CN113088466B - 一种具有拮抗产臭菌和除臭功效的地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种具有拮抗产臭菌和除臭功效的地衣芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有拮抗产臭菌和除臭功效的地衣芽孢杆菌C1，其保藏编号为CCTCC NO:M 2020680；本发明的地衣芽孢杆菌C1对于水环境中的产臭菌具有良好的抑菌效果，具有产臭菌拮抗功效，也可以有效去除/控制水环境中的臭味物质，具有除臭功效，可以应用于水环境治理技术领域；更进一步的，鉴于本发明的地衣芽孢杆菌C1还具有水产养殖环境的应用安全性，其还可以应用于水产养殖环境，用于除臭和拮抗产臭菌方面。

Description

一种具有拮抗产臭菌和除臭功效的地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有拮抗产臭菌和除臭功效的地衣芽孢杆菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术
近年来，在水产集约化养殖过程中，大量残饵、粪便和动植物尸体等常年累积，在大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌等产臭微生物的作用下产生了氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等恶臭物质，导致养殖水体发黑发臭，影响我国水产养殖业的可持续健康发展。
相比物理和化学法来防控水体黑臭，生物法对环境更为安全。因此，生物法防控水体黑臭，已经成为养殖水体除臭的研究热点和重要发展方向。
目前，主要是通过发酵脱硫除臭菌群来进行除臭，例如，以光合细菌、乳酸菌、酵母菌、放线菌、丝状菌为主的EM菌；由光合细菌、乳酸菌、酵母菌、放线菌、硝化细菌、反硝化细菌与芽孢杆菌复配的复合微生物制剂；由硝化菌、放线菌、丝状菌、光合菌、植物乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母菌和副干酪乳杆菌复配的脱硫除臭菌群等。
通过发酵脱硫除臭菌群的治理方法，只能做到“除臭”的治标效果，忽视了对于“产臭菌群”的抑制，不能从根本上达到好的治理效果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种地衣芽孢杆菌C1，该地衣芽孢杆菌C1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020680。
本发明另一方面提供了一种应用于水环境的除臭产品，其中，所述除臭产品包含如上述的地衣芽孢杆菌C1。
本发明再一方面提供了一种应用于水环境的产臭菌拮抗产品，其中，所述产臭菌拮抗产品包含如上述的地衣芽孢杆菌C1。
本发明再一方面提供了上述的地衣芽孢杆菌C1对于水产养殖环境的除臭方面的应用。
本发明再一方面提供了上述的地衣芽孢杆菌C1对于水产养殖环境的拮抗产臭菌方面的应用。
本发明再一方面提供了上述的地衣芽孢杆菌C1在水环境治理领域的应用。
优选的，所述应用为所述的地衣芽孢杆菌C1在除臭方面的治理应用。
优选的，所述应用为所述的地衣芽孢杆菌C1在拮抗产臭菌方面的治理应用。
本发明提供了一种具有拮抗产臭菌和除臭功效的地衣芽孢杆菌C1，其保藏编号为CCTCC NO:M 2020680；本发明的地衣芽孢杆菌C1对于水环境中的产臭菌具有良好的抑菌效果，具有产臭菌拮抗功效，也可以有效去除/控制水环境中的臭味物质，具有除臭功效，可以应用于水环境治理技术领域；更进一步的，鉴于本发明的地衣芽孢杆菌C1还具有水产养殖环境的应用安全性，其还可以应用于水产养殖环境，用于除臭和拮抗产臭菌方面。
附图说明
图1为本发明的菌株C1、空白对照组和阳性对照组菌株PNB3对于 NH3-N的去除率随时间变化的关系图；
图2为本发明的菌株C1、空白对照组和阳性对照组菌株PNB3对于 NO2-N的去除率随时间变化的关系图；
图3为本发明菌株C1对水环境中产臭菌的抑菌结果；
图4为本发明的菌株C1、空白对照组和阳性对照组菌株PNB3对于 NH3-N的去除率随时间变化的关系图；
图5为本发明的菌株C1、空白对照组和阳性对照组菌株PNB3对于 NO2-N的去除率随时间变化的关系图。
具体实施方式
以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。
下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、下面介绍本申请发明人从自然环境中分离筛选获得本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)C1的操作过程。
1、初筛：称取水产养殖淤泥1.0g(取自江苏连云港市大茂水产养殖场) 混悬于9mL无菌水中，振荡混匀，之后于80℃水浴静置10min；然后采用稀释涂布平板法和平板划线法在营养琼脂培养基上进行菌株的分离与纯化，选取符合芽孢杆菌形态的菌株作为候选菌株(具体参见文献：布坎南R E,吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册(第8版)[M].北京:科学出版社,1984: 729-759.)；
30℃培养24h后，将分离的候选菌株分别接种至无菌营养肉汤，再在 30℃、200r/min条件下摇床振荡培养24h后制成终浓度大约为2.0×106 CFU/mL的菌悬液。
2、二筛：筛选对产臭菌具有拮抗性能的菌株；
采用十字交叉划线法将初筛获得的候选菌株与4种产臭菌株(普通变形杆菌T1、大肠杆菌L1、大肠杆菌L7和大肠杆菌L9，均来源于上海海洋大学水生动物病原库)相互垂直地接种于营养琼脂培养基上，然后置于培养箱中28℃恒温培养，24～48h之内观察有无抑菌区出现；
并参照文献(LATEGAN M J,TORPY F R,GIBSON L F.Control of saprolegniosisin the eel Anguilla australis Richardson,by Aeromonas media strain A199[J].Aquaculture,2006,240(1/4):19-27)中所公开的对于优良拮抗菌株的判定标准，选取抑菌直径最大(约为18.5～22.3mm)的菌株作为拮抗产臭菌的优良菌株，将其命名为菌株C1。
二、关于菌株C1的鉴定过程如下：
1、分子生物学鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:43-65.)和《伯杰细菌鉴定手册》(布坎南R E,吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册(第8版)[M].北京:科学出版社,1984: 729-759.)对上述获得的拮抗产臭菌的优良菌株C1进行分子生物学鉴定。
具体的，以菌株C1的基因组DNA为模板(采用天根生化科技有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取菌株C1的基因组DNA)，再采用天根生化科技有限公司的PCR扩增试剂盒扩增该菌株C1的16S rRNA序列。
扩增所采用的引物为细菌16S rRNA的通用引物。
PCR的扩增条件为：94℃3min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，共35个循环。扩增条带使用天根生化科技有限公司的DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收；回收样品的测序由上海迈浦生物科技有限公司完成。
通过测序确定菌株C1的16S rRNA为1454bp大小的片段，具体序列如 SEQ ID NO.1所示；将其与GenBank基因库中已知的核酸序列进行BLAST 分析，结果显示，菌株C1的16SrRNA序列与芽孢杆菌属的地衣芽孢杆菌菌株的16S rRNA序列自然聚类，同源性达到93％-96％；再利用Mega 5.2软件包，通过邻接法构建系统发育树，并重复抽样1000次分析系统发育树各分支的置信度，发现菌株C1与地衣芽孢杆菌菌株514(GenBank登录号： MW270171)的亲缘关系最近。
2、生理生化鉴定
菌株C1的生理生化鉴定结果：
1)与地衣芽孢杆菌参考菌株PNB3的生理生化特性的一致性达到了 90.5％；两者仅在D-木糖和棉子糖的生理生化指标方面不同；
2)与地衣芽孢杆菌H1的生理生化特性的一致性达到了84.0％；两者仅在甘露醇、鼠李糖、果糖和海藻糖的生理生化指标方面不同；
3)与地衣芽孢杆菌A1的生理生化特性的一致性达到了80.0％；两者仅在吲哚、甘露醇和乳糖的生理生化指标方面不同；
4)与地衣芽孢杆菌CAS20的生理生化特性的一致性达到了78.6％；两者仅在甲基红实验、乳糖和溶菌酶的生理生化指标方面不同。
综合分子生物学和生理生化鉴定结果，最终判定筛选获得的拮抗产臭菌的优良菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
三、关于菌株的保藏
本发明的具有拮抗产臭菌作用的优良菌株C1，属地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，已于中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏日期：2020 年11月5日；保藏编号为CCTCC NO:M 2020680。保藏地址：中国武汉。
四、本发明的具有拮抗产臭菌的作用的优良菌株C1对于产臭菌的抑菌活性的测定与分析
参照文献(潘晓倩,成晓瑜,张顺亮,乔晓玲,陈文华.不同检测方法在抗菌肽抑菌效果评价的比较研究[J].肉类研究,2014,28(12):17-20.)的方法，采用纸片法测定本发明的菌株C1对产臭菌的拮抗活性。
具体的，先将121℃高温灭菌后的营养琼脂培养基制成不含菌的平板，待平板凝固后分别吸取200μL 2.5×105CFU/mL浓度的产臭菌株T1、L1、L7 和L9菌悬液均匀涂布于培养基表面。再将准备好的滤纸片置于平板中央，吸取10μL 2.0×105CFU/mL浓度的菌株C1的菌悬液，缓慢滴加于滤纸片上， 37℃培养24h后观察其抑菌圈大小。
该试验以地衣芽孢杆菌菌株PNB3(由上海海洋大学水生动物病原库提供)作为阳性对照。
试验结果参见下表1。
表1
Figure BDA0003008471890000051
从表1的结果可以看出，本发明的菌株C1对四种产臭菌均具有良好的抑菌效果。阳性对照菌株PNB3(已知的产臭菌拮抗菌)对于四种产臭菌的最大抑菌圈直径分别约为11.7mm、13.8mm，13.1mm和9.2mm；而本发明的菌株C1对于四种产臭菌的最大抑菌圈直径分别约为22.3mm、23.7mm、 21.8mm和18.5mm；从数据对比结果来看，本发明的菌株C1对于四种产臭菌的抑菌拮抗效果约为阳性对照菌株PNB3的1.7～2倍左右。可以看出，本发明的菌株C1能够显著抑制四种产臭菌的生长，具有拮抗产臭菌的作用。
五、本发明的菌株C1的除臭活性的测定与分析
参照文献(段露林,段学军.高效脱氨氮菌株的分离纯化及其除臭效果研究 [J].水处理技术,2017,43(03):53-55,63.)中的方法，以氨氮、亚硝酸盐氮作为臭源物质，按体积分数2％的接种量将菌浓度为2.0×105CFU/mL的菌株C1 分别接种于含有200mL亚硝化细菌培养液、硝化细菌培养液的锥形瓶中。
以接种菌株C1的作为实验组，另外，以空白液体培养基作为空白对照组，以接种地衣芽孢杆菌菌株PNB3的作为阳性对照组，置于28℃培养箱培养观察7d，每隔24h，用分光光度法测定培养液中NH3-N和NO2-N的含量。
关于NH3-N和NO2-N的去除率R的计算，参照文献(孙庆花,于德爽, 张培玉,林学政,徐光耀,李津.海洋菌株y3的分离鉴定及其异养硝化-好氧反硝化特性[J].环境科学,2016,37(03):1089-1097.)。
计算公式为：R＝(1-ρ/ρ0)×100％；
式中，ρ和ρ0分别为空白样品和接种样品中NH3-N或NO2-N的质量浓度。
试验结果参见图1和图2，图1为本发明的菌株C1、空白对照组和阳性对照组菌株PNB3对于NH3-N的去除率随时间变化的关系图；图2为本发明的菌株C1、空白对照组和阳性对照组菌株PNB3对于NO2-N的去除率随时间变化的关系图。
从图1可以看出，随着培养时间的增长，接种了菌株C1的实验组培养液中NH3-N的含量持续降低，其对于NH3-N的去除率逐渐提高，7d时，菌株C1的NH3-N去除率高达79％，而相同情况下的阳性对照组菌株PNB3的 NH3-N去除率仅43％。因此，可以看出，本申请的菌株C1对NH3-N具有显著的去除作用。
从图2可以看出，随着培养时间的增长，接种了菌株C1的实验组培养液中NO2-N的含量持续降低，其对于NO2-N的去除率逐渐提高，7d时，菌株C1的NO2-N去除率高达91％，而相同情况下的阳性对照组菌株PNB3的 NO2-N去除率仅26％。可以看出，本申请的菌株C1对NO2-N具有显著的去除作用。
综上，本发明的菌株C1对于NH3-N和NO2-N均具有良好的去除活性，即具有良好的除臭活性。
六、本发明的菌株C1在水产养殖环境的应用安全性
参照文献(陈薇,丁祥力,吴迎奔,等.水产养殖用复合微生态制剂的安全性评价[J].贵州农业科学,2013,41(2):138-140.)中的方法，分析本发明的菌株C1在水产养殖环境的应用安全性。
具体的，试验设置1个空白对照组和5个试验组，分别在盛有35dm3的标准稀释水的玻璃水族缸中放入健康斑马鱼(水产养殖应用方面的模式生物) 各10尾。5个试验组的鱼缸中加入本发明的菌株C1的菌悬液分别至终浓度为2.0×104、2.0×105、2.0×106、2.0×107、2.0×108CFU/mL，空白对照组不加任何物质。
连续喂养斑马鱼7d，观察鱼体反应能力、游动能力、呼吸能力等指标，试验期间水温控制在23℃、DO>4mg/L、pH为7.2。试验期间记录各组斑马鱼的死亡数目，采用BLISS法计算本发明的菌株C1对斑马鱼的半数致死浓度(LC50)。
试验结果参见下表2。
表2菌株C1的应用安全性
Figure BDA0003008471890000071
Figure BDA0003008471890000081
在菌株C1的终浓度为2.0×104～2.0×108CFU/mL的水产环境中，连续浸泡7d，斑马鱼均生长良好，游动和呼吸能力正常，未出现鱼体侧翻、反应迟缓等不正常现象，与空白对照组中的斑马鱼情况基本一致，生长良好，未出现死亡现象(表2的结果)；这些试验结果说明，本发明的菌株C1对于斑马鱼的LC50>2.0×108CFU/mL；也证明了本发明的菌株C1在水产养殖环境的应用安全性是可靠的。
鉴于本发明的地衣芽孢杆菌C1(保藏编号为CCTCC NO:M 2020680) 的拮抗产臭菌和除臭方面的良好活性，以及在水产养殖环境的应用安全性，本发明的地衣芽孢杆菌C1可以应用于水产养殖技术领域。具体来说，对于水产养殖环境的除臭方面的应用，或者，对于水产养殖环境的拮抗产臭菌方面应用。
七、本发明的菌株C1在水环境中拮抗产臭菌、以及去除臭味物质方面的应用效果分析
参照文献(段露林,段学军.高效脱氨氮菌株的分离纯化及其除臭效果研究 [J].水处理技术,2017,43(03):53-55,63.)中的方法，对本发明的菌株C1在水环境中拮抗产臭菌、以及去除臭味物质方面的应用效果进行测定分析。
具体的，将本发明的菌株C1按体积分数2％的接种量接种到30L的城市环境污水(来源于上海市南汇新城镇春华秋色公园)中直至终浓度达2.0 ×103CFU/mL，然后于30℃静置曝气，分别在振荡培养后的0、24、48、72、 96、120h取样，在伊红美兰培养基和M-WS培养基上采用稀释涂布平板法测定普通变形杆菌与大肠杆菌的浓度。同时，试验过程中每天采水样并利用试剂盒法(参见文献：隋丽英,于秀玲,辛乃宏,等.养殖水中氨氮和亚硝酸盐氮的快速测定[J].海湖盐与化工,1998(2):3-5.)来测定NH3-N和NO2-N含量的变化情况。
接种本发明的菌株C1的城市环境污水为实验组，同时，以不添加其他物质的城市环境污水作为空白对照组，以接种菌株PNB3的菌悬液的城市环境污水作为阳性对照组。
试验结果参见图3-图5；其中图3为本发明菌株C1对水环境中产臭菌的抑菌结果；图4为本发明的菌株C1、空白对照组和阳性对照组菌株PNB3对于NH3-N的去除率随时间变化的关系图；图5为本发明的菌株C1、空白对照组和阳性对照组菌株PNB3对于NO2-N的去除率随时间变化的关系图。
从图3中可以看出，试验期间，接种了本发明的菌株C1的实验组水体中的产臭菌含量大幅下降，具体的，普通变形杆菌和大肠杆菌的菌含量均明显低于空白对照组和阳性对照组，这说明，本发明的菌株C1可以有效抑制水环境中产臭菌的生长，对于水环境中的产臭菌具有良好的抑菌效果。
从图4中可以看出，试验期间，随着培养时间的增长，接种了本发明的菌株C1的实验组水体中的NH3-N的含量持续降低至0.46mg/L，空白对照组最终降低至0.73mg/L，接种了PNB3的阳性对照组最终降低至0.67mg/L；这说明本发明的菌株C1可以有效去除/控制水环境中的臭味物质NH3-N。
从图5中可以看出，试验期间，随着培养时间的增长，接种了本发明的菌株C1的实验组水体中的NO2-N的含量迅速降低至后期平稳并保持在0.026 mg/L，空白对照组和接种了PNB3的阳性对照组前期降低迟缓，到后期分别反弹至0.051mg/L、0.047mg/L；这说明本发明的菌株C1可以有效去除/控制水环境中的臭味物质NO2-N。
从上述内容可以看出，本发明的地衣芽孢杆菌C1(保藏编号为CCTCC NO:M2020680)对于水环境中的产臭菌具有良好的抑菌效果，具有产臭菌拮抗功效，因此，本领域技术人员在获知这一技术内容的基础上，可以开发应用于水环境的产臭菌拮抗产品。
从上述内容可以看出，本发明的地衣芽孢杆菌C1(保藏编号为CCTCC NO:M2020680)可以有效去除/控制水环境中的臭味物质，具有除臭功效，因此，本领域技术人员在获知这一技术内容的基础上，可以开发应用于水环境的除臭产品。
同理，从上述内容也可以看出，本发明的地衣芽孢杆菌C1可以应用于水环境治理技术领域。具体来说，可以应用于水环境的除臭方面的治理，或者，在水环境的拮抗产臭菌方面治理应用。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0003008471980000011
Figure IDA0003008471980000021
Figure IDA0003008471980000031

Claims (6)

1.一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)C1，该地衣芽孢杆菌C1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020680。
2.一种应用于水环境的除臭产品，其特征在于：所述除臭产品包含如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌C1。
3.一种应用于水环境的产臭菌拮抗产品，其特征在于：所述产臭菌拮抗产品包含如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌C1；所述产臭菌为普通变形杆菌T1、大肠杆菌L1、大肠杆菌L7或大肠杆菌L9中的任意一种或多种的组合。
4.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌C1对于水产养殖环境的除臭方面的应用。
5.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌C1对于水产养殖环境的拮抗产臭菌方面的应用，其特征在于：所述产臭菌为普通变形杆菌T1、大肠杆菌L1、大肠杆菌L7或大肠杆菌L9中的任意一种或多种的组合。
6.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌C1在水环境治理领域的应用，其特征在于：所述应用为所述的地衣芽孢杆菌C1在除臭方面的治理应用；或者，所述应用为所述的地衣芽孢杆菌C1在拮抗产臭菌方面的治理应用；所述产臭菌为普通变形杆菌T1、大肠杆菌L1、大肠杆菌L7或大肠杆菌L9中的任意一种或多种的组合。
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