CN113061152A - 一种利用氨基型树脂分离纯化甘油葡萄糖苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用氨基型树脂分离纯化甘油葡萄糖苷(GG)的方法，该方法首先将阴离子交换树脂转型成为带‑NH2的氨基型树脂，填充至含有保温夹套的层析柱中；然后将含有葡萄糖和果糖的甘油葡萄糖苷混合溶液稀释3倍，其中，稀释前混合溶液中甘油葡萄糖苷的浓度为400～600g/L，葡萄糖和果糖的浓度均为80～150g/L，再用移液管移取0.1～0.5mL稀释后的混合溶液并均匀地滴加到树脂上，采用洗脱剂以0.1～0.5BV/h的流速对树脂进行洗脱，收集洗脱液，即得纯化后的甘油葡萄糖苷溶液。本发明方法可以分离由酶合成GG产生的糖类物质，得到高纯度的GG溶液，弥补了分离纯化GG领域的技术空白。

Description

一种利用氨基型树脂分离纯化甘油葡萄糖苷的方法
技术领域
本发明涉及一种利用氨基型树脂分离纯化甘油葡萄糖苷的方法，属于分离技术领域。
背景技术
甘油葡萄糖糖苷(Glucosylglycerol，GG)是一种多功能细胞激活剂，由葡萄糖和甘油通过糖苷键连接而成。通过不同的连接形式，GG有六种结构，直至目前，β型GG只在高等植物中被检测到，α型的GG研究的较多，用途也较广。
2-αGG作为一种多功能细胞激活剂，具有保湿、抗氧化和抗衰老等功效，可用于化妆品行业；作为一种无致龋性的甜味剂，可添加到食品中；同时它还具有治疗过敏性呼吸系统疾病、降低血糖等功效，可应用于人体保健品；还能作为一种酶稳定剂，因此具有重大的研究意义和应用价值。
为了满足工业生产GG的需要，通常采用酶法来合成GG，但由酶合成GG 过程中会产生若干糖类物质，从而影响产品GG的纯度。而在已有的文献记载中，只有活性炭被报导有较好的分离效果(Goedl C,Sawangwan T,Mueller M,et al.A high-yielding biocatalyticprocess for the production of 2-O-(α-d-glucopyranosyl)-sn-glycerol,a naturalosmolyte and useful moisturizing ingredient[J].Angewandte Chemie.2008,47(52):10086-10089.)。因此，迫切需要开发一种高效的分离技术来提高GG的纯度，得到高纯度的GG溶液。其中，葡萄糖是该产品中的一种主要杂质，但至目前为止尚无较好的去除方法。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供一种利用氨基型树脂分离纯化甘油葡萄糖苷的方法，采用该方法可以分离由酶合成GG产生的糖类物质，得到高纯度的 GG溶液，弥补了分离纯化GG领域的技术空白。
为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：
一种利用氨基型树脂分离纯化甘油葡萄糖苷的方法，步骤如下：
(1)将树脂填充至含有保温夹套的层析柱中，层析柱体积为150～250 mL/BV，保温夹套的温度设置为30～50℃；
(2)将含有葡萄糖和果糖的甘油葡萄糖苷混合溶液稀释3倍，其中，稀释前混合溶液中甘油葡萄糖苷的浓度为400～600g/L，葡萄糖和果糖的浓度均为 80～150g/L，然后用移液管移取0.1～0.5mL稀释后的混合溶液，均匀地滴加到树脂上，采用洗脱剂以0.1～0.5BV/h的流速对树脂进行洗脱，收集洗脱液，用液相监控，得到纯化后的甘油葡萄糖苷溶液。
优选地，所述的保温夹套的温度为40℃。
优选地，所述氨基树脂是采用树脂LX-950转型制备得到，所述转型制备步骤为：首先采用4％氢氧化钠和4％盐酸对树脂进行交替洗脱，其次用4％赖氨酸转型，并用液相监控，当树脂吸附赖氨酸饱和后，再用纯水洗至中性，得到氨基型树脂。
优选地，所述洗脱剂为水或有机溶剂。
进一步优选地，所述有机溶剂为80％体积分数的乙腈水溶液。
优选地，所述的层析柱体积为200mL/BV。
优选地，步骤(2)中稀释前的混合溶液中甘油葡萄糖苷的浓度为600g/L。
优选地，所述移液管移取的混合溶液体积为0.1mL。
优选地，洗脱流速为0.1BV/h。
从以上描述可以看出，本发明具备以下优点：
(1)本发明方法可以分离由酶合成GG产生的糖类物质，得到高纯度的GG 溶液，弥补分离纯化GG领域的技术空白；
(2)本发明方法采用水或乙腈水溶液作为洗脱剂，洗脱体积少，经济和时间成本低。
(3)本发明方法条件温和，对操作者不会存在安全隐患。
附图说明
图1是实施例1中LX-950转型后的氨基树脂层析柱在35℃下的洗脱曲线图；
图2是实施例2中LX-950转型后的氨基树脂层析柱在40℃下的洗脱曲线图；
图3是实施例3中XR239A转型后的氨基树脂层析柱在40℃下用80％体积分数的乙腈水溶液洗脱的洗脱曲线图；
图4是实施例4中LX-950转型后的氨基树脂层析柱在40℃下的液相色谱图；
图5是实施例4中纯化后的甘油葡萄糖苷产品质谱图
具体实施方式
下面结合具体的实施例子，进一步阐述本发明的特点，但不对本发明的权利要求做任何限定。
实施例1
(1)采用4％氢氧化钠和4％盐酸对树脂LX-950(西安蓝晓科技新材料股份有限公司，下同)进行交替洗脱，其次用4％的赖氨酸转型，用液相监控，当赖氨酸被完全从树脂上洗脱下来后，再用纯水洗至中性，得到氨基树脂；
(2)步骤(1)得到的氨基树脂填充至含有保温夹套的层析柱中，层析柱体积为200mL/BV，保温夹套的温度设置为35℃；
(3)将含有葡萄糖和果糖的甘油葡萄糖苷混合溶液稀释3倍，其中，稀释前混合溶液中甘油葡萄糖苷的浓度为450g/L，葡萄糖的浓度为150g/L，果糖的浓度为100g/L，然后用移液管移取0.1mL稀释后的混合溶液，均匀地滴加到树脂上，用纯水以0.1BV/h的流速对树脂进行洗脱，收集洗脱液，利用色谱柱和高效液相色谱-示差检测器(流动相:乙腈/水＝8/2，下同)监控，得到纯化后的甘油葡萄糖苷溶液。绘制洗脱曲线图，结果如图1和表1所示。
表1 LX-950转型后的氨基树脂层析柱在35℃下用纯水洗脱的纯度变化表
Figure BDA0002993910980000031
由图1和表1可以看出，树脂在该条件下进行洗脱，并没有较好的分离GG 和其他糖类，只有在洗脱后期才得到少量GG纯品。
实施例2
将实施例1步骤(2)中保温夹套温度由35℃替换为40℃，其他操作和实施例1相同。收集洗脱液，利用色谱柱和高效液相色谱-示差检测器监控，得到纯化后的甘油葡萄糖苷溶液。绘制洗脱曲线图，结果如表2所示。
表2 LX-950转型后的氨基树脂层析柱在40℃下用纯水洗脱的纯度变化表
Figure BDA0002993910980000041
由图2和表2可以看出，树脂在该条件下进行洗脱，洗脱结果与实例1的结果相似，只有在洗脱后期才得到少量GG纯品。
实施例3
将实施例2步骤(1)中的氨基型树脂LX-950替换为聚赖氨酸型树脂XR239A (上海逊尔化工科技有限公司)，其他操作和实施例2相同。利用层析柱和高效液相色谱-示差检测器监控，收集洗脱液，得到纯化后的甘油葡萄糖苷溶液。绘制洗脱曲线图，结果如图3和表3所示。
表3 XR239A转型后的氨基树脂层析柱在35℃下用纯水洗脱的浓度变化表
Figure BDA0002993910980000042
Figure BDA0002993910980000051
由图3和表3可以看出，聚赖氨酸型树脂XR239A对含有葡萄糖和果糖的甘油葡萄糖苷混合溶液的分离效果远远低于氨基型树脂LX-950。
对比例1：树脂的选择
按实施例1所述方法，将LX-950用D293、D202，(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)以及XR306、XR385、XR650、XR205(上海逊尔化工科技有限公司)，用氨基酸进行转型，转型后，按实施例1所述方法进行实验。研究结果表明，对比例1所选用的树脂，并不能较好的分离甘油葡萄糖苷、果糖以及葡萄糖，具体表现为，所得洗脱液中，甘油葡萄糖苷的纯度几乎未提高。
对比例2：氨基酸的选择
按实施例1所述方法，选用LX-950树脂，将赖氨酸分别用甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸进行替换，用氨基酸进行树脂转型，转型后，按实施例1所述方法进行实验。研究结果表明，对比赖氨酸，其他种类氨基酸转型的树脂，分离甘油葡萄糖苷、果糖以及葡萄糖的效果均不理想，具体表现为，所得洗脱液中，甘油葡萄糖苷的纯度几乎未提高。这可能是由于赖氨酸中，具有两个-NH2基团，在空间构型上，能够与甘油葡萄糖苷形成多个氢键，使其与果糖和葡萄糖产生分离效果。
实施例4
将实施例2步骤(2)中洗脱剂由纯水替换为80％乙腈水溶液，其他操作和实施例2相同。收集洗脱液，利用色谱柱和高效液相色谱-示差检测器监控，得到纯化后的甘油葡萄糖苷溶液，其液相色谱结果和洗脱过程中纯度变化表分别如图4和表4所示。
表4 LX-950转型后的氨基树脂层析柱在40℃下用乙腈水溶液洗脱的纯度变化表
Figure BDA0002993910980000061
由表4可以看出，当采用80％体积分数的乙腈水溶液做为洗脱剂时，前期的收集液中含有大量的葡萄糖，而在后期可以得到较多GG纯品，将116-145mL 处的收集液浓缩后用液相检测，色谱图如图4所示，进一步经质谱确认，其为甘油葡萄糖苷，质谱图如图5所示。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用氨基型树脂分离纯化甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)将树脂填充至含有保温夹套的层析柱中，层析柱体积为150～250mL/BV，保温夹套的温度设置为30～50℃；
(2)将含有葡萄糖和果糖的甘油葡萄糖苷混合溶液稀释3倍，其中，稀释前混合溶液中甘油葡萄糖苷的浓度为400～600g/L，葡萄糖和果糖的浓度均为80～150g/L，然后用移液管移取0.1～0.5mL稀释后的混合溶液，均匀地滴加到树脂上，洗脱剂以0.1～0.5BV/h的流速对树脂进行洗脱，收集洗脱液，用液相监控，得到纯化后的甘油葡萄糖苷溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的树脂为LX-950，氨基酸为赖氨酸。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的保温夹套的温度为40℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基树脂是采用树脂LX-950转型制备得到，所述转型制备步骤为：首先采用4％氢氧化钠和4％盐酸对树脂LX-950进行交替洗脱，其次用4％赖氨酸转型，并用液相监控，当树脂吸附赖氨酸饱和后，再用纯水清洗6个BV至中性，得到氨基型树脂。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱剂为水或有机溶剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为80％体积分数的乙腈水溶液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的层析柱体积为200mL/BV。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中稀释前的混合溶液中甘油葡萄糖苷的浓度为600g/L。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述移液管移取的混合溶液体积为0.1mL。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，洗脱流速为0.1BV/h。
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