CN112646805A - 基于提取硫化一体机的游离dna提取硫化方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒，所述的试剂盒包括提取试剂组分、硫化试剂组分和纯化试剂组分；所述的提取试剂组分包括裂解液、提取漂洗液；所述的硫化试剂组分包括转化液、结合液和DNA保护液；所述的纯化试剂组分由洗涤液、磁珠、纯化漂洗液和洗脱缓冲液组成；所述的转化液由重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、四乙基氯化铵和尿素中的一种或多种组成；所述的结合液由胍盐、Tris‑HCl和结合增强剂中的一种或多种组成；所述的DNA保护液由对苯二酚、6‑羟基‑2,5,7,8‑四甲基苯并二氢吡喃‑2‑羧酸、NaF、四氢呋喃糠醇和咪唑烷基脲中的一种或多种组成；其中，所述的结合增强剂为Carrier RNA或特异性的捕获序列中的一种或两种组成。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，进一步来说，涉及表观遗传学基因检测，具体涉及一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒。
背景技术
随着癌症发病率和死亡率的不断增加，肺癌已经成为中国人群死亡的首要原因和主要的公共健康问题。根据国家癌症中心统计，2019年里恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，肺癌是世界上发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。我国75％的肺癌患者在诊断时已属晚期，5年生存率仅为15％～16％。在众多的研究中发现，cfDNA(也称血浆游离DNA或游离DNA)存在于晚期而且甚至存在于早期阶段的癌症患者的血浆/血清和外周血中。继续对其研究，发现cfDNA在疾病早期诊断、预后、检测等领域发挥着重要的作用，尤其在免疫性疾病诊疗、癌症筛查与治疗等方面具有较高价值。而且与组织样本相比，cfDNA检测具有无创和易获得的优势，比如对晚期癌症患者进行基因检测、药效评估等均可用cfDNA进行检测。伴随着cfDNA在临床医疗中的广泛应用，对cfDNA的提取提出了更高的要求。
DNA甲基化是表型修饰的一种，与癌症的发生密切相关。近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。如Septin9和(或)SDC2的甲基化与结直肠癌的发生密切相关，SHOX2基因甲基化与肺癌的发生密切相关；EMX1和(或LRRC4)的甲基化与肝癌密切相关。通过检测这些癌症标志物的甲基化水平可实现癌症的无创检测，提高癌症的早期发现率。
目前实际应用中，cfDNA的提取主要还是以手工提取为主，该方法手不仅工作量大，易出错，而且提取转化的最终效果易受人为因素等方面的影响，无法满足现有的检测需求。目前市场上已有不少自动核酸提取平台，如：Roche、Chiron、Abbott以及国内许多公司均开发出了全自动核酸提取仪器，但这些仪器的配套试剂主要为病毒核酸、基因组核酸或其它长片段核酸提取为主，鲜有基于自动化核酸提取平台的cfDNA提取试剂。亚硫酸盐转化试剂如QIAGEN和ZYMO公司的试剂全部以手动操作为主，导致后续的基因检测如qPCR检测均需要设置复孔才能保证检测结果的准确性，而国内如安徽为臻公司和北京博尔诚公司开发的基于自动核酸提取硫化仪器的核酸提取或亚硫酸氢盐纯化试剂，其操作仍不能实现全自动操作，部分试剂需要手工添加，得到的亚硫酸盐纯化DNA浓度低、稳定性差，很难满足下游的基因检测的需求。
因此，急需研发设计一种基于自动化提取硫化一体机的配套检测试剂进而满足后续的表观遗传学(基因)检测需求。
发明内容
针对现有应用中鲜有基于全自动提取硫化一体机的配套cfDNA提取和亚硫酸氢盐纯化试剂的技术瓶颈问题，本发明提供了一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化方法及试剂盒。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，包括提取试剂组分、硫化试剂组分和纯化试剂组分；
所述的提取试剂组分包括裂解液、提取漂洗液；
所述的硫化试剂组分包括转化液、结合液和DNA保护液；
所述的纯化试剂组分由洗涤液、磁珠、纯化漂洗液和洗脱缓冲液组成。
进一步的，所述的裂解液由蛋白变性剂、核酸保护剂、螯合剂和pH缓冲剂组成。
再进一步的，所述的蛋白变性剂包括胍盐；所述的核酸保护剂由水溶性维生素、DTT、Carrier RNA和NaF中的一种或多种组成；所述的螯合剂由EDTA和(或)EDTA-3K组成；所述的pH缓冲剂由磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液和柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种组成。
进一步优选的，所述的胍盐为3M～4M的盐酸胍或者异硫氰酸胍；所述的核酸保护剂包括5％～10％的水溶性维生素和(或)5％DTT和(或)0.01％～0.02％的NaF和(或)1ug/mL的Carrier RNA；所述的螯合剂包括5mM～50mM的EDTA和(或)5mM～50mM的EDTA-K3；所述的pH缓冲剂为100mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液。
进一步的，所述的提取漂洗液由胍盐、Tris-HCl(pH8.0)和EDTA组成。
再进一步的，所述的提取漂洗液由终浓度为1M～2M的盐酸胍和(或)异硫氰酸胍和10mM～50mM的Tris-HCl(pH8.0)和2mM～20mM的EDTA(pH8.0)组成。
进一步的，所述的转化液由重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、四乙基氯化铵和尿素中的一种或多种组成；所述的结合液由胍盐、Tris-HCl和结合增强剂中的一种或多种组成；所述的DNA保护液由对苯二酚、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、NaF、四氢呋喃糠醇和咪唑烷基脲的一种或多种组成。
再进一步的，所述的转化液由4M～7M的亚硫酸氢钠和(或)亚硫酸氢铵和(或)四乙基氯化铵和(或)尿素；所述的胍盐由终浓度为1M～2M的盐酸胍和(或)异硫氰酸胍；所述的Tris-HCl为10mM～50mM的Tris-HCl(pH8.0)；所述的结合增强剂为Carrier RNA和(或)特异性的捕获序列；
进一步优选的，所述的结合增强剂为浓度为1ug/mL Carrier RNA和100nmol/L的特异性捕获序列；所述特异性捕获序列位于目的基因片段的上游或者下游，且特异性捕获序列与目的基因片段的5’端间隔2bp～20bp，捕获序列片段大小为15bp～50bp，C碱基含量为10％～30％，Tm值在55℃～70℃之间，对引物探针序列无交叉影响。
进一步优选的，所述的DNA保护液由5％～10％的对苯二酚、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、NaF、四氢呋喃糠醇和咪唑烷基脲的一种或多种组成。
进一步的，所述的洗涤液由75％～80％的乙醇组成；所述的磁珠为粒径大小为300nm～800nm的硅羟基磁珠；所述的纯化漂洗液由10mM～50mM的Tris-Hcl(pH8.0)的70％～80％的乙醇组成；所述的洗脱缓冲液由10mM的Tris-HCl(pH8.0)和2mM的EDTA(pH8.0)组成。
再进一步优选的，所述的磁珠粒径大小为500nm的硅羟基磁珠。
本发明还提供了一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)试剂的准备与分装：在深孔板中1～9列依次加入4mL裂解液、1.8mL提取漂洗液、2mL洗涤液、2mL洗涤液、2mL洗涤液、1.8mL纯化漂洗液、40μL磁珠、40μL磁珠和100μL洗脱缓冲液；深孔板中第10列加入硫化试剂组分，具体加样顺序如下：
(2)加样：向1号孔位中添加血浆2ml，向9号孔位加入硫化试剂组分的转化液和DNA保护液，转化液和DNA保护液按照先加入转化液400μL后加入DNA保护液40μL的顺序进行加样；
(3)启动如下提取和硫化程序：
其中，步骤3.1)～3.5)为游离DNA的提取、纯化过程，步骤3.6)～3.12)为硫化过程，步骤3.13)～3.20)为硫化产物纯化过程；步骤3.13)结束后，向9号孔中依次加入1.5mL的结合液和50μL的DNA保护液；
(4)收集硫化纯化产物，将纯化后的硫化产物收集于DNA保存管中，-20℃±5℃保存备用。
进一步的，步骤3)中将结合液和DNA保护液置于核酸提取硫化仪器相应孔槽内，当仪器运行至步骤3.13)结束后，仪器自动向9号孔中依次加入1.5mL的结合液和50μL的DNA保护液。
本发明的技术效果在于：
提取、转化效率高：现有的市售试剂盒只能进行200μL～1mL的血浆量的提取和转化，采用本发明试剂提取和转化体系可进行1～2ml血浆cfDNA的提取和亚硫酸盐纯化，得率高；
硫化产物稳定性好：采用本发明的试剂得到的亚硫酸盐纯化产物稳定性好，可2℃～8℃稳定存储5天；
自动化程度高：本发明试剂能够与自动化核酸提取硫化仪器兼容，采用同一份磁珠实现提取和硫化纯化，整个操作过程无需任何手工操作程序。
具体实施方式
本发明为一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，包括提取试剂组分、硫化试剂组分和纯化试剂组分；
所述的提取试剂组分包括裂解液、提取漂洗液；
所述的硫化试剂组分包括转化液、结合液和DNA保护液；
所述的纯化试剂组分由洗涤液、磁珠、纯化漂洗液和洗脱缓冲液组成。
其一：进一步的，所述的裂解液由蛋白变性剂、核酸保护剂、螯合剂和pH缓冲剂组成。
再进一步的，所述的蛋白变性剂包括胍盐；所述的核酸保护剂由水溶性维生素、DTT、Carrier RNA和NaF中的一种或多种组成；所述的螯合剂由EDTA、EDTA-3K中的一种或多种组成；所述的pH缓冲剂由磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液和柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种组成。
进一步优选的，所述的胍盐为3M～4M的盐酸胍或者异硫氰酸胍；所述的核酸保护剂为5％～10％的水溶性维生素、5％DTT、0.01％～0.02％的NaF、1ug/mL的Carrier RNA中的一种或多种组成；所述的螯合剂包括5mM～50mM的EDTA、5mM～50mM的EDTA-K3中一种或多种；所述的pH缓冲剂为100mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液。
其二：进一步的，所述的提取漂洗液由胍盐、Tris-HCl(pH8.0)和EDTA组成。
再进一步的，所述的提取漂洗液由终浓度为1M～2M的盐酸胍和/或异硫氰酸胍、10mM～50mM的Tris-HCl(pH8.0)、2mM～20mM的EDTA(pH8.0)组成。
其三、进一步的，所述的转化液由重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、四乙基氯化铵和尿素中的一种或多种组成；所述的结合液由胍盐、Tris-HCl和结合增强剂中的一种或多种组成；所述的DNA保护液由对苯二酚、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、NaF、四氢呋喃糠醇和咪唑烷基脲中的一种或多种组成。
再进一步的，所述的转化液由4M～7M的亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、四乙基氯化铵和尿素中的一种或多种组成；所述的胍盐由终浓度为1M～2M的盐酸胍或异硫氰酸胍中一种或两种组成；所述的Tris-HCl为10mM～50mM的Tris-HCl(pH8.0)；所述的结合增强剂为Carrier RNA或特异性的捕获序列中的一种或两种组成；
进一步优选的，所述的结合增强剂为浓度为1ug/mL Carrier RNA和100nmol/L的特异性捕获序列；所述特异性捕获序列位于目的基因片段的上游或者下游，且特异性捕获序列与目的基因片段的5’端间隔2bp～20bp，捕获序列片段大小为15bp～50bp，C碱基含量为10％～30％，Tm值在55℃～70℃之间。
再进一步的，所述的DNA保护液由5％～10％的对苯二酚、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、NaF、四氢呋喃糠醇和咪唑烷基脲的一种或多种组成。
其四，进一步的，所述的洗涤液由75％～80％的乙醇组成；所述的磁珠粒径大小为300nm～800nm的硅羟基磁珠；所述的纯化漂洗液由10mM～50mM的Tris-Hcl(pH8.0)的70％～80％的乙醇组成；所述的洗脱缓冲液由10mM的Tris-HCl(pH8.0)和2mM的EDTA(pH8.0)组成。
再进一步的，所述的磁珠粒径大小为500nm的硅羟基磁珠。
本发明的一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化纯化方法，包括以下步骤：
(1)试剂的准备与分装：在深孔板中1～9列依次加入4mL裂解液、1.8mL提取漂洗液、2mL洗涤液、2mL洗涤液、2mL洗涤液、1.8mL纯化漂洗液、40μL磁珠、40μL磁珠和100μL洗脱缓冲液；深孔板中第10列加入硫化试剂组分，具体加样顺序如下：
(2)加样：向1号孔位中添加血浆2ml，向9号孔位加入硫化试剂组分的转化液和DNA保护液，转化液和DNA保护液按照先加入转化液400μL后加入DNA保护液40μL的顺序进行加样；
(3)启动如下提取和硫化程序：
其中，步骤3.1)～3.5)为游离DNA的提取、纯化过程，步骤3.6)～3.12)为硫化过程，步骤3.13)～3.20)为硫化产物纯化过程；步骤3.13)结束后，向9号孔中依次加入1.5mL的结合液和50μL的DNA保护液；
(4)收集硫化纯化产物，将纯化后的硫化产物收集于DNA保存管中，-20℃±5℃保存备用。
进一步的，步骤3)中将结合液和DNA保护液置于核酸提取硫化仪器相应孔槽内，当仪器运行至步骤3.13)结束后，仪器自动向9号孔中依次加入1.5mL的结合液和50μL的DNA保护液。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：硫化试剂组分的的确定和浓度的优化
硫化试剂的主要组分为亚硫酸氢钠，将实验中优化的7M的亚硫酸氢钠分别结合四乙基氯化铵、亚硫酸氢铵、尿素中的一种或多种，具体成分组合如下：
硫化试剂组合1：7M亚硫酸氢钠溶液
硫化试剂组合2：7M亚硫酸氢钠与0.5M四乙基氯化铵混合液
硫化试剂组合3：7M亚硫酸氢钠与1M四乙基氯化铵混合液
硫化试剂组合4：7M亚硫酸氢钠与0.5M亚硫酸氢铵混合液
硫化试剂组合5：7M亚硫酸氢钠与1M亚硫酸氢铵混合液
硫化试剂组合6：7M亚硫酸氢钠与0.5M尿素混合液
硫化试剂组合7：7M亚硫酸氢钠与1M尿素混合液
下面的表1为不同硫化试剂组合对β-Actin基因检测结果的影响
| 组1 | 组2 | 组3 | 组4 | 组5 | 组6 | 组7 | |
| 甲基化模板 | 26.17 | 25.31 | 25.05 | 26.30 | 26.23 | 26.21 | 26.19 |
| 非甲基化模板 | No | No | No | No | No | No | No |
表1
结论：采用β-Actin基因甲基化引物探针进行检测，实验结果表明β-Actin基因甲基化引物探针在7种组合下均有阳性检出，采用组合3时，检测Ct值最小，即提取的核酸亚硫酸盐纯化浓度最高。
实施例二：DNA保护液试剂成分的筛选和优化
DNA保护液试剂中成分主要有两种，不同成分的性能可能存在差别，所以需要通过实验进行筛选和优化。DNA保护液的主要成分可以为6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸或者对苯二酚的其中一种，本实施例中分别测试了6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸和对苯二酚两种保护剂在不同浓度下对β-Actin基因检测结果的影响：
DNA保护液成分组1：10％对苯二酚溶液
DNA保护液成分组2：15％对苯二酚溶液
DNA保护液成分组3：20％对苯二酚溶液
DNA保护液成分组4：10％6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸溶液
DNA保护液成分组5：15％6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸溶液
DNA保护液成分组6：20％6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸溶液
下面的表2为不同DNA保护液试剂对β-Actin基因检测结果的影响
| 组1 | 组2 | 组3 | 组4 | 组5 | 组6 | |
| 甲基化模板 | 26.56 | 27.32 | 27.12 | 25.88 | 25.13 | 25.93 |
| 非甲基化模板 | No | No | No | No | No | No |
表2
结论：表明β-Actin基因甲基化引物探针在6种DNA保护液组合下均有阳性检出，采用组5时，检测Ct值最小，即提取的核酸亚硫酸盐纯化浓度最高，纯化的核酸得到有效保护。
实施例三：结合液试剂成分的筛选和优化
结合液试剂中成分主要由盐酸胍、异硫氰酸胍、乙醇、异丙醇、Tris-Hcl的一种或多种。本实施例中采用β-Actin基因甲基化引物探针分别测试了1M的盐酸胍作为结合液分别与其他试剂进行8种不同混合处理的检测结果。
结合液组合1：1M盐酸胍溶液
结合液组合2：1M盐酸胍与乙醇混合溶液
结合液组合3：1M盐酸胍与异丙醇混合溶液
结合液组合4：1M盐酸胍与10mM Tris-Hcl混合溶液
结合液组合5：1M异硫氰酸胍溶液
结合液组合6：1M异硫氰酸胍与乙醇混合溶液
结合液组合7：1M异硫氰酸胍与异丙醇混合溶液
结合液组合8：1M异硫氰酸胍与10mMTris-Hcl混合溶液
下面的表3为不同组合的结合液对β-Actin基因检测结果的影响
表3
结论：表明β-Actin基因甲基化引物探针在8种结合液组合下均有阳性检出，采用组合4时，检测Ct值最小，即提取的核酸亚硫酸盐纯化浓度最高。
实施例四：试剂盒的组装按照表格4所示顺序，分别在试剂槽的孔位1中添加裂解液，孔位2中添加提取漂洗液，孔位7和8中添加磁珠，孔位9中添加洗脱缓冲液。孔位4和5的洗涤液试剂瓶放置于仪器洗涤液吸口处，孔位6纯化漂洗液放置于仪器纯化漂洗液吸口处，孔位10中的硫化试剂需要现配现用，将转化液试剂管和DNA保护液试剂管置于转化液和DNA保护液吸口处，使用时按照固定比例吸取后置于孔位10中。
下面的表4为试剂盒中的试剂分装顺序
表4
提取试剂盒的比较。
结论：采用本发明专利提供的cfDNA提取试剂盒按照试剂盒操作对8份血浆进行核酸提取，采用QIAGEN Nucleic Acid Kit(50)游离核酸提取试剂盒按照试剂盒说明书操作进行cfDNA提取，将两种方法提取的cfDNA采用人β-actin基因引物探针(扩增目的片段长度120bp)进行检测，比较二者检测Ct值差异。
下面的表5为不同提取试剂盒提取的cfDNAβ-actin基因检测Ct值的影响
| 样本1 | 样本2 | 样本3 | 样本4 | 样本5 | 样本6 | 样本7 | 样本8 | |
| 本发明 | 32.18 | 28.98 | 26.50 | 30.50 | 29.48 | 28.00 | 28.85 | 27.68 |
| QIAGEN | 33.15 | 30.28 | 27.56 | 33.12 | 31.25 | 30.05 | 29.49 | 30.16 |
表5
比较二者对8份血浆的提取的cfDNA检测Ct值可知，本发明提供的试剂盒检测Ct值明显小于比对试剂盒，说明本发明试剂盒提取的cfDNA浓度较对照试剂盒明显提高。
实施例六：本试剂盒与ZYMO cfDNA亚硫酸盐转化试剂盒的比较
采用本发明专利提供的cfDNA提取硫化全套试剂盒按照试剂盒操作对8份血浆进行核酸提取，同时采用QIAGEN Nucleic Acid Kit(50)游离核酸提取试剂盒按照试剂盒说明书操作进行cfDNA提取，采用ZYMO的EZ DNA Methylation-Direct KitTM对提取的8份血浆cfDNA进行亚硫酸盐转化并纯化，将两种方法的亚硫酸盐纯化DNA采用甲基化的人β-actin基因引物探针(扩增目的片段长度120bp)进行检测，比较二者检测Ct值差异。
下面的表6为不同提取和硫化试剂盒对β-actin基因甲基化检测Ct值的影响
表6
比较二者甲基化检测Ct值可知：采用本发明提供的提取硫化试剂甲基化检测Ct值明显小于两种市售品牌试剂盒的甲基化检测Ct值，说明本发明试剂盒提取硫化效果好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，包括提取试剂组分、硫化试剂组分和纯化试剂组分；其特征在于：
所述的提取试剂组分包括裂解液、提取漂洗液；
所述的硫化试剂组分包括转化液、结合液和DNA保护液；
所述的纯化试剂组分由洗涤液、磁珠、纯化漂洗液和洗脱缓冲液组成；
所述的转化液由重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、四乙基氯化铵和尿素中的一种或多种组成；所述的结合液由胍盐、Tris-HCl和结合增强剂中的一种或多种组成；所述的DNA保护液由对苯二酚、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、NaF、四氢呋喃糠醇和咪唑烷基脲中的一种或多种组成；
其中，所述的结合增强剂为Carrier RNA或特异性的捕获序列中的一种或两种组成。
2.根据权利要求1所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：所述的裂解液由蛋白变性剂、核酸保护剂、螯合剂和pH缓冲剂组成。
3.根据权利要求2所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：所述的蛋白变性剂包括胍盐；所述的核酸保护剂由水溶性维生素、DTT、Carrier RNA和NaF中的一种或多种组成；所述的螯合剂由EDTA、EDTA-3K中的一种或多种组成；所述的pH缓冲剂由磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液和柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种组成。
4.根据权利要求3中所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：蛋白变性剂的胍盐为3M～4M的盐酸胍或者异硫氰酸胍；所述的核酸保护剂为5％～10％的水溶性维生素、5％DTT、0.01％～0.02％的NaF、1ug/mL的Carrier RNA中的一种或多种组成；所述的螯合剂包括5mM～50mM的EDTA、5mM～50mM的EDTA-K3中一种或多种；所述的pH缓冲剂为100mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液。
5.根据权利要求1中所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：所述的提取漂洗液由胍盐、Tris-HCl(pH8.0)和EDTA组成。
6.根据权利要求5中所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：所述的提取漂洗液由终浓度为1M～2M的盐酸胍和/或异硫氰酸胍、10mM～50mM的Tris-HCl(pH8.0)、2mM～20mM的EDTA(pH8.0)组成。
7.根据权利要求1中所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：所述的结合增强剂为浓度为1ug/mL Carrier RNA和100nmol/L的特异性捕获序列；所述特异性捕获序列位于目的基因片段的上游或者下游，且特异性捕获序列与目的基因片段的5’端间隔2bp～20bp，捕获序列片段大小为15bp～50bp，C碱基含量为10％～30％，Tm值在55℃～70℃之间。
8.根据权利要求1中所述的基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化试剂盒，其特征在于：所述的转化液由4M～7M的亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、四乙基氯化铵和尿素中的一种或多种组成；结合液的胍盐由终浓度为1M～2M的盐酸胍或异硫氰酸胍中一种或两种组成；结合液的Tris-HCl为10mM～50mM的Tris-HCl(pH8.0)；所述的DNA保护液由5％～10％的对苯二酚、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、NaF、四氢呋喃糠醇和咪唑烷基脲的一种或多种组成；所述的洗涤液由75％～80％的乙醇组成；所述的磁珠粒径大小为300nm～800nm的硅羟基磁珠；所述的纯化漂洗液由10mM～50mM的Tris-Hcl(pH8.0)的70％～80％的乙醇组成；所述的洗脱缓冲液由10mM的Tris-HCl(pH8.0)和2mM的EDTA(pH8.0)组成。
9.一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)试剂的准备与分装：在深孔板中1～9列依次加入4mL裂解液、1.8mL提取漂洗液、2mL洗涤液、2mL洗涤液、2mL洗涤液、1.8mL纯化漂洗液、40μL磁珠、40μL磁珠和100μL洗脱缓冲液；深孔板中第10列加入硫化试剂组分，具体加样顺序如下：
(2)加样：向1号孔位中添加血浆2ml，向9号孔位加入硫化试剂组分的转化液和DNA保护液，转化液和DNA保护液按照先加入转化液400μL后加入DNA保护液40μL的顺序进行加样；
(3)启动如下提取和硫化程序：
其中，步骤3.1)～3.5)为游离DNA的提取、纯化过程，步骤3.6)～3.12)为硫化过程，步骤3.13)～3.20)为硫化产物纯化过程；步骤3.13)结束后，向9号孔中依次加入1.5mL的结合液和50μL的DNA保护液；
(4)收集硫化纯化产物，将纯化后的硫化产物收集于DNA保存管中，-20℃±5℃保存备用。
10.根据权利要求9所述的一种基于提取硫化一体机的游离DNA提取硫化纯化方法，其特征在于，步骤3)中将结合液和DNA保护液置于核酸提取硫化仪器相应孔槽内，当仪器运行至步骤3.13)结束后，仪器自动向9号孔中依次加入1.5mL的结合液和50μL的DNA保护液。
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