CN113005156A - 一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物及材料化学技术领域，涉及一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用，聚槲皮素的制备方法包括7个工艺步骤,首先制备槲皮素甲醇混合溶液，在向溶液中滴入漆酶和磷酸盐缓冲液的混合溶液，形成聚合物并沉淀，经冷冻干燥制得聚槲皮素冻干粉，将制得的聚槲皮素应用在眼科，制成聚槲皮素滴眼液，用于治疗真菌性角膜炎，有水溶性强、角膜穿透力强、毒性小、抗真菌、抗炎作用大、见效快的效果，延长眼表半衰期短，减少给药次数，增强患者用药的依从性，其制备工艺简单，原料成本低，适合工业生产。

Description

一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用
技术领域：
本发明属于药物及材料化学领域，涉及一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用，特别是利用漆酶促槲皮素聚合，使槲皮素的化学及生物特性得到改善，制得的聚槲皮素具有良好的抗真菌及抗炎作用，用聚槲皮素制得的滴眼液水溶性强、毒性小、抗真菌、抗炎作用大，用于治疗真菌性角膜炎。
背景技术：
真菌性角膜炎是一种由真菌感染引起的角膜炎症性病变，可由于眼部外伤、眼部慢性炎症及机体抵抗力下降等导致，是一类由致盲性真菌感染所导致的致盲性眼病，其诊断和治疗复杂而困难，临床治疗较为棘手。目前临床上采用的抗真菌药物如伏立康唑、两性霉素B和那他霉素，由于副作用大、低溶解性、昂贵的价格、毒性大和稳定性差等在临床应用受到不同程度的限制，治疗手段匮乏导致真菌性角膜炎的致盲率居高不下，申请号为CN201910315123.7的中国申请专利公开了一种槲皮素衍生物及其制备方法，采用槲皮素保护羟基、再进行取代反应和氢化反应制备槲皮素衍生物，得到了高纯度的槲皮素衍生物，对天然槲皮素进行化学修饰，通过在羟基位发生取代反应，有利于提高其水溶性和脂溶性，改善生物利用度，该申请专利未公布制得的衍生物用于角膜炎治疗。申请号为CN201010044868.3的中国专利公开了一种滴眼液及其制备方法，该滴眼液的组成及其按体积百分比的含量为牛血清0.1％～5％、增稠剂5％～15％、酸碱调节液 1％～5％、抗生素0.5％～2％、重组蛋白5％～20％、余为平衡盐溶液，将增稠剂、牛血清、抗生素和重组蛋白加到平衡盐溶液中，用酸碱调节剂调pH值，用渗透压缓冲剂调渗透压，经膜过滤除菌；或将重组蛋白制成无菌微粉，将牛血清溶解于平衡盐溶液中，调节pH值，膜过滤除菌，将重组粉末溶于该溶液中，即得滴眼液。该技术使用原料较多、工艺较为复杂，且制得的滴眼液未公开对真菌的抑制作用，也未公开对严重真菌性角膜炎的治疗作用及疗效。因此研发一种原料品种少、制备工艺简单、抗真菌且抗炎效果好的药物新剂型十分重要。
槲皮素是最丰富的膳食类黄酮之一，存在于多种日常食品中，例如苹果，洋葱，红茶，石榴等，槲皮素已被广泛报道对多种疾病发挥有益的生物活性，包括癌症、神经系统疾病、高血压、过敏性哮喘、糖尿病和特应性疾病等，槲皮素的抗微生物感染和抗炎活性也已在许多体内和体外研究中得到证实，然而，槲皮素的低溶解性和较差的稳定性会大大限制其生物利用度。本发明旨在增强槲皮素有益的化学和生物特性。传统化学催化剂一般需要剧烈的反应条件(如：高温、高压、强酸、强碱等)，而且很多具有毒性大、生物相容性低、反应效率较低等缺点，传统的化学催化技术会导致所需结构的不可逆破坏，并形成不需要的副产物，从而产生非特异性和不良的副反应。而酶是由生物体活细胞产生的具有特定空间结构的生物催化剂,具有极高的催化效率,少数的酶就能催化大量的化学反应，一般是非酶催化剂的 107～1013倍(7次方和13次方)，使得反应速率更快，酶催化聚合反应一般是在常温、常压、中性酸碱度等温和的反应条件下进行，酶促合成大分子被广泛认为是绿色化学中的强大催化反应。漆酶是多种植物或微生物中存在的多铜氧化还原酶，广泛来源于高等植物、微生物(包括真菌和细菌)和少量动物，这种高度安全的生物来源催化剂使其具有低毒性和高生物降解性，被认为是出色的安全催化剂，漆酶作为一种“绿色催化剂”，是天然的和可再生的，其催化过程将氧气还原为水，被公认为一种环境友好型催化剂，广泛应用于有机转化、合成染料脱色、造纸废水、食品加工、生物传感器和环境质量指标等多个绿色环境化学工程中；因此，寻求设计一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用，利用漆酶促槲皮素聚合，使槲皮素的化学及生物特性得到改善，制得的聚槲皮素具有良好的抗真菌及抗炎作用，该方法操作简单，高效节能，安全环保，将制得的聚槲皮素制成滴眼液，应用在眼科治疗真菌性角膜炎，具有毒性小、成本低、溶解性好、稳定性好、抗炎、抗真菌的优点，治疗效果显著。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，设计提出一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用，以解决传统化学催化方法毒性大、步骤繁琐、反应条件复杂、催化效率低的问题，克服传统化学催化方法易导致所需结构的不可逆破坏、产生非特异性和不良的副反应的缺陷，增强槲皮素有益的化学和生物特性，聚槲皮素制成的滴眼液解决了现有抗真菌滴眼液存在低溶解性、副作用大、稳定性差、毒性大、成本高的问题。
为了实现上述发明目的，本发明涉及的酶催化制备聚槲皮素的方法包括7个工艺步骤：
(1)在pH为4.5、温度为25℃的条件下，将分析纯99％的甲醇和浓度为100mM的磷酸盐缓冲液按照体积比为1：1的比例混合，形成甲醇和磷酸盐缓冲液混合溶液，然后用盐酸调整混合溶液的pH为 4.5；在每100mL pH 4.5的甲醇和磷酸盐缓冲液的混合物中加入 300～700mg浓度为10mM的槲皮素甲醇混合溶液，其溶剂为甲醇，形成反应液；
(2)将步骤(1)制得的反应液在25℃下连续搅拌48小时后，在通风阴暗的环境中，向反应液中加入总活性为30～60U的漆酶和磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液的浓度为100mM，反应48 小时并连续搅拌，混合溶液的颜色逐渐变暗，反应式为：
Figure BDA0002959201930000031
(3)将步骤(2)制得的混合溶液放入4℃的冰箱中，并持续搅拌 24小时以使聚合物沉淀；
(4)将步骤(3)制得的沉淀聚合物在离心机上以8000rpm离心 100分钟；
(5)将丙酮和去离子水溶液按照体积比1：3的比例配置洗涤溶液，然后洗涤步骤(4)制得的产物3次，以除去未反应的原料；
(6)在黑暗环境中，使用截留分子量为800的透析管在蒸馏水中透析步骤(5)制得的产物3天；
(7)使用冷冻干燥机在-60℃下真空冷冻干燥步骤(6)制得的产物，形成聚槲皮素冻干粉，并储存在4℃且无光的地方。
将本发明制得的聚槲皮素应用在眼科，制成聚槲皮素滴眼液，聚槲皮素滴眼液的成分及其含量为：在每10ml磷酸盐缓冲溶液中，加入的聚槲皮素冻干粉的含量为20～100ug。该滴眼液用于治疗真菌性角膜炎，有水溶性强、角膜穿透力强、毒性小、抗真菌、抗炎作用大、见效快的效果。
本发明与现有技术相比，使用安全绿色的漆酶催化体系，反应条件温和，易实现，环境友好，安全环保，该方法操作步骤简单，催化效率高，改善槲皮素的化学及生物特性，聚槲皮素副作用小、稳定性好，应用聚槲皮素制备的滴眼液水溶性强、角膜穿透力强、毒性小、抗真菌、抗炎作用大、见效快；延长眼表半衰期短，减少给药次数，增强患者用药的依从性；其制备工艺简单，原料成本低，适合工业生产。
附图说明：
图1是本发明的聚槲皮素的合成反应图。
图2是本发明制得的聚槲皮素的傅立叶红外光谱(FT-IR)。
图3是本发明制得的聚槲皮素热重分析图(TGA)。
图4是本发明制得的聚槲皮素扫描电镜照片。
图5是本发明制得的聚槲皮素滴眼液体外最低抑菌浓度(MIC) 分析图。
图6是本发明制得的聚槲皮素滴眼液的平板菌落计数分析图。
图7是本发明制得的聚槲皮素滴眼液与二甲基亚砜(DMSO)进行的高碘酸-希夫(PAS)染色比较图。
图8是使用本发明制得的聚槲皮素滴眼液后小鼠角膜炎症评分及角膜照片。
图9是使用本发明制得的聚槲皮素滴眼液与二甲基亚砜 (DMSO)进行的小鼠角膜苏木精-伊红(HE)染色比较。
图10是使用本发明制得的聚槲皮素滴眼液治疗后小鼠角膜免疫荧光染色照片。
图11是使用本发明制得的聚槲皮素滴眼液治疗后小鼠角膜的髓过氧化物酶(MPO)活性测定。
图12是使用本发明制得的聚槲皮素滴眼液治疗后的人上皮角膜细胞(HCEC)和小鼠角膜的实时PCR结果。
图13是使用本发明制得的聚槲皮素滴眼液治疗后小鼠角膜蛋白印迹结果。
图14是使用本发明制得的聚槲皮素滴眼液治疗后小鼠角膜酶联免疫吸附测定(ELISA)结果。
具体实施方式：
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例涉及的酶催化制备聚槲皮素的方法包括7个工艺步骤：
(1)在pH为4.5、温度为25℃的条件下，将分析纯99％的甲醇和浓度为100mM的磷酸盐缓冲液按照体积比为1：1的比例混合，形成甲醇和磷酸盐缓冲液混合溶液，然后用盐酸调整混合溶液的pH为 4.5；在每100mL pH 4.5的甲醇和磷酸盐缓冲液的混合物中加入 300～700mg浓度为10mM的槲皮素甲醇混合溶液，其溶剂为甲醇，形成反应液；
(2)将步骤(1)制得的反应液在25℃下连续搅拌48小时后，在通风阴暗的环境中，向反应液中加入总活性为30～60U的漆酶和磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液的浓度为100mM，反应 48小时并连续搅拌，混合溶液的颜色逐渐变暗，反应式为：
Figure BDA0002959201930000061
(3)将步骤(2)制得的混合溶液放入4℃的冰箱中，并持续搅拌 24小时以使聚合物沉淀；
(4)将步骤(3)制得的沉淀聚合物在离心机上以8000rpm离心 100分钟；
(5)将丙酮和去离子水溶液按照体积比1：3的比例配置洗涤溶液，然后洗涤步骤(4)制得的产物3次，以除去未反应的原料；
(6)在黑暗环境中，使用截留分子量为800的透析管在蒸馏水中透析步骤(5)制得的产物3天；
(7)使用冷冻干燥机在-60℃下真空冷冻干燥步骤(6)制得的产物，形成聚槲皮素冻干粉，并储存在4℃且无光的地方。
将本实施例制得的聚槲皮素应用在眼科，制成聚槲皮素滴眼液，聚槲皮素滴眼液的成分及其含量为：在每10ml磷酸盐缓冲溶液中，加入的聚槲皮素冻干粉的含量为20～100ug。该滴眼液用于治疗真菌性角膜炎，有水溶性强、角膜穿透力强、毒性小、抗真菌、抗炎作用大、见效快的效果。
实施例2：
本实施例涉及的酶催化制备聚槲皮素按照实施例1的工艺步骤制备，其中步骤(1)中，在每100mL pH 4.5的甲醇和磷酸盐缓冲液的混合物中加入浓度为10mM的槲皮素甲醇混合溶液的量为500mg；在步骤(2)中向反应液中加入总活性为50U的漆酶和磷酸盐缓冲液的混合溶液。
将本实施例制得的聚槲皮素应用在眼科，制成聚槲皮素滴眼液，聚槲皮素滴眼液的成分及其含量为：在每10ml磷酸盐缓冲溶液中，加入的聚槲皮素冻干粉的含量为77.2ug。该滴眼液用于治疗真菌性角膜炎，有水溶性强、角膜穿透力强、毒性小、抗真菌、抗炎作用大、见效快的效果。
实施例3：
本实施例按照实施例2的工艺步骤制备，采用辣根过氧化物酶 (HRP)代替漆酶进行催化槲皮素，制得聚槲皮素，并应用在眼科，用于治疗真菌性角膜炎，有水溶性强、角膜穿透力强、毒性小、抗真菌、抗炎作用大、见效快的效果。与HRP的反应涉及通过添加过氧化氢使铁酶进行初始的两电子氧化，从而形成氧化的中间体(HRP- 1)，槲皮素单体随后被中间体(HRP-1)氧化，从而形成单体基团，自由基物质首先偶联形成二聚体，然后形成三聚体，并重复进行直到获得相当大的低聚物。
实施例4：
本实施例按照实施例2的工艺步骤制备，采用凝胶渗透色谱 (GPC)、傅立叶红外光谱(FT-IR)、热重分析(TGA)、扫描电镜、溶解度测试对制得的聚槲皮素进行表征：
(1)凝胶渗透色谱(GPC)：将聚槲皮素溶解在四氢呋喃中，样品的进样量为10μg，柱温为30℃时，流速保持在1.00 mL·min-1。聚乙二醇标准溶液的校准曲线用于计算平均分子量和多分散度。结果：重均分子量(Mw)为6783.5g/mol，数均分子量 (Mn)为5178.2g/mol，多分散指数(Mw/Mn)为1.31。(2)傅立叶红外光谱(FT-IR)详见说明书附图的图2：通过傅立叶变换红外光谱仪获得聚槲皮素粉末和槲皮素粉末的FT-IR光谱，在400-4000 cm-1的区域内进行吸光度测量，并以4cm-1的分辨率进行32次扫描。结果：3000-3500cm-1处出现了大量的OH伸缩带，归因于酚和羟基的O-H键的振动；1550-1650cm-1的峰是由羰基振动引起的，这归因于醌的C＝O振动带；1450-1600cm-1处的峰来自芳族C＝C骨架振动；1169-1091cm-1处的谱带代表酚类化合物的C-O键。(3)热重分析图(TGA)详见说明书附图的图3：使用TGA分析仪(TG209F3，NETZSCH仪器，德国)在氮气流(20mL·min-1) 下，以10℃·min-1的加热速率将样品从25℃加热到700℃测试样品热稳定性。TGA表示了测量物质的质量与温度或时间的关系。由图可见，槲皮素的热稳定性随着温度的升高而降低，槲皮素在800℃下的降解率极高，剩余重量约为32.9％，也就是说重量损失为 67.1％。相反，聚槲皮素在相同条件下显示出极好的热稳定性，即使温度上升到几百摄氏度，也几乎没有降解。(4)扫描电镜照片详见说明书附图的图4：通过扫描电子显微镜(SEM，TM-3000， HitachiSU-70，日本)，在10kV的电压下以2000和5000倍的放大倍数表征聚槲皮素和槲皮素的表面形态结构。由图可见，槲皮素呈杆状分布并且呈相对分散的状态，聚槲皮素呈表面不均匀且具有三维结构的粗糙小颗粒，表现出相对聚集的状态，这种颗粒状结构增加了化合物的比表面积，暗示了更好的化学或生物学特性。(5)溶解度测试：分别将过量的聚槲皮素或槲皮素与水或二甲基亚砜(DMSO)(存在可见沉淀)混合。将溶液在25℃磁力搅拌72小时，直到达到平衡，沉淀6小时后，将上清液通过0.45μm膜滤器过滤，然后在高温真空烘箱中干燥，条件为80℃、0.08MPa，干燥时间为24h，使用分析天平定期测量干燥样品的重量，直到达到稳定为止，取三个精密测量的平均值，以确定每种条件下的溶解度。结果：聚槲皮素在 DMSO或水中的溶解度更好，在纯水或纯DMSO中，聚槲皮素的溶解度分别是槲皮素的1.69倍和1.83倍。
实施例5：
本实施例按照实施例2的工艺步骤制备，对制得的聚槲皮素滴眼液进行抗真菌活性分析：
(1)聚槲皮素滴眼液体外最低抑菌浓度(MIC)分析图详见说明书附图的图5：MIC是衡量抗菌药物的抗菌活性大小的一个指标，指在药物与病原菌在体外培养一定时间后，能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度。用沙氏培养基将分生孢子悬浮液调节至5×105cfu/ml，将聚槲皮素滴眼液以倍比稀释的浓度分别溶解在液体培养基中。将要测试的稀释溶液转移到96孔板中，每孔的体积为100μL，每种条件重复5次。将96孔板在37℃下孵育24小时，然后用酶标仪在540nm下测量光密度(OD)。由图可见：聚槲皮素在1.93μg/ml 时开始抑制烟曲霉菌，而根据以前的研究槲皮素在4.8μg/ml时开始抑制烟曲霉菌。
(2)聚槲皮素滴眼液的平板菌落计数分析图详见说明书附图的图6：平板菌落计数是统计组织含菌数的有效方法，在建立FK小鼠模型后的第3天，收集二甲基亚砜(DMSO)对照组和聚槲皮素滴眼液治疗组的小鼠角膜，并在PBS中将角膜研磨均匀。将磨碎的角膜均匀地涂在琼脂培养皿上，并在37℃下孵育过夜。结果显示：聚槲皮素治疗组的真菌菌落计数明显低于对照组，提示聚槲皮素可以降低体内真菌负荷。
(3)聚槲皮素滴眼液与二甲基亚砜(DMSO)进行高碘酸-希夫 (PAS)染色比较，比较图例详见说明书附图的图7：PAS是组织病理学中常用的检测真菌的方法，真菌细胞壁中存在的多糖成分可被特异性地染成紫红色，建立FK小鼠模型后，在感染后的第3天收获 DMSO和聚槲皮素治疗组的眼球并用4％多聚甲醛固定48小时。用石蜡包埋眼球后切成5μm的切片。染色步骤按照PAS染色试剂盒的说明进行。真菌细胞壁中存在的多糖和几丁质可被染色。结果示：聚槲皮素治疗组小鼠角膜上皮及基质中的真菌载量低于DMSO组。
实施例6：
本实施例按照实施例2的工艺步骤制备，对制得的聚槲皮素滴眼液进行抗炎活性分析：
(1)聚槲皮素滴眼液治疗后小鼠角膜炎症评分及角膜照片详见说明书附图的图8：建立小鼠模型，在用水合氯醛(8％)麻醉后，向小鼠注射右角膜基质中的烟曲霉分生孢子(0.5×105μL-1)，因为左眼为空白对照。每天用3μL聚槲皮素(7.72μg/ml)处理实验眼，每天3次，而对照眼用相同剂量的溶剂处理。使用12分评分系统对不同组角膜进行一致的临床评分。由图可见：聚槲皮素治疗组的角膜无论是在角膜透明程度还是溃疡形态上都明显优于对照组，所以炎症评分明显低于对照组。
(2)聚槲皮素滴眼液进行的小鼠角膜苏木精-伊红(HE)染色比较，比较图例详见说明书附图的图9：HE染色可显示组织病理切片中疾病的炎症程度，用于估计真菌性角膜炎(FK)小鼠角膜的组织病理学变化，建立FK小鼠模型后，取DMSO和聚槲皮素治疗后第三天的眼球，并用4％多聚甲醛固定48小时。用石蜡包埋眼球，切成5微米的切片。并按照HE染色试剂盒提供的常规方法染色。结果显示：聚槲皮素治疗组角膜上皮及基质的炎症细胞明显较单纯溶剂处理组减少。
(3)聚槲皮素滴眼液治疗后小鼠角膜免疫荧光染色比较分析，比较照片详见说明书附图的图10：感染后第3天的小鼠眼球在液氮中冷冻，然后将角膜切成8μm的厚度并固定。将切片用10％山羊血清封闭30分钟，并与单克隆大鼠抗小鼠嗜中性粒细胞标记物(NIMP-R14)在4℃孵育过夜，此后与FITC偶联的山羊抗大鼠二抗共同孵育1小时。细胞核用DAPI染色。通过荧光显微镜拍摄角膜切片的图像。结果显示：聚槲皮素明显降低FK小鼠角膜上皮及基质中性粒细胞数目，从而意味着聚槲皮素可以减轻炎症反应程度。
(4)聚槲皮素滴眼液治疗后小鼠角膜的髓过氧化物酶(MPO) 活性测定，测定结果图例详见说明书附图的图11：MPO活性实验用于定量测定中性粒细胞水平。感染后第3天收获小鼠角膜，并根据 MPO试剂盒的说明进行测定。结果显示：聚槲皮素明显降低FK小鼠角膜中性粒细胞水平，此数据与上述免疫荧光结果一致。
(5)聚槲皮素滴眼液治疗后的人上皮角膜细胞(HCEC)和小鼠角膜的实时PCR结果分析，分析图例详见说明书附图的图12：人角膜上皮细胞(HCECs)和小鼠角膜的总RNA用RNAiso Plus试剂提取，并用分光光度法定量，PCR程序按照试剂商提供的步骤进行。 PCR结果显示：无论在体内还是体外，聚槲皮素都可在基因水平降低 FK炎症反应过程中重要的炎症介质TLR-2,TLR-4,IL-1β和TNF-α的表达。
(6)聚槲皮素滴眼液治疗后小鼠角膜蛋白印迹结果分析，分析图例详见说明书附图的图13：在小鼠感染后第3天，提取DMSO和聚槲皮素治疗组的小鼠角膜蛋白质，将蛋白质转移到PVDF膜上后，将膜置于封闭缓冲液中2小时，然后使用GAPDH，TLR-2和TLR-4 的一抗在4℃过夜，再用二抗孵育2小时。通过Vilber Solo 4S化学发光成像系统获得各组条带图像。结果显示聚槲皮素可在蛋白水平显著降低体内炎症反应中TLR-2和TLR-4的表达。
(7)聚槲皮素滴眼液治疗后小鼠角膜酶联免疫吸附测定 (ELISA)结果分析，分析图例详见说明书附图的图14：在小鼠角膜感染后第3天，取正常组、DMSO和聚槲皮素处理组的角膜并研磨均匀，离心后收集上清液。根据小鼠ELISA试剂盒提供的步骤评估各组 IL-1β和TNF-α的蛋白水平。结果显示聚槲皮素可在蛋白水平降低体内炎症反应中IL-1β和TNF-α的表达，这些数据与PCR结果一致。

Claims (6)

1.一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用，其特征在于聚槲皮素的制备方法包括7个工艺步骤：
(1)在pH为4.5、温度为25℃的条件下，将分析纯99％的甲醇和浓度为100mM的磷酸盐缓冲液按照体积比为1：1的比例混合，形成甲醇和磷酸盐缓冲液混合溶液，然后用盐酸调整混合溶液的pH为4.5；在每100mL pH 4.5的甲醇和磷酸盐缓冲液的混合物中加入300～700mg浓度为10mM的槲皮素甲醇混合溶液,其溶剂为甲醇，形成反应液；
(2)将步骤(1)制得的反应液在25℃下连续搅拌48小时后，在通风阴暗的环境中，向反应液中加入总活性为30～60U的漆酶和磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液的浓度为100mM，反应48小时并连续搅拌，混合溶液的颜色逐渐变暗，反应式为：
Figure FDA0002959201920000011
(3)将步骤(2)制得的混合溶液放入4℃的冰箱中，并持续搅拌24小时以使聚合物沉淀；
(4)将步骤(3)制得的沉淀聚合物在离心机上以8000rpm离心100分钟；
(5)将丙酮和去离子水溶液按照体积比1：3的比例配置洗涤溶液，然后洗涤步骤(4)制得的产物3次，以除去未反应的原料；
(6)在黑暗环境中，使用截留分子量为800的透析管在蒸馏水中透析步骤(5)制得的产物3天；
(7)使用冷冻干燥机在-60℃下真空冷冻干燥步骤(6)制得的产物，形成聚槲皮素冻干粉，并储存在4℃且无光的地方。
2.根据权利要求1所述的一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用，其特征在于将制得的聚槲皮素应用在眼科，制成聚槲皮素滴眼液，聚槲皮素滴眼液的成分及其含量为：在每10ml磷酸盐缓冲溶液中，加入的聚槲皮素冻干粉的含量为20～100ug。该滴眼液用于治疗真菌性角膜炎，有水溶性强、角膜穿透力强、毒性小、抗真菌、抗炎作用大、见效快的效果。
3.根据权利要求1所述的一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用，其特征在于所述的步骤(1)中，在每100mL pH 4.5的甲醇和磷酸盐缓冲液的混合物中加入浓度为10mM的槲皮素甲醇混合溶液的量为500mg；在步骤(2)中向反应液中加入总活性为50U的漆酶和磷酸盐缓冲液的混合溶液。
4.根据权利要求3所述的一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用，其特征在于将制得的聚槲皮素应用在眼科，制成聚槲皮素滴眼液，聚槲皮素滴眼液的成分及其含量为：在每10ml磷酸盐缓冲溶液中，加入的聚槲皮素冻干粉的含量为77.2ug。该滴眼液用于治疗真菌性角膜炎，有水溶性强、角膜穿透力强、毒性小、抗真菌、抗炎作用大、见效快的效果。
5.根据权利要求4所述的一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用，其特征在于将制得的滴眼液进行抗真菌应用比较，聚槲皮素在1.93μg/ml时开始抑制烟曲霉菌，而根据以前的研究槲皮素在4.8μg/ml时开始抑制烟曲霉菌。
6.根据权利要求4所述的一种酶催化制备聚槲皮素的方法及聚槲皮素的应用，其特征在于将制得的滴眼液进行抗炎应用比较，聚槲皮素治疗组的角膜无论是在角膜透明程度还是溃疡形态上都明显优于对照组，所以炎症评分明显低于对照组。
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