CN112608379A - 一种驴皮胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及阿胶生产技术领域，具体为一种驴皮胶原蛋白的制备方法，具体步骤如下：驴皮预处理、酶解膜循环分离、脱色及脱腥处理和冷冻干燥。本发明通过特定组合的工艺步骤及参数条件进行驴皮预处理、酶解膜循环分离、脱色及脱腥处理和冷冻干燥，得到分子量为2‑5KD胶原蛋白粉末，该胶原蛋白粉末具有下述特点：制备驴皮胶原蛋白的三股螺旋结构并没有被破坏，仍然保留其原有的生物活性；主要成分为2‑5KD胶原蛋白粉末；驴皮胶原蛋白来源于脊椎动物的胶原与人肌体、皮肤具有良好的同源性和相容性，其分子量和结构相似；涂于皮肤后可快速溶入表皮，可用于制备外科植入物和组织工程医疗产品，开发医药、医学试剂、及保健品等。
Description
技术领域
本发明涉及阿胶生产技术领域，具体为一种驴皮胶原蛋白的制备方法。
背景技术
近年来，养驴慢慢受到畜牧业人士的关注，因为，不仅驴肉本身具有较高的经济使用价值，驴皮还具有很高的药用价值，具有天然的补血、止血作用，是制作阿胶的主要原料。
驴皮生皮料是极其复杂的物质，基本上是由蛋白质和非蛋白质两大组分组成，其中，蛋白质占鲜皮的30％-35％。新剥下来的生皮pH值为6.8-7.8，在存放过程中随皮料的逐渐变质，pH值亦随之变化。组成生皮的蛋白质种类很多，皮料蛋白质分为纤维蛋白(结构蛋白)、非纤维蛋白(非结构蛋白)和酶等。纤维蛋白由胶原、角朊、弹性硬朊组成。胶原约占生皮总量(除皮下层)的29％，约占全部蛋白质总量的88％。
目前，驴皮的应用主要是作为熬制阿胶的重要原料。根据中国药典2005年版一部的记载，阿胶的制法如下：将驴皮浸泡去毛，切块洗净，分次水煎，小组过，合并滤液，浓缩至稠膏状，冷凝，切块，晾干，即得。
上述简单的熬制方法，没有针对驴皮中所含胶原成分的特性进行选择性提取和精制，使阿胶中除含胶原外，还含有部分水解产生的赖氨酸、精氨酸、组氨酸等多种氨基酸，以及钙、硫等成分；并且阿胶的水溶性差，只能烊化服用，也不能作为化妆品等使用，其使用受到较大限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种驴皮胶原蛋白的制备方法，以解决上述背景技术中提出现如今滇重楼的资源已经严重不足的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种驴皮胶原蛋白的制备方法，具体步骤如下：
S1：驴皮预处理；
S2：酶解膜循环分离；
S3：脱色及脱腥处理；
S4：冷冻干燥；
作为优选，驴皮预处理的具体步骤如下：
S11：取新鲜驴皮洗净，尽量去掉脂肪层，将其浸泡至10倍体积含有中性蛋白酶、α淀粉酶与纤维素酶混合水溶液，温度加热至35-37℃，PH6.8-7.3，浸泡30-35min脱毛；
S12：将初步处理的驴皮剪碎成5mm*5mm的小块，向中加入20倍体积含1.5-3％的脂肪酶、浓度为0.5-0.8mol/L的Na2CO3以及浓度为0.4-0.6mol/LKCl的水溶液，控制温度在20-30℃下搅拌浸泡50-60min，软化驴皮去除脂肪，蒸馏水冲洗至中性，沥干水分；
S13：向处理后的驴皮碎片中加入液氮研磨至粉末状。
作为优选，步骤S11中中性蛋白酶、α淀粉酶、纤维素酶与水的比例为2：1.5：1：100。
作为优选，酶解膜循环分离的具体步骤如下：
S21：准备反应罐A和反应罐B，将驴皮粉末与水按1:2混合，加入反应罐A中，向反应罐A中加入4.3-4.7％以壳聚糖为载体的固定化中性蛋白酶、菠萝蛋白酶混合物，调节反应温度50-53℃，PH6.5-7.0；
S22：反应罐A反应35-40min后，将混合液依次加入至蠕动泵A、B、C，调节蠕动泵A流量200mL/min，蠕动泵B、C流量100mL/min，过中空纤维膜A，分子截留大小为20KD，过滤体积/膜面积比450mL/m2，滤膜加压0.01MPa，调节反应温度37-40℃，PH7.0-7.5；
S23：反应罐B中加入2.8-3.3％的壳聚糖固定化碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶混合物，反应温度50-55℃，PH8.5-9.0进行二次酶解；
S24：蠕动泵C开启后20min，输送至蠕动泵D、E、F中，调节蠕动泵D流量100mL/min，蠕动泵E、F流量50mL/min，过中空纤维膜B，分子截留大小5KD，过滤体积/膜面积比350mL/m2，滤膜加压0.01MPa，调节反应温度37-40℃，PH7.0-7.5；
S25：过中空纤维膜C，分子截留大小3KD，过滤体积/膜面积比300mL/m2，设置压力0.01MPa，调节反应温度37-40℃，PH7.0-7.5；
S26：截取目标分子量为2-5KD的胶原蛋白，进行后续处理。
作为优选，步骤S21中固定化中性蛋白酶、菠萝蛋白酶的比例1.5：1。
作为优选，步骤S23中添加的碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的比例为1：1.2。
作为优选，脱色及脱腥处理的具体步骤如下：
S31：调节PH至4.0，加入0.55％活性炭，控制温度在40℃下，脱色35-40min；
S32：过超滤去除活性炭，并加入1-1.2％酵母，PH4.5，在35℃条件下发酵30-35min；
S33：高温灭菌并微滤去除残存酵母，获得胶原蛋白溶液。
作为优选，冷冻干燥的具体步骤为：将所得胶原蛋白溶液进行冷冻干燥处理，获得分子量2-5KD胶原蛋白粉末。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本驴皮胶原蛋白的制备方法中，通过特定组合的工艺步骤及参数条件进行驴皮预处理、酶解膜循环分离、脱色及脱腥处理和冷冻干燥，得到分子量为2-5KD胶原蛋白粉末，该胶原蛋白粉末具有下述特点：首先，制备驴皮胶原蛋白的三股螺旋结构并没有被破坏，仍然保留其原有的生物活性；其次，该驴皮胶原蛋白的主要成分为2-5KD胶原蛋白肽粉末，水溶性好，具有小分子生物体内易吸收的特性；再次，驴皮胶原蛋白来源于脊椎动物的胶原，其分子量和结构相似，与人肌体、皮肤具有良好的同源性和相容性。基于以上特性，本方法中制备的驴皮胶原蛋白制品外用可涂于皮肤表面并快速溶入表皮，内服可保持自身活性功效，于体内快速吸收。
2、本驴皮胶原蛋白的制备方法中，驴皮胶原蛋白在补血的同时可以改善皮肤弹性、调节皮肤水油平衡。使用本方法制备的皮胶原蛋白，其人体试食试验结果表明，服用驴皮胶原蛋白45天后皮肤水份平均增加20％，油份增加10％，皮肤水份、油份状况得到了改善，试验组总有效率达到60％，可用于制备外科植入物和组织工程医疗产品，开发医药、医学试剂、及保健品等。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供以下技术方案：
实施例1
一种驴皮胶原蛋白的制备方法，具体步骤如下：
S1：驴皮预处理；
S2：酶解膜循环分离；
S3：脱色及脱腥处理；
S4：冷冻干燥；
本实施例中，驴皮预处理的具体步骤如下：
S11：取新鲜驴皮洗净，尽量去掉脂肪层，将其浸泡至10倍体积含有中性蛋白酶、α淀粉酶与纤维素酶混合水溶液，温度加热至35℃，PH7，浸泡35min脱毛；
S12：将初步处理的驴皮剪碎成5mm*5mm的小块，向中加入20倍体积含2％的脂肪酶、浓度为0.6mol/L的Na2CO3以及浓度为0.6mol/LKCl的水溶液，控制温度在25℃下搅拌浸泡60min，软化驴皮去除脂肪，蒸馏水冲洗至中性，沥干水分；
S13：向处理后的驴皮碎片中加入液氮研磨至粉末状。
具体的，步骤S11中中性蛋白酶、α淀粉酶、纤维素酶与水的比例为2：1.5：1：100。
本实施例中，酶解膜循环分离的具体步骤如下：
S21：准备反应罐A和反应罐B，将驴皮粉末与水按1:2混合，加入反应罐A中，向反应罐A中加入4.5％以壳聚糖为载体的固定化中性蛋白酶、菠萝蛋白酶混合物，调节反应温度50℃，PH7；
S22：反应罐A反应35in后，将混合液依次加入至蠕动泵A、B、C，调节蠕动泵A流量200mL/min，蠕动泵B、C流量100mL/min，过中空纤维膜A，分子截留大小为20KD，过滤体积/膜面积比450mL/m2，滤膜加压0.01MPa，调节反应温度37℃，PH7.5；
S23：反应罐B中加入3％的壳聚糖固定化碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶混合物，反应温度50℃，PH9.0进行二次酶解；
S24：蠕动泵C开启后20min，输送至蠕动泵D、E、F中，调节蠕动泵D流量100mL/min，蠕动泵E、F流量50mL/min，过中空纤维膜B，分子截留大小5KD，过滤体积/膜面积比350mL/m2，滤膜加压0.01MPa，调节反应温度39℃，PH7.5；
S25：过中空纤维膜C，分子截留大小3KD，过滤体积/膜面积比300mL/m2，设置压力0.01MPa，调节反应温度40℃，PH7.0-7.5；
S26：截取目标分子量为2-5KD的胶原蛋白，进行后续处理。
具体的，步骤S21中固定化中性蛋白酶、菠萝蛋白酶的比例1.5：1，步骤S23中添加的碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的比例为1：1.2。
本实施例中，脱色及脱腥处理的具体步骤如下：
S31：调节PH至4.0，加入0.55％活性炭，控制温度在40℃下，脱色40min；
S32：过超滤去除活性炭，并加入1％酵母，在PH4.5，温度35℃条件下发酵30min；
S33：高温灭菌并微滤去除残存酵母，获得胶原蛋白溶液。
此外，冷冻干燥的具体步骤为：将所得胶原蛋白溶液进行冷冻干燥处理，获得分子量2-5KD胶原蛋白粉末。
实施例2
一种驴皮胶原蛋白的制备方法，具体步骤如下：
S1：驴皮预处理；
S2：酶解膜循环分离；
S3：脱色及脱腥处理；
S4：冷冻干燥；
本实施例中，驴皮预处理的具体步骤如下：
S11：取新鲜驴皮洗净，尽量去掉脂肪层，将其浸泡至10倍体积含有中性蛋白酶、α淀粉酶与纤维素酶混合水溶液，温度加热至36℃，PH7，浸泡30min脱毛；
S12：将初步处理的驴皮剪碎成5mm*5mm的小块，向中加入20倍体积含2％的脂肪酶、浓度为0.6mol/L的Na2CO3以及浓度为0.6mol/L的KCl的水溶液，控制温度在25℃下搅拌浸泡55min，软化驴皮去除脂肪，蒸馏水冲洗至中性，沥干水分；
S13：向处理后的驴皮碎片中加入液氮研磨至粉末状。
具体的，步骤S11中中性蛋白酶、α淀粉酶、纤维素酶与水的比例为2：1.5：1：100。
本实施例中，酶解膜循环分离的具体步骤如下：
S21：准备反应罐A和反应罐B，将驴皮粉末与水按1:2混合，加入反应罐A中，向反应罐A中加入4.7％以壳聚糖为载体的固定化中性蛋白酶、菠萝蛋白酶混合物，调节反应温度52℃，PH6.8；
S22：反应罐A反应38min后，将混合液依次加入至蠕动泵A、B、C，调节蠕动泵A流量200mL/min，蠕动泵B、C流量100mL/min，过中空纤维膜A，分子截留大小为20KD，过滤体积/膜面积比450mL/m2，滤膜加压0.01MPa，调节反应温度38℃，PH7.2；
S23：反应罐B中加入3％的壳聚糖固定化碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶混合物，反应温度50℃，PH9.0进行二次酶解；
S24：蠕动泵C开启后20min，输送至蠕动泵D、E、F中，调节蠕动泵D流量100mL/min，蠕动泵E、F流量50mL/min，过中空纤维膜B，分子截留大小5KD，过滤体积/膜面积比350mL/m2，滤膜加压0.01MPa，调节反应温度38℃，PH7.2；
S25：过中空纤维膜C，分子截留大小3KD，过滤体积/膜面积比300mL/m2，设置压力0.01MPa，调节反应温度38℃，PH7.2；
S26：截取目标分子量为2-5KD的胶原蛋白，进行后续处理。
具体的，步骤S21中固定化中性蛋白酶、菠萝蛋白酶的比例1.5：1，步骤S23中添加的碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的比例为1：1.2。
本实施例中，脱色及脱腥处理的具体步骤如下：
S31：调节PH至4.0，加入0.55％活性炭，控制温度在40℃下，脱色40min；
S32：过超滤去除活性炭，并加入1.2％酵母，PH4.5，在35℃条件下发酵35min；
S33：高温灭菌并微滤去除残存酵母，获得胶原蛋白溶液。
此外，冷冻干燥的具体步骤为：将所得胶原蛋白溶液进行冷冻干燥处理，获得分子量2-5KD胶原蛋白粉末。
实施例3
一种驴皮胶原蛋白的制备方法，具体步骤如下：
S1：驴皮预处理；
S2：酶解膜循环分离；
S3：脱色及脱腥处理；
S4：冷冻干燥；
本实施例中，驴皮预处理的具体步骤如下：
S11：取新鲜驴皮洗净，尽量去掉脂肪层，将其浸泡至10倍体积含有中性蛋白酶、α淀粉酶与纤维素酶混合水溶液，温度加热至36℃，PH7.0，浸泡30min脱毛；
S12：将初步处理的驴皮剪碎成5mm*5mm的小块，向中加入20倍体积含1.5-3％的脂肪酶、浓度为0.6mol/L的Na2CO3以及浓度为0.6mol/LKCl的水溶液，控制温度在30℃下搅拌浸泡60min，软化驴皮去除脂肪，蒸馏水冲洗至中性，沥干水分；
S13：向处理后的驴皮碎片中加入液氮研磨至粉末状。
具体的，步骤S11中中性蛋白酶、α淀粉酶、纤维素酶与水的比例为2：1.5：1：100。
本实施例中，酶解膜循环分离的具体步骤如下：
S21：准备反应罐A和反应罐B，将驴皮粉末与水按1:2混合，加入反应罐A中，向反应罐A中加入4.6％以壳聚糖为载体的固定化中性蛋白酶、菠萝蛋白酶混合物，调节反应温度52℃，PH7.0；
S22：反应罐A反应40min后，将混合液依次加入至蠕动泵A、B、C，调节蠕动泵A流量200mL/min，蠕动泵B、C流量100mL/min，过中空纤维膜A，分子截留大小为20KD，过滤体积/膜面积比450mL/m2，滤膜加压0.01MPa，调节反应温度37℃，PH7.2；
S23：反应罐B中加入3.2％的壳聚糖固定化碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶混合物，反应温度55℃，PH8.5进行二次酶解；
S24：蠕动泵C开启后20min，输送至蠕动泵D、E、F中，调节蠕动泵D流量100mL/min，蠕动泵E、F流量50mL/min，过中空纤维膜B，分子截留大小5KD，过滤体积/膜面积比350mL/m2，滤膜加压0.01MPa，调节反应温度38℃，PH7.2；
S25：过中空纤维膜C，分子截留大小3KD，过滤体积/膜面积比300mL/m2，设置压力0.01MPa，调节反应温度39℃，PH7.2；
S26：截取目标分子量为2-5KD的胶原蛋白，进行后续处理。
具体的，步骤S21中固定化中性蛋白酶、菠萝蛋白酶的比例1.5：1，步骤S23中添加的碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的比例为1：1.2。
本实施例中，脱色及脱腥处理的具体步骤如下：
S31：调节PH至4.0，加入0.55％活性炭，控制温度在40℃下，脱色36min；
S32：过超滤去除活性炭，并加入1.2％酵母，PH4.5，在35℃条件下发酵34min；
S33：高温灭菌并微滤去除残存酵母，获得胶原蛋白溶液。
此外，冷冻干燥的具体步骤为：将所得胶原蛋白溶液进行冷冻干燥处理，获得分子量2-5KD胶原蛋白粉末。
将本发明的三个实施例驴皮胶原蛋白的制备方法生产的驴皮胶原蛋白与现有的胶原蛋白在服用45天后的皮肤水份增加量，油份增加量，皮肤吸收率，如下表所示。
由上表可以看出，本发明驴皮胶原蛋白的制备方法，通过特定组合的工艺步骤及参数条件进行驴皮预处理、酶解膜循环分离、脱色及脱腥处理和冷冻干燥，得到分子量为2-5KD胶原蛋白粉末，该胶原蛋白粉末具有下述特点：制备驴皮胶原蛋白的三股螺旋结构并没有被破坏，仍然保留其原有的生物活性；主要成分为2-5KD胶原蛋白粉末，水溶性好，能被水以任意比例稀释；来源于脊椎动物的胶原与人肌体、皮肤具有良好的同源性和相容性，其分子量和结构相似；涂于皮肤后可快速溶入表皮；驴皮胶原蛋白的变性温度约为36.5℃，经人肌体、皮肤吸收后，在人体正常体温和体内胶原酶的作用下，可生物降解为小分子多肽、单肽，又可在其他酶的作用下继续分解成二十余种氨基酸，易被吸收，继续发挥营养作用；驴皮胶原蛋白，在补血的同时改善皮肤弹性、改善皮肤水份和油份。人体试食试验结果表明，服用驴皮胶原蛋白45天后皮肤水份平均增加20％，油份增加10％，皮肤水份、油份状况得到了改善，试验组总有效率达到60％，可用于制备外科植入物和组织工程医疗产品，开发医药、医学试剂、及保健品等。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种驴皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
S1：驴皮预处理；
S2：酶解膜循环分离；
S3：脱色及脱腥处理；
S4：冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的驴皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于：驴皮预处理的具体步骤如下：
S11：取新鲜驴皮洗净，尽量去掉脂肪层，将其浸泡至10倍体积含有中性蛋白酶、α淀粉酶与纤维素酶混合水溶液，温度加热至35-37℃，PH6.8-7.3，浸泡30-35min脱毛；
S12：将初步处理的驴皮剪碎成5mm*5mm的小块，向中加入20倍体积含1.5-3％的脂肪酶、浓度为0.5-0.8mol/L的Na2CO3以及浓度为0.4-0.6mol/LKCl的水溶液，控制温度在20-30℃下搅拌浸泡50-60min，软化驴皮去除脂肪，蒸馏水冲洗至中性，沥干水分；
S13：向处理后的驴皮碎片中加入液氮研磨至粉末状。
3.根据权利要求2所述的驴皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤S11中中性蛋白酶、α淀粉酶、纤维素酶与水的比例为2：1.5：1：100。
4.根据权利要求1所述的驴皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于：酶解膜循环分离的具体步骤如下：
S21：准备反应罐A和反应罐B，将驴皮粉末与水按1:2混合，加入反应罐A中，向反应罐A中加入4.3-4.7％以壳聚糖为载体的固定化中性蛋白酶、菠萝蛋白酶混合物，调节反应温度50-53℃，PH6.5-7.0；
S22：反应罐A反应35-40min后，将混合液依次加入至蠕动泵A、B、C，调节蠕动泵A流量200mL/min，蠕动泵B、C流量100mL/min，过中空纤维膜A，分子截留大小为20KD，过滤体积/膜面积比450mL/m2，滤膜加压0.01MPa，调节反应温度37-40℃，PH7.0-7.5；
S23：反应罐B中加入2.8-3.3％的壳聚糖固定化碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶混合物，反应温度50-55℃，PH8.5-9.0进行二次酶解；
S24：蠕动泵C开启后20min，输送至蠕动泵D、E、F中，调节蠕动泵D流量100mL/min，蠕动泵E、F流量50mL/min，过中空纤维膜B，分子截留大小5KD，过滤体积/膜面积比350mL/m2，滤膜加压0.01MPa，调节反应温度37-40℃，PH7.0-7.5；
S25：过中空纤维膜C，分子截留大小3KD，过滤体积/膜面积比300mL/m2，设置压力0.01MPa，调节反应温度37-40℃，PH7.0-7.5；
S26：截取目标分子量为2-5KD的胶原蛋白，进行后续处理。
5.根据权利要求4所述的驴皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤S21中固定化中性蛋白酶、菠萝蛋白酶的比例1.5：1。
6.根据权利要求4所述的驴皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤S23中添加的碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的比例为1：1.2。
7.根据权利要求1所述的驴皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于：脱色及脱腥处理的具体步骤如下：
S31：调节PH至4.0，加入0.55％活性炭，控制温度在40℃下，脱色35-40min；
S32：过超滤去除活性炭，并加入1-1.2％酵母，PH4.5，在35℃条件下发酵30-35min；
S33：高温灭菌并微滤去除残存酵母，获得胶原蛋白溶液。
8.根据权利要求1所述的驴皮胶原蛋白的制备方法，其特征在于：冷冻干燥的具体步骤为：将所得胶原蛋白溶液进行冷冻干燥处理，获得分子量2-5KD胶原蛋白粉末。
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| RU2795059C1 (ru) * | 2022-05-25 | 2023-04-28 | Общество С Ограниченной Ответственностью Научно-Исследовательский Институт "Профессиональные Биотехнологии" | Способ обработки шкур крупного рогатого скота для получения коллагенсодержащего материала пищевого назначения |
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|---|---|---|---|---|
| CN101851339A (zh) * | 2010-05-19 | 2010-10-06 | 成都新际生物活性胶原开发有限公司 | 一种驴皮胶原的制备方法 |
| CN108208307A (zh) * | 2018-03-12 | 2018-06-29 | 广东正当年生物科技有限公司 | 一种具有美容功能的胶原蛋白肽的制备方法 |
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| CN108728507A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-11-02 | 金华市铁骑士生物科技有限公司 | 鱼皮胶原多肽的制备方法 |
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|---|---|---|---|---|
| RU2795059C1 (ru) * | 2022-05-25 | 2023-04-28 | Общество С Ограниченной Ответственностью Научно-Исследовательский Институт "Профессиональные Биотехнологии" | Способ обработки шкур крупного рогатого скота для получения коллагенсодержащего материала пищевого назначения |
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