体的粒径为200-500nm，较佳地300-450nm，更佳地330-400nm，更佳地360-400nm，更佳地370-390nm。
在本发明的一个优选例中，所述前药作为脂质体的脂质材料。
优选地，所述前药作为脂质双分子层。
在本发明的一个优选例中，所述的1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇 (DSPE-PEG)选自下组：DSPE-PEG600、DSPE-PEG800、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG4000、DSPE-PEG6000，或其组合。
在本发明的一个优选例中，所述的脂质体还包括水、缓冲溶液和/或全氟正戊烷。
在本发明的一个优选例中，所述的脂质体包裹水、缓冲溶液和/或全氟正戊烷。
优选地，所述的脂质双分子层包裹水、缓冲溶液和/或全氟正戊烷。
在本发明的一个优选例中，所述的缓冲溶液包括甘油磷酸盐缓冲液。
优选地，所述的甘油磷酸盐缓冲液中，甘油的体积分数为5-15％，较佳地8-12 ％，更佳地10％。
优选地，所述的甘油磷酸盐缓冲液的浓度为5-15mM，较佳地8-12mM，更佳地 10mM，以磷酸根的浓度计。
优选地，所述的甘油磷酸盐缓冲液的pH为7.2-7.6，较佳地7.4。
优选地，所述的脂质双分子层包裹全氟正戊烷和/或甘油磷酸盐缓冲液。
在本发明的一个优选例中，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与本发明所述的双亲性材料的重量比为0.2-2:0.2-2，较佳地0.5-1.5:0.5-1.5，更佳地0.8-1.2:0.8-1.2，最佳地1:1。
优选地，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与1,2-二硬脂基-sn- 甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的重量比为0.5-5:1，较佳地0.8-3:1，更佳地1-2:1，更佳地1.3-1.7:1，最佳地1.5:1。
优选地，所述的本发明所述的双亲性材料与1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- 聚乙二醇(DSPE-PEG)的重量比为0.5-5:1，较佳地0.8-3:1，更佳地1-2:1，更佳地1.3-1.7:1，最佳地1.5:1。
优选地，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与所述前药的重量比为0.5-5:1，较佳地0.8-3:1，更佳地1-2:1，更佳地1.3-1.7:1，最佳地1.5:1。
优选地，所述的本发明所述的双亲性材料与所述前药的重量比为0.5-5:1，较佳地0.8-3:1，更佳地1-2:1，更佳地1.3-1.7:1，最佳地1.5:1。
优选地，所述的1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)与所述前药的重量比为0.2-2:0.2-2，较佳地0.5-1.5:0.5-1.5，更佳地0.8-1.2:0.8-1.2，最佳地 1:1。
优选地，所述的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)与全氟正戊烷的质量体积比(mg:μl)为1:20-50，较佳地1:20-40，更佳地1:25-38，更佳地1:30-35，更佳地1:22-34。
优选地，所述的本发明所述的双亲性材料与全氟正戊烷的质量体积比(mg:μl) 为1:20-50，较佳地1:20-40，更佳地1:25-38，更佳地1:30-35，更佳地1:32-34。
优选地，所述的1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)与全氟正戊烷的质量体积比(mg:μl)为1:30-70，较佳地1:40-60，更佳地1:45-55，更佳地1:48-52。
优选地，所述的全氟正戊烷与所述缓冲溶液的体积比为1:40-80，较佳地1:50-70，更佳地1:55-65，更佳地1:58-62。
优选地，所述的全氟正戊烷与所述甘油磷酸盐缓冲液的体积比为1:40-80，较佳地1:50-70，更佳地1:55-65，更佳地1:58-62。
具体地，本发明所述的脂质体如上本发明第五个方面所述。
本发明还提供一种制备本发明所述的脂质体的方法，所述的方法包括步骤：
(1)将脂质材料和前药溶于有机溶剂中，除去有机溶剂，得到脂质膜；
(2)用全氟正戊烷和缓冲溶液对脂质膜水化后，搅拌，得到脂质体。
优选地，所述步骤(1)中，所述的有机溶剂选自下组：氯仿、二氯甲烷，或其组合。
优选地，所述的全氟正戊烷与所述甘油磷酸盐缓冲液的体积比为1:40-80，较佳地1:50-70，更佳地1:55-65，更佳地1:58-62。
代表性地，所述的方法包括步骤：
(i)DPPC、如本发明所述的双亲性材料(DOPE-DMA)、DSPE-PEG和吉西他滨反油酸酯溶于氯仿中，旋转减压蒸发除去溶剂，在圆底烧瓶中形成脂质膜。
(ii)将脂质膜冷却至2-6℃，加入全氟正戊烷浸入脂质膜，然后加入甘油磷酸盐缓冲液进行水化，在2-6℃下搅拌0.8-1.2h后，然后圆底烧瓶在敞口和25-35℃条件下搅拌0.8-1.2h，得到脂质体。
典型地，所述的方法包括步骤：
(i)1.2-1.8mg DPPC、1.2-1.8mg如本发明所述的双亲性材料(DOPE-DMA)、 0.8-1.2mg DSPE-PEG和0.8-1.2mg吉西他滨反油酸酯溶于氯仿中，旋转减压蒸发除去溶剂，在圆底烧瓶中形成脂质膜。
(ii)将脂质膜冷却至2-6℃，加入45-55μL全氟正戊烷浸入脂质膜，然后加入 2.8-3.2mL甘油磷酸盐缓冲液进行水化，在2-6℃下搅拌0.8-1.2h后，然后圆底烧瓶在敞口和25-35℃条件下搅拌0.8-1.2h，得到脂质体。
在本发明的一个优选例中，本发明所述的脂质体的制备方法如上本发明第六个方面所述。
本发明还提供一种本发明所述的负载药物的脂质体的用途，用于制备预防和/或治疗疾病的组合物。
在本发明的一个优选例中，所述的疾病为所述的药物的适应症疾病。
代表性地，所述疾病包括肿瘤。
在本发明的一个优选例中，所述的组合物为药物组合物。
优选地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
优选地，所述的组合物为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
优选地，所述的组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。
在本发明的一个优选例中，所述的注射制剂为静脉注射制剂、瘤内注射制剂、肿瘤血管内注射制剂或肿瘤微环境注射制剂。
在本发明的一个优选例中，所述的治疗包括抑制、减轻、缓解、逆转或根除。
系统或装置
本发明还提供一种用于治疗疾病的系统或装置，所述的系统或装置包括如本发明所述的纳米颗粒或脂质体；和超声装置。
在本发明的一个优选例中，所述的系统或装置还包括或标签，所述的说明书或标签记载：
在给所需的对象施用如本发明所述的脂质体脂质体预防和/或治疗疾病过程中，对病灶部位(如肿瘤部位)进行超声刺激。
在本发明的一个优选例中，所述的超声装置包括超声仪。
在本发明的一个优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在本发明的一个优选例中，所述的非人哺乳动物包括牛、马、羊、狗、猫或鼠。
在本发明的一个优选例中，所述的疾病为药物的适应症疾病。
在本发明的一个优选例中，所述疾病包括肿瘤。
在本发明的一个优选例中，所述的施用为注射施用、口服施用或外用施用。
在本发明的一个优选例中，所述注射施用为静脉施用、瘤内注射施用、肿瘤血管内注射施用或肿瘤微环境注射施用。
预防和/或治疗疾病的方法
本发明还提供一种预防和/或治疗疾病的方法，所述的方法包括步骤：
给所需的对象施用如本发明所述的纳米颗粒或脂质体，从而治疗疾病。
优选地，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
优选地，所述的非人哺乳动物包括牛、马、羊、狗、猫或鼠。
优选地，所述的疾病为药物的适应症疾病。
优选地，所述疾病包括肿瘤。
优选地，在给所需的对象施用如本发明所述的纳米颗粒或脂质体体过程中，对病灶部位(如肿瘤部位)进行超声刺激。
优选地，所述的施用为注射施用、口服施用或外用施用。
优选地，所述注射施用为静脉注射施用、瘤内注射施用、肿瘤血管内注射施用或肿瘤微环境注射施用。
组合物
本发明所述的组合物包括但并不限于药物组合物。
本发明的组合物还可以包括药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可接受的载体可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温
Figure BDA0003038983300000191
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明组合物施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：注射施用、口服施用或外用施用。优选地，所述注射施用为静脉注射施用、瘤内注射施用、肿瘤血管内注射施用或肿瘤微环境注射施用。
本发明所述的组合物或制剂的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。代表性地，用于口服施用或给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡； (f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h) 吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部施用或给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
施用组合物时，是将安全有效量的本发明所述的纳米颗粒或脂质体适用于需要治疗的人或非人动物(如大鼠、小鼠、狗、猫、牛、羊、鸡、鸭等)，其中施用时剂量为药学上可接受认为的有效给药剂量。如本文所用，术语“安全有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“安全有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。例如，对于 60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.1～1000mg，优选1～600mg，更优选为 2-300mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要技术效果包括：
1.本发明开发了一种结构新颖的双亲性材料，所述的双亲性材料用于制备的载药纳米颗粒(如载药脂质体)能够显著有效进入肿瘤细胞，从而增强药物的抗肿瘤治疗效果。
2.本发明所述的双亲性材料用于制备的载药纳米颗粒(如载药脂质体)具有优异的长时间血液清除半衰期，在超声刺激下能够显著扩大或增加血管内皮细胞中的开口，促进载药脂质体从血管渗入的肿瘤部位，并显著促进载药脂质体进入肿瘤细胞，且避免溶酶体的滞留和降解，增强药物的抗肿瘤效果。
3.本发明所述的双亲性材料生物相容性好、安全性高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下具体实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1
1.材料与仪器
1.1材料
除指定以外的所有化学试剂均购自Sigma-Aldrich Inc和Aladdin ReagentInc.。 DOPE，DPPC和DSPE-PEG2000购自Avanti Lipids Inc.(美国)。Cyanine5(Cy5) 标记的DSPE-PEG2000(DSPE-PEGCy5)购自西安瑞禧生物科技有限公司。EXO1和吉西他滨前药CP4126购自Med-chem Express。RPMI 1640培养基、DMEM培养基，胎牛血清(FBS)和0.25％胰蛋白酶溶液购自GIBCO(USA)。Alamar Blue Cell Viability Reagent、Hoechst 33342和
Figure BDA0003038983300000201
Green DND26购自Thermo Fisher Scientific Inc.。Ki67抗体购自Proteintech Group。TUNEL细胞凋亡测定试剂盒购自罗氏公司。基质胶基底膜基质(Matrigel basement membrane matrix)购自BD Biosciences。
其中，吉西他滨前药CP4126为吉西他滨反油酸酯，结构如下：
Figure BDA0003038983300000202
1.2仪器
使用动态光散射分析仪(Nano-ZS 90，Malvern)测量纳米颗粒的流体动力学直径(粒径)大小和zeta电位(电势)，选择纳米粒子的折射率为1.59，以通过强度百分比(强度％)确定粒径。
通过冷冻透射电子显微镜(cryo-TEM)(Talos F200C 200kv，FEI Inc.)在碳涂层的200目铜TEM网格中对纳米颗粒的形貌进行成像.
用酶标仪(SpectraMax M5，Molecular Devices)检测Cy5标记的纳米颗粒的荧光光谱和荧光强度。
2.细胞培养和动物模型
人源性胰腺导管腺癌(PDA)细胞系BxPC3，人源性神经胶质瘤细胞系U251，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自美国典型培养物保藏中心。BxPC3在RPMI 1640 培养基中培养，U251和HUVEC在DMEM培养基中培养，这些培养基添加10％FBS、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)，培养在37℃和5％CO2湿润气体中进行。
雄性BALB/c小鼠(6-8周)由浙江中医药大学实验动物中心提供。将小鼠以12h 的明/暗周期饲养在批准的动物饲养设施中，自由饮食。通过皮下或胰腺原位接种稳定表达荧光素酶的BxPC3细胞(BxPC3-Luci)，构建胰腺癌小鼠模型；通过皮下接种U251细胞系，构建脑胶质瘤小鼠模型。
3.脂质材料的合成
3.1 DOPE-DMA的合成
Figure BDA0003038983300000211
DOPE-DMA的合成方法如图1所示，具体步骤如下：
(1)1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-赖氨酸(DOPE-Lys)的制备：在二氯甲烷(DCM，10mL)中加入Boc保护的赖氨酸(Boc-Lys，0.35g，1mmol)，1- 乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.39g，2mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.23g，2mmol)，室温下反应4h，随后添加二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE，0.75g，1mmol)，室温下反应12h。加入三氟乙酸(TFA，10mL)，室温下反应4h。旋转蒸发浓缩后，在甲醇中透析(截留分子量为500Da)24h，旋转蒸发干燥后，获得DOPE-Lys产物(约0.65g，产率为74.5％)。
(2)2，3-二甲基马来酸酐(DMA，0.15g，1.2mmol)、4-二甲基氨基吡啶(25mg，0.1mmol)和DOPE-Lys(0.44g，0.5mmol)在二氯甲烷中(5mL)中混合，在室温下搅拌12h；减压浓缩后，在甲醇中透析(透析管：MEMBRA-CEL MD44，截留分子量1000Da，Viskase)，冷冻干燥后，获得DOPE-DMA(约0.32g，产率57.2％), 合成的DOPE-DMA的1H NMR和MALDI-TOF-MS的图谱分别如图2和图3所示：
1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):
5.40-5.03(m,5H),4.33(s,1H),4.15-3.76(m,8H),3.21(s,1H),3.01(s,4H),2.31(s,4H),2.20-1.97(s,20H),1.62(s,6H),1.31(m,35H),0.91(s,6H)。
MALDI-TOF-MS：
[M-H2O-H]-、[M-H2O]和[M-H]-的分子量为别为1104.68、1105.69和1122.69。
3.2.DOPE-SA的合成
Figure BDA0003038983300000212
DOPE-SA的合成方法如图4所示，具体步骤如下：丁二酸酐(SA，0.12g，1.2 mmol)、4-二甲基氨基吡啶(25mg，0.1mmol)和DOPE-Lys(0.44g，0.5mmol)在二氯甲烷中(5mL)中混合，在室温下搅拌12h；减压浓缩后，在甲醇中透析(透析管：MEMBRA-CEL MD44，截留分子量1000Da，Viskase)，冷冻干燥后，获得DOPE-SA，合成的DOPE-SA的1H NMR和MALDI-TOF-MS的图谱分别如图5和图 6所示：
1H-NMR(400MHz,CDCl3,δ):
5.38-5.01(m,5H),4.30(s,1H),4.12-3.77(m,7H),3.22(s,1H),3.01(s,9H),2.62(m,5H),2.36(s,4H),2.02(s,8H),1.61(s,6H),1.32(m,36H),0.90(s,6H)。
MALDI-TOF-MS：
[M-H]-,[M]和[M+H]+的分子量为别为1070.66、1071.67和1072.67。
4.脂质体的制备及其表征和特性
4.1脂质体的制备
4.1.1 SCGLN脂质体纳米液滴的制备：
(1)1.5mg DPPC、1.5mg DOPE-DMA、1mg DSPE-PEG2000和1mg吉西他滨前药CP4126溶于5ml圆底烧瓶中的2mL氯仿中，40℃旋转减压蒸发除去溶剂，在圆底烧瓶中形成脂质膜。
(2)将脂质膜冷却至4℃，加入50μL全氟正戊烷浸入脂质膜，然后加入3mL 甘油磷酸盐缓冲液(10mM，pH＝7.4，甘油的体积分数为10v/v％)进行水化，在4 ℃下磁力搅拌子搅拌1h后，然后圆底烧瓶在敞口条件下在30℃水浴锅中磁力搅拌子搅拌1h，得到SCGLN脂质体纳米液滴，测定吉西他滨的包封率为100％，载药量为9.98 wt％。
4.1.2 Cy5标记SCGLN脂质体纳米液滴(SCGLNCy5)的制备
SCGLNCy5制备方法同“4.1.1SCGLN脂质体纳米液滴的制备”，不同点在于：以 1.5mgDSPE-PEGCy5替换1.5mg DSPE-PEG2000。
4.1.3 SGLN脂质体纳米液滴的制备：
(1)1.5mg DPPC、1.5mg DOPE-SA、1mg DSPE-PEG2000和1mg吉西他滨前药 CP4126溶于5ml圆底烧瓶中的2mL氯仿中，40℃旋转减压蒸发除去溶剂，在圆底烧瓶中形成脂质膜。
(2)将脂质膜冷却至4℃，加入50μL全氟正戊烷浸入脂质膜，然后加入3mL 甘油磷酸盐缓冲液(10mM，pH＝7.4，甘油的体积分数为10v/v％)进行水化，在4 ℃下磁力搅拌子搅拌1h后，然后圆底烧瓶在敞口条件下在30℃水浴锅中磁力搅拌子搅拌1h，得到SGLN脂质体纳米液滴，测定吉西他滨的包封率为100％，载药量为9.98 wt％。
4.1.4 Cy5标记SGLN脂质体纳米液滴(SGLNCy5)的制备
SGLNCy5制备方法同“4.1.3SGLN脂质体纳米液滴的制备”，不同点在于：以1.5mgDSPE-PEGCy5替换1.5mg DSPE-PEG2000。
4.1.5 SCLN脂质体纳米液滴的制备：
(1)1.5mg DPPC、1.5mg DOPE-DMA和1mg DSPE-PEG2000溶于5ml圆底烧瓶中的2mL氯仿中，40℃旋转减压蒸发除去溶剂，在圆底烧瓶中形成脂质膜。
(2)将脂质膜冷却至4℃，加入50μL全氟正戊烷浸入脂质膜，然后加入3mL 甘油磷酸盐缓冲液(10mM，pH＝7.4，甘油的体积分数为10v/v％)进行水化，在4 ℃下磁力搅拌子搅拌1h后，然后圆底烧瓶在敞口条件下在30℃水浴锅中磁力搅拌子搅拌1h，得到SCLN脂质体纳米液滴，测定吉西他滨的包封率为100％，载药量为9.98 wt％。
4.2脂质体纳米液滴的表征
4.2.1用PBS缓冲液(pH 7.4或6.5)适当稀释脂质体纳米液滴后，在37℃条件下使用动态光散射分析仪(Nano-ZS 90，Malvern)测量脂质体的粒径。SCGLN和SGLN 脂质体纳米液滴在37℃的pH 7.4PBS缓冲液中的粒径如表1所示，其中SCGLN冷冻透射电子显微镜图像如图7的图7A所示。
表1.在37℃的pH 7.4PBS缓冲液中脂质体的粒径(单位nm)
Figure BDA0003038983300000221
Figure BDA0003038983300000231
从图7A中可以看出，SCGLN脂质体纳米液滴具有明显的冰云阴影，表明SCGLN 脂质体纳米液滴包有全氟正戊烷。
4.2.2 SCGLN和SGLN脂质体纳米液滴在37℃的pH 7.4PBS缓冲液中经短时间20s超声和长时间5min超声(强度：2W/cm2，频率：3MHz，占空比：50％)处理后粒径大小变化如表2所示，其中，SCGLN在不同超声时间下的冷冻透射电子显微镜图像如图7 的图7B和图7C所示。
表2. 37℃温度下脂质体经超声处理后粒径变化(单位nm)
Figure BDA0003038983300000232
从表1和表2可以看出，SCGLN脂质体纳米液滴在37℃的pH7.4 PBS缓冲液(模拟人体血液环境)中，粒径为377.7±60.2nm，SCGLN脂质体纳米液滴经超声处理后， SCGLN脂质体纳米液滴的粒径变大，SCGLN脂质体纳米液滴(粒径为377.7±60.2nm) 转变为微泡(粒径约为1.5μm)，随着超声时间的延长，微泡破裂重新组装成纳米脂质体(179.3±27.6nm)，表明微泡又重新转变为纳米脂质体。SGLN和SCGLN具有相似的粒径转变特性。
4.3脂质体纳米液滴的特性
4.3.1跨血管内皮细胞转运
Transwell系统(3μm微孔聚酯膜和24mm直径内置皿)用于研究脂质体在内皮细胞中的转运。将HUVEC内皮细胞(5×105/mL，1mL)在顶室中孵育4天，以促进致密细胞层的形成。将BxPC3细胞(1×105细胞/mL，1mL)接种到基底室的底部中 12h。将顶室放置在基底外侧隔室上后，将SCGLNCy5或SGLNCy5(GEM当量相同) 加入到有或没有超声刺激(强度：2W/cm2，频率：3MHz，占空比：50％，持续时间5min))的顶室中，并在pH7.4或6.5培养基中孵育2小时。使用酶标仪测量基底外侧培养基的荧光强度。收集BxPC3细胞，并通过流式细胞术测量Cy5荧光强度，跨血管内皮细胞转运结果如图8中所示。
从图8中可以看出，使用如图8A所示的Transwell模型研究不同脂质体纳米离子经超声刺激诱导的体外血管通透性，在Transwell模型的顶室中培养血管内皮细胞 HUVEC，在基腔室的底部培养BxPC3肿瘤细胞。从图8B中可以看出，在超声刺激条件为(强度：2W/cm2，频率：3MHz，占空比：50％，持续时间5min)，SCGLN 和SGLN的MFI比没有超声刺激条件得到的MFI高出3-4倍，表明在超声刺激下， SCGLN和SGLN的血管通透性显著增强。从图8C中可以看出，在酸性的pH 6.5培养基(模拟肿瘤酸性微环境)，与SGLN相比，SCGLN能够加快进入到BxPC3细胞中，从而发挥SCGLN携带的抗癌药物吉西他滨(GEM)对肿瘤细胞的抗癌效果。
4.3.2细胞毒性和凋亡测试
使用悬滴法构建肿瘤球体，将SCGLN、SGLN和游离吉西他滨原药GEM在pH6.5 培养基的测试浓度(相当于GEM：0～10μg/mL)加入孔中，超声刺激(强度：2W/cm2，频率：3MHz，占空比：50％，持续时间5min)5分钟和孵育72h，同时以SCLN作为对照。然后将培养基替换为90μL新鲜培养基和10μLAlamar Blue Cell Viability Reagent 的混合物，并连续孵育12h，然后使用酶标仪(SpectraMax M5，Molecular Devices) 检测样品板以获得荧光强度读数，细胞毒性和凋亡测试的结果如图9所示。
从图9A中可以看出，在3D的BxPC3细胞培养中，SCGLN表现出最高的细胞毒性，SCGLN对3D的BxPC3多细胞肿瘤球的IC50为0.17μM，比GEM，SGLN和 SGLN的细胞毒性高3-7倍。
此外，从图9B可以看出，SCGLN对3D BxPC3细胞进行抑制后的肿瘤球体形态从光滑的球形变为十分不规则和塌陷的形状，且从TUNEL染色观察的相应凋亡分析可以看出，SCGLN导致的凋亡细胞分布在整个球体中，从而表明SCGLN具有优异的细胞杀伤作用。
4.3.3肿瘤球体的渗透
构建三维(3D)多细胞BxPC3肿瘤球体，并将其转移到共聚焦培养皿中。在超声刺激(强度：2W/cm2，频率：3MHz，占空比：50％，持续时间5min)的37℃的 pH6.5或7.4培养基中添加SCGLNCy5和SGLNCy5(GEM等量)，并孵育6小时。用 PBS洗涤后，用CLSM在XYZ-3D叠层中从顶点到中间以25μm的间隔获得图像。同时，将肿瘤球体用胞吐抑制剂EXO1(20μM)预处理3h，以表征胞吐活性，肿瘤球体的渗透性结果如图10所示。
从图10A可以看出，在pH 6.5的培养基(模拟肿瘤的酸性微环境)中孵育6小时后，SGLN主要位于BxPC3球体的外围，而SCGLN穿透BxPC3球体并分布在整个球体内，而在pH 7.4的培养基或在用胞吐抑制剂EXO1预处理的pH 6.5的培养基中孵育6小时后，SCGLN位于BxPC3球体的外围，表明肿瘤的酸性微环境能够促进 SCGLN经胞吞作用进行肿瘤细胞中，从而发挥SCGLN负载的抗癌药物的抗癌效果。
从图10B可以看出，SCGLN主要分布在细胞质中而不位于溶酶体中，表明 SCGLN能够避免溶酶体的滞留和降解，从而能够有效促进抗癌药物在细胞内发挥抗癌效果。
4.3.4体内分布、渗透和体内成像
携带胰腺原位BxPC3肿瘤的小鼠用于研究药物在肿瘤部位的聚集和渗透。给小鼠静脉注射SCGLNCy5和SGLNCy5或(相当于GEM 20mg/kg的剂量，每组3只小鼠) 后，并在对胰腺原位进行超声刺激(强度：2W/cm2，频率：3MHz，占空比：50％，持续时间：10分钟，MettlerSonicator-740)。在注射后8h，在配备有荧光滤光片组 (激发/发射，640/670nm)的CaliperIVIS Lumina II(美国PerkinElmer，美国)的荧光光谱成像仪上进行全身光学成像。然后给每只小鼠静脉注射FITC标记的番茄凝集素(FITC-凝集素，每只小鼠0.05mg)，注射后5分钟后用2％戊二醛溶液进行心脏灌注。然后收集肿瘤组织，并在组织OCT-Freeze培养基(Leica，德国)中冷冻。切成10μm厚的切片后，使用CLSM拍摄图像并使用ImageJ软件进行分析。BxPC3异种移植小鼠静脉注射脂质体纳米滴的体内分布、渗透和体内成像的结果如图11所示。
图11A显示超声装置对荷瘤小鼠的胰腺原位进行超声，使用医用超声耦合剂将超声探头(型号：1cm2，Sonicator 740)粘在腹部胰腺附近，静脉注射不同脂质体纳米粒子后，立即进行超声刺激(强度：2W/cm2，频率：3MHz，占空比：50％)。从图11B中可以看出，SCGLN与SGLN具有相似的长时间血液清除特性，消除半衰期约为42分钟，显著高于临床商用的超声造影剂(SonoVue，Sonazoid等，T1/2在5～20 分钟)的血液清除半衰期。较长的消除半衰期能够显著延长SCGLN在血液中的循环时间，增强SCGLN经超声刺激后渗透进行肿瘤部位，发挥抗肿瘤作用。
从图11C和图11D中可以看出，即图11B显示SCGLN和SGLN具有相似的血液清除特性且在约2h内通过了血液清除，然而，与SGLN相比，SCGLN却表现出更高的肿瘤蓄积率，SCGLN在肿瘤中的荧光强度是SGLN的3.59倍，表明SCGLN能够在肿瘤部位进行更有效的聚集。
在右胁腹(接受超声刺激)和左胁腹(无超声刺激)负载原位胰腺癌BxPC3荷瘤小鼠中进一步研究了SCGLN的生物分布，消除小鼠个体差异，从图11E中可以看出，超声刺激的右胁腹的肿瘤的荧光强度是无超声刺激的左胁腹的肿瘤的荧光强度的 2.91倍，表明超声刺激能够增强SCGLN的肿瘤中的蓄积。
使用血管和粒子的荧光共定位研究不同脂质体纳米粒子的肿瘤渗透能力，从图11F中可以看出，荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的番茄凝集素(FITC-Lectin)染色的血管显示，SGLN大多位于血管附近，然而SCGLN可以到达远离血管的位置，并深入肿瘤实质中分布。从图11G中可以看出，SGLN的荧光强度从血管到深入的肿瘤实质过程中的迅速衰减，超过70μm几乎无法检测到，然而SCGLN的荧光强度在 100μm的距离处也可以检测到，表明SCGLN具有优异的肿瘤穿透能力。
4.3.5超声作用下的体内实时血管外渗
将小鼠在腹部血管旁边皮下接种BxPC3肿瘤，肿瘤大小达到30-50mm3时，使用背部皮肤皱褶小室(APJ Trading Co.Inc，美国)将肿瘤固定在显微镜载玻片上，将超声波探针固定在背部皮肤皱褶小室，涂上偶联剂，尾静脉注射SCGLNCy5或 SGLNCy5(剂量均为GEM20mg/kg)后，将肿瘤部位超声刺激处理(声强：2W/cm2， 3MHz，占空比：50％，持续时间：10分钟，Mettler Sonicator-740)。在尾静脉注射 SCGLNCy5或SGLNCy5后的10min、30min、60min时，使用CLSM对肿瘤区域成像，并使用ImageJ软件计算相应的肿瘤荧光强度。在尾静脉注射SCGLNCy5或SGLNCy5 60min时，对小鼠进行心脏灌注。将肿瘤切成小碎片，并在60℃的氢氧化钾溶液(30 ％)中浸泡10分钟。然后将样品用2％单宁和1％渗透酸染色2小时，用乙醇脱水，然后转移到乙酸异戊酯中进行临界点干燥。喷金处理后，在场发射扫描电子显微镜 (SEM)(HitachiLtd，SU8010)中观察样品。静脉注射SCGLNCy5或SGLNCy5脂质体纳米粒子在超声刺激处理后的体内实时肿瘤积累和血管外渗结果如图12所示。
使用如图12A所示的CLSM和超声装置组装的成像装置研究尾静脉注射 SCGLNCy5或SGLNCy5脂质体纳米粒子在超声刺激处理后的体内实时肿瘤积累和血管外渗。从图12B和图12C中可以看出，SGLN和SCGLN脂质体纳米粒子静脉注射后，在血管中迅速衰减，然而，虽然SGLN在30min从毛细血管中渗出，但SGLN几乎不会渗透到深部肿瘤中，少量SGLN分布在血管周围，并且大多数返回血流并被清除，相反，SCGLN可以迅速从毛细血管中渗出并在60min内穿透肿瘤实质。尽管SCGLN 与SGLN经历相似的血液清除，但是SCGLN在肿瘤中保留的荧光信号比SGLN强得多，表明SCGLN具有优异的血管外渗和肿瘤蓄积能力。从图12D中可以看出，SCGLN 注射给药在超声处理后，肿瘤血管内皮细胞间的开口扩宽至约1μm，并且具有丰富的开口，从而促进纳米粒子从毛细血管渗入的肿瘤部位，因此，SCGLN注射给药在超声处理后能够通过扩大的肿瘤血管内皮细胞中的开口渗透进入肿瘤部位，超声刺激 SCGLN能够促进扩宽肿瘤部位的血管内皮细胞的间隙和开口，促进SCGLN从血管内像肿瘤部位渗透，超声刺激诱导的SCGLN肿瘤积累的示意图如图12E所示。
4.3.6体内抗肿瘤活性
使用生物发光的BxPC3细胞(BxPC3-Luci)构建原位胰腺肿瘤。使用CaliperIVISLuminaII(PerkinElmer，USA)体内成像系统测量小鼠的生物发光强度，以评估肿瘤的生长。在生物发光的BxPC3细胞(BxPC3-Luci)接种后第8天将小鼠随机分为5组(n＝5)。SCGLN、SGLN、游离GEM(均相当于GEM 20mg/kg的剂量)、SCLN和PBS，每两天静脉注射，注射给药后，肿瘤部位经过超声刺激处理(强度：2W/cm2，3MHz，占空比：50％，持续时间：10分钟，Mettler Sonicator-740)，共给药5次。在首次给药(第8天)以及第12、16和20天，使用体内成像系统在注射10mg/mL D-萤光素PBS(200μL)后，通过生物发光评估肿瘤进展并进行半定量分析。在第20天处死小鼠，解剖肿瘤并称重(肿瘤抑制率＝100％×(PBS组的平均肿瘤重量-实验组的平均肿瘤重量)/PBS组的平均肿瘤重量)，用4％中性缓冲的多聚甲醛对肿瘤进行固定，并包埋在石蜡中。将5μm厚的组织切片安装在载玻片上，并用苏木精-曙红(H&E)染色，使用Ki67抗体检测试剂盒(美国Proteintech)对组织切片进行Ki67染色，并用光学显微镜(OLYMPUS，BX51，日本)进行，以研究在检查区域中阳性染色的增生性肿瘤细胞的百分比。不同脂质体纳米粒子对原位负载 BxPC3肿瘤小鼠的体内抗肿瘤活性如图13所示。
脂质体纳米粒子的体内抗肿瘤活性在另一种渗透性差的U251神经胶质瘤中进一步测试。小鼠的右腹皮下接种2×107个U251细胞。与上述胰腺肿瘤治疗实验相同，在接种后第6天将小鼠随机分为5组(n＝5)。SCGLN、SGLN、游离GEM(均当于 GEM 20mg/kg的剂量)、SCLN和PBS，每两天静脉注射，注射给药后，经过超声刺激处理(强度：2W/cm2，3MHz，占空比：50％，持续时间：10分钟，Mettler Sonicator-740)，共给药5次，首次给药为第6天。在治疗期间测量肿瘤的宽度和长度以及小鼠的体重。实验结束时，对小鼠实施安乐死，并解剖肿瘤并称重。通过将实验组与对照组进行比较来评估治疗的疗效。不同脂质体纳米粒子对U251神经胶质瘤肿瘤小鼠的体内抗肿瘤活性如图14所示。
图13A为每只小鼠接种BxPC3-Luci细胞后的实验时间表和治疗时间表。从图 13B中可以看出，SGLN和SCGLN处理的小鼠的体重略有下降，但与PBS的体重无明显差异，而用GEM处理的小鼠在实验结束时体重降低为初始体重的近10％，表明 SGLN和SCGLN具有优异的生物安全性。从图13C和图13D中可以看出，尽管SCLN 的平均肿瘤重量小于PBS缓冲液，但无显着差异，表明SCLN对肿瘤生长无影响，SCGLN 的体内抑制肿瘤能力最强，SCGLN的平均肿瘤抑制率为91.1％，远高于GEM(66.7 ％)，SCLN(14.4％)和SGLN(69.1％)的平均抑制率。进行肿瘤的组织学分析以研究抗肿瘤活性的机制，从图13E的H&E染色可以看出，与PBS处理相比，GEM， SGLN和SCGLN处理的肿瘤的致密细胞降低，与GEM和SGLN相比，SCGLN处理的肿瘤包含更大量凋亡细胞和更广泛的核收缩和丰富的腔，Ki67免疫染色显示， SCGLN治疗的肿瘤的Ki67阳性细胞少于GEM和SGLN治疗的肿瘤，表明SCGLN 对肿瘤细胞增殖具有显著的抑制作用。
从图14A中可以看出，在治疗过程中，GEM组小鼠的体重逐渐下降，而SGLN 和SCGLN组的小鼠无明显变化，与PBS或SCLN的小鼠无明显差异。从图14B和图14C中可以看出，与PBS或SCLN治疗的小鼠相比，GEM，SGLN和SCGLN对肿瘤具有抑制作用，然而，出乎意料地发现，从首次治疗后第4天开始，SCGLN组的皮下U251胶质瘤逐渐消退，并在首次治疗后第12天被完全根除且不可见。从图 14D和图14E中可以看出，尽管SCLN的平均肿瘤重量小于PBS缓冲液，但无显着差异，表明SCLN对肿瘤生长无影响，然而SCGLN具有优异的抗肿瘤效果，100％消除肿瘤，优于GEM(68.8％)和SGLN(81.4％)。结果表明SCGLN具有优异的抗肿瘤效果。
以上所述是本发明针对一种案例设计的实施方案，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种双亲性材料，其特征在于，所述的双亲性材料的结构如下所示：
Figure FDA0003038983290000011
2.如权利要求1所述的双亲性材料的用途，其特征在于，用于制备纳米颗粒。
3.如权利要求2所述的双亲性材料的用途，其特征在于，所述的双亲性材料促进所述的纳米颗粒进入肿瘤细胞。
4.如权利要求2所述的双亲性材料的用途，所述的纳米颗粒为纳米粒或脂质体；
所述的双亲性材料作为纳米粒的纳米材料；
所述的双亲性材料作为脂质体的脂质材料。
5.一种纳米颗粒，其特征在于，所述的纳米颗粒包括如权利要求1所述的双亲性材料。
6.一种如权利要求5所述的纳米颗粒的用途，其特征在于，用于负载药物。
7.一种脂质体，其特征在于，所述的脂质体包括脂质材料和前药，所述的脂质材料作为脂质双分子层；
所述的脂质材料包括1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、如权利要求1所述的双亲性材料和1,2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)。
8.如权利要求7所述的脂质体，其特征在于，所述前药作为脂质体的脂质材料；和/或
所述的脂质双分子层包裹水、缓冲溶液和/或全氟正戊烷；
优选地，所述的前药包括吉西他滨反油酸酯。
9.如权利要求7所述的脂质体的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗疾病的组合物；
优选地，所述的前药包括抗癌药物的前药，所述的疾病包括肿瘤(如胰腺癌和/或胶质瘤)。
10.一种用于治疗疾病的系统或装置，其特征在于，所述的系统包括如权利要求7所述的脂质体；和超声装置；
所述的系统或装置还包括或标签，所述的说明书或标签记载：
在给所需的对象施用如权利要求7所述的脂质体预防和/或治疗疾病过程中，对病灶部位(如肿瘤部位)进行超声刺激。
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