CN112553257A - 一种重组腺相关病毒的制备方法、系统及重组杆粒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种重组腺相关病毒的制备方法、系统及重组杆粒。首先构建包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒；其中，至少一个所述必需功能元件被插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因基因座的N末端或C末端；然后将获得的包含生产所述重组腺相关病毒的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，转染到宿主细胞系培养制备重组腺相关病毒。与传统的Tn7重组制备重组杆粒得到的重组杆状病毒相比，将包含Cap、Rep和ITR核心元件插入到杆状病毒必需基因两侧获得的重组杆状病毒在细胞中连续传代rAAV生产水平更稳定，其rAAV产率更高。

Description

一种重组腺相关病毒的制备方法、系统及重组杆粒
技术领域
本发明属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种重组腺相关病毒的制备方法、系统及重组杆粒。
背景技术
重组腺相关病毒(rAAV)由于具有宿主范围广、免疫原性低、安全性高、可介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，是目前基因治疗领域最具应用前景的载体之一。
随着第一种重组腺相关病毒(rAAV)介导的基因治疗药物的批准，对大规模AAV载体制造技术的需求不断增加(Yla-Herttuala,S.,Mol Ther.20,1831-1832,2012)。然而，rAAV的大规模生产仍然是开发这一类型疗法的限制因素。因此，为了克服这一难题和生物安全性的问题，已开发了利用杆状病毒感染昆虫细胞的能力的生产系统，即将提供Rep、Cap和ITR核心表达元件分别通过Tn7重组整合到3种不同的杆状病毒基因组中，需要用这3种重组杆状病毒共感染昆虫细胞制备rAAV(Urabe等，2002，Hum.Gene Ther.13:1935-1943；US20030148506；US20040197895)。在此基础上进一步简化为2种杆状病毒的的生产系统，将Rep和Cap表达框整合到一种杆状病毒中(Smith等，2009，Mol.Ther.17:1888-1896)。然而，两杆状病毒共同感染细胞效率较低，无法充分利用每个细胞的产能，而且感染是个随机的过程，容易产生不含核酸的空壳缺陷rAAV颗粒，制备工艺条件优化起来比较复杂，不同批次制备的rAAV质量不稳定。
因此，又在此基础上进一步开发了一杆状病毒系统(One Bac system)，主要有依赖细胞系的一杆状病毒系统、基于一个穿梭质粒的一杆状病毒系统和基于DH10Bac的一杆状病毒系统。依赖包装细胞系的一杆状病毒系统是先建立诱导表达AAV Rep基因和Cap基因的包装细胞系，再感染整合了携带外源目的基因(GOI)的ITR核心表达元件的重组杆状病毒BEV-(ITR-GOI)后，诱导细胞系中Rep和Cap基因表达进而产rAAV(Aslanidi等,2009,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,206:5059-5064)。基于一个穿梭质粒的一杆状病毒系统则是将把AAV的Cap基因、Rep基因和ITR核心表达元件一起构建到一个穿梭质粒上，通过Tn7转座子介导的重组将穿梭质粒上携带的rAAV包装元件整合到一个杆状病毒基因组中，然后将这一种重组杆状病毒感染宿主细胞从而产生rAAV(Yang等,2018,Mol Ther Methods ClinDev.2018Jul 4；10:38-47.)。基于DH10Bac的一杆状病毒系统则是将AAV的Cap基因和Rep基因整合到DH10Bac中的杆状病毒基因组(Bacmid)中，通过Tn7转座子介导的重组得到包含ITR核心元件、Cap基因和Rep基因的重组Bacmid，将这一种重组杆状病毒(BEV)感染宿主细胞从而产生rAAV(吴阳等，CN201811618542)。
然而，上述所有的状病毒系统均依赖于Tn7重组将ITR核心元件插入到非必需基因——Polh基因的基因座位，而Rep和Cap表达框则通过Tn7重组或者Red重组插入到polh基因的基因座位或其它一些非必需基因的基因座中，在杆状病毒传代过程中由于Tn7序列或者非必需基因容易丢失的问题，导致产生的BEV的传代稳定性较差。因此并不适合于对稳定性要求很高的大规模批量化的生产和应用，因此用于生产基因治疗载体药物仍然有很大的改进需求。
发明内容
针对现有技术的缺陷或改进需求，本发明提供了一种重组腺相关病毒的制备方法、系统及重组杆粒，通过将生产重组腺相关病毒的必需功能元件(Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI)中的至少一种插入到重组杆状病毒基因组的必需基因的N末端或C末端，旨在解决现有技术将该必需功能元件插入重组杆状病毒基因组的非必需基因座，在杆状病毒传代过程中外源基因容易丢失导致产生的BEV的传代稳定性较差的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种重组腺相关病毒的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建包含生产重组腺相关病毒的重组杆状病毒基因组的重组杆粒；所述重组杆状病毒基因组中包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件，所述必需功能元件包括Cap基因、Rep基因以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI；
(2)将步骤(1)获得的包含生产重组腺相关病毒的重组杆状病毒基因组的重组杆粒转染到宿主细胞系培养；
其中，所述必需功能元件中的至少一个被插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因基因座的N末端或C末端。
优选地，所述必需功能元件中的至少一个被插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因基因座的N末端或C末端，是指所述必需功能元件中的至少一个位于所述重组杆状病毒基因组必需基因表达框的3kb范围内。
优选地，所述必需功能元件中的至少一个位于必需基因表达框的1.5kb范围内。
优选地，步骤(1)具体为：构建包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件的同源重组载体，或者构建包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件的同源重组载体和穿梭质粒，利用同源重组的方法将生产所述重组腺相关病毒的三个必需功能元件整合到同一个包含重组杆状病毒基因组的重组杆粒中，获得包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒；
其中，所述同源重组载体包括靶向杆状病毒必需基因，且该载体中携带Cap基因表达框、Rep基因表达框和ITR-GOI中的至少一种。
优选地，其余必需功能元件被插入到所述重组杆状病毒基因组非必需基因的基因座中。
优选地，所述杆状病毒基因组必需基因的基因座选自Ac6、Ac9、Ac10、Ac17、Ac66、Ac109、Ac139、Ac135、Ac98、Ac147和Ac128。
优选地，所述杆状病毒基因组必需基因的基因座选自Ac135、Ac98(38K)、Ac147(IE1)和Ac128(GP64)。
优选地，所述Cap基因表达框和Rep基因表达框被插入到所述重组杆状病毒基因组一个必需基因基因座的C末端；所述带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI被插入到所述重组杆状病毒基因组一个非必需基因的基因座中。
优选地，所述Cap基因表达框和Rep基因表达框被插入到所述重组杆状病毒基因组一个必需基因基因座的N末端或C末端；所述带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI被插入到所述重组杆状病毒基因组另一个必需基因基因座的N末端或C末端。
优选地，所述Cap基因的基因序列为依据核糖体泄漏扫描进行密码子优化的序列。
优选地，所述Cap基因的基因序列为如SEQ ID No.1所示的序列。
优选地，所述Rep基因的基因序列为依据核糖体泄漏扫描进行密码子优化的序列。
优选地，所述Rep基因的基因序列为如SEQ ID No.2所示的序列。
优选地，所述核心表达元件ITR基因序列为如SEQ ID No.3所示的序列。
优选地，步骤(1)具体包括如下子步骤：
(1-1)构建包含Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI的一个或多个同源重组载体；
(1-2)利用步骤(1-1)获得的一个或多个同源重组载体，将Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI整合，使其插入到重组杆状病毒基因组一个或多个必需基因基因座的N末端或C末端，获得包含生产所述重组腺相关病毒的所有必需功能元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒。
优选地，步骤(1)具体包括如下步骤：
(1-1)构建包含所述必需功能元件中的一个或两个元件的同源重组载体；然后通过Red同源重组将该同源重组载体中的AAV必需功能元件插入到杆状病毒基因组一个或两个必需基因基因座的N末端或C末端；
(1-2)构建包含其余必需功能元件的穿梭质粒；
(1-3)通过穿梭质粒介导的Tn7重组将Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI整合在一个杆状病毒基因组中，获得包含生产所述重组腺相关病毒的所有必需功能元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒。
按照本发明的另一个方面，提供了一种用于制备重组腺相关病毒的重组杆粒，该重组杆粒包括重组杆状病毒基因组，该重组杆状病毒基因组中包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件；所述必需功能元件包括Cap基因、Rep基因以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI；
其中，所述必需功能元件中的至少一个被插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因基因座的N末端或C末端。
按照本发明的另一个方面，提供了一种重组腺相关病毒的制备系统，包含所述的重组杆粒。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明提供的rAAV的制备方法，将生产重组腺相关病毒的必需功能元件(Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI)中的至少一种插入到重组杆状病毒基因组的必需基因的N末端或C末端，不仅没有影响该必需基因的表达，而且很好地解决了现有技术将rAAV必需功能元件插入重组杆状病毒基因组的非必需基因座，在杆状病毒传代过程中外源基因容易丢失，导致产生的BEV的传代稳定性较差的技术问题。稳定性是限制杆状病毒制备AAV系统大规模放大(如2000L的规模)的关键因素，解决了BEV的传代稳定性使得AAV大规模放大制备成为可能。
(2)本发明提供的包含生产rAAV的必需功能元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，由于ITR-GOI、Rep基因和Cap基因中的一个或多个负载在重组杆状病毒基因组一个或多个必需基因的N末端或C末端，显著提高了包含生产所述rAAV全部功能元件的重组杆状病毒的传代稳定性和rAAV的产量，且对于现有的rAAV的杆状病毒制备系统兼容性良好，显著提高了所制备的重组杆状病毒BEV的整体稳定性。
(3)本发明优选实施例中将生产重组腺相关病毒的三个必需基因元件全部插入到重组杆状病毒基因组的必需基因座的一端，大大提高了重组杆状病毒的传代稳定性以及重组腺相关病毒的产率。
附图说明
图1为本发明重组腺相关病毒的制备流程示意图。
图2为本发明重组腺相关病毒必需功能元件表达框示意图。
图3为实施例1构建的AC20-313 BEV不同代次的稳定性。
图4为实施例1的9KC-142A BEV不同代次的稳定性。
图5为实施例1构建的AC20-313不同代次的BEV包装rAAV的产率。
图6为实施例1中9KC-142A不同代次的BEV包装rAAV的产率。
图7为实施例1中构建的AC20-313 P2-P10代BEV包装rAAV的SDS-PAGE银染图。
图8为实施例2中Ac-141-175 BEV不同代次的稳定性。
图9为实施例2中9KC-313 BEV不同代次的稳定性。
图10为实施例2中Ac-141-175不同代次的BEV包装rAAV的产率。
图11为实施例2中9KC-313不同代次的BEV包装rAAV的产率。
图12为实施2中Ac-141-175 P2-P10代BEV包装rAAV的SDS-PAGE银染图。
图13为实施例3中Ac-141-163 BEV不同代次的稳定性。
图14为实施例3中Ac-141-163不同代次的BEV包装rAAV的产率。
图15为实施例3中Ac-141-163 P2-P10代BEV包装rAAV的SDS-PAGE银染图。
图16为实施例4中Ac-141-162 BEV不同代次的稳定性。
图17为实施例4中Ac-141-162不同代次的BEV包装rAAV的产率。
图18为实施例4中Ac-141-162vs 9kc-313包装率。
图19为Ac-141-160和Ac-141-162 BEV生产的rAAV SDS-PAGE银染图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核多角体病毒(AcMNPV)基因组全长约134kb，存在约156个开放阅读框。在这些基因中，62个基因可以被归类为(可能的)非必需基因，已知的杆状病毒系统都是将AAV的Cap基因、Rep基因和ITR核心表达元件分开或者一起插入到Polh、Chia、Cath、egt、p10、ctx等非必需基因座位上，在杆状病毒传代过程中外源基因容易丢失导致产生的BEV的传代稳定性较差。另外94个认为是细胞培养增殖的必需基因，其中有一些是与杆状病毒核衣壳相关的蛋白，如Ac100(P6.9)、Ac89(VP39capsid)、Ac80(GP41 tegument)、Ac98(38K)、Ac142、Ac144、Ac92(P33)、Ac54(VP1054)、Ac77(VLF-1)、Ac104(VP80)、Ac9(PP78/83)这些基因一旦发生缺失或者突变则杆状病毒无法稳定存在；有一些是杆状病毒的囊膜蛋白，如Ac94(ODV-E25)、Ac109(ODV-EC43)、Ac143(ODV-E18)这几个基因一旦发生缺失则杆状病毒无法稳定存在；还有一些则是与BV产量相关的蛋白，如Ac17、Ac34、Ac36、Ac38、Ac139、Ac153这几个基因一旦发生缺失则杆状病毒的BV滴度降至1/100～1/1000。这些必需基因在杆状病毒传代过程中比较稳定，不容易丢失。
本发明提供的一种重组腺相关病毒的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)构建包含生产重组腺相关病毒的重组杆状病毒基因组的重组杆粒；所述重组杆状病毒基因组中包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件，所述必需功能元件包括Cap基因、Rep基因以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI；
(2)将步骤(1)获得的包含生产重组腺相关病毒的重组杆状病毒基因组的重组杆粒转染到宿主细胞系培养；
其中，所述必需功能元件中的至少一个被插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因基因座的N末端或C末端。本发明所述必需基因基因座的N末端或C末端是指所述必需功能元件位于重组杆状病毒基因组必需基因表达框的3kb范围内，优选位于必需基因表达框的1.5kb范围内。
一些实施例中，步骤(1)具体为：构建包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件的同源重组载体，或者构建包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件的同源重组载体和穿梭质粒，利用同源重组的方法将生产所述重组腺相关病毒的三个必需功能元件整合到同一个包含重组杆状病毒基因组的重组杆粒中，获得包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒；其中，所述同源重组载体包括靶向杆状病毒必需基因，且该载体中携带Cap基因表达框、Rep基因表达框和ITR-GOI中的至少一种。
一些实施例中，所述同源重组为Red重组和/或Tn7同源重组。
利用Tn7转座子介导的重组是一种快速高效的将外源基因构建到重组杆状病毒基因组上的方法，首先要先在重组杆状病毒基因组上引入Tn7转座子识别序列；另外，不适合同时或多次在多个不同位点进行重组。目前，对重组杆状病毒基因组进行高效改造仍然是比较复杂和繁琐的工作。
Red重组是一种细菌水平的高效重组方法，可以在大肠杆菌(DH10Bac)中用来快速改造重组杆状病毒基因组，Red重组是利用λ噬菌体Red重组酶(由Exo、Beta和Gam这3种蛋白质组成)将导入细胞携带有同源臂的线性DNA片段与基因组的特定靶序列进行同源重组，从而实现目的基因的替换(参考Doublet等，2008，J Microbiol Methods.,75(2):359-61)。为了便于重组子的筛选，引入两侧带有FRT序列的氯霉素(Chol)抗性基因表达框(SEQ IDNo.1)或两侧带有FRT序列的庆大霉素(Gen)抗性基因表达框(SEQ ID No.2)，便于后面通过pCP20质粒(温度敏感质粒，表达Flp重组酶)去除该抗性基因，可用于在杆粒基因组中连续多次利用该抗性基因进行一系列的基因缺失或插入。
本发明重组腺相关病毒的制备方法中，可以将生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件中的一个、两个或三个插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因基因座的N末端或C末端，利用必需基因基因座在杆状病毒传代中不容易丢失的特性，提高杆状病毒的传代稳定性，从而提高重组腺相关病毒的整体制备稳定性和制备产量。如果必需功能元件没有全部被插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因的基因座中，也可以将其余必需功能元件被插入到所述重组杆状病毒基因组非必需基因的基因座中。优选方案中将三个必需功能元件均插入到重组杆状病毒基因组的必需基因基因座的N末端或C末端。
本发明所述杆状病毒基因组必需基因被定义为从杆状病毒基因组中进行失活或移除后严重影响杆状病毒在昆虫细胞培养物中的生长能力和(或)稳定存在的基因。一些实施例中，所述杆状病毒基因组必需基因基因座选自Ac6(3089..3721)、Ac17(13738..14232)、Ac9(5287..6918)、Ac66(55292..57718)、Ac109(94721..95893)、Ac98(85021..85983)、Ac139(121205..122554)、Ac135(116492..117391)、Ac10(6917..7735)、IE1(127198..128946)和GP64(108179..109717)，IE1也即Ac147，GP64也即Ac128。
本发明实施例中将AAV包装元件插入到Ac135、Ac98(38K)、Ac147(IE1)和Ac128(GP64)这四个必需基因的C末端，与传统的Tn7重组制备重组杆粒得到的重组杆状病毒相比，将包含Cap、Rep和ITR核心元件插入到杆状病毒必需基因的C末端获得的重组杆状病毒在细胞中连续传代rAAV生产水平更稳定，其rAAV产率更高。然而，将AAV包装元件插入到杆状病毒必需基因Ac80(GP41)和Ac153的C末端后获得的重组杆状病毒在细胞中连续传代rAAV生产水平急剧下降。分析原因可能是由于将AAV包装元件插入到杆状病毒必需基因Ac80(GP41)和Ac153的C末端破坏了下游必需基因Ac79和Ac154基因的启动子区域，影响了Ac79和Ac154基因的表达，获得的重组杆状病毒在细胞中连续传代rAAV生产水平急剧下降。因此推测将AAV包装元件插入到杆状病毒必需基因的N末端或C末端而不影响上下游必需基因的表达均可，杆状病毒必需基因还可以选自Ac6、Ac9、Ac10、Ac17、Ac66、Ac109和Ac139基因座。
本发明所述重组杆状病毒基因组非必需基因的基因座选自Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56中的一个或多个。优选地，选自非必需基因基因座Chia和/或Cath。
一些实施例中，所述Cap基因表达框和Rep基因表达框被插入到所述重组杆状病毒基因组一个必须基因基因座的N末端或C末端；所述带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI被插入到所述重组杆状病毒基因组一个非必须基因基因座中或该非必须基因基因座的N末端或C末端。
另一些实施例中，所述Cap基因表达框和Rep基因表达框被插入到所述重组杆状病毒基因组一个必须基因基因座的N末端或C末端；所述带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI被插入到所述重组杆状病毒基因组另一个必须基因基因座的N末端或C末端。
优选实施例中，所述rAAV的制备方法中，所述Cap基因表达框中Cap基因序列为依据核糖体泄漏扫描进行密码子优化的序列，优选如SEQ ID No.3所示的序列。所述Rep基因表达框中Rep基因序列为依据核糖体泄漏扫描进行密码子优化的序列，优选如SEQ ID No.4示的序列。所述核心表达元件ITR基因序列优选如SEQ ID No.5所示的序列。
本发明所述重组杆粒源自于杆状病毒AcMNPV的基因组，其包含产生rAAV所必需的AAV Cap基因和Rep基因的表达框，产生腺相关病毒所必需的功能蛋白组分的表达框位于P10或PH启动子下游受其调控，如图2所示。
一些实施例中：步骤(1)具体包括如下子步骤：
(1-1)构建包含Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI的一个或多个同源重组载体；
(1-2)利用步骤(1-1)获得的一个或多个同源重组载体，将Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI整合，使其插入到重组杆状病毒基因组一个或多个必需基因基因座的N末端或C末端，获得包含生产所述重组腺相关病毒的所有必需功能元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒。
一些实施例中，步骤(1-2)利用步骤(1-1)获得的一个或多个同源重组载体，通过Red同源重组将Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI插入到所述重组杆状病毒基因组一个或多个必需基因的基因座的N末端或C末端并进行整合。
在各种构造中，载体可以包含来自病毒诸如杆状病毒的序列，诸如但不限于苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)。
一些实施例中，首先分别构建包含rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)和Rep基因表达框(Rep)的同源重组载体和包含外源目的基因(GOI)的ITR核心元件(ITR-GOI)的同源重组载体；然后通过第一步同源重组将Cap、Rep表达框整合到杆状病毒基因组一个必需基因的基因座表达框的N末端或C末端，接着通过第二步同源重组将ITR-GOI整合到上述杆状病毒基因组另一个必需基因座表达框的N末端或C末端，获得包含生产rAAV所必需的功能蛋白组分和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒。
一些实施例中，将包含Cap基因表达框和Rep基因表达框的同源重组载体通过电转化DH10Bac/pKD46电转感受态细胞，获得包含Cap基因表达框和Rep基因表达框的DH10Bac菌株，且所述Cap基因表达框和Rep基因表达框插入到杆状病毒基因组一个必需基因表达框的N末端或C末端；然后将包含外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI的同源重组载体通过电转化所述包含Cap基因表达框和Rep基因表达框的DH10Bac菌株，以将包含外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI插入到杆状病毒基因组另一个必需基因表达框的N末端或C末端，获得包含生产所述重组腺相关病毒的重组杆状病毒基因组的重组杆粒。
另一些实施例中，步骤(1)具体包括如下步骤：
(1-1)构建包含所述必需功能元件中的一个或两个元件的同源重组载体；然后通过Red同源重组在大肠杆菌中将该同源重组载体中的必需功能元件插入到杆状病毒基因组一个或两个必需基因基因座的N末端或C末端；
(1-2)构建包含其余必需功能元件的穿梭质粒；
(1-3)通过穿梭质粒介导的Tn7重组将Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI整合在一个杆状病毒基因组中，获得包含生产所述重组腺相关病毒的所有必需功能元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒。
一些实施例中，首先构建含rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)和Rep基因表达框(Rep)的同源重组载体和包含外源目的基因(GOI)的ITR核心元件(ITR-GOI)的穿梭载体；然后通过Red同源重组将Cap、Rep表达框插入到杆状病毒基因组必需基因的基因座的N末端或C末端；接着通过Tn7重组将穿梭载体中的ITR-GOI插入到上述杆状病毒基因组中的attTn7位点，获得包含生产rAAV所必需的功能蛋白组分和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒。
一些实施例中，首先构建包含外源目的基因(GOI)的ITR核心元件(ITR-GOI)的同源重组载体和的含rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)和Rep基因表达框(Rep)的穿梭载体；然后通过Red同源重组将ITR-GOI插入到杆状病毒基因组必需基因的基因座的N末端或C末端；接着通过Tn7重组将穿梭载体中的Cap、Rep表达框插入到上述杆状病毒基因组中的attTn7位点，获得包含生产rAAV所必需的功能蛋白组分和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒。
一些实施例中，所述穿梭质粒基于pfast.Bac.Dual质粒，其包含腺相关病毒的Rep基因、Cap基因的表达框和ITR-GOI核心表达元件中的一个或两个基因。
一些实施例中，所述含有重组杆状病毒基因组的重组杆粒源自于AcMNPV E2(基因组序列如：Genbank accession No.KM667940.1)，AcMNPV Bacmid(bMON14272)的结构参考文献(Luckow等,J Virol,1993.67(8):4566-79.)。
rAAV的包装主要需要3种主要的必需功能元件：rAAV的基因组即ITR核心表达元件、AAV的Rep功能基因、以及AAV的Cap功能基因。另外还可以包括AAP等其他功能蛋白组分，AAP基因对增加包装效率有一定的促进作用。因此，按照同样的思路，为了进一步增加重组腺相关病毒的包装效率，还可以将除必需功能元件以外的其他功能蛋白组分比如APP等整合到重组杆粒中，具体可以插入到重组杆粒基因组的非必需基因基因座中或必需基因基因座的N末端或C末端。
现有的大多数制备rAAV的杆状病毒系统中，携带外源基因(AAV的Rep基因、Cap基因或ITR核心表达元件)的重组杆状病毒采用的都是被插入到杆状病毒的非必需基因多角体基因(Polyhedron,polh)位点；为了便于重组杆状病毒的构建，通常利用商业化的Bac-to-Bac系统。Bac-to-Bac系统的原理是：首先将外源基因构建到穿梭质粒中，接着将重组穿梭质粒转化含有重组杆粒的大肠杆菌，通过Tn7转座子介导的细菌水平重组将重组穿梭质粒携带的外源基因整合到重组杆粒中。然后将从上述大肠杆菌中抽提获得的重组杆粒DNA转染昆虫细胞后拯救出携带有外源基因的重组杆状病毒BEV。该系统中这种既能在大肠杆菌中进行复制增殖又能在昆虫细胞中进行复制并包装出重组杆状病毒的大分子环状DNA被称为杆粒(Bacmid)。因为杆粒携带有细菌复制原点、抗生素抗性基因、重组杆状病毒基因组和Tn7重组克隆位点。该系统最早的开发者Luckow等就是选用多角体基因(polh)位点作为Tn7重组克隆位点的(Luckow等,1993,J.Virol.67(8):4566-4579)。
现在也有一些人选择将rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框：Rep基因和Cap基因基因表达框插入到ctx、egt、39k、orf51、pg37、iap2、odv-e56(Noad等,2009,BMC MolecularBiology10:87)等一些非必需基因座(CN201811618542；CN201280046259)。杆状病毒基因组中存在多个复制起始位点，在杆状病毒增殖过程中其基因组以多起点复制的形式复制，BEV在多次传代后会出现部分非必需基因的缺失，因此将外源基因插入到非必需基因座位产生的BEV传代稳定性较差，目的基因容易丢失。此外，目前所有的状病毒系统均依赖于Tn7重组插入ITR核心表达元件，需要在重组杆状病毒基因组上引入一对Tn7转座子识别序列，在杆状病毒传代过程中Tn7不稳定容易丢失，导致产生的BEV的传代稳定性较差。因此并不适合于对稳定性要求较高的大规模、批量化的生产和应用，因此用于生产基因治疗载体药物仍然有很大的改进需求。
本发明提供的包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，由于ITR-GOI、Rep基因、Cap基因中的至少一个被负载在必需基因的N末端或C末端，显著提高了所制备的重组杆状病毒BEV的整体稳定性。
本发明将获得的包含生产rAAV所必需的功能蛋白组分和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，转染宿主细胞系培养获得重组杆状病毒。具体地，将获得的重组杆粒转染相应宿主细胞系后制备所述rAAV，包括但不限于以下方式：
抽提转染：采用试剂盒从大肠杆菌抽提纯化所述重组杆粒DNA，再转染到宿主细胞系中。
直接感染：将含有所述重组杆粒转染到宿主细胞系后获得重组杆状病毒BEV，再用BEV直接感染相应宿主细胞系。
本发明所述含有杆状病毒基因组的重组杆粒包含生产rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框和ITR核心元件表达框。一些实施例中，所述含有杆状病毒基因组的重组杆粒为Chia基因和Cath基因(简称CC)缺失的杆状病毒。所述产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框和ITR-GOI表达框被插入到所述重组杆粒选自必需基因Ac135、Ac98(38K)、Ac147(IE1)、Ac128(GP64)、Ac6、Ac9、Ac10、Ac17、Ac66、Ac109和Ac139的一个或多个基因座中。
本发明还提供了一种用于制备重组腺相关病毒的重组杆粒，该重组杆粒包括重组杆状病毒基因组，该重组杆状病毒基因组中包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件；所述必需功能元件包括Cap基因、Rep基因以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI；其中，所述必需功能元件中的至少一个被插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因基因座的N末端或C末端。
本发明还提供了一种重组腺相关病毒的制备系统，包含如上所述的重组杆粒。
以下为实施例：
实施例1
利用DH10Bac-Cap-Rep(Ac135)-Tn7(ITR-GOI)制备rAAV。
本实施例包含一个同源重组载体和穿梭载体：同源重组载体靶向必需基因Ac135基因，含有生产rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框、Chol表达框和ETL-EGFP表达框，其中Chol表达框作为Red同源重组阳性克隆筛选标记，ETL-EGFP表达框则用于BEV的TCID50滴度测定；穿梭载体含有rAAV的核心表达元件ITR-GOI表达框。
利用本实施例提供的rAAV制备系统、制备rAAV的方法，包括以下步骤：
1.1构建包含AAV所述必须功能元件Cap和Rep基因表达框的同源重组载体；然后通过Red同源重组在大肠杆菌中将该同源重组载体中的必须功能元件插入到杆状病毒基因组一个或两个必需基因基因座的C末端，具体步骤如下：
1.1.1构建包含rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)靶向必需基因Ac135基因的同源重组载体。首先，我们以野生型AcMNPV杆粒DNA为模版，用引物(HAL(135)-F：agttattgtgccgtttgctca和HAL(135)-R：ttatttaattgtgtttaatattaca)扩增上游同源臂片段——HAL(Ac135)(SEQ ID No.6)，用引物(HAR(135)-F：tcatttgtttttaaaattga和HAR(135)-R：ttgaaaaacaaatgacatcatct)扩增下游同源臂片段——HAR(Ac135)(SEQ IDNo.7)。
1.1.2然后，我们将上游同源臂、下游同源臂、氯霉素抗性基因表达框(P1-FRT-Chlo-P2)、Cap9基因表达框(P10-Cap9-PA)、Rep2基因表达框(PH-Cap9-PA)这几个DNA片段一起克隆到pUC57载体上，获得靶向Ac135基因的同源重组载体pUC57-HAL(Ac135)-P1-FRT-Chol-P2-ETL-EGFP-PA-Cap9KC-Rep2-HAR(Ac135)。
1.1.3将1.1.2步骤中得到的同源重组载体用限制性内切酶PmeI和AvrII双酶切，回收线性DNA片段HAL(Ac135)-P1-FRT-Chol-P2-ETL-EGFP-PA-Cap9KC-Rep2-HAR(Ac135)。然后，将该DNA片段电转化DH10Bac/pKD46感受态细胞，涂卡那霉素、四环素、氯霉素三种抗性的LB平板。37度倒置培养48h后，挑取蓝斑摇菌。小提杆粒DNA进行PCR鉴定，筛选阳性克隆，测序验证。我们将筛选出来的阳性菌株命名为DH10Bac-P1-FRT-Chol-P2-ETL-EGFP-PA-Cap9KC-Rep2(Ac135)，该菌株中Rep、Cap表达框位于杆状病毒必需基因Ac135基因C末端2625bp处。
1.2构建包含ITR核心元件(ITR-GOI)的穿梭载体。本实施例中ITR核心表达元件采用了红色荧光蛋白(mcherry)表达框，即由miniEf1a启动子控制mcherry表达，便于检测rAAV的活性，将ITR和红色荧光蛋白表达框(GOI)构建到穿梭载体pFastDual。
1.3将上述1.2步骤中构建的穿梭载体转化DH10Bac-P1-FRT-Chol-P2-ETL-EGFP-PA-Cap9KC-Rep2(Ac135)感受态，利用Tn7重组将ITR-GOI插入到上述步骤2中得到的含有重组杆状病毒基因组的重组杆粒中的Tn7位点上，最终得到包含生产rAAV所必需的功能蛋白组分和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，编号AC20-313。
1.4将步骤1.3中获得的包含生产rAAV所必需的功能蛋白组分和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒AC20-313，转染宿主细胞系培养获得重组杆状病毒。
抽提该重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞，制备重组杆状病毒BEV和rAAV。转染后的Sf9昆虫细胞成功产生BEV，大量复制增殖的BEV进一步感染导致Sf9细胞发生明显病变现象(CPE)，用荧光显微镜可以观察明显的绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白的表达。收集发生CPE的Sf9细胞培养上清液，其中含有大量BEV，即为第0代BEV(P0)，同时收集含有大量rAAV的Sf9细胞。将制备得到的BEV-P0以感染复数(MOI＝3)感染悬浮培养的Sf9细胞，感染72小时后，细胞活性下降至50％以下，将细胞培养液1000g离心5min，分别收集培养上清和细胞沉淀，上清液标记为第1代BEV-P1，细胞则标记为用BEV-P0包装的rAAV。
该系统所产生的重组杆状病毒的稳定性和AAV产率稳定性检测。
首先我们按照专利CN106544325B中的方法得到对应的重组杆状病毒作为对照，编号为9KC-142A(PFD-ITR-CMV-EGFP-PA)9KC-142A是将rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap9)、Rep基因表达框(Rep)和ITR-GOI一起构建到穿梭载体上，然后通过Tn7重组插入到非必需基因Polh座位上得到含有重组杆状病毒基因组的重组杆粒，最后转染Sf9细胞得到重组杆状病毒。
为了进一步分析本实施例系统的稳定性，本实施例以及接下来的实施例中均采用Q-PCR的方法检测BEV和AAV的滴度。方法引用至专利CN108699567A。将本实施例制备的BEV-Cap-Rep(Ac135)-Tn7(ITR-GOI)以相同的MOI经过连续传代后感染Sf9细胞，获得P2、P3、P4、P5……P10代次的BEV，测试重组杆状病毒的传代稳定性。采用荧光定量PCR(qPCR)的方法测定所有代次BEV的滴度，滴度单位用VG/ml(VG,virus genomes)表示。使用对应于gp64基因的一对引物(Q-GP64-F:AACTTGGACATTACCCCGCC和Q-GP64-R：CCGTTGTACGCATACGCCTG)来测定总杆状病毒滴度，使用对应于Rep序列的一对qPCR引物(Q-Rep-F:GAACAAGGTGGTGGACGAGT和Q-Rep-R:ATTCAAACAGGCGCTTAAAT)来测定包含Rep表达框和Cap表达框的杆状病毒滴度，使用对应于Tn7序列的一对qPCR引物(Q-Tn7-F:tcgtattagcttacgacgctaca和Q-Tn7-R:tagttgggaactgggagggg)测定包含ITR-GOI的杆状病毒滴度。通过Tn7/GP64以及REP/GP64的比值，评估BEV中外源基因片段：Rep/Cap表达框和ITR-GOI表达框的传代稳定性。如果比值稳定不变，代表Rep/Cap表达框和ITR-GOI表达框的传代稳定性较好，如果随着传代次数的增加，比值下降明显，说明插入的外源片段的稳定性较差。整个传代过程以总BEV滴度也就是GP64的Q-PCR滴度计算感染复数(MOI)传代。
评估重组杆状病毒的传代稳定性的另一方面是重组腺相关病毒(rAAV)的包装率和上清滴度，qPCR的方法测定所有代次rAAV的滴度，滴度单位用VG/ml(VG,virus genomes)表示。rAAV滴度的检测使用靶向ITR序列的一对引物(Q-ITR-F:GGAACCCCTAGTGATGGAGTT和Q-ITR-R:CGGCCTCAGTGAGCGA)或者WPRE序列的一对引物(Q-WPRE-F:CCGTTGTCAGGCAACGTG和Q-WPRE-R:AGCTGACAGGTGGTGGCAAT)。检测结果如下图。
图3为AC20-313 BEV不同代次的稳定性。rAAV的rep和cap表达框放在杆状病毒必需基因Ac135的C端，杆粒编号AC20-313，Q-PCR检测P2-P10代次的BEV稳定性，Tn/GP64的百分比代表ITR-GOI表达盒在BEV上的稳定性，REP/GP64的百分比代表rep和cap表达盒在BEV上的稳定性。从柱形图不同代次的BEV稳定性结果分析，稳定性较好。
图4为对照组9KC-142A BEV不同代次的稳定性。对照组9KC-142A BEV为参照专利CN106544325A中的方法构建得到重组杆粒，编号9KC-142A，作为对照病毒。Q-PCR检测P2-P10代次的BEV稳定性，Tn/GP64的百分比代表ITR-GOI表达盒在BEV上的稳定性，REP/GP64的百分比代表rep和cap表达盒在BEV上的稳定性。从柱形图不同代次的BEV稳定性结果分析，对照病毒的稳定性较差。
图5为AC20-313不同代次的BEV包装rAAV的产率。Q-PCR检测P2-P10代次的rAAV的细胞包装率和上清滴度，从图上可以看出，前P2-P4代的BEV产生的rAAV包装率和上清滴度较高，从P5开始包装率下降，但是到P9代包装率仍然在6.06E+4vg/cell，上清滴度1.20E+10vg/ml。
图6为9KC-142A不同代次的BEV包装rAAV的产率。Q-PCR检测P2-P10代次的rAAV的细胞包装率和上清滴度，从图上可以看出，从P2-P5代包装率下降明显，P5代的包装率只有7.02E+4vg/cell，上清滴度只有1.26E+9vg/ml。
图7为AC20-313 P2-P10代BEV包装rAAV的SDS-PAGE银染图。图中的3条带分别为AAV病毒的VP1、VP2、VP3，大小分别为87KDa、72KDa、62KDa。P2代BEV种毒生产出的rAAV标注为P3，依次类推。
实验结果表明，与对照组9KC-142A相比，本实施例中通过将rAAV的Rep/Cap表达框放在必需基因Ac135基因C末端2625bp处所获得的BEV其传代稳定性得到显著增强，如图3所示。具体表现为Tn7/GP64的百分比维持恒定不下降，REP/GP64的百分比缓慢下降，P10(26.72％)与P2(64.97％)比，下降约2.4倍。而对照组9KC-142A Tn7/GP64和REP/GP64的百分比下降非常明显，REP/GP64的百分比P10(0.64％)与P2(37.78％)比，下降59倍。且P4的REP/GP64百分比已下降至6.88％(下降5.5倍)。同时，不同代次的BEV感染宿主细胞sf9，产生的rAAV的上清滴度和细胞包装率AC20-313也显著优于对照组9KC-142A。AC20-313 P2/P3/P4的包装率基本在1E+6VG/Cell，从P5开始有缓慢下降(下降2.5倍，包装率3.72E+5VG/Cell)。P9的包装率仍然有6.06E+4VG/Cell，生产rAAV的稳定性得到了极大的改善。而对照组9KC-142A从P2-P5代包装率下降明显，P5代的包装率只有7.02E+4vg/cell，上清滴度只有1.26E+9vg/ml，如图6所示。
将本实施例制备的P2、P3、P4、P5……P10代次的BEV，以相同的MOI分别感染200mlsf9细胞，感染3天后监测细胞活性，活性低于50％，分别离心收获细胞沉淀和上清，将收获的细胞沉淀和上清分别纯化，细胞反复冻融3次裂解，5000rpm离心10min收集上清，在上清中加入核酸酶(Benzonase)37℃水浴处理60min，处理后5000rpm离心10min。收集的细胞裂解液和收集的上清液PEG沉淀重悬后用碘克沙醇密度梯度离心分离纯化(方法参考Aslanidi等,2009,Proc.NatlAcad.Sci.USA,206:5059-5064)。最终纯化的成品病毒全部用185ul PBS重悬，取10ul各代次纯化出的成品病毒跑SDS-PAGE胶，银染。结果如图7所示。
胶图中标注P3、P4...P11代表的是用前一个代次的种毒BEV扩增产生的rAAV。从图7可以看出，不同代次的BEV(P2-P10)在进行rAAV病毒包装时，P2-P7的BEV种毒稳定性较好，产生的rAAV总量下降较少。这与图3的结果保持一致。其中P3和P4泳道rAAV病毒浓度非常高，所以泳道较黑。代表P2和P3种毒BEV扩增rAAV时，病毒的包装率非常高。
因此，将rep和cap表达框放置在杆状病毒必须基因AC135位置旁边，将ITR-GOI表达框仍然通过Tn7重组的方法放置在非必需基因Polh座位上提高了BEV的传代稳定性和稳定生产rAAV的能力。
实施例2
鉴于实施例1中，我们将rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)靶向必需基因Ac135基因，获得了BEV稳定性和rAAV包装率优于将Rep/Cap放于非必须基因PH座位上的重组杆状病毒杆粒。因此，接下来的实施例中将Rep/Cap放于必须基因GP64的旁边，将rAAV的核心表达元件ITR-GOI表达框放在杆状病毒各种不同的必需基因的C末端，评估BEV的稳定性和rAAV的包装率。
利用DH10Bac-△CC-Cap-Rep(GP64)-ITR-GOI(Ac135)制备rAAV。
本实施例包含两个同源重组载体：一个是含有生产rAAV所必需的功能蛋白组分的Cap和Rep表达框、Chol表达框和ETL-EGFP表达框的靶向必需基因GP64的同源重组载体，其中Chol表达框作为Red同源重组阳性克隆筛选标记，ETL-EGFP表达框则用于BEV的TCID50滴度测定；另一个是含有rAAV的核心表达元件ITR-GOI表达框和Gen表达框的靶向必需基因Ac135基因的同源重组载体，其中Gen表达框作为Red同源重组阳性克隆筛选标记。
利用本实施例提供的rAAV制备系统、制备rAAV的方法，包括以下步骤：
2.1分别构建包含rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)的靶向必需基因GP64基因的同源重组载体和包含ITR-GOI的靶向必需基因Ac135基因的同源重组载体；
2.1.1构建包含rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)靶向GP64基因的同源重组载体。野生型AcMNPV基因组中的Chia、Cath和GP64这三个基因相邻，本实施例采用在GP64的C端插入rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)的同时缺失Chia和Cath基因的优选方案。首先，我们以野生型AcMNPV杆粒DNA为模版，用引物(HAL(GP64)-F：ggtaacggccaattcaacgt和HAL(GP64)-R：aagcaatatattgagtatca)扩增上游同源臂片段——HAL(GP64)(SEQ ID No.8)，用引物(HAR(GP64)-F：tctcaacacactcgctatttgga和HAR(GP64)-R：tggagaacaccaagtttggcggcgt)扩增下游同源臂片段——HAR(GP64)(SEQ IDNo.9)。
然后，将上游同源臂、下游同源臂、氯霉素抗性基因表达框(P1-FRT-Chlo-P2)、Cap9基因表达框(P10-Cap9-PA)、Rep2基因表达框(PH-Cap9-PA)这几个DNA片段一起克隆到pUC57载体上，获得靶向GP64基因的同源重组载体pUC57-HAL(GP64)-P1-FRT-Chol-P2-ETL-EGFP-PA-Cap9KC-Rep2-HAR(GP64)。
2.1.2构建包含ITR核心表达元件(ITR-GOI)的靶向Ac135基因的同源重组载体。本实施例中ITR的核心表达元件采用了红色荧光蛋白(mcherry)表达框，由miniEf1a启动子控制mcherry的表达，便于检测rAAV的活性。首先，我们以野生型AcMNPV杆粒DNA为模版，设计引物扩增上游同源臂片段——HAL(Ac135)(SEQ ID No.6)和下游同源臂片段——HAR(Ac135)(SEQ ID No.7)。
然后，将上游同源臂、下游同源臂、庆大霉素抗性基因表达框(P1-FRT-Gen-P2)和IT R核心元件基因表达框(ITR-GOI)一起克隆到pUC57载体上，，获得靶向Ac135基因且携带ITR-GOI的同源重组载体pUC57-HAL(Ac135)-P1-FRT-Gen-P2-Tn7L-ITR-miniEF1a-mcherry-WPRE-PA-ITR-HAR(Ac135)。
2.2通过Red同源重组分别将rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)和包含外源目的基因(GOI)的ITR核心元件(ITR-GOI)分别插入到杆状病毒基因组中必需基因GP64基因的C末端和必需基因Ac135基因的C末端，获得包含生产rAAV所必需的功能蛋白组分、ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒；
2.2.1参照实施例1中1.1.4步骤将rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)插入到杆状病毒基因组中必需基因GP64基因的C末端，将筛选出来的阳性菌株命名为DH10Bac-△CC-Cap9-Rep2(GP64)。
2.2.2然后，参照实施例1中1.1.4步骤将外源目的基因(GOI)的ITR核心元件(ITR-GOI)插入到2.2.1中得到的重组杆状病毒基因组中的必需基因Ac135基因的C末端，将筛选出来的阳性单克隆菌株命名为DH10Bac-△CC-Cap-Rep(GP64)-ITR-GOI(Ac135)。抽提杆粒，得到包含生产rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，编号Ac-141-175，该杆粒中Rep、Cap表达框位于杆状病毒必需基因GP64基因C末端235bp处，ITR核心元件位于杆状病毒必需基因Ac135基因C末端1503bp。
2.3将步骤2.2中获得的包含生产rAAV所必需的功能蛋白组分和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒Ac-141-175，转染宿主细胞系培养获得重组杆状病毒。
抽提该重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞，制备重组杆状病毒BEV和rAAV。转染后的Sf9昆虫细胞成功产生BEV，大量复制增殖的BEV进一步感染导致Sf9细胞发生明显病变现象(CPE)，用荧光显微镜可以观察明显的绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白的表达。收集发生CPE的Sf9细胞培养上清液，其中含有大量BEV，即为第0代BEV(P0)，同时收集含有大量rAAV的Sf9细胞。将制备得到的BEV-P0以感染复数(MOI＝3)感染悬浮培养的Sf9细胞，感染72小时后，细胞活性下降至50％以下，将细胞培养液1000g离心5min，分别收集培养上清和细胞沉淀，上清液标记为为第1代BEV-P1，细胞则标记为用BEV-P0包装的rAAV。
该系统所产生的重组杆状病毒的稳定性和AAV产率稳定性检测。
对照杆状病毒为参照专利CN109609552B中的方法得到的重组杆状病毒，编号为9KC-313(ITR-miniEf1a-mcherry-WPRE-PA-ITR)。9KC-313是将rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap9)和Rep基因表达框(Rep)插入到非必需基因(Cath和Chia)座位上，然后通过Tn7重组将ITR-GOI插入到非必需基因Polh座位上得到含有重组杆状病毒基因组的重组杆粒，最后转染Sf9细胞得到重组杆状病毒。
为了进一步分析本实施例系统的稳定性，将本实施例制备的BEV-Cap-Rep(GP64)-ITR-GOI(Ac135)以相同的MOI经过连续传代后感染Sf9细胞，获得P2、P3、P4、P5……P10代次的BEV，测试重组杆状病毒的传代稳定性。
采用荧光定量PCR(qPCR)的方法测定所有代次BEV的滴度，滴度单位用VG/ml(VG,virus genomes)表示。使用对应于gp64基因的一对引物(Q-GP64-F:AACTTGGACATTACCCCGCC和Q-GP64-R：CCGTTGTACGCATACGCCTG)来测定总杆状病毒滴度，使用对应于Rep序列的一对qPCR引物(Q-Rep-F:GAACAAGGTGGTGGACGAGT和Q-Rep-R:ATTCAAACAGGCGCTTAAAT)来测定包含Rep表达框和Cap表达框的杆状病毒滴度，使用对应于Tn7序列的一对qPCR引物(Q-Tn7-F:tcgtattagcttacgacgctaca和Q-Tn7-R:tagttgggaactgggagggg)测定包含ITR-GOI的杆状病毒滴度。通过Tn7/GP64以及REP/GP64的比值，评估B EV中外源基因片段：Rep/Cap表达框和ITR-GOI表达框的传代稳定性。如果比值稳定不变，代表Rep/Cap表达框和ITR-GOI表达框的传代稳定性较好，如果随着传代次数的增加，比值下降明显，说明插入的外源片段的稳定性较差。整个传代过程以总BEV滴度也就是GP64的Q-PCR滴度计算感染复数(MOI)传代。
评估重组杆状病毒的传代稳定性的另一方面是重组腺相关病毒(rAAV)的包装率和上清滴度，qPCR的方法测定所有代次rAAV的滴度，滴度单位用VG/ml(VG,virus genomes)表示。rAAV滴度的检测使用靶向WPRE序列的一对引物(Q-WPRE-F:CCGTTGTCAGGCAACGTG和Q-WPRE-R:AGCTGACAGGTGGTGGCAAT)。检测结果如图8至图12所示。
图8为Ac-141-175BEV不同代次的稳定性图。rAAV的rep和cap表达框放在杆状病毒必需基因GP64的C端，rAAV的ITR-GOI表达框放在杆状病毒必须基因Ac135的C端，杆粒编号Ac-141-175。Q-PCR检测P2-P10代次的BEV稳定性。从柱形图不同代次的BEV稳定性结果分析，稳定性较好。
图9为对照组9KC-313 BEV不同代次的稳定性。对照组9KC-313 BEV为参照专利CN109609552A中的方法构建得到重组杆粒，编号9KC-313，作为对照病毒。Q-PCR检测P2-P10代次的BEV稳定性。从柱形图不同代次的BEV稳定性结果分析，Tn7/GP64的比值偏低，且在P4代下降至27.66％。
图10为Ac-141-175不同代次的BEV包装rAAV的产率。Q-PCR检测P2-P10代次的rAAV的细胞包装率和上清滴度，从图上可以看出，包装率和上清滴度均比较稳定，在P9代时，包装率仍然维持在2.14E+5vg/cell，上清滴度达到9.12E+10vg/ml。
图11为对照组9KC-313不同代次的BEV包装rAAV的产率。Q-PCR检测P2-P10代次的rAAV的细胞包装率和上清滴度，从图上可以看出，对照病毒不同代次的BEV产生rAAV的稳定性较差，包装率下降非常明显，P5代只有2.62E+4vg/cell。
图12Ac-141-175 P2-P10代BEV包装rAAV的SDS-PAGE银染图。图中的3条带分别为AAV病毒的VP1、VP2、VP3，大小分别为87KDa、72KDa、62KDa。P2代BEV种毒生产出的rAAV标注为P3，依次类推。
实验结果表明，与对照组9KC-313相比，本实施例中通过将rAAV的Rep/Cap表达框放在必需基因GP64基因C末端235bp处，将ITR-GOI表达框放在杆状病毒必需基因Ac135基因C末端2625bp处所获得的BEV其传代稳定性得到显著增强(图8)。具体表现为Tn7/GP64和REP/GP64的百分比在P2-P7维持恒定不下降。Tn7/GP64百分比P10(33.00％)与P2(62.08％)比，下降约1.9倍。而对照组9KC-313 Tn7/GP64的百分比在P4时就从P2的66.92％下降至27.66％，下降2.4倍。Tn7/GP64的比值反映的是ITR-GOI的稳定性。rAAV的包装率结果(图9、图10)进一步说明Ac-141-175 P2-P9代的BEV均能有1E+5 VG/cell的包装率，而对照9KC-313的不同代次BEV的细胞包装率下降迅速，从P3的4.94E+5 VG/cell下降至P4的1.73E+5VG/cell、P5的2.62E+4 VG/cell。
将本实施例制备的P2、P3、P4、P5……P10代次的BEV，以相同的MOI分别感染200mlsf9细胞，感染3天后监测细胞活性，活性低于50％，分别离心收获细胞沉淀和上清，将收获的细胞沉淀和上清分别纯化，细胞反复冻融3次裂解，5000rpm离心10min收集上清，在上清中加入核酸酶(Benzonase)37℃水浴处理60min，处理后5000rpm离心10min。收集的细胞裂解液和收集的上清液PEG沉淀重悬后用碘克沙醇密度梯度离心分离纯化(方法参考Aslanidi等，2009，Proc.NatlAcad.Sci.USA,206:5059-5064)。最终纯化的成品病毒全部用185ul PBS重悬，取10ul各代次纯化出的成品病毒跑SDS-PAGE胶，银染。结果如图12所示。
从图12可以看出，不同代次的BEV(P2-P10)在进行rAAV病毒包装时，P2-P9的BEV种毒稳定性较好，产生的rAAV总量下降较少。这与图10的结果保持一致。
因此，将ITR-GOI放置在杆状病毒必须基因AC135位置旁边提高了BEV的传代稳定性和稳定生产rAAV的能力，对rAAV的大规模生产有显著意义。
实施例3
将rAAV的Rep/Cap表达框固定放在杆状病毒的必需基因GP64基因C末端235bp处，继续测试其它杆状病毒必须基因座位，利用DH10Bac-△CC-Cap-Rep(GP64)-ITR-GOI(38K)制备rAAV。
参考实施例2.1中的步骤，用引物(HAL(38K)-F：tcggcgaacgtgttttgtcccaa和HAL(38K)-R：ctattcattgtcgctgtcttct)扩增上游同源臂HAL(38K)(SEQ ID No.10)和引物(HAR(38K)-F：agtttatatttttatttaata和HAR(38K)-R：gatcatgtagcacactcgatgcga)扩增下游同源臂HAR(38K)(SEQ ID No.11)，构建包含ITR核心表达元件(ITR-GOI)的靶向杆状病毒基因组必需基因38K基因的同源重组载体。然后参照实施例1中1.1.4步骤将ITR-GOI插入到2.2.1中得到的重组杆状病毒基因组中的必需基因38K基因的C末端126bp处，我们将筛选出来的阳性单克隆菌株命名为DH10Bac-△CC-Cap-Rep(GP64)-ITR-GOI(38K)。抽提杆粒，得到包含生产rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，编号Ac-141-163。
按照实施例2中的方法进行BEV传代稳定性的测试，测试数据如图13、图14和图15所示。
图13示意Ac-141-163 BEV不同代次的稳定性。rAAV的ITR-GOI表达框放在杆状病毒必须基因38K的C端126bp处，杆粒编号Ac-141-163。Q-PCR检测P2-P10代次的BEV稳定性。从柱形图不同代次的BEV稳定性结果分析，稳定性较好。
图14示意Ac-141-163不同代次的BEV包装rAAV的产率。Q-PCR检测P2-P10代次的rAAV的细胞包装率和上清滴度，从图上可以看出，P5代包装率开始下降，但是P10代的包装率仍然维持在较高水平1.21E+5vg/cell，上清滴度达到1.84E+11vg/ml。
图15为Ac-141-163 P2-P10代BEV包装rAAV的SDS-PAGE银染图。图中的3条带分别为AAV病毒的VP1、VP2、VP3，大小分别为87KDa、72KDa、62KDa。P2代BEV种毒生产出的rAAV标注为P3，依次类推。
从以上结果可以看出，相较于实施例2中的对照病毒9KC-313，Ac-141-163不同代次的BEV的Tn7/GP64和Rep/GP64的百分比均非常稳定。其rAAV的包装率和上清滴度都保持在较高的水平。P2-P4的包装率保持在1.00E+6 VG/cell。虽然在P5时包装率从P4的9.06E+5VG/cell下降至1.77E+5 VG/cell。随后包装率一直稳定保持直至P10包装率1.21E+5 VG/cell。而对照组9KC-313 P5的包装率已经下降至2.62E+4 VG/cell。rAAV上清滴度也维持在较高的水平，最高时达到5.86E+11 VG/mL(P6)，大大提高了总rAAV的量。
将本实施例制备的P2、P3、P4、P5……P10代次的BEV，以相同的MOI分别感染200mlsf9细胞，感染3天后监测细胞活性，活性低于50％，分别离心收获细胞沉淀和上清，将收获的细胞沉淀和上清分别纯化，细胞反复冻融3次裂解，5000rpm离心10min收集上清，在上清中加入核酸酶(Benzonase)37℃水浴处理60min，处理后5000rpm离心10min。收集的细胞裂解液和收集的上清液PEG沉淀重悬后用碘克沙醇密度梯度离心分离纯化(方法参考Aslanidi等，2009，Proc.NatlAcad.Sci.USA,206:5059-5064)。最终纯化的成品病毒全部用185ul PBS重悬，其中P10的体积是185ul*1.5＝277.5ul，P9在纯化过程中样品出了一点状况，最终总病毒量减少。取10ul各代次纯化出的成品病毒跑SDS-PAGE胶，银染。结果如图15所示。
从图15可以看出，排除纯化过程中出状况的P9和实际体积是其它病毒1.5倍的P10，不同代次的BEV(P2-P10)在进行rAAV病毒包装时，BEV各代次种毒稳定性较好，产生的rAAV总量下降较少。进一步说明将rep和cap表达框放在BEV必需基因GP64的C端，ITR-GOI放在BEV必需基因38K的C端能够极大的稳定rAAV的生产。
实施例4
将rAAV的Rep/Cap表达框固定放在杆状病毒的必需基因GP64基因C末端235bp处，继续测试其它杆状病毒必须基因座位，利用DH10Bac-△CC-Cap-Rep(GP64)-ITR-GOI(IE1)制备rAAV。
参考实施例2.1中的步骤，用引物(HAL(IE1)-F：atcatgacaatattgcgagt和HAL(IE1)-R：ttaattaaattcgaatt)扩增上游同源臂HAL(IE1)(SEQ ID No.12)和引物(HAR(IE1)-F：ttatacatatattttgaat和HAR(IE1)-R：ccgacccagattcgcctcaat)扩增下游同源臂HAR(IE1)(SEQ ID No.13)，构建包含ITR核心表达元件(ITR-GOI)的靶向杆状病毒基因组必需基因IE1基因的同源重组载体。然后参照实施例1中1.1.4步骤将ITR-GOI插入到2.2.1中得到的重组杆状病毒基因组中的必需基因IE1基因的C末端1237bp处，我们将筛选出来的阳性单克隆菌株命名为DH10Bac-△CC-Cap-Rep(GP64)-ITR-GOI(IE1)。抽提杆粒，得到包含生产rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，编号Ac-141-162。
按照实施例2中的方法进行BEV传代稳定性的测试，测试数据如图16、图17和图18所示。
图16Ac-141-162 BEV不同代次的稳定性。rAAV的ITR-GOI表达框放在杆状病毒必须基因IE1的C末端1237bp处，杆粒编号Ac-141-162。Q-PCR检测P2-P10代次的BEV稳定性。从柱形图不同代次的BEV稳定性结果分析，稳定性和对照病毒9KC-313差不多。图17为Ac-141-162不同代次的BEV包装rAAV的产率。Q-PCR检测P2-P10代次的rAAV的细胞包装率和上清滴度，从图上可以看出，包装率逐代下降，稳定性较差。
从以上结果可以看出，相较于实施例1中的对照病毒9KC-142A，Ac-141-162不同代次的BEV的Rep/GP64的百分比要稳定。与对照病毒9KC-313类似，Ac-141-162不同代次的BEV的Tn7/GP64百分比下降较快，稳定性并没有实施例1、2、3中的AC20-313、Ac-141-175、Ac-141-163好。Tn/GP64从P2的165.52％下降至P5的25.18％，其rAAV的包装率和上清滴度也表现出逐步下降的趋势。其细胞包装率和上清的滴度水平和对照病毒9KC-313基本保持一致，略高一点，见图18。图18为Ac-141-162vs 9kc-313包装率。从图上可以看出，Ac-141-162各代次的包装率略高于对照病毒9kc-313。
对比例1
将rAAV的Rep/Cap表达框固定放在杆状病毒的必需基因GP64基因C末端235bp处，继续测试其它杆状病毒必须基因座位，利用DH10Bac-△CC-Cap-Rep(GP64)-ITR-GOI(GP41)制备rAAV。
参考实施例2.1中的步骤，用引物(HAL(GP41)-F：ttttgtgaacgggctcgcta和HAL(GP41)-R：tcatggcgacgactctgtaca)扩增上游同源臂HAL(GP41)(SEQ ID No.14)和引物(HAR(GP41)-F：ttatgcagtgcgccctttcgt和HAR(GP41)-R：tgccggcggcggcgattacta)扩增下游同源臂HAR(GP41)(SEQ ID No.15)，构建包含ITR核心表达元件(ITR-GOI)的靶向杆状病毒基因组必需基因GP41基因的同源重组载体。然后参照实施例1中1.1.4步骤将ITR-GOI插入到2.2.1中得到的重组杆状病毒基因组中的必需基因GP41基因的C末端115bp处，我们将筛选出来的阳性单克隆菌株命名为DH10Bac-△CC-Cap-Rep(GP64)-ITR-GOI(GP41)。抽提杆粒，得到包含生产rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，编号Ac-141-160。
该实施例中参照实施例2中的方法进行BEV的拯救和传代，同期一起拯救和传代的有编号Ac-141-160和Ac-141-162。将2个编号的病毒同时扩到P2代后，用P2的BEV种毒接种250mL sf9细胞，感染3天后在计数细胞活性，活性低于50％，分别收获上清和细胞，将细胞反复冻融裂解，采用碘克沙醇密度梯度离心法纯化至纯品AAV，检测收获时上清和细胞中rAAV病毒的滴度，以及最终纯化的rAAV的滴度和纯度。纯度用SDS-PAGE银染的方法检测。
表1
Figure BDA0002813533160000181
图19为Ac-141-160(rAAV的ITR-GOI表达框放在杆状病毒必须基因GP41的C端)和Ac-141-162 BEV生产的rAAV SDS-PAGE银染图。在Q-PCR检测2种病毒滴度一致的情况下，Ac-141-160的VP3较粗，说明其空壳率较高。结合表1和图19的结果，可以看出Ac-141-162P3产生的成品病毒滴度为3.15E+13 VG/mL，Ac-141-160 P3产生的成品病毒滴度为2.21E+13 VG/mL，但是SDS-PAGE中Ac-141-160的VP3的条带明显要粗一些，说明Ac-141-160生产的rAAV的空壳率高于Ac-141-162。分析原因，可能是由于将ITR-GOI放在必需基因GP41基因的C末端(相当于放在了Ac79基因的N端起始密码子前面)，可能影响了Ac79基因的表达，进而影响了杆状病毒的增殖。因此将ITR-GOI表达框放在必需基因GP41的C端可能不是最优的选择。
对比例2
将rAAV的Rep/Cap表达框固定放在杆状病毒的必需基因GP64基因C末端235bp处，继续测试其它杆状病毒必须基因座位，利用DH10Bac-△CC-Cap-Rep(GP64)-ITR-GOI(Ac153)制备rAAV。
参考实施例2.1中的步骤，用引物(HAL(Ac153)-F：tgacataaatatggagaatcaggca和HAL(Ac153)-R：ttaattttcaaacccaaaattaacagt)扩增上游同源臂HAL(Ac153)(SEQ IDNo.16)和引物(HAR(Ac153)-F：tgtgatatgaaatgtatata和HAR(Ac153)-R：atgcaagaattgtatgttgct)扩增下游同源臂HAR(Ac153)(SEQ ID No.17)，构建包含ITR核心表达元件(ITR-GOI)的靶向杆状病毒基因组必需基因Ac153基因的同源重组载体。然后参照实施例1中1.1.4步骤将ITR-GOI插入到2.2.1中得到的重组杆状病毒基因组中的必需基因Ac153基因的C末端1368bp处，我们将筛选出来的阳性单克隆菌株命名为DH10Bac-△CC-Cap-Rep(GP64)-ITR-GOI(Ac153)。抽提杆粒，得到包含生产rAAV衣壳蛋白基因表达框(Cap)、Rep基因表达框(Rep)和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，编号Ac-141-174。
按照实施例2中的方法进行BEV传代稳定性的测试，只进行了P1-P3的测试，测试数据如下。
表2
Figure BDA0002813533160000191
与实施例6类似，Ac-141-174病毒的细胞包装率较低，且Tn7/GP64百分比非常低，说明ITR-GOI表达框放在必需基因Ac153旁边并不合适。分析原因，可能是由于将ITR-GOI放在必需基因Ac153基因的C末端(相当于放在了Ac154基因的N端起始密码子前面)，可能影响了Ac154基因的表达，进而影响了杆状病毒的增殖。因此将ITR-GOI表达框放在必需基因Ac154基因的C端可能不是最优的选择。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉枢密脑科学技术有限公司
<120> 一种重组腺相关病毒的制备方法、系统及重组杆粒
<141> 2021-02-26
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1035
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgggaatta gccatggtcc atatgaatat cctccttagt tcctattccg aagttcctat 60
tctctagaaa gtataggaac ttcggcgcgc ctacctgtga cggaagatca cttcgcagaa 120
taaataaatc ctggtgtccc tgttgatacc gggaagccct gggccaactt ttggcgaaaa 180
tgagacgttg atcggcacgt aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat aagatcacta 240
ccgggcgtat tttttgagtt gtcgagattt tcaggagcta aggaagctaa aatggagaaa 300
aaaatcactg gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga acattttgag 360
gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga tattacggcc 420
tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat tcacattctt 480
gcccgcctga tgaatgctca tccggaatta cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg 540
atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga aacgttttca 600
tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat 660
gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt 720
ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt ggccaatatg 780
gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg 840
ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtttgtg atggcttcca tgtcggcaga 900
atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta aggcgcgcca 960
tttaaatgaa gttcctattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga acttcgaagc 1020
agctccagcc tacac 1035
<210> 2
<211> 928
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgggaatta gccatggtcc atatgaatat cctccttagt tcctattccg aagttcctat 60
tctctagaaa gtataggaac ttcggcgcgc ctacctgtga cggaagatca cttcgcagaa 120
taaataaatc ctggtgtccc tgttgatacc gggaagccct gggccaactt ttggcgaaaa 180
tgagacgttg atcggcacgt aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat aagatcacta 240
ccgggcgtat tttttgagtt gtcgagattt tcaggagcta aggaagctaa aatgttacgc 300
agcagcaacg atgttacgca gcagggcagt cgccctaaaa caaagttagg tggctcaagt 360
atgggcatca ttcgcacatg taggctcggc cctgaccaag tcaaatccat gcgggctgct 420
cttgatcttt tcggtcgtga gttcggagac gtagccacct actcccaaca tcagccggac 480
tccgattacc tcgggaactt gctccgtagt aagacattca tcgcgcttgc tgccttcgac 540
caagaagcgg ttgttggcgc tctcgcggct tacgttctgc ccaggtttga gcagccgcgt 600
agtgagatct atatctatga tctcgcagtc tccggcgagc accggaggca gggcattgcc 660
accgcgctca tcaatctcct caagcatgag gccaacgcgc ttggtgctta tgtgatctac 720
gtgcaagcag attacggtga cgatcccgca gtggctctct atacaaagtt gggcatacgg 780
gaagaagtga tgcactttga tatcgaccca agtaccgcca cctaagtggc agggcggggc 840
gtaaggcgcg ccatttaaat gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata 900
ggaacttcga agcagctcca gcctacac 928
<210> 3
<211> 2217
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gccgccctgg ctgccgacgg ttatctaccc gattggctcg aggacaacct tagtgaagga 60
attcgcgagt ggtgggcttt gaaacctgga gcccctcaac ccaaggcaaa tcaacaacat 120
caagacaacg ctcgaggtct tgtgcttccg ggttacaaat accttggacc cggcaacgga 180
ctcgacaagg gggagccggt caacgcagca gacgcggcgg ccctcgagca cgacaaggcc 240
tacgaccagc agctcaaggc cggagacaac ccgtacctca agtacaacca cgccgacgcc 300
gagttccagg agcggctcaa agaagatacg tcttttgggg gcaacctcgg gcgagcagtc 360
ttccaggcca aaaagaggct tcttgaacct cttggtctgg ttgaggaagc ggctaagacg 420
gctcctggaa agaagaggcc tgtagagcag tctcctcagg aaccggactc ctccgcgggt 480
attggcaaat cgggtgcaca gcccgctaaa aagagactca atttcggtca gactggcgac 540
acagagtcag tcccagaccc tcaaccaatc ggagaacctc ccgcagcccc ctcaggtgtg 600
ggatctctta caatggcttc aggtggtggc gcaccagtgg cagacaataa cgaaggtgcc 660
gatggagtgg gtagttcctc gggaaattgg cattgcgatt cccaatggct gggggacaga 720
gtcatcacca ccagcacccg aacctgggcc ctgcccacct acaacaatca cctctacaag 780
caaatctcca acagcacatc tggaggatct tcaaatgaca acgcctactt cggctacagc 840
accccctggg ggtattttga cttcaacaga ttccactgcc acttctcacc acgtgactgg 900
cagcgactca tcaacaacaa ctggggattc cggcctaagc gactcaactt caagctcttc 960
aacattcagg tcaaagaggt tacggacaac aatggagtca agaccatcgc caataacctt 1020
accagcacgg tccaggtctt cacggactca gactatcagc tcccgtacgt gctcgggtcg 1080
gctcacgagg gctgcctccc gccgttccca gcggacgttt tcatgattcc tcagtacggg 1140
tatctgacgc ttaatgatgg aagccaggcc gtgggtcgtt cgtcctttta ctgcctggaa 1200
tatttcccgt cgcaaatgct aagaacgggt aacaacttcc agttcagcta cgagtttgag 1260
aacgtacctt tccatagcag ctacgctcac agccaaagcc tggaccgact aatgaatcca 1320
ctcatcgacc aatacttgta ctatctctca aagactatta acggttctgg acagaatcaa 1380
caaacgctaa aattcagtgt ggccggaccc agcaacatgg ctgtccaggg aagaaactac 1440
atacctggac ccagctaccg acaacaacgt gtctcaacca ctgtgactca aaacaacaac 1500
agcgaatttg cttggcctgg agcttcttct tgggctctca atggacgtaa tagcttgatg 1560
aatcctggac ctgctatggc cagccacaaa gaaggagagg accgtttctt tcctttgtct 1620
ggatctttaa tttttggcaa acaaggaact ggaagagaca acgtggatgc ggacaaagtc 1680
atgataacca acgaagaaga aattaaaact actaacccgg tagcaacgga gtcctatgga 1740
caagtggcca caaaccacca gagtgcccaa gcacaggcgc agaccggctg ggttcaaaac 1800
caaggaatac ttccgggtat ggtttggcag gacagagatg tgtacctgca aggacccatt 1860
tgggccaaaa ttcctcacac ggacggcaac tttcaccctt ctccgctgat gggagggttt 1920
ggaatgaagc acccgcctcc tcagatcctc atcaaaaaca cacctgtacc tgcggatcct 1980
ccaacggcct tcaacaagga caagctgaac tctttcatca cccagtattc tactggccaa 2040
gtcagcgtgg agatcgagtg ggagctgcag aaggaaaaca gcaagcgctg gaacccggag 2100
atccagtaca cttccaacta ttacaagtct aataatgttg aatttgctgt taatactgaa 2160
ggtgtatata gtgaaccccg ccccattggc accagatacc tgactcgtaa tctgtaa 2217
<210> 4
<211> 1872
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gccgccctgg cggggtttta cgagattgtg attaaggtcc ccagcgacct tgacgggcat 60
ctgcccggca tttctgacag ctttgtgaac tgggtggccg agaaggagtg ggagttgccg 120
ccagattctg acttggatct gaatctgatt gagcaggcac ccctgaccgt ggccgagaag 180
ctgcagcgcg actttctgac ggagtggcgc cgtgtgagta aggccccgga ggcccttttc 240
tttgtgcaat ttgagaaggg agagagctac ttccacttac acgtgctcgt ggaaaccacc 300
ggggtgaaat ccttagtttt gggacgtttc ctgagtcaga ttcgcgaaaa actgattcag 360
agaatttacc gcgggatcga gccgactttg ccaaactggt tcgcggtcac aaagaccaga 420
aacggcgccg gaggcgggaa caaggtggtg gacgagtgct acatccccaa ttacttgctc 480
cccaaaaccc agcctgagct ccagtgggcg tggactaatt tagaacagta tttaagcgcc 540
tgtttgaatc tcacggagcg taaacggttg gtggcgcagc atctgacgca cgtgtcgcag 600
acgcaggagc agaacaaaga gaatcagaat cccaattctg acgcgccggt gatcagatca 660
aaaacttcag ccaggtacat ggagctggtc gggtggctcg tggacaaggg gattacctcg 720
gagaagcagt ggatccagga ggaccaggcc tcatacatct ccttcaatgc ggcctccaac 780
tcgcggtccc aaatcaaggc tgccttggac aatgcgggaa agattatgag cctgactaaa 840
accgcccccg actacctggt gggccagcag cccgtggagg acatttccag caatcggatt 900
tataaaattt tggaactaaa cgggtacgat ccccaatatg cggcttccgt ctttctggga 960
tgggccacga aaaagttcgg caagaggaac accatctggc tgtttgggcc tgcaactacc 1020
gggaagacca acatcgcgga ggccatagcc cacactgtgc ccttctacgg gtgcgtaaac 1080
tggaccaatg agaactttcc cttcaacgac tgtgtcgaca agatggtgat ctggtgggag 1140
gaggggaaga tgaccgccaa ggtcgtggag tcggccaaag ccattctcgg aggaagcaag 1200
gtgcgcgtgg accagaaatg caagtcctcg gcccagatag acccgactcc cgtgatcgtc 1260
acctccaaca ccaacatgtg cgccgtgatt gacgggaact caacgacctt cgaacaccag 1320
cagccgttgc aagaccggat gttcaaattt gaactcaccc gccgtctgga tcatgacttt 1380
gggaaggtca ccaagcagga agtcaaagac tttttccggt gggcaaagga tcacgtggtt 1440
gaggtggagc atgaattcta cgtcaaaaag ggtggagcca agaaaagacc cgcccccagt 1500
gacgcagata taagtgagcc caaacgggtg cgcgagtcag ttgcgcagcc atcgacgtca 1560
gacgcggaag cttcgatcaa ctacgcagac aggtaccaaa acaaatgttc tcgtcacgtg 1620
ggcatgaatc tgatgctgtt tccctgcaga caatgcgaga gaatgaatca gaattcaaat 1680
atctgcttca ctcacggaca gaaagactgt ttagagtgct ttcccgtgtc agaatctcaa 1740
cccgtttctg tcgtcaaaaa ggcgtatcag aaactgtgct acattcatca tatcatggga 1800
aaggtgccag acgcttgcac tgcctgcgat ctggtcaatg tggatttgga tgactgcatc 1860
tttgaacaat aa 1872
<210> 5
<211> 141
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc t 141
<210> 6
<211> 370
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agttattgtg ccgtttgctc acgaaattaa cgacacggga ctttacgagt acgacgtcgt 60
agcttacgtg gacagtgtgc agtttgatgg cgaacaattt gaagagtttg tgcagagttt 120
aatattgccg tcgtcgttca aaaattcgga aaaggtttta tattacaacg aagcgtcgaa 180
aaacaaaagc atgatctaca aggctttaga gtttactaca gaatcgagct ggggcaaatc 240
cgaaaagtat aattggaaaa ttttttgtaa cggttttatt tatgataaaa aatcaaaagt 300
gttgtatgtt aaattgcaca atgtaactag tgcactcaac aaaaatgtaa tattaaacac 360
aattaaataa 370
<210> 7
<211> 386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tcatttgttt ttaaaattga actggcttta cgagtagaat tctacgcgta aaacacaatc 60
aagtatgagt cataatctga tgtcatgttt tgtacacggc tcataaccga actggcttta 120
cgagtagaat tctacttgta atgcacgatc agtggatgat gtcatttgtt tttcaaatcg 180
agatgatgtc atgttttgca cacggctcat aaactcgctt tacgagtaga attctacgtg 240
taacgcacga tcgattgatg agtcatttgt tttgcaatat gatatcatac aatatgactc 300
atttgttttt caaaaccgaa cttgatttac gggtagaatt ctacttgtaa agcacaatca 360
aaaagatgat gtcatttgtt tttcaa 386
<210> 8
<211> 401
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ggtaacggcc aattcaacgt gacgatgcgc acgtcctcgg gtatgcattt gttaaaaaac 60
acacagctcg ctttaccaaa cgaaagcaaa ggtactaaat atggcgccat tggctgattt 120
gttattccaa gataattaca aataaactga tccgtcgtgg ggtgataact ggcaggtgtc 180
agctttaaat aatcttcaac gttgttgtcg cgcaaaagtc tgcattttac acgcgttgtt 240
aatcccacga cttttgcatg taaaatcgga tccaaatact gcagaatcgt gtctataatt 300
tctaatggta aacgtatgcg ttttgctcgt gggcgctttg taacgctcga catcctaata 360
acaactaaca caaaactaaa atgatactca atatattgct t 401
<210> 9
<211> 406
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tctcaacaca ctcgctattt ggaacataat catatcgtct cagtagctca aggtagagcg 60
tagcgctctg gatcgtatag atcttgctaa ggttgtgagt tcaagtctcg cctgagatat 120
taaaaaactt tgtaatttta aaaattttat tttataatat acaattaaaa actatacaat 180
tttttattat tacattaata atgatacaat ttttattatt acatttaata ttgtctatta 240
cggtttctaa tcatacagta caaaaataaa atcacaatta atataattac aaagttaact 300
acatgaccaa acatgaacga agtcaattta gcggccaatt cgccttcagc catggaagtg 360
atgtcgctca gactggtgcc gacgccgcca aacttggtgt tctcca 406
<210> 10
<211> 409
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tcggcgaacg tgttttgtcc caacgagttt agcgtgacca cgttcacgca atccactatt 60
aaaacgatca acgagacggg aatatatgcc accgcatgca cgccggtcag cagcttgacg 120
ctaattgaac attttgcaac attaaaaaat aacgtgcccg atcacacgct cgttctcgat 180
gtggtcgacc aacagattca gttttcaata ctcgacatta tcaattattt gatttacaat 240
ggctacgtgg atttgttggc cgaataacgc gtatatagac gcttgtacgt tcatcgtagt 300
aatcatttta atacatttga ttgaactaaa catacatctg caatgggtga aagagtcact 360
aaattttgca atggaaaacg gcgataaaga agacagcgac aatgaatag 409
<210> 11
<211> 430
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
agtttatatt tttatttaat aaaatattgt tcgtaatcca taatgttttg tattatttca 60
ttgtgataat gttcccaatc ttgcacgggg gtggggcatc gtttgacttt gacgtagaaa 120
tcgtacgcgt agttattagt tggcagatcg tcgacaagtg tgatcgactt gaaaaagttt 180
acatttttat cgctcaaata tttaattaca atttttggcg atttgggtat attgttgtcg 240
gatcgatgat tgtgaatgtc aaaaacaaat ttattttcaa tgaaacgctt ttttaaattg 300
taatctacaa tagcgttgtg tgaattttga actaaatcag agcgttcttc ttgaacggtg 360
gaaccttcgc tgataatgat atcaaaatag ccttccaaat cgacgtctcg catcgagtgt 420
gctacatgat 430
<210> 12
<211> 428
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atcatgacaa tattgcgagt aataataacg cagaaaattt aaaaaaggtt aagaaggagg 60
acggcagcat gcacattgtc gaacagtatt tgactcagaa tgtagataat gtaaagggtc 120
acaattttat agtattgtct ttcaaaaacg aggagcgatt gactatagct aagaaaaaca 180
aagagtttta ttggatttct ggcgaaatta aagatgtaga cgttagtcaa gtaattcaaa 240
aatataatag atttaagcat cacatgtttg taatcggtaa agtgaaccga agagagagca 300
ctacattgca caataatttg ttaaaattgt tagctttaat attacagggt ctggttccgt 360
tgtccgacgc tataacgttt gcggaacaaa aactaaattg taaatataaa aaattcgaat 420
ttaattaa 428
<210> 13
<211> 414
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ttatacatat attttgaatt taattaatta tacatatatt ttatattatt tttgtctttt 60
attatcgagg ggccgttgtt ggtgtggggt tttgcataga aataacaatg ggagttggcg 120
acgttgctgc gccaacacca cctcctcctc ctcctttcat catgtatctg tagataaaat 180
aaaatattaa acctaaaaac aagaccgcgc ctatcaacaa aatgataggc attaacttgc 240
cgctgacgct gtcactaacg ttggacgatt tgccgactaa accttcatcg cccagtaacc 300
aatctagacc caagtcgcca actaaatcac caaacgagta aggttcgatg cacatgagtg 360
tttggcccgc aggaagatcg ctaatatcta cgtattgagg cgaatctggg tcgg 414
<210> 14
<211> 446
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ttttgtgaac gggctcgcta aattgttgcg gttcgctggc agtatcgtcg ttgagcgcca 60
atttcaacgg gatgtattcc accttttcgt ggttgcccaa ccgatagtag ggcacgtcca 120
aattcatgtt tacaacttat ttgctaacag gaatttatgc aacaaaagtg gtttggcttt 180
gatgagacgc aatttgaaat acttgctgca tttacgctta agattgtatt ccatgcgggc 240
ggcggtgttg tagtcgtacg cgctcgcgct gtgatacacg agccgtaaat tggttgcgtt 300
gcgcaaacac ttggcgcctt gtttgttcga atgctgtttt atgcgtctgt taagattgct 360
cgtgatgccc gtgtacaatt ttccattgtc ttgccgcaga atgtacacgc accacacctt 420
gttggtgtac agagtcgtcg ccatga 446
<210> 15
<211> 394
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ttatgcagtg cgccctttcg tgttcggccg agtggcgtta ggcgcagccg cggcaataat 60
cgcgttggcg tccttgttgt aatttatttg ttgaaaaata aaacgtctta gagtttcgtt 120
ttggaacgcc aattcggtca agctctcctg gcaagcgctt ttggtcaaat gagcggccgg 180
cgaattgacc gcgttggcgg ccgacgttaa gaaggtggcg ttctggaaca tgctgggctg 240
cttgccggct cgcgtcgcca gctcggccat gtaattgaat atgttggcag acgcagatag 300
cggcgccaaa aacgcaacgt tctcttttaa actcatgact cgcgccctgt ttttttcgtt 360
cagcacgtag tggtagtaat cgccgccgcc ggca 394
<210> 16
<211> 385
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
tgacataaat atggagaatc aggcaaagat agctgctttg gaagctgaat tggaagaaga 60
aaaaaatcac agtgatcaag tagcttctga aaaccgacag ctgatagaag aaaatactcg 120
tctcaatgaa cagattcaag agttgcagca tcaggtgagg acattggtgc cgcaacgtgg 180
cattacggtt aatcagcaaa ttggccgtga cgacagtgcg ccagccgagc tgaacgagcg 240
ttttcgctca cttgtctatt cgactatttc agagctgttt attgaaaatc gcgttcatag 300
tattcaaaat tatgtttatg ccggaacttc tgctgctagt tcatgtgatg taaatgttac 360
tgttaatttt gggtttgaaa attaa 385
<210> 17
<211> 332
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
tgtgatatga aatgtatata taaaaatgat ggaataaata ataaacattt ttatactttt 60
tatgtttttt ttatttcatg tgattaagaa acttttaaga tggatagtag taattgtatt 120
aaaatagatg taaaatacga tatgccgtta cattatcaat gtgacaataa cgcagataaa 180
gacgttgtaa atgcgtatga cactatcgat gttgacccca acaaaagatt tataattaat 240
cataatcacg aacaacaaca agtcaatgaa acaaataaac aagttgtcga taaaacattc 300
ataaatgaca cagcaacata caattcttgc at 332

Claims (10)

1.一种重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建包含生产重组腺相关病毒的重组杆状病毒基因组的重组杆粒；所述重组杆状病毒基因组中包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件，所述必需功能元件包括Cap基因、Rep基因以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI；
(2)将步骤(1)获得的包含生产重组腺相关病毒的重组杆状病毒基因组的重组杆粒转染到宿主细胞系培养；
其中，所述必需功能元件中的至少一个被插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因基因座的N末端或C末端。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述必需功能元件中的至少一个被插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因基因座的N末端或C末端，是指所述必需功能元件中的至少一个位于所述重组杆状病毒基因组必需基因表达框的3kb范围内。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述必需功能元件中的至少一个被插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因基因座的N末端或C末端，是指所述必需功能元件中的至少一个位于所述重组杆状病毒基因组必需基因表达框的1.5kb范围内。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体为：构建包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件的同源重组载体；或者构建包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件的同源重组载体和穿梭质粒，利用同源重组的方法将生产所述重组腺相关病毒的三个必需功能元件整合到同一个包含重组杆状病毒基因组的重组杆粒中，获得包含生产所述重组腺相关病毒必需功能元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒；
其中，所述同源重组载体包括靶向杆状病毒必需基因，且该载体中携带Cap基因表达框、Rep基因表达框和ITR-GOI中的至少一种。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其余必需功能元件被插入到所述重组杆状病毒基因组非必需基因的基因座中。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述杆状病毒基因组必需基因的基因座选自Ac6、Ac9、Ac10、Ac17、Ac66、Ac109、Ac139、Ac135、Ac98、Ac147和Ac128。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括如下子步骤：
(1-1)构建包含Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI的一个或多个同源重组载体；
(1-2)利用步骤(1-1)获得的一个或多个同源重组载体，将Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI整合，使其插入到重组杆状病毒基因组一个或多个必需基因基因座的N末端或C末端，获得包含生产所述重组腺相关病毒所有必需功能元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括如下步骤：
(1-1)构建包含所述必需功能元件中的一个或两个元件的同源重组载体；然后通过Red同源重组将该同源重组载体中的AAV必需功能元件插入到杆状病毒基因组一个或两个必需基因基因座的N末端或C末端；
(1-2)构建包含其余必需功能元件的穿梭质粒；
(1-3)通过穿梭质粒介导的Tn7重组将Cap基因表达框、Rep基因表达框以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI整合在一个杆状病毒基因组中，获得包含生产所述重组腺相关病毒所有必需功能元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒。
9.一种用于制备重组腺相关病毒的重组杆粒，其特征在于，该重组杆粒包括重组杆状病毒基因组，该重组杆状病毒基因组中包含生产所述重组腺相关病毒的必需功能元件；所述必需功能元件包括Cap基因、Rep基因以及带有外源目的基因的核心表达元件ITR-GOI；
其中，所述必需功能元件中的至少一个被插入到所述重组杆状病毒基因组必需基因基因座的N末端或C末端。
10.一种重组腺相关病毒的制备系统，其特征在于，包含如权利要求9所述的重组杆粒。
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