CN112646041A - 包含抗体ch3域的异源二聚体及含其的抗体、融合蛋白 - Google Patents

包含抗体ch3域的异源二聚体及含其的抗体、融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种包含抗体CH3结构域的异源二聚体，其中一个CH3结构域CH3A的T366被替换为W，另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M、R或N，L368被替换为R，和Y407被替换为W、F或M。本发明还提供了一种包含该异源二聚体的抗体和融合蛋白。本发明的异源二聚体的纯度相比于目前已报道的突变体有较大的优势，且具有较佳的稳定性。纯度的提高使其在体内药效提高、毒性降低等，较佳的稳定性可以确保其在体内稳定的发挥作用。

Description

包含抗体CH3域的异源二聚体及含其的抗体、融合蛋白
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体涉及一种包含抗体CH3结构域的异源二聚体及含其的抗体、融合蛋白。
背景技术
双特异性抗体(Bi-Specific Antibody，BsAb)，又称双抗，可同时识别和结合两种不同的抗原或同一种抗原的两种表位，并激活或阻断两种不同的信号通路以发挥其作用。其理论上可以发挥两种单抗联合的协同作用，是当下行业最热门的新药研发投资方向之一。双特异性抗体在自然状态下并不存在，需要通过重组DNA或细胞融合技术人工制备实现，借助DNA重组和蛋白质工程技术手段构建的BsAb也成为抗体药物新的研究方向之一。早在1960年间就有人用来自两个不同的多克隆血清的Fab结合成双特异性F(ab')2。1975年杂交瘤技术的建立推动了双抗技术的发展，双抗除了可以通过化学缀合法合成外，还可以通过两个杂交瘤的融合形式杂合子的杂交瘤而生产双抗。而重组抗体技术的发展使得双抗技术飞速发展，几十种具有不同结构和功能的双抗被报道。双特异性抗体越来越受到重视，迄今三种双特异性抗体Catumaxomab(
Figure BDA0002719140670000011
抗EpCAM×抗CD3)、Blinatumomab(
Figure BDA0002719140670000012
抗CD19×抗CD3)和Emicizumab(
Figure BDA0002719140670000013
抗Factor IX×抗Factor X)已被FDA批准用于临床治疗，其他几十种双抗药物目前正在临床研发阶段。
人体内的天然抗体是单抗原特异性的，而双特异性抗体却能够识别两种抗原或同一种抗原的两种表位。与单抗相比，双抗有多种优势：①“AB”形式可以解决一些“A+B”形式无法解决的问题，比如T细胞(T cell)募集和杀伤。②双靶点双抗效果可能优于两个单靶点单抗的联合使用。比如HER2双位点的双抗，有药企在临床前发现HER2双位点双抗相对于单抗，可以使得HER2受体在细胞表面形成网状的连接，形成集聚，提高抑制肿瘤的效果，甚至可能对HER2中低表达的乳腺癌有效，目前正在临床验证中，1期临床已经显现了部分效果。③双靶点双抗副作用可能小于两个单靶点单抗的联合使用。比如CD47单抗容易结合红细胞和血小板，造成贫血，CD47-PDL1双抗或者CD47-CD19双抗会减小副作用，其潜在机理是另一端(PDL1或CD19结合区)会靶向肿瘤细胞，起到牵引作用，让CD47抗体部分更多在肿瘤细胞上起作用，从而减少副作用。不过，这类假设目前还有待验证，相关药物正在或准备临床中。另外，PDL1-CTLA4双抗可能也会有类似效果，其副作用可能小于PD1和CTLA4单抗的联合使用，CTLA4单独使用的副作用很大，PDL1-CTLA4双抗可能会更好的靶向肿瘤细胞，使得副作用减小，目前有实验正在做II期临床。④在优良设计和成熟平台基础上，“AB”双抗的研发和生产成本应该低于“A+B”两个单抗的研发和生产成本。
在双抗药物开发的过程中，也面临很多挑战，例如如何解决错配问题、如何改善下游工艺不稳定的问题、如何解决纯化问题、如何保证双抗的稳定性、如何平衡两个抗体的表达量等，具体包括：①双抗在体内的作用机制比单抗复杂；②分子量较大的双抗，对肿瘤组织的渗透性与单抗相比会相对较差；③通常双特异性抗体在CMC大规模生产阶段依赖于亲和层析，但大规模的亲和层析步骤烦琐，成本高且产率较低，因此也较难于获得临床前和临床研究生产足够质量和数量的材料。④双抗结构比较复杂，全长的双抗的传统生产方法是基于抗体重链和轻链质粒配对共转染和表达，会导致形成最高达10种不同的由重链和轻链的各种组合组成的混合物，其中只有一个具有正确的结构，同时生产的过程中多半会伴有较高的多聚体、错配、纯化得率低等问题，如果双抗纯度保证不了，会使其在体内药效下降、毒性升高等问题；⑤虽然已有几十种具有不同结构和功能的双抗被报道，但真正好用的结构大都由大公司的专利壁垒保护，旁人不能轻易触碰。
为了克服上述挑战，各种不同结构的双特异性抗体被开发出来，一般根据是否含有Fc区而被分为IgG-like双特异性抗体和non-IgG-like双特异性抗体(如BiTE、DART等)。相对而言，IgG-like双特异性抗体在产量、纯度、体内稳定性、Fc效应介导、免疫原性小等各方面均有优势，具体包括：①其Fc部分有助于抗体后期的protein A亲和纯化并提高其溶解性、稳定性，在CMC的大规模纯化和生产方面有优势；②具有Fc介导的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用(ADCP)；③相对分子量较大，且Fc部分与受体FcRn结合，增加了抗体血清半衰期。此类抗体结构主要包括Triomabs/Quadroma、DVD-Ig(dual variable domain Ig)、CrossMAb、Two-in-one IgG、scFv2-Fc。目前全球共批准了3款双特异性抗体药物，只有安进的Blincyto属于non-IgG-like双特异性抗体，其他两款皆属于IgG-like双特异性抗体。
但IgG-like的双抗生产过程中重轻链错配的问题至今仍无法彻底解决。目前来说，解决重链错配的问题的方法有旋钮入孔法(Knobs-into-holes，KIH)、静电转向突变(Electrostatic Steering Mutations)、人类IgG4 Fab臂交换(Fab Arm Exchange ofhuman IgG4 isotype)、SEEM法、不同亚型的重链配对法(
Figure BDA0002719140670000021
)、单臂抗体(One-ArmedAntibodies)等。旋钮入孔法(Knobs-into-holes，KIH)最早是在1996年被Ridgway报道的(John B.B.Ridgway.et al.'Knobs-into-holes'engineering of antibody CH3 domainsfor heavy chain heterodimerization.Protein Engineering.vol.9no.7pp.617-621.1996)，在这项研究中，“旋钮”端是通过定点突变A链CH3段T366位氨基酸成Y，并将B链CH3段的Y407突变成T，因此形成旋钮-孔的嵌入式结构。抗CD3/CD4-IgG(T366Y/Y407’T，第1代)杂合体在蛋白A纯化后最高能得到92％纯度的蛋白，而野生型的抗CD3/CD4-IgG杂合体最高只占回比率的57％。1997年，Atwell利用噬菌体展示技术筛选位于A和B链CH3界面上相互作用的残基，找到能稳定A:B杂合体的突变组合(Shane Atwell.et al.StableHeterodimers from Remodeling the Domain Interface of a Homodimer using aPhage Display Library.J.Mol.Biol(1997)270,26-35)。A链上CH3段通过突变T366成残基色氨酸W形成Knob端，而B链的残基366、368和407是通过噬菌体展示随机筛选得到的，它们围绕在A链的Knob结构附近。A链的Knob突变体与一段Flag标记融合，B链的Hole段融合表达在M13基因III后面，可以通过使用抗Flag抗体利用噬菌体筛选的方法筛选到展示稳定的A:B链杂合子。最后筛选得到的T366W/T366'S:L368'A:Y407'V组合(第2代)，该组合的Tm为69.4℃，比T366Y/Y407’T的异二聚体稳定性高4℃，比野生型二聚体低11.0℃。1998年，Merchant改良了第2代的KIH技术(A.Margaret Merchant.et al.An efficient route tohuman bispecific IgG.NATURE BIOTECHNOLOGY.Volume 16.July1998.)，他们在原来的基础上添加了一对二硫键来提高异源CH3配对的稳定性，这样无论是从稳定性还是表达量上来看都得到了很大的提高，S354C：T366W/Y349'C：T366'S：L368'A：Y407'V突变位点组合(第3代)后，最高能得到约95％的A:B链杂合子。此外，Kannan Gunasekaran等人(EnhancingAntibody Fc Heterodimer Formation through Electrostatic Steering Effects.THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.285,NO.25,pp.19637–19646,June 18,2010)还通过将A链上CH3段的K392突变成残基D，K409突变成残基D，而将B链的E356突变成残基K，D399突变成残基K，从而改变异源二聚体CH3接触面上的电荷使异源链间相互吸引，增加了其稳定性。目前来看，用IgG亚型做双抗比较成熟的方法就是KIH，被FDA批准的Emicizumab(
Figure BDA0002719140670000031
抗Factor IX×抗Factor X)就是用到KIH和共享轻链实现双靶向性的。IgG-like是国际上公认的最接近人天然抗体的结构，它在人体内免疫原反应最小，体内半衰期相对较长。目前第一代T366Y/Y407’T的KIH方法专利保护过期，效果较好的第2和3代的位点都在专利保护的范围之内，筛到更多效果更好的位点仍然有较大的市场需求。且之前大部分的位点都是用噬菌体技术筛选出来的，该方法有一定的局限性，比如：噬菌体展示出来的scFv未必能彻底还原抗体的实际结构，且展示蛋白的大小和数量也受到一定的限制，而抗体重链Fc段上可能还有很多好用的位点可能还未发现。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服本领域缺乏更多效果更好的异源二聚体的缺陷，而提供一种包含抗体CH3结构域的异源二聚体及含其的抗体、融合蛋白。本发明的异源二聚体的纯度相比于目前已报道的突变体有较大的优势，且具有较佳的稳定性(主要体现在不影响其与靶标亲和力的同时，对Fc受体的结合亲和力也无影响，从而对其Fc介导的效应功能例如ADCC、CDC和ADCP等无影响)。纯度的提高从而使其在体内药效提高、毒性降低等等，而较佳的稳定性可以确保其在体内稳定的发挥作用。
本发明人试图在亲本抗体Fc片段的恒定区中寻找特定位点，将该特定位点上的天然氨基酸替代为某些氨基酸，以便异源Fc片段之间形成较稳定的二聚体。通过大量实验，本发明人筛选出在A链、B链发生特定突变的包含抗体CH3结构域的异源二聚体，其纯度显著高于现有技术，且对其与Fc受体的结合亲和力无影响。
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种包含抗体CH3结构域的异源二聚体，其中，一个CH3结构域CH3A的T366被替换为W，另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M、R或N，L368被替换为R，和Y407被替换为W、F或M。
本发明中的氨基酸位置若无特殊说明，均根据EU系统编号(EU numberingsystem)。
较佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M或N。
较佳地，所述Y407被替换为W或M。
较佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M，L368被替换为R，和Y407被替换为W。
较佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M，L368被替换为R，和Y407被替换为F。
较佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为R，L368被替换为R，和Y407被替换为W。
较佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M，L368被替换为R，和Y407被替换为M。
较佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为N，L368被替换为R，和Y407被替换为W。
较佳地，所述抗体CH3结构域为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的免疫球蛋白的CH3结构域；更佳地，所述IgG为人IgG；进一步更佳地，所述人IgG为人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。
较佳地，所述CH3结构域CH3A和/或所述CH3结构域CH3B上还包括其他氨基酸的突变，所述突变为所述CH3结构域CH3A和/或所述CH3结构域CH3B的氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或添加，并保持或改善了所述异源二聚体的稳定性。在本发明中，所述突变优选为使得所述CH3结构域CH3A与所述CH3结构域CH3B之间形成二硫键的突变，例如所述CH3结构域CH3A的S354被替换为C且所述CH3结构域CH3B的Y349被替换为C，以形成二硫键。
较佳地，所述异源二聚体为异源二聚体Fc对。
为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供了一种抗体，其包括如本发明第一方面所述的包含抗体CH3结构域的异源二聚体。
较佳地，所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体；
更佳地，其中所述双特异性抗体为scFv-Fc、VHH-Fc、Fab-Fc-scFv(又称Fab-scFv-Fc或Fab-Fc:scFv-Fc)、Fc-crossmab、Fc-common light chain(常规轻链)或scFv-Fc-VHH的形式；所述scFv-Fc的结构优选为，具有不同抗原特异性的两种抗体片段scFv融合至异源二聚体Fc对的N-端或C-端；所述VHH-Fc的结构优选为，具有不同抗原特异性的两种抗体片段VHH融合至异源二聚体Fc对的N-端或C-端；所述Fab-Fc-scFv的结构优选为，具有不同抗原特异性的两种抗体片段Fab和scFv融合至异源二聚体Fc对的N-端或C-端；所述Fc-crossmab(crossmab为本领域技术人员常规理解的含义，由罗氏的科学家发明的crossmab技术，可以确保两条重链和两条轻链都能够按照预期结果正确配对联结)的结构优选为，具有不同抗原特异性的两种抗体片段Fab和具有crossmab结构的Fab融合至异源二聚体Fc对的N-端或C-端；所述Fc-common light chain(常规轻链)的结构优选为，具有不同抗原特异性的两种含相同轻链的Fab融合至异源二聚体Fc对的N-端或C-端；所述scFv-Fc-VHH的结构优选为，具有不同抗原特异性的两种抗体片段scFv和VHH融合至异源二聚体Fc对的N-端或C-端。
为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种融合蛋白，其通过将两种蛋白融合至如本发明第一方面所述的异源二聚体的N-端或C-端而制备。
为了解决上述技术问题，本发明第四方面提供了一种核酸，其编码如本发明第一方面所述的异源二聚体、如本发明第二方面所述的抗体和/或如本发明第三方面的融合蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明第五方面提供了一种重组载体，其包括如本发明第四方面所述的核酸。
较佳地，所述重组载体的骨架为质粒pCP-stuffer-hCg1。
为了解决上述技术问题，本发明第六方面提供了一种宿主细胞，其转染有如本发明第五方面所述的重组载体。
较佳地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或大肠杆菌细胞，所述哺乳动物细胞优选为CHO细胞或HEK293细胞，所述HEK293细胞例如为Freestyle 293-F细胞。
为了解决上述技术问题，本发明第七方面提供了一种药物组合物，其包含作为有效成分的如本发明第二方面所述的抗体或如本发明第三方面所述的融合蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种制备CH3结构域变体对的方法，所述CH3结构域变体对优选形成异源二聚体，所述方法包括：
(a)通过以下方案之一制备CH3结构域突变对：
一个CH3结构域CH3A的T366被替换为W，另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M、R或N，L368被替换为R，和Y407被替换为W、F或M；
(b)使步骤(a)中的所述CH3结构域突变对结合。
较佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M或N。
较佳地，所述Y407被替换为W或M。
更佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M，L368被替换为R，和Y407被替换为W。
更佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M，L368被替换为R，和Y407被替换为F。
更佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为R，L368被替换为R，和Y407被替换为W。
更佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M，L368被替换为R，和Y407被替换为M。
更佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为N，L368被替换为R，和Y407被替换为W。
较佳地，所述抗体CH3结构域为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的免疫球蛋白的CH3结构域；所述IgG优选为人IgG；所述人IgG优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种制备异源二聚体Fc对蛋白的方法，所述方法包括：
(d)制备包含核酸的重组Fc对蛋白表达载体，其中所述核酸表达蛋白，在所述蛋白中通过前述方法制备的CH3结构域变体对分别融合至抗体Fc野生型铰链-CH2结构域的C-端；
(e)通过将制备的所述表达载体共转化至细胞来表达所述重组Fc对蛋白；以及
(f)纯化和回收共表达的重组Fc对蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了如本发明第一方面所述的异源二聚体在制备异源二聚体Fc对、抗体和/或融合蛋白中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了如本发明第一方面所述的异源二聚体、如本发明第二方面所述的抗体和/或如本发明第三方面所述的融合蛋白在制备治疗疾病的药物中的用途。
为了更容易地理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本发明中另有明确定义，否则本发明中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.Chem,243，p3558(1968)中所述。
本发明所述的“异源二聚体”是指两个不同的单体亚基结合而成的肽链。例如，是指包括具有不同氨基酸序列的两种抗体域或包括含该抗体域的一部分或全部抗体的二聚体，特别地，包括具有不同抗体重链恒定区序列的CH3结构域对或包括含具有不同序列的CH3结构域对的一部分或全部抗体的二聚体。
本发明中，两个不同的单体亚基各自含有Fc片段或Fc变体片段，并通过Fc片段或Fc变体片段相互作用形成异源二聚体。
本发明中组成异源二聚体的“单体亚基”(即CH3结构域CH3A链、CH3结构域CH3B链)可以是融合蛋白或非融合蛋白。
本发明所述的“融合蛋白”是指，通过用基因重组方法、化学方法或其它适当方法将两个或多个基因的编码区连接，在同一调控序列控制下表达基因重组所得的蛋白质产物。本发明的融合蛋白中，两个或多个基因的编码区之间可由编码肽接头的序列于一个或数个位置融合。
术语“Fc”指的是免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。例如，免疫球蛋白Fc区可包括重链CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。Fc可以来源于不同的种属，优选人的免疫球蛋白。“Fc”优选包括至少一个免疫球蛋白绞链区，以及IgG的CH2和CH3区，例如包括IgG1的一个CH2结构域、一个CH3结构域和一个免疫球蛋白绞链区，铰链区起始氨基酸位置可以变动。术语“异源二聚体Fc”一般指的是包括分别具有不同氨基酸序列的CH3结构域CH3A和CH3结构域CH3B的重链恒定区(铰链-CH2-CH3)之间的二聚体。
本发明中，“Fab片段”由一条轻链的CL和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链可能与另一个重链分子形成二硫键。术语“Fv”意指向抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段，但缺少恒定区。VHH抗体是迄今为止发现的具有抗原结合功能的最小分子量抗体片段，仅由重链的可变区VHH(重链抗体的可变区片段，Variable domain of heavychain of heavy chain antibody)单结构域形成。
本发明中，所述的scFv(single chain antibody fragment，单链抗体)可为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子[参见，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)]。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的G4S氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(G4S)4或(G4S)3接头，但也可使用其变体。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双特异性抗体(diabodies)、和三抗体(triabodies)、共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
如本文使用的，术语“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素，但根据上下文的理解，也包括“由……组成”的情况。
本发明所述的“异源二聚体”优选为基因共表达的产物。如在原核细胞在大肠杆菌中共表达或在真核细胞，如在293细胞、CHO细胞中共表达。
本发明中所述的“共表达”(coexpression)指在一个细胞中多个基因一起表达，同时出现它们的产物。这些基因可以是同时存在分别或共同地受控表达。在本发明中，优选在一个真核细胞中共表达两种基因。共表达得到的基因表达产物有利于高效、简单地形成复合物，在本发明中，有利于形成异源二聚体蛋白。
本发明所述的术语“抗体”包括免疫球蛋白，其是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
“药物组合物”表示含有一种或多种本发明所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其它化学组分的混合物，以及其它组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
本发明的组合物以药学上有效的量施用。在本发明中，术语“药学上有效的量”指的是足以以适用于医疗的合理的效益/风险比治疗疾病的量。可通过包括患者疾病种类和疾病严重程度、药物活性、药物敏感性、给药时间、给药途径、排放比(discharge ratio)、治疗期和同时使用的药物的因素以及医药领域中众所周知的其它因素来确定有效剂量水平。本发明的组合物可作为单独治疗剂或与其它治疗剂组合施用。本发明的组合物可与相关领域中的治疗剂顺序或同时施用，或单次或多次施用。考虑到可由本领域那些技术人员容易地确定的所有上述因素施用不会引起副作用的最小量而获得最大效果的量是重要的。
具体而言，根据患者的年龄、性别和体重，本发明的化合物的有效量可以变化，且通常每kg体重施用0.01g至100mg，优选地，每天或每隔一天施用0.01g至100mg，或可分为每日1-3次。然而，由于根据给药途径、肥胖程度、性别、体重、年龄等该剂量可增加或减小，因此本发明并不限于该剂量。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的异源二聚体的纯度相比于目前已报道的突变体有较大的优势，且具有较佳的稳定性(主要体现在不影响其与靶标亲和力的同时，对Fc受体的结合亲和力也无影响，从而对其Fc介导的效应功能例如ADCC、CDC和ADCP等无影响)。纯度的提高从而使其在体内药效提高、毒性降低等等(在本发明某一较佳实施例中，突变体的纯度高达71.21％以上，显著优于现有技术的突变体纯度)，而较佳的稳定性可以确保其在体内稳定的发挥作用。在某一较佳实施例中，本发明的异源二聚体在没有额外加入二硫键的情况下其效果已经显著优于背景提及的在第2代的基础上添加了二硫键来提高异源CH3配对的稳定性的突变体的效果。
附图说明
图1为两个点突变的Overlap PCR方法示意图。
图2为三个点突变的Overlap PCR方法示意图。
图3为与人EGFRVIII ECD-his蛋白结合力的曲线和EC50值。
图4为与人CD64 ECD-his蛋白结合力的曲线和EC50值
图5为ForteBio Octet测定异源二聚体Fc突变体与人CD16a ECD-his的亲和力。
图6为ForteBio Octet测定异源二聚体Fc突变体与人CD16b ECD-his的亲和力。
图7为ForteBio Octet测定异源二聚体Fc突变体与人CD32a ECD-his的亲和力。
图8为ForteBio Octet测定异源二聚体Fc突变体与人CD32b ECD-his的亲和力。
图9为ForteBio Octet测定异源二聚体Fc突变体与人FcRn ECD-his在PH5.0条件下的亲和力。
图10为ForteBio Octet测定异源二聚体Fc突变体与人FcRn ECD-his在PH7.4条件下的亲和力。
图11为HPLC-SEC检测异源二聚体Fc突变体的纯度。
图12为不同组的Fc-Crossmab和Fab-Fc-scFv(Fab-Fc:scFv-Fc)双抗的纯度和产量比较。
图13为G6-PC3、G6-EX4、G6-EX5和G6-EX6组的HPLC-SEC纯度结果图。
图14为G7-PC3、G7-EX4、G7-EX5和G7-EX6组的HPLC-SEC纯度结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1所示。
表1
Figure BDA0002719140670000101
Figure BDA0002719140670000111
所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表2所示。
表2
Figure BDA0002719140670000112
Figure BDA0002719140670000121
实施例1表达载体的构建
现有技术中，一般是选择位于两个CH3结构域(EU编号为341至446的氨基酸位点)相互作用界面上的这些氨基酸位点进行一些改进，以更好地促进Fc结构域中异源二聚体的形成。本发明人通过大量实验的摸索，以野生型A链质粒载体pCP-EGFR scFv-hFc链(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中hFc来自hIgG1)和野生型B链质粒载体pCP-hFc链(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)作为模板，使用定点突变法或Overlap PCR法构建表3中所示的突变体的A或B链载体，引物列表和序列参见表4和5。其中，KIH-1、KIH-2、KIH-3、KIH-4分别为背景提及的第1代、第2代、第3代突变体和Kannan Gunasekaran等人制备的突变体。
表3G4组载体突变位点
Figure BDA0002719140670000122
Figure BDA0002719140670000131
表4不同载体和引物列表
Figure BDA0002719140670000132
Figure BDA0002719140670000141
Figure BDA0002719140670000151
表5引物序列表
Figure BDA0002719140670000152
Figure BDA0002719140670000161
Figure BDA0002719140670000171
Figure BDA0002719140670000181
1)点突变法
以上述野生型A链质粒载体或野生型B链质粒载体为模板，用Muta-directTM site-directed mutagenesis试剂盒(SBS Genetech,SDM-15)和突变引物(上下游引物分别命名为引物F或R，详见表4和5)进行PCR扩增，诱导目的基因进行定点突变。PCR反应完毕后，用Mutazyme酶将质粒模板降解，将PCR产物转化到商业化的感受态DH5α细胞。挑克隆做菌落PCR鉴定和测序(上海美吉生物技术有限公司)。将测序正确的克隆扩大培养至100或200ml，用
Figure BDA0002719140670000182
Xtra Maxi Plus protocol(MACHEREY-NAGEL，cat.740416.50)试剂盒提取质粒，Nanodrop测试质粒浓度，测序鉴定。
2)Overlap PCR法
第一轮PCR：
第一轮PCR包括以上述的野生型A链质粒载体或野生型B链质粒载体为模板，按照下述两个或三个点突变示意图(图1和图2)中的方法进行第1轮PCR反应，引物序列具体见表4和5。按照第1轮PCR反应体系扩增获得PCR产物D、E、F(两个突变位点)或D、E、F、G(三个突变位点)。所有引物使用前稀释至10μM待用，在50μl反应体系中加入2.5μl引物，说明所述引物在反应体系中的终浓度为500nM。
第1轮PCR反应体系见下表6。
表6
Figure BDA0002719140670000191
PCR产物通过1％琼脂糖电泳，从而回收目的DNA片段。
第2轮Overlap PCR见下表7(几种大片段之间摩尔比均为1:1)。
表7
Figure BDA0002719140670000192
通过1％琼脂糖电泳回收目的DNA片段。
上述两个点突变的Overlap PCR方法如下(示意图如图1所示)：
1)第1轮PCR反应体系引物对为：pEF1A和A-R1；A-F1和B-R1；B-F1和pSV40。
2)第2轮overlap PCR：将D、E和F的片段以摩尔比(1:1:1)混合在一起，并进行overlap PCR反应。
通过1％琼脂糖电泳回收目的DNA片段，风干DNA并溶于30μl ddH2O中。
上述三个点突变的Overlap PCR方法如下(示意图如图2所示)：
1)第1轮PCR反应体系引物对为：pEF1A和A-R1；A-F1和B-R1；B-F1和C-R1；C-F1和pSV40。
2)第2轮overlap PCR：将D、E、F和G的片段以摩尔比(1:1:1：1)混合在一起，并进行overlap PCR反应。通过1％琼脂糖电泳回收目的DNA片段，风干DNA并溶于30μl ddH2O中。
使用Kpn I和Not I进行双酶切：
Figure BDA0002719140670000193
Figure BDA0002719140670000201
所述的pCP-stuffer-hCg1质粒核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，混均后37℃孵育过夜，切胶回收6.5kb DNA大片段。
同源重组体系见下表8。
表8
Figure BDA0002719140670000202
转化步骤见下表9。
表9
Figure BDA0002719140670000203
实施例2异源二聚Fc突变抗体的表达和纯化
质粒转染：取5mL培养基(奥普迈，货号81075-001)和100μg质粒(上述A链质粒载体50μg，所述B链质粒载体50μg)混匀，取5mL培养基和PEI混匀(PEI用量是质粒质量的2倍)，静置5分钟后混匀，静置15-20分钟(培养基体积应该随体系增大而以对应比例增大)，缓缓加入100mL Freestyle 293-F细胞中，细胞密度控制在1-1.5×106/ml范围，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入37度摇床培养，130RPM，8％CO2；第二天加入终浓度为0.5％的蛋白胨；6-7天后，2500rpm离心30分钟收集上清，活细胞百分比必须在60％以上。
重力柱纯化：离心后的细胞悬液用0.22μm滤器过滤。将含Protein A填料的亲和层析柱用5倍柱体积0.5M NaOH冲洗，5倍柱体积的PBS进行平衡，将过滤好的细胞上清流过柱子，必要时收集上清。上柱完成后，使用5倍柱体积的PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M的pH 3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并用1/10体积的pH8.5的1M Tris-HCl中和。将抗体注入透析袋中，在1×PBS中透析4度透析过夜。第2天将抗体吸出，0.22μm滤器过滤，Nanodrop测定浓度，SEC(size exclusion chromatography)测定抗体纯度。
纯化后的QC结果显示(表10和图11)：此步骤制得的异源二聚体Fc突变体(KIH-20至KIH-24)与阳性对照位点抗体相比(KIH-1至KIH-4)在纯度上有较明显的优势，特别是KIH-20、KIH-22、KIH-23、KIH-24四组的A:B型异源二聚体的纯度达到89.14％、90.78％、92.47％、95.31％，而阳性对照组KIH-1至KIH-4的A:B型异源二聚体的纯度仅47.13％、51.96％、67.76％、58.58％。KIH1～4、KIH-20、KIH-23、KIH-24各组转染100ml HEK293细胞的抗体总产量差别不大，均在1～2mg之间。其中，KIH-4是通过改变异源二聚体CH3接触面上的电荷使异源链间相互吸引，而KIH1～3则是通过改变异源二聚体CH3接触面上侧链的大小而提高亲和力和稳定性。此外，可见本实施例中的异源二聚体在没有额外加入二硫键的情况下其效果已经显著优于现有技术中添加了二硫键来提高异源CH3配对的稳定性的突变体(例如阳性对照组KIH-1至KIH-4)的效果。
表10双抗生产数据表
Figure BDA0002719140670000211
效果实施例1 ELISA法鉴定异源二聚体Fc突变体与人EGFRVIII ECD-his抗原的亲和力
在96孔透明平底板里，每孔加入100μL的1μg/mL人EGFRVIII ECD-his抗原(SINOBIOLOGICAL，货号29662-H08B)包被，4℃过夜。第2天，加入200μL 1％BSA in PBST封闭，37℃孵育1hr，PBST洗板三次。将样品从10μg/ml开始以5倍梯度稀释成8个浓度，每孔100μL样品稀释液，37℃孵育1hr，PBST洗板三次。每孔加100μL(1:5000稀释)anti-human IgG FcHRP(goat)二抗，37℃孵育1hr，PBST洗板三次。每孔加100μL TMB显色液(A：B＝1:1)，反应5min后，加100μL 1M HCl终止反应。酶标仪(BMI-B22-01)上测450nm吸收波长。
Elisa结果(表11和图3)显示：上述实施例2制得的异源二聚体Fc突变体(KIH-20至KIH-24)与阳性对照位点抗体相比(KIH-1至KIH-4)与抗原的结合力变化不大，OD450曲线无明显差异，空白组和阴性对照组无抗原结合信号。表11中的数据为OD450值。
表11与人EGFRVIII ECD-his蛋白结合力的平均值
Figure BDA0002719140670000221
Figure BDA0002719140670000222
Figure BDA0002719140670000231
效果实施例2 ELISA法鉴定异源二聚体Fc突变体与人CD64 ECD-his的亲和力
在96孔透明平底板里，按照67、13、2.67、0.53、0.107、0.021、0.0043、0nM共计8个浓度梯度，100μL每孔，加入KIH-2、3、20、21、23、24和人IgG1野生型抗体包被4℃过夜。第2天，加入200μL PBST(1％BSA)封闭，37℃孵育1hr，PBST洗板三次。每孔加入100μL人CD64ECD-his抗原稀释液(1μg/mL)(SINO BIOLOGICAL，货号：10256-H08H)，37℃孵育1hr，PBST洗板三次。每孔加100μL(1:10000稀释)anti-his HRP兔二抗(ABCAM，#ab1187)，37℃孵育1hr，PBST洗板三次。每孔加100μL TMB显色液(A：B＝1:1)，反应5min后，加100μL 1M HCl终止反应。酶标仪(BMI-B22-01)上测450nm吸收波长。
其中，CD64为FcγR受体家族Ⅰ成员，CD64(FcγRI)在细胞上为70kDa穿膜糖蛋白，属Ig超家族成员，胞膜外区有3个C2结构，基因染色体定位于1q23～24。FcγRⅠ是高亲合力受体，Kd值为10-8～10-9M，主要与人的单体IgG1、IgG3以及小鼠IgG2a和IgG3结合。与人IgG4结合的亲合力明确降低，与IgG2则无结合能力。FcγRⅠ主要分布于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等，但表达水平各不相同。
Elisa结果(表12和图4)显示：上述实施例2制得的异源二聚体Fc突变体(KIH-20、21、23、24)与阳性对照位点抗体(KIH-2和3)相比与人CD64 ECD-his的结合力无明显差异。hIgG1对照组(SIGMA，货号I4506)与人CD64 ECD-his抗原的结合EC50为1.317nM。
本发明实施例2纯化的KIH突变体都是单臂ScFv-Fc：Fc的形式，而hIgG1是全长抗体，故两者的EC50值相近，但不完全相同，因为结构不同。从实验结果可以看出，本发明的KIH突变体对于其自身与人CD64 ECD-his的结合无明显影响，从而说明本发明突变后所得的KIH突变体与FcγRⅠ受体的结合无明显改变，从而对其FcγRⅠ介导的效应功能例如ADCC、CDC、ADCP等没有影响。表12中的数据为OD450值。
表12 ELISA检测出不同异源Fc突变体与人CD64 ECD-his蛋白结合力数值
Figure BDA0002719140670000241
效果实施例3 ForteBio Octet测定异源二聚体Fc突变体与人hCD16a ECD-his、hCD16b ECD-his、hCD32a ECD-his、hCD32b ECD-his的亲和力
生物膜层光学干涉技术原理：当两列或几列光波在空间相遇时，会进行叠加，这种现象称为光的干涉。ForteBio Octet仪器就是利用光的干涉现象，它内部有生物传感器，传感器底端由生物膜层覆盖，生物膜层可以结合并固定生物分子。当具有一定带宽的可见光垂直入射生物膜层时，光在生物膜层的两个界面反射后形成一定波长的干涉波，当固定分子与溶液中分子发生作用时，生物膜层加厚，干涉光谱曲线向波长增加方向移动，光波相位移动由工作站实时探测，对光波的相位移动进行分析便可定量得出传感器表面分子数量变化及相关浓度与动力学数据。
程序与方法：
1)分析参数
样品体积：200μL/孔，水合溶液体积200μL/孔；
流速：1000转/秒，生物传感器水合和样品板平衡10分钟。
2)绑定测量
Fortebio Octet的2个传感器尖端(H1S1K)用于对每种抗原进行实验；
传感器活性：200μl动力学缓冲液(pH7.4)，持续孵育10分钟。
3)在pH7.4时抗体与抗原结合：
a.平衡：200μl动力学缓冲液(pH7.4)，持续60s；
b.载荷：动力学缓冲液(pH7.4)中hCD16a ECD-his(Acro,#CDA-H5220)、hCD16bECD-his(R&D,#1597-FC)、hCD32a ECD-his(Acro,#CD1-H5223)、hCD32b ECD-his(Acro,#CDB-H5228)抗原浓度为20μg/ml孵育240s；
c.基线：200μl 1×动力学缓冲液(pH7.4)，持续240s；
d.结合：抗原(连续稀释溶液)在200ul 1×动力学缓冲液(pH7.4)中保持60s；
e.解离：200μl 1×动力学缓冲液(pH7.4)，持续60S；
f再生：PBS中的200μl 10mM甘氨酸和200μl PBS中30秒。
其中，CD32(FcγRⅡ)为40kDa跨膜糖蛋白，属于Ig超家族成员，胞膜外区有2个C2结构，基因染色体定位于1q23～24。FcγRⅡ结合人IgG1、IgG3、IgG4，亲合力较低。FcγRⅡ表达于除红细胞外的其它血细胞。根据DNA序列和功能不同，FcγRⅡ可分为FcγRⅡa(CD32a)、FcγRⅡb(CD32b)等。CD16(FcγRⅢ)为50～70kDa跨膜糖蛋白，属Ig超家族成员，有2个C2结构，基因染色体位于1q23～24。FcγRⅢ结合人IgG1、IgG3，亲和力较低。FcγRⅢ有FcγRⅢa(CD16a)和FcγRⅢb(CD16b)两种亚型，FcγRⅢa主要分布于巨噬细胞、NK细胞和嗜酸性粒细胞，FcγRⅢb主要分布于中性粒细胞表面。
Octet结果显示：上述实施例2制得的不同浓度的异源二聚体Fc突变体(KIH-20、23、24)与阳性对照位点抗体(KIH-2)相比，与hCD16a ECD-his(图5)、hCD16b ECD-his(图6)、hCD32a ECD-his(图7)、hCD32b ECD-his(图8)的亲和力KD值的差异在3倍以内。不同浓度的hIgG1和KIH-0阴性对照组与hCD16a ECD-his、hCD16b ECD-his、hCD32a ECD-his、hCD32b ECD-his的亲和力KD值为10-7～10-8nM之间(图5-8)。
本发明实施例2纯化的KIH突变体都是单臂ScFv-Fc：Fc的形式，而hIgG1是全长抗体，故两者的EC50值相近，但不完全相同，因为结构不同。从实验结果可以看出，本发明的KIH突变体对于其自身与人CD16a、CD16b、CD32a和CD32b ECD-his的结合无明显影响，从而说明本发明突变后所得的KIH突变体与FcγRⅡa(CD32a)、FcγRⅡb(CD32b)、FcγRⅢA(CD16a)和FcγRⅢB(CD16b)受体的结合无明显改变，从而对其介导的效应功能例如ADCC、CDC、ADCP等没有影响。
效果实施例4 Octet法鉴定异源二聚体Fc突变体与人hFcRn ECD-his在pH5.0和pH7.4下的亲和力
1)在pH7.4下，程序与方法与效果实施例2相同，仅抗原换为FcRn ECD-his(Acro,#FCN-H52W7)。
2)在pH5.0下的条件如下所述：
a.平衡：200μl动力学缓冲液(pH7.4)，持续60s；
b.载荷：动力学缓冲液(pH7.4)中抗原浓度为20ug/ml(hFcRn ECD-his)孵育240s；
c.基线：200μl 1×动力学缓冲液(pH5.0)，持续240s；
d.结合：抗原(连续稀释溶液)在200ul 1×动力学缓冲液(pH5.0)中保持60s；
e.解离：200μl 1×动力学缓冲液(pH5.0)，持续60s；
f.再生：PBS中的200μl 10mM甘氨酸和200μl PBS中30秒。
由于抗体与FcRn的结合是pH敏感型的，抗体通过胞饮作用进入细胞，在酸性pH<6.5内涵体中，抗体与FcRn结合，FcRn介导抗体循环到细胞外，而在胞外中性pH7.4条件下，抗体与FcRn解离，抗体被释放，这样抗体的半衰期能保持在21天左右。
Octet结果显示：上述实施例2制得的不同浓度的异源二聚体Fc突变体(KIH-20、23、24)与阳性对照位点抗体(KIH-2)相比，在pH5.0条件下，与hFcRn ECD-his的亲和力KD值的差异不大(图9)。hIgG1和KIH-0对照组与hFcRn ECD-his的亲和力KD值为10-7～10-8nM之间。
上述实施例2制得的异源二聚体Fc突变体(KIH-20、23、24)与阳性对照位点抗体(KIH-2)相比，在pH7.4条件下，与hFcRn ECD-his均未显示出明显的亲和力曲线(图10)。hIgG1和KIH-0阴性对照组与hFcRn也未显示出明显的亲和力曲线。
综合上述实施例的实验结果可以看出，本发明的异源二聚体Fc突变体KIH-20至KIH-24的纯度相比于目前已报道的位点都有较大的优势，且其与人EGFRVIII ECD-his蛋白、人CD64 ECD-his蛋白、人CD16a ECD-his蛋白、人CD16b ECD-his蛋白、人CD32a ECD-his蛋白、人CD32b ECD-his蛋白、人hFcRn ECD-his蛋白(pH5.0条件下)的结合力与现有技术的异源二聚体Fc突变体与这些蛋白的结合力无异，可见本发明的KIH-20至KIH-24在纯度提高的情况下，对其本身介导的ADCC、CDC、ADCP等无显著影响，可以确保其在体内稳定的发挥作用。
效果实施例5
Fc-Crossmab是Genetech公司报道的最经典的双抗形式，它具有如正常单抗的结构，却是可以特异性的针对两个不同的Epitope，将实施例1中提到的突变位点构建到Fc-Crossmab双抗形式中，方法与实施例1提到的方法类似。其中G6-PC3为已有报道的阳性组，G6-EX4、G6-EX5、G6-EX6为实验组，详细的位点突变情况见表13。为了得到这些双抗，每组需要同时转染4种不同的质粒(表14)，质粒的序列具体如SEQ ID NO:42至SEQ ID NO:55所示。这些双抗纯化后，用HPLC-SEC方法检测抗体纯度，四组均为单一高纯度的峰形(图13)，将实验组和阳性组比对(图12中的A)，在纯度性质方面差别不大，均靠近100％。这些双抗每100ml的293F细胞产量均在1mg以上(图12中的C)。
可见，筛选得到的新的突变位点应用于Fc-Crossmab经典的双抗上，得到的生产纯度与G6-PC3阳性组相当。
表13 Fc-Crossmab双抗的突变位点信息
Figure BDA0002719140670000271
表14 Fc-Crossmab双抗的转染质粒名称和突变位点信息
Figure BDA0002719140670000281
效果实施例6
Fab-Fc-scFv也是一款较经典的双抗形式，Fc由A和B链组成,A链的N端是Fab，B链的N端是scFv。这种结构的双抗也可以特异性的针对两个不同的Epitope，将实施例1中提到的突变位点构建到Fab-Fc-scFv双抗形式中，方法与实施例1提到的方法类似。其中G7-PC3为已有报道的突变位点阳性组，G7-EX4、G7-EX5、G7-EX6为实验组，详细的位点突变情况见表15。为了得到这些双抗，每组需要同时转染3种不同的质粒(表16)，质粒的序列如SEQ IDNO:46至SEQ ID NO:57所示。这些双抗纯化后，用HPLC-SEC方法检测抗体纯度，四组均为单一高纯度的峰形(图14)，将实验组和阳性组比对(图12中B)，在纯度性质方面差别不大，均在90％以上。这些双抗每100ml的293F细胞产量均在1mg以上(图12中的D)。
可见，筛选得到新的突变位点应用于Fab-Fc-scFv经典的双抗上，得到的生产纯度与G6-PC3阳性组相当。
表15 Fab-Fc-scFv双抗的突变位点信息
Figure BDA0002719140670000282
Figure BDA0002719140670000291
表16 Fab-Fc-scFv双抗的转染质粒名称和突变位点信息
Figure BDA0002719140670000292
SEQUENCE LISTING
<110> 上海睿智化学研究有限公司
<120> 包含抗体CH3域的异源二聚体及含其的抗体、融合蛋白
<130> P20015050C
<150> 2019109684822
<151> 2019-10-12
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7961
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A链质粒载体pCP-EGFR scFv-hFc链
<400> 1
agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga 60
gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa 120
ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta 180
tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca 240
ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt 300
gccttgaatt acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg 360
aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt 420
tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 480
tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct 540
ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt 600
ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg 660
gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc 720
tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 780
gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc 840
aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag 900
ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag 960
gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt 1020
ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca 1080
cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa 1140
gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gaagatctct 1200
agaagctggg taccgcccgg gcgccaccat ggagtttggg ctgagctggc tttttcttgt 1260
cgcgattctt aagggtgtcc agtgccaggt gcagctggtg cagtcaggag cagaagtgaa 1320
gaagcccgga gccagcgtga aagtgtcttg caaggccagc ggctacacct tcatcagctt 1380
caccatgcat tgggtcaagc agaggccagg acagggactc gagtggattg gctacatcaa 1440
ccccaacagc ggctacacca agtacaacca gaagttcaag gacaaggcca ccctgaccag 1500
agacaccagc accagcaccg tgtacatgga gctgagcagc ctgaggagcg aggatacagc 1560
cgtgtactat tgcaccaggg gcggaggcag aggattcgct tattggggcc agggaacact 1620
ggtgacagtg tccagcggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc 1680
ggacatcctg atgacccaga gccctagcag cctgagcgcc agcgtgggag atagagtgac 1740
catcacttgc cacgccagcc aggacatcaa cagcaacatc ggttggctgc agcagaagcc 1800
cggcaagagc ttcaaggccc tgatctacca cggcacaaat ctggaggacg gagtgcctag 1860
cagattcagc ggcagcggaa gcggaacaga ttacaccctg accatcagca gcctgcagcc 1920
agaggacttc gccacctact actgcgtgca gtacgcccag ttccccttca ccttcggaca 1980
gggaaccaag ctggagatca aggacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga 2040
actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat 2100
ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt 2160
caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga 2220
ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg 2280
gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga 2340
gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc 2400
atcccgcgag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta 2460
tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac 2520
cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga 2580
caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca 2640
caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatagggcc gctcgaggcc 2700
ggcaaggccg gatccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag 2760
aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 2820
cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 2880
tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtatggc 2940
tgattatgat ccggctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg 3000
cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt 3060
caggcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgaggtcgac tctagaggat 3120
cgatgccccg ccccggacga actaaacctg actacgacat ctctgcccct tcttcgcggg 3180
gcagtgcatg taatcccttc agttggttgg tacaacttgc caactgggcc ctgttccaca 3240
tgtgacacgg ggggggacca aacacaaagg ggttctctga ctgtagttga catccttata 3300
aatggatgtg cacatttgcc aacactgagt ggctttcatc ctggagcaga ctttgcagtc 3360
tgtggactgc aacacaacat tgcctttatg tgtaactctt ggctgaagct cttacaccaa 3420
tgctggggga catgtacctc ccaggggccc aggaagacta cgggaggcta caccaacgtc 3480
aatcagaggg gcctgtgtag ctaccgataa gcggaccctc aagagggcat tagcaatagt 3540
gtttataagg cccccttgtt aaccctaaac gggtagcata tgcttcccgg gtagtagtat 3600
atactatcca gactaaccct aattcaatag catatgttac ccaacgggaa gcatatgcta 3660
tcgaattagg gttagtaaaa gggtcctaag gaacagcgat atctcccacc ccatgagctg 3720
tcacggtttt atttacatgg ggtcaggatt ccacgagggt agtgaaccat tttagtcaca 3780
agggcagtgg ctgaagatca aggagcgggc agtgaactct cctgaatctt cgcctgcttc 3840
ttcattctcc ttcgtttagc taatagaata actgctgagt tgtgaacagt aaggtgtatg 3900
tgaggtgctc gaaaacaagg tttcaggtga cgcccccaga ataaaatttg gacggggggt 3960
tcagtggtgg cattgtgcta tgacaccaat ataaccctca caaacccctt gggcaataaa 4020
tactagtgta ggaatgaaac attctgaata tctttaacaa tagaaatcca tggggtgggg 4080
acaagccgta aagactggat gtccatctca cacgaattta tggctatggg caacacataa 4140
tcctagtgca atatgatact ggggttatta agatgtgtcc caggcaggga ccaagacagg 4200
tgaaccatgt tgttacactc tatttgtaac aaggggaaag agagtggacg ccgacagcag 4260
cggactccac tggttgtctc taacaccccc gaaaattaaa cggggctcca cgccaatggg 4320
gcccataaac aaagacaagt ggccactctt ttttttgaaa ttgtggagtg ggggcacgcg 4380
tcagccccca cacgccgccc tgcggttttg gactgtaaaa taagggtgta ataacttggc 4440
tgattgtaac cccgctaacc actgcggtca aaccacttgc ccacaaaacc actaatggca 4500
ccccggggaa tacctgcata agtaggtggg cgggccaaga taggggcgcg attgctgcga 4560
tctggaggac aaattacaca cacttgcgcc tgagcgccaa gcacagggtt gttggtcctc 4620
atattcacga ggtcgctgag agcacggtgg gctaatgttg ccatgggtag catatactac 4680
ccaaatatct ggatagcata tgctatccta atctatatct gggtagcata ggctatccta 4740
atctatatct gggtagcata tgctatccta atctatatct gggtagtata tgctatccta 4800
atttatatct gggtagcata ggctatccta atctatatct gggtagcata tgctatccta 4860
atctatatct gggtagtata tgctatccta atctgtatcc gggtagcata tgctatccta 4920
atagagatta gggtagtata tgctatccta atttatatct gggtagcata tactacccaa 4980
atatctggat agcatatgct atcctaatct atatctgggt agcatatgct atcctaatct 5040
atatctgggt agcataggct atcctaatct atatctgggt agcatatgct atcctaatct 5100
atatctgggt agtatatgct atcctaattt atatctgggt agcataggct atcctaatct 5160
atatctgggt agcatatgct atcctaatct atatctgggt agtatatgct atcctaatct 5220
gtatccgggt agcatatgct atcctcatgc atatacagtc agcatatgat acccagtagt 5280
agagtgggag tgctatcctt tgcatatgcc gccacctccc aagggggcgt gaattttcgc 5340
tgcttgtcct tttcctgctg cttatcgatg ataagctgtc aaacatgaga attcttgaag 5400
acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc 5460
ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 5520
ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 5580
atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 5640
tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 5700
tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 5760
ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 5820
atgtggcgcg gtattatccc gtgttgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 5880
ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 5940
catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 6000
cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 6060
ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 6120
cgagcgtgac accacgatgc ctgcagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 6180
cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 6240
tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 6300
agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 6360
ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 6420
gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 6480
atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 6540
cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 6600
agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 6660
ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 6720
accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct 6780
tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 6840
cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 6900
gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 6960
gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 7020
gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 7080
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 7140
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 7200
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 7260
ctggcctttt gctcacatga agctgtccct gatggtcgtc atctacctgc ctggacagca 7320
tggcctgcaa cgcgggcatc ccgatgccgc cggaagcgag aagaatcata atggggaagg 7380
ccatccagcc tcgcgtcgcg aacgccagca agacgtagcc cagcgcgtcg gccccgagat 7440
gcgccgcgtg cggctgctgg agatggcgga cgcgatggat atgttctgcc aagggttggt 7500
ttgcgcattc acagttctcc gcaagaattg attggctcca attcttggag tggtgaatcc 7560
gttagcgagg tgccgccctg cttcatcccc gtggcccgtt gctcgcgttt gctggcggtg 7620
tcactggccc cgtgggttag ggacggggtc ccccatgggg aatggtttat ggttcgtggg 7680
ggttattatt ttgggcgttg cgtggggtca ggtccacgac tggactgagc agacagaccc 7740
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T366S/L368A-R1
<400> 17
tgacggcgca gctcaggctg acctggttct tg 32
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y407V-F1
<400> 18
ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc gtg 33
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y407V-R1
<400> 19
cacggtgagc ttgctcacga ggaagaagga gcc 33
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E356K-F1
<400> 20
cccgcaagga gatgaccaag aacc 24
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E356K-R1
<400> 21
gttcttggtc atctccttgc gggatggggg cag 33
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D399K-F1
<400> 22
gtgctgaagt ccgacggctc cttc 24
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D399K-R1
<400> 23
gaaggagccg tcggacttca gcacgggagg cg 32
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y349C-F1
<400> 24
cgagaaccac aggtgtgcac cctgccccca tcc 33
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y349C-R1
<400> 25
ggatgggggc agggtgcaca cctgtggttc tcg 33
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D356R-F1-5bp
<400> 26
cccgcaggga gatgaccaag aac 23
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D356R-R1-5bp
<400> 27
catctccctg cgggatgggg gcagg 25
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T366M/L368R-F1
<400> 28
gaaccaggtc agcctgatgt gccgcgtcaa aggcttctat c 41
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T366M/L368R-R1
<400> 29
gatagaagcc tttgacgcgg cacatcaggc tgacctggtt c 41
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T366R/L368R-F1
<400> 30
gaaccaggtc agcctgcggt gccgcgtcaa aggcttctat c 41
<210> 31
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T366R/L368R-R1
<400> 31
gatagaagcc tttgacgcgg caccgcaggc tgacctggtt c 41
<210> 32
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T366N/L368R-F1
<400> 32
gaaccaggtc agcctgaact gccgcgtcaa aggcttctat c 41
<210> 33
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T366N/L368R-R1
<400> 33
gatagaagcc tttgacgcgg cagttcaggc tgacctggtt c 41
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y407W-F1
<400> 34
ggctccttct tcctctggag caagctcacc gtg 33
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y407W-R1
<400> 35
cacggtgagc ttgctccaga ggaagaagga gcc 33
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y407F-F1
<400> 36
ggctccttct tcctcttcag caagctcacc gtg 33
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y407F-R1
<400> 37
cacggtgagc ttgctgaaga ggaagaagga gcc 33
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y407M-F1
<400> 38
ggctccttct tcctcatgag caagctcacc gtg 33
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y407M-R1
<400> 39
cacggtgagc ttgctcatga ggaagaagga gcc 33
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEF1α
<400> 40
gccctttttg agtttgga 18
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSV40
<400> 41
cactgcattc tagttgtg 18
<210> 42
<211> 1368
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G6-3A质粒DNA
<400> 42
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttaat acctattgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaggg ggctggagtg ggtggccaac ataaaacaag atggaggtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctatgt attactgtgc gagagatggc 300
cgcagctggt accctgatgc ttttgatatc tggggccaag ggacagtggt caccgtctct 360
tcagcttcgg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 420
tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 480
cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 540
gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac 600
gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca 660
aagagcttca acaggggaga gtgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 720
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 780
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 840
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 900
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 960
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1020
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1080
ccatgccgcg aggagatgac caagaaccag gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc 1140
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1200
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1260
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1320
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatag 1368
<210> 43
<211> 455
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G6-3A质粒氨基酸
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Arg Ser Trp Tyr Pro Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser
115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
130 135 140
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
145 150 155 160
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
165 170 175
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
180 185 190
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
195 200 205
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
210 215 220
Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 44
<211> 636
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G6-4A质粒DNA
<400> 44
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt acctggttgg cctggtatca gcagaaactg 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgag gtgtctattt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tatcatagtt tttcttcttt cggcggaggg 300
accagggtgg agatcaaatc gtcggcttcg accaagggcc catcggtctt ccccctggca 360
ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 420
ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 480
ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 540
tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc 600
aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgttga 636
<210> 45
<211> 206
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G6-4A质粒氨基酸
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Val Ser Ile Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Ser Ser
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Leu Val Gly Phe Asp Gln
100 105 110
Gly Pro Ile Gly Leu Pro Pro Gly Thr Leu Leu Gln Glu His Leu Trp
115 120 125
Gly His Ser Gly Pro Gly Leu Pro Gly Gln Gly Leu Leu Pro Arg Thr
130 135 140
Gly Asp Gly Val Val Glu Leu Arg Arg Pro Asp Gln Arg Arg Ala His
145 150 155 160
Leu Pro Gly Cys Pro Thr Val Leu Arg Thr Leu Leu Pro Gln Gln Arg
165 170 175
Gly Asp Arg Ala Leu Gln Gln Leu Gly His Pro Asp Leu His Leu Gln
180 185 190
Arg Glu Ser Gln Ala Gln Gln His Gln Gly Gly Gln Glu Ser
195 200 205
<210> 46
<211> 1344
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G6-3B质粒DNA
<400> 46
caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60
tcttgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactaca tccattgggt ccggcaggct 120
ccaggacagg gactcgagtg gatgggttgg atctacccag gcagcggcaa caccaagtac 180
aacgagaagt tcaagggccg cgtgaccatg accagagaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgag aagcgaggac acagccgtgt actattgcgc caggagaggc 300
gattggtact tcgacgtctg gggccaggga acaaccgtga ccgtgtctag cgcttcgacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgcgagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgagctg cgccgtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa atga 1344
<210> 47
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G6-3B质粒氨基酸
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 48
<211> 663
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCP-mab004VL.g0-hCk质粒DNA
<400> 48
gacatcgtga tgacccagag cccagacagc ctggcagtgt ctctgggaga gagagccaca 60
atcaactgca agtccagcca gagcctgctg ttcagcggaa accagaagag cagcctggcc 120
tggtatcagc agaagccagg acagcctccc aagctgctga tctattgggc cagcaccagg 180
gagagcggag tgccagatag attcagcggc agcggaagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atctcttctc tgcaggccga agacgtggcc gtgtactatt gccagcagta ctacagctac 300
cctctgacct tcggccaggg aacaaagctg gagatcaagc gtacggtggc tgcaccatct 360
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480
caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540
ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660
tga 663
<210> 49
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCP-mab004VL.g0-hCk质粒氨基酸
<400> 49
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 50
<211> 1344
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G6-1B-Y349C质粒DNA
<400> 50
caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60
tcttgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctactaca tccattgggt ccggcaggct 120
ccaggacagg gactcgagtg gatgggttgg atctacccag gcagcggcaa caccaagtac 180
aacgagaagt tcaagggccg cgtgaccatg accagagaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgag aagcgaggac acagccgtgt actattgcgc caggagaggc 300
gattggtact tcgacgtctg gggccaggga acaaccgtga ccgtgtctag cgcttcgacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
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cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Ser Pro Gly Lys

Claims (10)

1.一种包含抗体CH3结构域的异源二聚体，其中，一个CH3结构域CH3A的T366被替换为W，其特征在于，另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M、R或N，L368被替换为R，和Y407被替换为W、F或M，所述氨基酸位置根据EU系统编号；
较佳地，所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M或N，和/或，所述Y407被替换为W或M。
2.如权利要求1所述的异源二聚体，其特征在于，
所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M，L368被替换为R，和Y407被替换为W；
所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M，L368被替换为R，和Y407被替换为F；
所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为R，L368被替换为R，和Y407被替换为W；
所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为M，L368被替换为R，和Y407被替换为M；或
所述另一个CH3结构域CH3B的T366被替换为N，L368被替换为R，和Y407被替换为W。
3.如权利要求1或2所述的异源二聚体，其特征在于，所述抗体CH3结构域为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的免疫球蛋白的CH3结构域；所述IgG优选为人IgG；所述人IgG优选为人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4；
和/或，所述CH3结构域CH3A和/或所述CH3结构域CH3B上还包括其他氨基酸的突变，所述突变优选为使得所述CH3结构域CH3A与所述CH3结构域CH3B之间形成二硫键的突变，例如所述CH3结构域CH3A的S354被替换为C且所述CH3结构域CH3B的Y349被替换为C，以形成二硫键。
4.如权利要求1～3任一项所述的异源二聚体，其特征在于，所述异源二聚体为异源二聚体Fc对。
5.一种抗体，其包括如权利要求1～4任一项所述的包含抗体CH3结构域的异源二聚体；
较佳地，所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体；
更佳地，其中所述双特异性抗体为scFv-Fc、VHH-Fc、Fab-Fc-scFv、Fc-crossmab、Fc-common light chain或scFv-Fc-VHH的形式。
6.一种融合蛋白，其通过将两种蛋白融合至如权利要求1～4任一项所述的异源二聚体的N-端或C-端而制备。
7.一种核酸，其编码如权利要求1～4任一项所述的异源二聚体、如权利要求5所述的抗体和/或如权利要求6所述的融合蛋白。
8.一种重组载体，其包括如权利要求7所述的核酸；
较佳地，所述重组载体的骨架为质粒pCP-stuffer-hCg1。
9.一种宿主细胞，其转染有如权利要求8所述的重组载体；
较佳地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或大肠杆菌细胞，所述哺乳动物细胞优选为CHO细胞或HEK293细胞，所述HEK293细胞例如为Freestyle 293-F细胞。
10.一种药物组合物，其包含作为有效成分的如权利要求5所述的抗体或如权利要求6所述的融合蛋白。
CN202011082356.6A 2019-10-12 2020-10-12 包含抗体ch3域的异源二聚体及含其的抗体、融合蛋白 Active CN112646041B (zh)

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