CN113209367B - 一种活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨及其制备方法和应用 - Google Patents
一种活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨及其制备方法和应用。该方法通过微波辅助的化学沉淀法制备出活性离子和碳酸根离子共掺的弱结晶羟基磷灰石粉体，分别通过以下两种方法制备人工骨：一是经过预压成型、冷等静压二次成型得到块状坯体，破碎、筛分和烧结，得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨；二是采用挤出滚圆法制备活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石微球，进行冷等静压、干燥、烧结及筛分，得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨。该人工骨显著改善了羟基磷灰石的降解性能并提高了材料的成骨活性，使其在骨缺损填充修复生物医用材料方面具有应用的潜力。
Description
技术领域
本发明属于骨缺损修复生物医用材料领域，具体涉及一种活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨及其制备方法和应用。
背景技术
羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP)具有良好的生物活性和骨传导性，植入人体后能在短时间内与周围组织在界面上形成紧密的化学键性结合，是目前临床应用最广泛的硬组织修复替代材料之一。然而，高结晶度的羟基磷灰石存在可降解性差、骨整合速率低、缺乏骨诱导性等问题，这限制了其在临床上的应用。研究发现，天然骨的无机矿物组成是非化学计量的弱结晶碳酸化羟基磷灰石，且含有钠、镁、钾、氟、氯、锶、锌、硅、铜等多种不同的微量和痕量元素，这些微量痕量元素在与骨发育和代谢密切相关的生化反应中起着重要作用。
大量研究表明，通过离子掺杂改性可以使羟基磷灰石具有更优异的生物学性能。碳酸根离子是骨磷灰石中含量最多的离子，约占骨矿物总质量的4％～8％。碳酸根替代磷酸根合成的羟基磷灰石通常称为碳酸化羟基磷灰石(Carbonated hydroxyapatite，CHA)。研究显示，碳酸根离子的掺入，可以改善羟基磷灰石的生物相容性，刺激细胞在其表面的成骨分化。锌离子可以通过抑制破骨细胞分化和提高成骨细胞活性和成骨分化来促进骨生长。锶离子与钙离子属于同一主族，因此锶离子可以任意比例替代羟基磷灰石中的钙离子，且可以抑制破骨细胞活性和促进成骨前体细胞增殖。镁离子掺杂羟基磷灰石也有利于成骨细胞增殖及促进成骨和成血管。硅掺杂羟基磷灰石更易于在体内降解和促进新骨生成和血管化。此外，研究显示，羟基磷灰石的降解速率明显受到其结晶度的影响，降低羟基磷灰石的结晶度能够显著提高其生物可降解性能。因此，与传统的高结晶度羟基磷灰石相比，活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石与人体自然骨骼成分更加接近，具有更优异的降解性能和成骨性能。
羟基磷灰石在临床上用作骨缺损修复或替代材料时，需要以磷灰石块体、微球或颗粒人工骨等形式植入体内，否则容易引起炎症反应(Groot K D.Effect of Porosityand Physicochemical Properties on the Stability,Resorption,and Strength ofCalcium Phosphate Ceramics[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2010,523(Bioceramics:Material Characteristics Versus in Vivo Behavior):227-233.)。羟基磷灰石陶瓷支架一般是经过高温烧结制备得到，然而，这个方法并不适用于活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石块体、微球或颗粒人工骨等的制备。研究表明，碳酸根离子掺杂会降低羟基磷灰石的热稳定性，使其在温度达到700℃以上时发生分解，此外，在高温烧结过程中，羟基磷灰石的结晶度会不断提高，晶粒尺寸增大。目前已有研究者提供了一种弱结晶碳酸化羟基磷灰石块体的制备方法，具体是将氢氧化钙粉体压制成直径为10mm的圆片，然后将其置于二氧化碳氛围下反应3天，最后将反应后的圆片在60℃的磷酸氢二钠溶液中浸泡14天，即得到弱结晶碳酸化羟基磷灰石块体，但是该方法反应周期长，制备工艺复杂，并且得到的碳酸化羟基磷灰石的结晶度不可控(Nagai H,Kobayashi-Fujioka M,Fujisawa K,et al.Effects of low crystalline carbonate apatite onproliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow cells.JMater Sci Mater Med,2015,5(2):1-8.)。活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石块体或颗粒骨修复材料的制备还未见有报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨及其制备方法和应用。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的制备方法，包括如下步骤：
(1)将钙源、活性离子源、磷源、碳酸根离子源与水混合均匀，得到反应溶液，调节所述反应溶液的pH为碱性，搅拌处理，进行微波处理，陈化、离心取沉淀，洗涤，干燥，得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体；
(2)将步骤(1)所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体压制成型，得到块状坯体，将块状坯体破碎，过筛，得到筛分后的颗粒，升温进行烧结，得到所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨(特定粒度范围、形状不规则的颗粒人工骨)。
本发明提供的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨，其组成通式为Ca10-aMa(PO4)6-b-c(SiO4)b(CO3)c(OH)2，a×10表示M离子的摩尔掺杂百分含量(mol.％)，(100×b)/6、(100×c)/6分别表示硅酸根离子和碳酸根离子的摩尔掺杂百分含量(mol.％)，其中0≤a≤2，0≤b≤0.5，0＜c≤1.6，a、b不同时为零，M为掺杂替代Ca位的金属离子，所述金属离子为Sr、Zn、Mg离子中的一种。
进一步地，步骤(1)所述钙源为硝酸钙；
进一步地，步骤(1)所述活性离子源为硝酸锶、硝酸锌、硝酸镁、正硅酸乙酯中的至少一种；
进一步地，步骤(1)所述磷源为磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的至少一种；
进一步地，步骤(1)所述碳酸根离子源为碳酸氢铵、碳酸氢钠中的至少一种；
进一步地，步骤(1)中，调节所述反应溶液的pH值为10.0-11.0。
优选地，步骤(1)中，可以采用氨水或氢氧化钠水溶液调节所述反应溶液的pH值为10.0-11.0。
进一步地，步骤(1)所述钙源与活性离子源的摩尔比为4-200:1；
进一步地，步骤(1)所述钙源与磷源的摩尔比为1.4-2.5:1；
进一步地，步骤(1)所述碳酸根离子源与磷源的摩尔比为0.01-0.40:1；
进一步地，步骤(1)所述钙源与水的摩尔体积比为0.05-0.25:1mol/L。
优选地，在步骤(1)所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨中，活性离子的掺杂含量范围为：1-20mol.％锶离子、0.5-3mol.％锌离子、0.5-3mol.％镁离子、2-8mol.％硅酸根离子；掺杂碳酸根离子的含量范围为9-26mol.％。
进一步地，步骤(1)所述搅拌的速率为300-600r/min，
进一步地，步骤(1)所述搅拌的时间为15-45min；
进一步地，步骤(1)所述微波处理的时间为15-60min，进一步地，步骤(1)所述微波处理的功率为2-10kW；
进一步地，步骤(1)所述陈化的时间为24-72h。
进一步地，步骤(2)所述压制成型包括：预压成型和冷等静压二次加压成型，所述预压成型的压强为20-60MPa，所述预压成型的保压时间为15-90s；所述冷等静压二次加压成型的压强为80-220MPa，冷等静压二次加压成型的保压时间为2-10min；
进一步地，步骤(2)所述筛分后的颗粒粒径为0.5-2.8mm；
进一步地，步骤(2)所述烧结的温度为520-700℃；
进一步地，步骤(2)所述烧结的保温时间为1-5h；
进一步地，步骤(2)所述升温的速率为2-10℃/min。
本发明提供另一种活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的制备方法，包括如下步骤：
将所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体、微晶纤维素及甲基纤维素水溶液，混合均匀，得到可塑物料，将所述可塑物料塑型为球状颗粒，干燥，冷等静压，升温进行烧结，筛分，得到所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨。
进一步地，所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体与微晶纤维素的质量比为5:4-5:9；
进一步地，所述甲基纤维素水溶液的浓度为0.3-1.0wt％；
进一步地，所述甲基纤维素水溶液与活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体的质量比为8:5-12:5；
进一步地，所述干燥的温度为37-60℃，
进一步地，所述干燥的时间为12-48h；
进一步地，所述冷等静压的压强为80-220MPa，冷等静压的保压时间为2-10min。
进一步地，所述烧结的温度为520-700℃，烧结的保温时间为1-5h，所述升温的速率为2-10℃/min；
进一步地，所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的粒径大小为0.5-2.8mm。
优选地，所述将可塑物料塑型为球状颗粒，包括：
将所述可塑物料加入到挤出机中，使物料从孔板中挤出，得到圆棒状物料；然后将圆棒状物料放进滚圆机中，调节转速，得到羟基磷灰石球状颗粒。
进一步优选地，所述挤出机的挤出速度为10～90r/min；所述孔板的孔径尺寸范围为0.5-3.0mm；所述滚圆机调节转速的范围为400-1000r/min。
本发明提供一种由上述制备方法制得的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨。
本发明提供的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨能够应用在制备医用骨缺损填充修复材料中。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨，在组成和结晶度上与人体自然骨骼的无机成分更加接近，低结晶度和离子掺杂协同促进了材料的降解和骨髓间充质干细胞在材料表面的黏附和成骨分化，显著优于传统高结晶度羟基磷灰石的降解性能和成骨性能，因此作为骨缺损修复材料具有独特的优势和应用潜力。
(2)本发明在制备活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的过程中，不需要经过高温烧结，这可以避免碳酸化羟基磷灰石在高温烧结过程中发生二氧化碳逸出和结晶度升高等问题。此外，本发明可以通过控制微波处理时间和陈化时间来调控活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体的结晶度，并通过控制低温烧结温度来调控最终活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的结晶度。
(3)本发明通过改变磷源和碳酸根离子源的相对初始含量可以得到不同碳酸根含量的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体，从而得到不同碳酸根含量的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨。
(4)本发明通过冷等静压成型提高了活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石块状坯体和球状颗粒的致密度，从而提高低温烧结后活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒的强度；此外，在活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石球状颗粒人工骨的制备过程中，在所述掺杂量范围内掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石无毒性，且通过低温烧结去除了添加的微晶纤维素和甲基纤维素等有机试剂，得到了完全无毒性的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨。
附图说明
图1为对比例1和实施例1的X射线衍射图。
图2为对比例1高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨破碎前陶瓷块体表面的扫描电子显微镜图。
图3为实施例1活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨破碎前陶瓷块体表面的扫描电子显微镜图。
图4为对比例1高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨和实施例1活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的开孔孔隙率和体积密度结果图。
图5为小鼠骨髓间充质干细胞与对比例1高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨和实施例1活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨共培养7天后的细胞增殖情况结果图。
图6a、图6b、图6c分别为小鼠骨髓间充质干细胞与对比例1高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨、实施例1活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨共培养后的成骨分化相关基因表达情况结果图。
图7为实施例1制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的形貌图。
图8为实施例2制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的形貌图。
图9为小鼠骨髓间充质干细胞与对比例2高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨和实施例2活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨共培养7天后的ALP活性结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体按以下方法制备：称取14.66g(0.111mol)磷酸氢二铵和3.08g(0.039mol)碳酸氢铵加入2000mL的水中，配制成混合水溶液A；称取56.09g(0.2375mol)硝酸钙和2.65g(0.0125mol)硝酸锶加入2000mL的水中，配制成混合水溶液B；将混合水溶液A滴加到混合水溶液B中，滴加过程中400r/min持续搅拌，搅拌均匀，得到反应溶液，同时用氨水调节反应溶液的pH值为10.0；滴加结束后继续搅拌30min(搅拌速率为400r/min)，搅拌均匀，然后将溶液转移至微波柜中微波处理60min，微波处理的功率为2kw，随后陈化24h、离心取沉淀、洗涤和冷冻干燥，得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体。
活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨按如下方法制备：将活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体装填入不锈钢模具中，用压力机预压成型，成型压强为30MPa，保压时间60s，得到预压坯体；将预压坯体进行冷等静压二次成型，成型压强为220MPa，保压时间2min；然后将坯体破碎并用筛孔尺寸为0.60mm和0.71mm的标准筛进行筛分；最后将筛分后的羟基磷灰石颗粒(粒径为0.60-0.71mm)以5℃/min的升温速率加热至520℃，煅烧2h，即得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨。
对比例1
为与本实施例制备得到的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨进行对比，对比例1制备了未掺杂离子的高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨，具体方法如下：
按照钙磷摩尔比为1.67，将2000mL的磷酸氢二铵水溶液(0.075mol/L)滴加到2000mL硝酸钙水溶液(0.125mol/L)中，滴加过程中400r/min持续搅拌，搅拌均匀，同时用氨水调节反应溶液的pH值为10.0，滴加结束后继续搅拌120min，搅拌均匀，然后静置陈化24h，并离心取沉淀、洗涤和冷冻干燥，之后在900℃下煅烧，升温速率为5℃/min，保温时间为2h，最后研磨过筛，得到高结晶度羟基磷灰石粉体(粒径为200nm)。
将高结晶度羟基磷灰石粉体装填入不锈钢模具中，用压力机预压成型，成型压强为30MPa，保压时间60s，得到预压坯体；将预压坯体进行冷等静压二次成型，成型压强为220MPa，保压时间2min；然后将坯体破碎并用尺寸为0.60mm和0.71mm的标准筛进行筛分；最后将筛分后的羟基磷灰石颗粒(粒径为0.60-0.71mm)以5℃/min的升温速率加热至1100℃，煅烧2h，即得到高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨。
图1为对比例1和实施例1羟基磷灰石颗粒人工骨研磨成粉的X射线衍射图，可以看出对比例和实施例的物相均为单一的羟基磷灰石，无其他杂相生成。结晶度定量计算结果表明，对比例1制备的高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨的结晶度为100％，而实施例1制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的结晶度为30％。元素分析结果表明实施例1制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的碳酸根的含量为9.2wt.％，ICP结果分析表明其锶离子掺量为4.19mol.％。
图2为对比例1高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨的扫描电子显微镜图，可以看出高结晶度羟基磷灰石陶瓷晶粒尺寸较大，晶粒圆润且部分开始粘结。图3是实施例1制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的扫描电子显微镜图，可以看出，陶瓷晶粒尺寸细小，表面孔隙较多。
图4为对比例1高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨和实施例1制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的开孔孔隙率和体积密度，由图4可知，对比例1的开孔孔隙率和体积密度分别为2.93±0.41％、3.05±0.05g/m3，实施例1的分别为33.15±0.58％、1.89±0.01g/m3，相比于对比例1，实施例1的开孔孔隙率明显增加，体积密度则明显降低。对比例1高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨的比表面积为1.874m2/g，而实施例1活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的比表面积为71.688m2/g，实施例1的比表面积明显高于对比例1。
图5为小鼠骨髓间充质干细胞与对比例1制备的高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨和实施例1制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨共培养后的细胞增殖结果图。图6a、图6b、图6c分别为小鼠骨髓间充质干细胞与对比例1高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨、实施例1活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨共培养后的成骨分化相关基因表达情况结果图(图6a、图6b、图6c分别是Col-I基因、Runx2基因、OPN基因的结果图)。
细胞与材料共培养7d后，使用细胞计数试剂盒(CCK8)测定细胞增殖情况。细胞与材料共培养7d和14d后，使用实时定量PCR仪检测其成骨分化相关基因的表达情况。细胞增殖和成骨分化相关基因表达情况的检测中，细胞培养板为48孔板，接种密度为3×104cells/孔。由图5、图6a、图6b及图6c可知，在CCK-8检测中，实施例1的吸光度明显高于对比例1的吸光度，说明实施例1的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨有利于细胞增殖；在成骨分化相关基因表达检测中，在与活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨共培养时，细胞的Collagen I(Col-I)、Runt-related transcription factor2(Runx2)和osteopontin(OPN)三种成骨分化相关基因的表达量都有一定幅度的上调，说明活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的成骨性能得到了显著提高。
体外降解实验表明，对比例1制备的高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨在Tris-HCl缓冲溶液中浸泡28天后，几乎不发生降解，质量损失率接近于0％，钙离子释放量为8.94mg/L；实施例1制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨在Tris-HCl缓冲溶液中浸泡28天后，质量损失率为7.28％±0.54％，钙离子释放量为55.07mg/L，锶离子的释放量为20.56mg/L。活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的降解性能显著提高。
图7实施例1制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的形貌图，该颗粒人工骨尺寸范围为0.60mm-0.71mm。
实施例2
活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体按以下方法制备：称取16.93g(0.128mol)磷酸氢二铵和1.72g(0.02mol)碳酸氢铵加入1000mL的水中，配制成混合水溶液A；称取58.74g(0.25mol)硝酸钙和0.32g(0.00125mol)硝酸镁加入1000mL的水配制成混合水溶液B；将混合水溶液A滴加到混合水溶液B中，滴加过程中300r/min持续搅拌，搅拌均匀，得到反应溶液，同时用氨水调节反应溶液的pH值为10.5；滴加结束后继续搅拌45min(搅拌速率为300r/min)，搅拌均匀，然后将溶液转移至微波柜中微波处理15min，微波处理时输出功率为5kw，随后陈化36h、离心取沉淀、洗涤和冷冻干燥，得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体。
活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨按如下方法制备：分别称取5g活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体和4g微晶纤维素混合均匀，加入8g质量分数为0.3wt.％的甲基纤维素水溶液，拌匀制成可塑物料；将物料添加到挤出机中，选择孔板孔径为2.0mm，调节挤出速度为90r/min，得到圆棒状物料；将圆棒状物料倒入滚圆机中，调节转速为1000r/min，得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石球状颗粒；将球状颗粒在60℃下干燥12h后，进行冷等静压成型，成型压强为220MPa，保压时间2min，然后以2℃/min的速率升温至650℃，煅烧1.5h；最后用尺寸为1.40mm和1.70mm的标准筛进行筛分，得到尺寸范围为1.40mm～1.70mm的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨。图8为实施例2活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的形貌图，该颗粒人工骨尺寸范围为1.40mm-1.70mm。
对比例2
为与本实施例制备得到的弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨进行对比，对比例2制备了未掺杂离子的高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨，具体方法如下：
按照钙磷摩尔比为1.67，将2000mL的磷酸氢二铵水溶液(0.075mol/L)滴加到2000mL硝酸钙水溶液(0.125mol/L)中，滴加过程中400r/min持续搅拌，搅拌均匀，得到反应溶液，同时用氨水调节反应溶液的pH值为10，滴加结束后继续搅拌120min，搅拌均匀(搅拌速率为400r/min)，然后静置陈化24h，并离心取沉淀、洗涤和冷冻干燥，之后在900℃下煅烧，升温速率为5℃/min，保温时间为2h，最后研磨过筛，得到高结晶度羟基磷灰石粉体(粒径为200nm)。
分别称取5g高结晶度羟基磷灰石粉体和4g微晶纤维素混合均匀，加入8g质量分数为0.3wt.％的甲基纤维素水溶液，拌匀制成可塑物料；将物料添加到挤出机中，选择孔板孔径为2.0mm，调节挤出速度为90r/min，得到一定长度的圆棒状物料；将圆棒状物料倒入滚圆机中，调节转速为1000r/min，得到高结晶度羟基磷灰石球状颗粒；将球状颗粒在60℃下干燥12h后，进行冷等静压成型，成型压强为220MPa，保压时间2min，然后以2℃/min的速率升温至1100℃，煅烧1.5h；最后用尺寸为1.40mm和1.70mm的标准筛进行筛分，得到尺寸范围为1.40mm～1.70mm的高结晶度羟基磷灰石颗粒人工骨。
物相分析结果显示，对比例2和实施例2的物相均为单一的羟基磷灰石，无其他杂相生成。结晶度定量计算结果表明，实施例2制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的结晶度为40％，元素分析结果表明其碳酸根含量为5.0wt.％，ICP结果分析表明其镁离子掺量为0.62mol.％。
对两者表面微观形貌进行观察可知，对比例2颗粒人工骨晶粒尺寸较大而实施例2颗粒人工骨晶粒细小，表面孔隙较多。活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨在Tris-HCl缓冲溶液中浸泡28天后，质量损失率为3.32％±0.25％，钙离子释放量为26.96mg/L，镁离子释放量为1.28mg/L，因此活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨明显改善了羟基磷灰石的降解性能。将实施例2和对比例2分别与小鼠骨髓间充质干细胞共培养，发现实施例2制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的细胞增殖和成骨活性均优于对比例2。在细胞和材料共培养7d后，CCK-8检测中，实施例2的吸光度为1.81±0.15，对比例2的吸光度为1.47±0.14；ALP活性检测中，实施例2的ALP活性表达量为13.64±3.80U/mg，对比例2的ALP活性表达量为3.42±0.47U/mg(参照图9所示)。因此活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨促进了小鼠骨髓间充质干细胞的增殖，提高了羟基磷灰石的成骨分化性能。
实施例3
活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体按以下方法制备：称取18.00g(0.136mol)磷酸氢二铵和1.08g(0.014mol)碳酸氢铵加入1500mL的水中配制成混合水溶液A；称取57.27g(0.2425mol)硝酸钙和2.23g(0.0075mol)硝酸锌加入1500mL的水中配制成混合水溶液B；将混合水溶液A滴加到混合水溶液B中，滴加过程中500r/min持续搅拌，搅拌均匀，得到反应溶液，同时用氢氧化钠溶液调节反应溶液的pH值为11；滴加结束后继续搅拌20min(搅拌速率为500r/min)，搅拌均匀，然后将溶液转移至微波柜中微波处理30min，微波处理时输出功率为8kw，随后陈化48h、离心取沉淀、洗涤和冷冻干燥，得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体。
活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨按如下方法制备：将活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体装填入不锈钢模具中，用压力机预压成型，成型压强为20MPa，保压时间90s，得到预压坯体；将预压坯体进行冷等静压二次成型，成型压强为80MPa，保压时间10min；然后将坯体破碎并用尺寸为0.50mm和0.60mm的标准筛进行筛分；最后将筛分后的羟基磷灰石颗粒以10℃/min的升温速率加热至700℃，煅烧2.5h，即得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨。
物相分析结果显示，本实施例制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨由纯相的羟基磷灰石组成，无其他杂相生成。结晶度定量计算结果表明，本实施例制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的结晶度为45％，元素分析结果表明其碳酸根含量为3.0wt.％，ICP结果分析表明其锌离子掺量为1.05mol.％。利用扫描电子显微镜观察可知，活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨晶粒尺寸细小，表面孔隙较多。活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨在Tris-HCl缓冲溶液中浸泡28天后，质量损失率为2.02％±0.3％，钙离子释放量为17.63mg/L，锌离子释放量为0.08mg/L，因此活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨明显改善了羟基磷灰石的降解性能。小鼠骨髓间充质干细胞与活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石共培养7天后，CCK-8检测中，吸光度为1.63±0.12，ALP活性检测中，ALP活性表达量为9.02±0.75U/mg，本实施例中细胞的种植密度和检测方法与实施例2相同，因此活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨促进了小鼠骨髓间充质干细胞的增殖，提高了羟基磷灰石的成骨分化性能。
实施例4
活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体按以下方法制备：称取15.89g(0.12mol)磷酸氢二铵和2.35g碳酸氢铵(0.03mol)加入1250mL的水中配制成混合水溶液A；量取0.68mL(0.003mol)正硅酸乙酯溶解于无水乙醇中并加入到混合水溶液A中；称取59.04g硝酸钙(0.25mol)加入1250mL的水中配制成硝酸钙水溶液；将混合水溶液A滴加到硝酸钙水溶液中，滴加过程中600r/min持续搅拌，搅拌均匀，得到反应溶液，同时用氨水调节反应溶液的pH值为10.5；滴加结束后继续搅拌15min(搅拌速率为600r/min)，搅拌均匀，然后将溶液转移至微波柜中微波处理15min，微波处理时输出功率为10kw，随后陈化72h、离心、洗涤和冷冻干燥，得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体。
活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨按如下方法制备：分别称取5g活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体和9g微晶纤维素混合均匀，加入12g质量分数为1.0wt.％的甲基纤维素水溶液，拌匀制成可塑物料；将物料添加到挤出机中，选择孔板孔径为3.0mm，调节挤出速度为70r/min，得到一定长度的圆棒状物料；将圆棒状物料倒入滚圆机中，调节转速为800r/min，得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石球状颗粒；将球状颗粒在37℃下干燥48h后，进行冷等静压成型，成型压强为150MPa，保压时间6min，然后以5℃/min的速率升温至600℃，煅烧2h；最后用尺寸为2.36mm和2.80mm的标准筛进行筛分，得到尺寸范围为2.36mm～2.80mm的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨。
物相分析结果显示，本实施例制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨由纯相的羟基磷灰石组成，无其他杂相生成。结晶度定量计算结果表明，本实施例制备的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的结晶度为35％，元素分析结果表明其碳酸根含量为7.0wt.％，ICP结果分析表明其硅酸根离子掺量为0.52mol.％。利用扫描电子显微镜观察可知，活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨晶粒尺寸细小，表面孔隙较多。活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨在Tris-HCl缓冲溶液中浸泡28天后，质量损失率为5.92％±0.28％，钙离子释放量为35.4mg/L，硅离子释放量为1.6mg/L，因此活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨明显改善了羟基磷灰石的降解性能。小鼠骨髓间充质干细胞与活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石共培养7天后，CCK-8检测中，吸光度为1.63±0.12，ALP活性检测中，ALP活性表达量为9.02±0.75U/mg，本实施例中细胞的种植密度和检测方法与实施例2相同，因此活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨促进了小鼠骨髓间充质干细胞的增殖，提高了羟基磷灰石的成骨分化性能。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将钙源、活性离子源、磷源、碳酸根离子源与水混合均匀，得到反应溶液，调节所述反应溶液的pH为碱性，搅拌处理，进行微波处理，陈化、离心取沉淀，洗涤，干燥，得到活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体；
所述活性离子源为硝酸锶、硝酸锌、硝酸镁、正硅酸乙酯中的至少一种；
所述钙源与活性离子源的摩尔比为4-200：1；所述钙源与磷源的摩尔比为1.4-2.5：1；步骤(1)所述碳酸根离子源与磷源的摩尔比为0.01-0.40：1；所述钙源与水的摩尔体积比为0.05-0.25：1mol/L；
所述微波处理的时间为15-60min，微波处理的功率为2-10kW；所述陈化的时间为24-72h；
(2)将步骤(1)所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体压制成型，得到块状坯体，将块状坯体破碎，过筛，得到筛分后的颗粒，升温进行烧结，得到所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨；所述筛分后的颗粒粒径为0.5-2.8mm；所述烧结的温度为520-700℃，烧结的保温时间为1-5h，所述升温的速率为2-10℃/min；
或者，
将所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体、微晶纤维素及甲基纤维素水溶液，混合均匀，得到可塑物料，将所述可塑物料塑型为球状颗粒，干燥，冷等静压，升温进行烧结，筛分，得到所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨；所述烧结的温度为520-700℃，烧结的保温时间为1-5h，所述升温的速率为2-10℃/min；所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的粒径大小为0.5-2.8mm。
2.根据权利要求1所述的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述钙源为硝酸钙；所述磷源为磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的至少一种；所述碳酸根离子源为碳酸氢铵、碳酸氢钠中的至少一种；步骤(1)中，调节所述反应溶液的pH值为10.0-11.0。
3.根据权利要求1所述的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述搅拌处理的速率为300-600r/min，搅拌处理的时间为15-45min。
4.根据权利要求1所述的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述压制成型包括：预压成型和冷等静压二次加压成型，所述预压成型的压强为20-60MPa，所述预压成型的保压时间为15-90s；所述冷等静压二次加压成型的压强为80-220MPa，冷等静压二次加压成型的保压时间为2-10min。
5.根据权利要求1所述的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体与微晶纤维素的质量比为5:4-5:9；所述甲基纤维素水溶液的浓度为0.3-1.0wt.％；所述甲基纤维素水溶液与活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石粉体的质量比为8:5-12:5；所述干燥的温度为37-60℃，干燥的时间为12-48h；所述冷等静压的压强为80-220MPa，冷等静压的时间为2-10min。
6.一种由权利要求1-5任一项所述的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨。
7.权利要求6所述的活性离子掺杂弱结晶碳酸化羟基磷灰石颗粒人工骨在制备骨缺损填充修复生物医用材料中的应用。
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