CN113278494A - 数字pcr微滴生成芯片 - Google Patents

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顾大勇
季明辉
庄添驰
何建安
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Nanjing Medical University
Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine
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Nanjing Medical University
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Abstract

本发明涉及一种数字PCR微滴生成芯片，其包括，芯片本体，所述芯片本体包括样本供液池、至少两个独立的微滴生成单元和微滴收集池；微滴生成单元分别与所述样本供液池和所述微滴收集池连通；微滴生成单元包括依次连通的微通道和微滴生成部；微滴生成部的入口端至出口端的横截面面积逐渐增大，微通道的出口端与所述微滴生成部的入口端相交处围设成一液滴溢出区，至少两个所述微滴生成单元中液滴溢出区的面积不同。通过在芯片本体上集成多个微滴生成单元，至少两个微滴生成单元具有不同面积的液滴溢出区，使得样本溶液进入微滴生成部的体积不同，从而收集到不同体积的液滴，为微滴式数字PCR扩增后的样本检测提供较大的动态检测范围，提高检测效率。

Description

数字PCR微滴生成芯片
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，特别是涉及一种数字PCR微滴生成芯片。
背景技术
微滴式数字PCR是近年来迅速发展起来的一种突破性的检测和定量核酸的技术，在传统的PCR扩增前将一个大的反应体系进行微滴化处理，将此反应体系分割为成千上万个油包水的微滴，即成千上万个独立的PCR反应体系。在此过程中，利用微滴形成装置将样品稀释至单分子水平，并被平均分配到这几万个反应体系中，每个微滴中不含或者含有至少一个待检测的核酸靶分子。微滴式数字PCR在扩增完成后，对每个微滴进行逐一检测，可以通过采用泊松概率分布公式计算出样本的原始浓度。与传统PCR相比，微滴式数字PCR将样品分隔在不同的反应体系中，有效避免了反应过程中不同引物或产物间的相互杂交以及同产物间的竞争抑制，能够实现不同模板的同时扩增，也能得到较高的扩增效率。此外，由于微滴式数字PCR的反应特点，所需样本量极少，单DNA模板出现在单个微滴体系中而未被检出的可能性非常低，比起第二代的qPCR来说是一个巨大的进步。微滴式数字PCR在检测领域有着多种不可替代的优势，尤其适用于微量DNA检测与定量，并且使用灵活，可以按照实验需要调整通量和灵敏度，为核酸检测提供了更可靠的结果。其中，微滴的形成是微滴式数字PCR技术实现的关键环节。
目前，由于制备的微滴在微滴式数字PCR设备进行样品检测不能满足动态检测范围，还需将检测样本再进行稀释以满足数字PCR检测的浓度要求，操作费时费力、样本检测效率低、增加样本污染风险并造成资源浪费。
发明内容
基于此，有必要针对制备的微滴不满足检测要求造成样本检测效率低的问题，提供一种数字PCR微滴生成芯片。
一种数字PCR微滴生成芯片，包括，芯片本体，所述芯片本体包括样本供液池、至少两个独立的微滴生成单元和微滴收集池；所述微滴生成单元分别与所述样本供液池和所述微滴收集池连通；所述微滴生成单元包括依次连通的微通道和微滴生成部；所述微滴生成部的入口端至出口端的横截面面积逐渐增大，所述微通道的出口端与所述微滴生成部的入口端相交处围设成一液滴溢出区，至少两个所述微滴生成单元中所述液滴溢出区的面积不同。
在其中一个实施例中，独立的所述微滴生成单元中的所述微通道在其长度方向上具有形状一致的横截面或具有逐渐变小的横截面。
在其中一个实施例中，独立的所述微滴生成单元中的所述微滴生成部从出口端至入口端横截面逐渐变小，且各横截面上相应点的连线的交线/交点，在所述微滴生成部的出口端的投影位于所述微滴生成部的出口端所在的端面的中心位置。
在其中一个实施例中，独立的所述微滴生成单元中的所述液滴溢出区具有两条相互垂直的水平对称轴和竖直对称轴，所述水平对称轴的长度值小于所述竖直对称轴的长度值。
在其中一个实施例中，若干个所述微滴生成单元的所述液滴溢出区的竖直对称轴的长度值相同。
在其中一个实施例中，以所述芯片本体的厚度方向为投影方向，所述微滴生成部的出口端的投影尺寸值与所述微滴生成部的入口端投影尺寸值的比值范围为5.5-19。
在其中一个实施例中，独立的所述微滴生成单元中的所述微通道和所述微滴生成部的横截面均为轴对称图形。
在其中一个实施例中，还包括样本加样池，所述样本加样池与所述样本供液池连通，所述样本加样池上设有加样孔，样本注射泵通过所述加样孔向所述样本加样池内注入样本反应液。
在其中一个实施例中，所述样本加样池与所述样本供液池之间设有至少两个分支供液池，所述分支供液池沿所述样本供液池的长度方向并排分布，所述分支供液池的两端分别连通所述样本加样池和所述样本供液池；所述微滴生成单元沿所述样本供液池的长度方向并排分布，所述微通道的延伸方向与所述样本供液池的长度方向垂直。
在其中一个实施例中，还包括变向阀，所述变向阀与所述分支供液池连接，用于改变样本溶液的流向。
上述数字PCR微滴生成芯片，通过在芯片本体上集成多个微滴生成单元，至少两个微滴生成单元具有不同面积的液滴溢出区，使得样本溶液进入微滴生成部的体积不同，从而收集到不同体积的液滴，为微滴式数字PCR扩增后的样本检测提供较大的动态检测范围，提高检测效率。
附图说明
图1为本发明数字PCR微滴生成芯片的整体结构示意图。
图2为本发明数字PCR微滴生成芯片中基板的结构示意图。
图3为图2局部放大示意图。
图4为本发明数字PCR微滴生成芯片中基板的俯视投影图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
参阅图1，图1示出了本发明一实施例中的数字PCR微滴生成芯片的整体结构示意图，本发明一实施例提供的数字PCR微滴生成芯片，包括芯片本体100，芯片本体100包括样本供液池200、至少两个独立的微滴生成单元300、微滴收集池400和废液池500。样本供液池200的输出端连通接微滴生成单元300的输入端，微滴生成单元300的输出端连通微滴收集池400的输入端，微滴收集池400的输出端连通废液池500。样本溶液通过样本供液池200进入微滴生成单元300内生成液滴后进入微滴收集池400，废液池500用于收集多余的样本溶液。
参阅图1所示，芯片本体100还包括样本加样池600，样本加样池600用于向样本供液池200提供样本溶液，样本供液池200将样本溶液输送至微滴生成单元300。样本加样池600与样本供液池200之间还设有逐级分支的分支供液池700，分支供液池700用于将同一个样本加样池600中的样本反应溶液通过多个输送通道输送至样本供液池200。样本加样池600与分支供液池700的连通形式可以是树形结构。样本加样池600作为主流道，分支供液池700作为样本加样池600的分支流道，作为分支流道的分支供液池700可以再进行分支，作为下一级分支流道的主流道。以此类推，可以根据需要设定分支级数，形成若干个分支供液池700。若干个分支供液池700与样本供液池200的不同位置连通，可以使得样本供液池200内的样本溶液分布均匀。样本供液池200在连通多个微滴生成单元300而具有较大供液范围的情况下，不会因为样本加样池600与样本供液池200的连通位置单一而造成样本供液池200的不同区域具有不同浓度的样本溶液。
参阅图1所示，作为示例性的，在本实施例中，以样本加样池600设置两个分支为例，样本加样池600和样本供液池200均为内部中空的长方体结构，但不限于长方体结构。样本供液池200与样本加样池600平行设置。样本加样池600与两个作为分支结构的分支供液池700呈“匚”形结构，“匚”形结构的竖直边为样本加样池600，“匚”形结构的两条水平边为与样本加样池600连通的作为分支结构的分支供液池700。为便于理解及描述，将作为两个分支结构的分支供液池700分别定义为第一分支供液池710和第二分支供液池720。样本加样池600的两端连通第一分支供液池710和第二分支供液池720。可以理解的，第一样本供液池210和第二样本供液池220沿样本加样池600的长度方向并列设置。
参阅图1所示，第一分支供液池710具有分支结构，分别是第三分支供液池711和第四分支供液池712。第一分支供液池710连通第三分支供液池711和第四分支供液池712，连通的第三分支供液池711和第四分支供液池712呈“匚”形结构，“匚”形结构的两条水平边分别为第三分支供液池711和第四分支供液池712。同样地，第二分支供液池720具有分支结构，分别是第五分支供液池721和第六分支供液池722。连通的第五分支供液池721和第六分支供液池722呈“匚”形结构，“匚”形结构的两条水平边分别为第五分支供液池721和第六分支供液池722。可以理解的，上述的第三分支供液池711、第四分支供液池712、第五分支供液池721和第六分支供液池722在与样本加样池600的长度平行的方向上并列设置，且与样本供液池200在不同的位置连通。
将样本加样池600与样本供液池200之间布置多个分支结构，可以通过一个样本加样池600有针对性地与样本供液池200的不同位置连通，而不用连通样本供液池200的所有位置，保证样本供液池200内样本溶液分布均匀的同时节约样本资源，且使得芯片本体100的结构更加紧凑。
在一些实施例中，分支供液池700内设有变向阀(图中未示出)，用于改变样本溶液的流向，以控制样本溶液进入指定的微滴形成单元300。
参阅图1所示，样本加样池600上设有加样孔610，注射泵通过加样孔610向样本加样池600中注入样本溶液。微滴生成芯片还设有通气孔(图中未示出)，通气孔用于平衡微滴生成芯片内部的气压。通气孔可以根据实际需要设置在样本加样池600和/或样本供液池200处，使样本加样池600和/或样本供液池200的内部与外部大气连通。
参阅图1所示，芯片本体100包括盖板110和基板120，基板120上设有至少两个开放的微滴形成通道结构。盖板110和基板120采用热键合的方式连接，以通过盖板110盖合在基板120上后将开放的微滴形成通道结构封闭，形成具有流道的样本加样池600、样本供液池200、微滴生成单元300和微滴收集400。
参阅图2所示，图2示出的是微滴生成芯片中基板的结构示意图。作为示例性的，在本实施例中，芯片本体100上设置了四组微滴形成单元，每组微滴形成单元包括若干个独立的微滴形成单元300，至少两组独立的微滴形成单元300生成的液滴的体积不同。若干个独立的微滴生成单元300沿样本供液池200的长度方向并列布置。下面以其中一个独立的微滴形成单元300为例进行具体介绍。
参阅图3所示，图3是图2的局部放大示意图。微滴形成单元300包括依次连通的微通道310和微滴生成部320。可同时参阅图2所示，微通道310的入口端311连通样本供液池200，其出口端312连通微滴生成部320的入口端321，微滴生成部320的出口端322连通微滴收集池400。微滴生成部320从入口端321至出口端322，其横截面面积逐渐增大。参阅图3所示，微滴生成部320的入口端的初始端面与微通道310的出口端312的末端端面相交的位置形成一封闭的相交线330，封闭的相交线330围设成一液滴溢出区340。可以理解的是，微滴生成部320与微通道310在液滴溢出区330的位置共面，液滴溢出区340可以看作是微通道310和微滴生成部320的共有部分。液滴溢出区340具有两条相互垂直的对称轴，样本溶液流动方向所在的水平面或竖直面垂直于两条相互垂直的对称轴所在的平面。微滴生成部320的最小横截面的形状尺寸与液滴溢出区330的形状尺寸相同。当微通道310为等截面的形状时，微通道310的横截面的形状尺寸与液滴溢出区330的形状尺寸相同；当微通道310为变截面的形状时，微通道310中至少一处的横截面的形状尺寸与液滴溢出区330的形状尺寸相同。
样本溶液由样本供液池200进入微通道310，由于液体的流动性，样本溶液在对应的微通道310内被塑形为与微通道310内部空间形状相匹配的样本流，样本流的横截面与微通道310的横截面相对应，可以通过改变微通道310的横截面尺寸来调节样本流的横截面。微滴生成部320在样本流的流动方向上设置逐渐增大的横截面，使与微滴生成部320的内壁接触的微滴具有静态不稳定性。样本流在经过液滴溢出区330进入微滴生成部320的内部时受到剪切力，且在逐渐靠近微滴收集池400的过程中，在剪切力和不稳定性两个影响因素的共同作用下，样本流被剪断呈微滴并从微滴生成部320的内壁脱离进入微滴收集池400。可以理解的，微滴生成部320与微通道310的相交线330围设的液滴溢出区340的面积不同，样本流在液滴溢出区340处被剪切的体积不同，微滴生成部320内生成的微滴体积相应不同。
参阅图2所示，在本实施例中，以微通道310为等截面形状为例，微通道310的形状为中空的长方体，其横截面形状为矩形。为了便于理解及描述，将样本供液池200的长度方向看作Y轴方向，芯片的厚度方向亦或样本供液池200的高度方向看作Z轴方向，微通道310的入口端311向出口端312的延伸方向亦或样本供液池200的宽度方向看作X轴方向。可同时参阅图3所示，微通道310的在Y轴方向上的长度看作微通道310的宽度值，将微通道310的在X轴方向上的长度看作微通道310的长度值，微通道310的在Z轴方向上的长度看作微通道310的高度值。其中，在同一竖直平面内，若干个微滴生成单元300中微通道310的在Z轴方向的高度值保持一致，在单个独立的微滴生成单元300中，微通道310的在Z轴方向的高度值大于微通道310的在Y轴方向的宽度值，使得通过改变微通道310在Y轴方向的宽度值就可以调控进入微滴生成部320内的微滴的生成体积，操作简单可控。
由于液滴溢出区340的形状与微通道310的出口端312的横截面相同，液滴溢出区340的形状可以看作矩形，其两条相互垂直的对称轴可以称作Y向对称轴和Z向对称轴，Y向对称轴的长度值小于Z向对称轴的长度值。可通过改变Y向对称轴的尺寸继而改变液滴溢出区340的面积，来调控在微滴生成部320内生成的微滴的体积。
参阅图3所示，与长方体状的微通道310连通的微滴生成部320包括相互平行设置的液滴溢出区340和第一侧面325、相互平行设置且形状相同的上端面323和下端面324、及第二侧面326和第三侧面327。需要说明的是，图3所示的为基板120的局部示意图，是无盖板110的，微滴生成部320的朝向微滴收集池400的一个侧面，也即第一侧面325，与微滴收集池400连通，且微滴生成部320具有与微通道310共有的液滴溢出区340，为便于理解微滴生成部320的形状，图示的对微滴生成部320的组成部分的附图标记仅做示意性的，并不完全代表实体部分。具体而言，液滴溢出区340和第一侧面325均为假想面，液滴溢出区340为微通道310与微滴生成部320的交界面，第一侧面325为微滴生成部320与微滴收集池400的交界面。
继续参阅图3所示，在本实施例中，微滴生成部320的上端面323和下端面324分别与XY轴所在的平面平行。液滴溢出区340、第一侧面325、第二侧面326和第三侧面327均位于相互平行的上端面323和下端面324之间，并与上端面323和下端面324分别连接。液滴溢出区340和第一侧面325分别与YZ轴所在的平面平行，也即液滴溢出区340和第一侧面325均与微通道310的长度方向的平面垂直；第一侧面325朝向微滴收集池400并与微滴收集池400连通。在X轴方向上，第二侧面326和第三侧面327位于液滴溢出区340和第一侧面325之间，并均与液滴溢出区340和第一侧面325连接。沿微滴生成部320内样本流的流动方向，从液滴溢出区340至第一侧面325横截面逐渐变大。可以理解的，第二侧面326和第三侧面327不平行。第二侧面326和第三侧面327在延伸方向上的交线在第一侧面325的投影位于第一侧面325的中线上。即，沿Z轴方向的俯视投影图上，相互平行的上端面323和下端面324为等腰梯形。上述等腰梯形的底边与微滴收集池400连接，相等的两条边分别与微通道310连接。
参阅图4所示，图4示出的基座120的俯视投影视图。以上述依次连通的微通道310和微滴生成部320为例，为了保证液滴生成的稳定性，微滴生成部320的第二侧面326和第三侧面327在延伸方向上的夹角不能过小或过大，其夹角范围值与微通道310的宽度值相适应。具体的，在本实施例中，沿样本供液池200的长度方向，即图示的Y轴方向，微滴生成部320的第一侧面325投影的宽度值H2与微通道310的横截面投影的宽度值H1的比值范围为5.5～19，以此可调控微滴生成部320的第二侧面326和第三侧面327之间的夹角。
在本实施例中，沿样本供液池200的长度方向，微通道310横截面投影的宽度值大于6μm。微通道310的横截面的宽度值越大，进入微通道310的样本流的横截面面积越大，对应的，生成的液滴的体积会更大，液滴的尺寸变异系数较低，不易受液体流速影响。
上述数字PCR微滴生成芯片，通过在同一芯片上设置若干个并列的微滴生成单元300，至少两个微滴生成单元300中的液滴溢出区340的面积不同，可以实现在同一芯片中生成多重体积的微滴的目的。
不同于上述实施例中微通道310和微滴生成部320相交线300围设的液滴溢出区340的为矩形的形状，在另一实施例中，微通道310和微滴生成部320相交形成封闭的相交线330，相交线330围设成一椭圆形的液滴溢出区340，可以通过改变椭圆形的短轴尺寸改变液滴溢出区340的面积，使进入微通道310内的样本流形成不同体积的微滴。不同于上述实施例中微通道310为等截面的形状，在又一实施例中，在样本流的流动方向上，微通道310的横截面的尺寸从入口端311至出口端312逐渐变小，可在样本流经过液滴溢出区340时提供较大的出口压力进入微滴生成部320。
在本实施例中，样本溶液包括油相溶液和PCR溶液。在进行微滴制备时，注射泵通过加样孔610将油相溶液注入芯片本体100内并充分淹没浸润芯片本体100的微通道310和微滴生成部320。然后通过加样孔610将PCR溶液注入芯片本体100内，PCR溶液在压力作用下快速流动经微通道310到达液滴溢出区340，并进入微滴生成部320，在液滴溢出区340处的剪切力及微滴生成部320内部的静态不稳定性的共同影响下，液滴脱离微滴生成部320进入微滴收集池400。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种数字PCR微滴生成芯片，其特征在于，包括，芯片本体，所述芯片本体包括样本供液池、至少两个独立的微滴生成单元和微滴收集池；所述微滴生成单元分别与所述样本供液池和所述微滴收集池连通；所述微滴生成单元包括依次连通的微通道和微滴生成部；所述微滴生成部的入口端至出口端的横截面面积逐渐增大，所述微通道的出口端与所述微滴生成部的入口端相交处围设成一液滴溢出区，至少两个所述微滴生成单元中所述液滴溢出区的面积不同。
2.根据权利要求1所述的数字PCR微滴生成芯片，其特征在于，独立的所述微滴生成单元中的所述微通道在其长度方向上具有形状一致的横截面或具有逐渐变小的横截面。
3.根据权利要求1所述的数字PCR微滴生成芯片，其特征在于，独立的所述微滴生成单元中的所述微滴生成部从出口端至入口端横截面逐渐变小，且各横截面上相应点的连线的交线/交点，在所述微滴生成部的出口端的投影位于所述微滴生成部的出口端所在的端面的中心位置。
4.根据权利要求1所述的数字PCR微滴生成芯片，其特征在于，独立的所述微滴生成单元中的所述液滴溢出区具有两条相互垂直的水平对称轴和竖直对称轴，所述水平对称轴的长度值小于所述竖直对称轴的长度值。
5.根据权利要求4所述的数字PCR微滴生成芯片，其特征在于，若干个所述微滴生成单元的所述液滴溢出区的竖直对称轴的长度值相同。
6.根据权利要求1所述的数字PCR微滴生成芯片，其特征在于，以所述芯片本体的厚度方向为投影方向，所述微滴生成部的出口端的投影尺寸值与所述微滴生成部的入口端投影尺寸值的比值范围为5.5-19。
7.根据权利要求1所述的数字PCR微滴生成芯片，其特征在于，独立的所述微滴生成单元中的所述微通道和所述微滴生成部的横截面均为轴对称图形。
8.根据权利要求1所述的数字PCR微滴生成芯片，其特征在于，还包括样本加样池，所述样本加样池与所述样本供液池连通，所述样本加样池上设有加样孔，样本注射泵通过所述加样孔向所述样本加样池内注入样本反应液。
9.根据权利要求8所述的数字PCR微滴生成芯片，其特征在于，所述样本加样池与所述样本供液池之间设有至少两个分支供液池，所述分支供液池沿所述样本供液池的长度方向并排分布，所述分支供液池的两端分别连通所述样本加样池和所述样本供液池；所述微滴生成单元沿所述样本供液池的长度方向并排分布，所述微通道的延伸方向与所述样本供液池的长度方向垂直。
10.根据权利要求9所述的数字PCR微滴生成芯片，其特征在于，还包括变向阀，所述变向阀与所述分支供液池连接，用于改变样本溶液的流向。
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