CN112469281B - 有害生物防治组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文披露了在用于降低有害生物(例如，农业有害生物)的适应度和/或增加植物的适应度的方法中可用的有害生物防治组合物，例如生物型杀有害生物剂组合物或生物驱避剂组合物，这些有害生物防治组合物包含多个植物信使包(例如，包括植物细胞外囊泡(EV)，或其节段、部分或提取物)。

Description

有害生物防治组合物及其用途
背景技术
人类环境中普遍存在植物有害生物，包括植物病原体(例如，细菌或真菌)；无脊椎动物有害生物(例如，昆虫、软体动物和线虫)；以及杂草。尽管已使用多种手段来试图防治这些有害生物的侵染，但对安全且有效的有害生物防治策略的需求正在增加。因此，本领域需要防治植物有害生物的新方法和组合物。
发明内容
本文披露了在用于降低有害生物(例如，农业有害生物)的适应度和/或增加植物的适应度的方法中可用的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物，其包含多个植物信使包(plant messenger pack，PMP)。
在一个方面，本披露的特征在于一种有害生物防治组合物，其包含多个植物信使包(PMP)，其中该组合物被配制用于递送至植物，并且其中该组合物包含至少5％PMP，如通过wt/vol百分比PMP蛋白组成和/或百分比脂质组成(例如，通过测量荧光标记的脂质)测量的
在另一个方面，本披露的特征在于一种有害生物防治组合物，其包含多个PMP，其中该组合物被配制用于递送至植物有害生物，并且其中该组合物包含至少5％PMP。
在该有害生物防治组合物的一些实施例中，该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。在其他实施例中，该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。在一些实施例中，该组合物被配制用于递送至植物。在一些实施例中，该组合物被配制用于递送至植物有害生物。在一些实施例中，这些PMP稳定至少24小时、48小时、7天、或30天。在其他实施例中，这些PMP在至少24℃、20℃、或4℃的温度下稳定。在仍其他实施例中，该组合物中的多个PMP的浓度有效降低植物有害生物的适应度。
在另一个方面，本披露的特征在于一种有害生物防治组合物，其包含多个PMP，其中该组合物中的多个PMP的浓度有效降低植物有害生物的适应度。
在一些实施例中，该组合物被配制用于递送至植物。在一些实施例中，该组合物被配制用于递送至植物有害生物。在一些实施例中，该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。在一些实施例中，该PMP包含多种PMP蛋白，并且PMP的浓度是其中的PMP蛋白的浓度。在其他实施例中，该组合物中的多个PMP的浓度是至少0.01ng、0.1ng、1ng、2ng、3ng、4ng、5ng、10ng、50ng、100ng、250ng、500ng、750ng、1μg、10μg、50μg、100μg、或250μgPMP蛋白/ml。在又其他实施例中，该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。
在一些实施例中，该组合物中的多个PMP的浓度有效降低植物有害生物的适应度。在一些实施例中，该植物EV是经修饰的植物细胞外囊泡(EV)。在一些实施例中，该植物EV是植物外泌体或植物微囊泡。在一些实施例中，该多个PMP进一步包含有害生物驱避剂。
在另一个方面，本披露的特征在于一种有害生物防治组合物，其包含多个PMP，其中该多个PMP中的每一个包含异源杀有害生物剂，并且其中该组合物被配制用于递送至植物或植物有害生物。
在一些实施例中，该异源杀有害生物剂是除草剂、抗细菌剂、抗真菌剂、杀昆虫剂、杀软体动物剂、或杀线虫剂。
在一些实施例中，该除草剂是阿霉素。在其他实施例中，该除草剂是草铵膦、草甘膦、喔草酯、苯嗪草酮、吡草胺、二甲戊乐灵、氟噻草胺、吡氟酰草胺、异噁草酮、烟嘧磺隆、硝磺草酮、唑啉草酯、磺草酮、苄草丹、甲磺草胺、治草醚、喹草酸、野麦畏、特丁津、莠去津、乙氧氟草醚、敌草隆、氟乐灵、或绿麦隆。
在一些实施例中，该抗细菌剂是阿霉素。在一些实施例中，该抗细菌剂是抗生素。在一些实施例中，该抗生素是万古霉素。在其他实施例中，该抗生素是青霉素、头孢菌素、四环素、大环内酯、磺胺、万古霉素、多粘菌素、短杆菌肽、氯霉素、克林霉素、大观霉素、环丙沙星、异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇(ethambutol)、乙胺丁醇(myambutol)、或链霉素。在一些实施例中，该抗真菌剂是嘧菌酯、代森锰、丙硫菌唑、灭菌丹、戊唑醇、苯醚甲环唑、克菌丹、乙嘧酚磺酸酯、或乙膦酸-Al。在一些实施例中，该杀昆虫剂是氯化烟酰、新烟碱、氨基甲酸酯、有机磷酸酯、拟除虫菊酯、噁二嗪、多杀菌素、环二烯、有机氯、苯基吡唑(fiprole)、菌素(mectin)、双酰肼、苯甲酰脲、有机锡、吡咯、二硝基萜烯醇、METI、特窗酸、特特拉姆酸、或邻苯二甲酰胺。在一些实施例中，该异源杀有害生物剂是小分子、核酸、或多肽。在一些实施例中，该小分子是抗生素或次生代谢物。在一些实施例中，该核酸是抑制性RNA。在一些实施例中，该异源杀有害生物剂被该多个PMP中的每一个包封；包埋在该多个PMP中的每一个的表面上；或与该多个PMP中的每一个的表面缀合。
在一些实施例中，该多个PMP中的每一个进一步包含有害生物驱避剂。在一些实施例中，该多个PMP中的每一个进一步包含另外的异源杀有害生物剂。
在一些实施例中，该植物有害生物是细菌或真菌。在一些实施例中，该细菌是假单胞菌属(Pseudomonas)物种，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。在一些实施例中，该真菌是核盘霉属(Sclerotinia)物种、葡萄孢属(Botrytis)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰孢属(Fusarium)物种、或青霉属(Penicillium)物种。在其他实施例中，该植物有害生物是昆虫，例如蚜虫或鳞翅目昆虫；软体动物；或线虫，例如玉米根结线虫。
在一些实施例中，该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。在一些实施例中，这些PMP在4℃下稳定至少24小时、48小时、7天、或30天。在其他实施例中，这些PMP在至少20℃、24℃、或37℃的温度下稳定。
在一些实施例中，该组合物中的多个PMP的浓度有效降低植物有害生物的适应度。
在一些实施例中，该组合物中的多个PMP的浓度是至少0.01ng、0.1ng、1ng、2ng、3ng、4ng、5ng、10ng、50ng、100ng、250ng、500ng、750ng、1μg、10μg、50μg、100μg、或250μg PMP蛋白/mL。
在一些实施例中，该组合物包含农业上可接受的载体；被配制成稳定这些PMP；被配制成液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
在一些实施例中，该组合物包含至少5％PMP。
在另一个方面，本披露的特征在于一种有害生物防治组合物，其包含多个PMP，其中通过包括以下步骤的方法从植物中分离这些PMP：(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在该粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；(d)向该多个纯PMP负载有害生物防治剂；以及(e)将步骤(d)的这些PMP配制用于递送至植物或植物有害生物。
在另一个方面，本披露的特征在于一种植物，其包含本文提供的任何一种有害生物防治组合物。
在又另一个方面，本披露的特征在于一种植物有害生物，其包含本文提供的任何一种有害生物防治组合物。
在仍另一个方面，本披露的特征在于一种将有害生物防治组合物递送至植物的方法，其包括使该植物与本文描述的任何一种组合物接触。
并且在仍另一个方面，本披露的特征在于一种增加植物的适应度的方法，该方法包括向该植物递送本文描述的任何一种组合物，其中相对于未处理的植物，该方法增加该植物的适应度。
在一些实施例中，该植物具有由植物有害生物导致的侵染。在一些实施例中，相对于未处理的植物中的侵染，该方法降低该侵染。在一些实施例中，相对于未处理的植物中的侵染，该方法显著消除该侵染。
在一些实施例中，该植物易受由植物有害生物导致的侵染的影响。在一些实施例中，相对于未处理的植物中侵染的可能性，该方法降低该植物中侵染的可能性。
在一些实施例中，该植物有害生物是细菌，例如假单胞菌属物种；或真菌，例如核盘霉属物种、葡萄孢属物种、曲霉属物种、镰孢属物种、或青霉属物种。
在其他实施例中，该植物有害生物是昆虫，例如蚜虫或鳞翅目昆虫；软体动物；或线虫，例如玉米根结线虫。
在一些实施例中，将该有害生物防治组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送。
在另一个方面，本披露的特征在于一种将有害生物防治组合物递送至植物有害生物的方法，其包括使该植物有害生物与本文描述的任何一种组合物接触。
在另一个方面，本披露的特征在于一种降低植物有害生物的适应度的方法，该方法包括向该植物有害生物递送本文描述的任何一种组合物，其中相对于未处理的植物有害生物，该方法降低该植物有害生物的适应度。
在一些实施例中，该方法包括将该组合物递送至其中该植物有害生物生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境。在一些实施例中，将该组合物作为植物有害生物可食用组合物递送，以被该植物有害生物摄食。
在一些实施例中，该植物有害生物是细菌或真菌。在其他实施例中，该植物有害生物是昆虫，例如蚜虫或鳞翅目昆虫；软体动物；或线虫，例如玉米根结线虫。在一些实施例中，将该组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送。
在另一个方面，本披露的特征在于一种处理具有真菌感染的植物的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物。
在仍另一个方面，本披露的特征在于一种处理具有真菌感染的植物的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物，并且其中该多个PMP中的每一个包含抗真菌剂。在一些实施例中，该抗真菌剂是核酸，该核酸抑制引起该真菌感染的真菌中基因的表达。在一些实施例中，该基因是dcl1和/或dcl2。在一些实施例中，该真菌感染是由真菌引起的，该真菌属于核盘霉属物种，例如核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)；葡萄孢属物种，例如灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)；曲霉属物种；镰孢属物种；或青霉属物种。在一些实施例中，该组合物包含源自拟南芥属(Arabidopsis)的PMP。在一些实施例中，该方法降低或显著消除该真菌感染。
在另一个方面，本披露的特征在于一种处理具有细菌感染的植物的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物。
在仍另一个方面，本披露的特征在于一种处理具有细菌感染的植物的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物，并且其中该多个PMP中的每一个包含抗细菌剂。在一些实施例中，该抗细菌剂是阿霉素。在一些实施例中，该细菌感染是由细菌引起的，该细菌属于假单胞菌属物种，例如丁香假单胞菌。在一些实施例中，该组合物包含源自拟南芥属(Arabidopsis)的PMP。在一些实施例中，该方法降低或显著消除该细菌感染。
在另一个方面，本披露的特征在于一种降低昆虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该昆虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物。
在又另一个方面，本披露的特征在于一种降低昆虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该昆虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物，并且其中该多个PMP中的每一个包含杀昆虫剂。在一些实施例中，该杀昆虫剂是肽核酸。
在一些实施例中，该昆虫植物有害生物是蚜虫。在一些实施例中，该昆虫植物有害生物是鳞翅目昆虫，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。在一些实施例中，相对于未处理的昆虫植物有害生物，该方法降低该昆虫植物有害生物的适应度。
在另一个方面，本披露的特征在于一种降低线虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该线虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物。
在另一个方面，本披露的特征在于一种降低线虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该线虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物，并且其中该多个PMP中的每一个包含杀线虫剂。
在一些实施例中，该杀线虫剂是肽，例如Mi-NLP-15b。在一些实施例中，该线虫植物有害生物是玉米根结线虫。在一些实施例中，相对于未处理的线虫植物有害生物，该方法降低该线虫植物有害生物的适应度。
在另一个方面，本披露的特征在于一种降低杂草的适应度的方法，其中该方法包括向该杂草递送包含多个PMP的有害生物防治组合物。
在另一个方面，本披露的特征在于一种降低杂草的适应度的方法，其中该方法包括向该杂草递送包含多个PMP的有害生物防治组合物，并且其中该多个PMP中的每一个包含除草剂。在一些实施例中，相对于未处理的杂草，该方法降低该杂草的适应度。从以下具体实施方式和权利要求书中，本发明的其他特征和优点将显而易见。
定义
如本文所用，术语“有害生物防治组合物”是指包含多个植物信使(PMP)包的生物型杀有害生物剂或生物驱避剂组合物。该多个PMP中的每一个可以包含杀有害生物剂，例如异源杀有害生物剂。
如本文所用，术语“生物型杀有害生物剂组合物”是指包含多个植物信使(PMP)包的杀有害生物组合物。
如本文所用，术语“生物驱避剂组合物”是指包含多个植物信使(PMP)包的有害生物驱避剂组合物。
如本文所用，“递送”或“接触”是指向植物或植物有害生物应用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物，在其中该组合物有效改变该植物或植物有害生物的适应度的区域中直接在该植物或植物有害生物上或邻近该植物或植物有害生物。在其中使组合物与植物直接接触的方法中，可以使组合物与整个植物或仅与植物的部分接触。
如本文所用，“降低植物有害生物的适应度”是指作为施用本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的结果而产生的对有害生物生理学或由所述有害生物进行的任何活动的任何破坏，包括但不限于以下任何一种或多种希望的作用：(1)使有害生物的群体降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(2)使有害生物(例如，昆虫)的繁殖速率降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(3)使有害生物的移动性降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(4)使有害生物的体重降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(5)使有害生物的代谢速率或活动降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；或(6)使有害生物的植物侵染降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多。与未被施用该有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比，可以确定有害生物适应度的降低。
如本文所用，术语“被配制用于递送至植物或植物有害生物”是指包含农业上可接受的载体的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物。
如本文所用，术语“侵染”是指植物上不希望的有害生物的存在，例如植物、其一部分或植物周围的生境被植物有害生物定植或感染，特别是在侵染降低植物的适应度的情况下。“侵染的降低”或“侵染的处理”是指相对于未处理的植物，植物上或周围的有害生物的数量的降低(例如，约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或％100)或由有害生物直接或间接引起的植物的症状或体征的降低(例如，约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或％100)。侵染或相关症状可以通过鉴定侵染或相关症状的任何手段来鉴定。例如，植物的一个或多个部分中侵染的降低的量可以足以“显著消除”侵染，这是指足以可持续地解决症状和/或相对于未处理的植物增加植物适应度的量的侵染降低。
如本文所用，“增加植物的适应度”是指植物生产的增加，例如改进的产率、改进的植物活力、或来自植物的收获产品的品质。改进的植物产率涉及相对于在相同条件下但不应用本发明组合物而生产的植物的相同产品的产率或与应用常规杀有害生物剂相比，按可测量量计植物的产品的产率的增加(例如，如通过植物生物质、谷粒、种子或果实产率、蛋白质含量、碳水化合物或油含量或叶面积测量的)。例如，产率可以增加至少约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、或大于100％。产率可以以在某种基础上植物或植物的产品的按重量或体积计量来表示。基础可以以时间、生长面积、生产的植物的重量、或所用原料的量来表示。植物适应度的增加也可以通过其他手段来测量，诸如相对于在相同条件下但不施用本发明组合物或施用常规杀有害生物剂而生产的植物的活力等级、植株密度(stand)(植物数量/单位面积)、植物高度、秆围、植物冠层、视觉外观(诸如更绿的叶颜色)、根等级、出苗、蛋白质含量、增加的分蘖、更大的叶、更多的叶、更少的死的基生叶、更强的分蘖、更少的所需肥料、更少的所需种子、更多产的分蘖、更早开花、提早的谷粒或种子成熟度、更少的植物节(verse)(倒伏)、增加的芽生长、更早萌发、或这些因素的任何组合，按可测量或可察觉的量计相同因素的增加或改进。
如本文所定义，术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的并且是指线性或支链的、单链或双链的RNA或DNA或者其杂交体，无论长度(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、150、200、250、500、1000、或更多个核酸)。该术语还涵盖RNA/DNA杂交体。核苷酸典型地通过磷酸二酯键连接在核酸中，尽管术语“核酸”还涵盖具有其他类型的键或主链(例如，尤其是磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基氨基磷酸酯、吗啉代、锁核酸(LNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、和肽核酸(PNA)键或主链)的核酸类似物。核酸可以是单链、双链的，或含有单链和双链序列二者的部分。核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合以及碱基(包括，例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、和经修饰的或非典型碱基(包括，例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、和5羟基甲基胞嘧啶))的任何组合。
如本文所用，术语“有害生物”是指对植物或其他生物体造成损害，存在于不希望它们的地方，或在其他方面例如通过影响人类农业方法或产品而对人不利的生物体。有害生物可以包括例如无脊椎动物(例如，昆虫、线虫、或软体动物)；微生物(例如，植物病原体、内生植物、专性寄生生物、兼性寄生生物、或兼性腐生植物)，诸如细菌、真菌、或病毒；或杂草。
如本文所用，术语“杀有害生物剂(pesticidal agent)”或“杀有害生物剂(pesticide)”是指防治或降低农业、环境、或家内/家庭(domestic/household)有害生物(诸如昆虫、软体动物、线虫、真菌、细菌、或病毒)的适应度(例如，杀死或抑制生长、增殖、分裂、繁殖或扩散)的药剂、组合物或其中的物质。杀有害生物剂应理解为涵盖天然存在的或合成的杀昆虫剂(杀幼虫剂或杀成虫剂)、昆虫生长调节剂、杀蜱螨亚纲动物剂(杀螨剂)、杀软体动物剂、杀线虫剂、杀外寄生生物剂、杀细菌剂、杀真菌剂、或除草剂。术语“杀有害生物剂”可以进一步涵盖其他生物活性分子，诸如抗生素、抗病毒剂、杀有害生物剂、抗真菌剂、抗蠕虫剂、营养物、和/或使昆虫运动停止或减缓的药剂。在一些情况下，该杀有害生物剂是化感物质。如本文所用，“化感物质”或“化感剂”是由生物体产生的物质，该生物体(例如，植物)可以影响另一种生物体(例如，有害生物)的生理功能(例如，萌发、生长、存活或繁殖)。
该杀有害生物剂可以是异源的。如本文所用，术语“异源的”是指(1)对植物是外源的(例如，来源于不是产生PMP的植物或植物部分的源)(例如，使用本文描述的负载方法添加PMP)或(2)对产生PMP的植物细胞或组织是内源的，但以高于在自然界中发现的浓度(例如，高于在天然存在的植物细胞外囊泡中发现的浓度)的浓度存在于PMP中(例如，使用本文描述的负载方法、遗传工程、体外或体内方法添加PMP)的药剂(例如，杀有害生物剂)。
如本文所用，术语“驱避剂”是指阻止有害生物接近或保留在植物上的药剂、组合物或其中的物质。驱避剂可以例如降低植物上或附近的有害生物的数量，但不一定杀死或降低该有害生物的适应度。
如本文所用，术语“肽”、“蛋白质”或“多肽”涵盖天然或非天然存在的氨基酸(D-或L-氨基酸)的任何链，无论长度(例如，至少2、3、4、5、6、7、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、100或更多个氨基酸)、存在或不存在翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)、或存在例如与肽共价连接的一个或多个非氨基酰基(例如，糖、脂质等)，并且包括例如天然蛋白、合成的或重组的多肽和肽、杂交分子、类肽或模拟肽。
如本文所用的，两个序列之间的“百分比同一性”通过BLAST 2.0算法(描述于Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-410)确定。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。
如本文所用，术语“植物”是指整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子、以及它们的子代。植物细胞包括但不限于来自以下物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。植物部分包括分化的和未分化的组织，包括但不限于以下：根、茎、芽、叶、花粉、种子、果实、收获的生产、肿瘤组织、汁液(例如，木质部汁液和韧皮部汁液)、以及各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚、和愈伤组织)。植物组织可以在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。另外，植物可以经遗传工程化以产生例如本文描述的方法或组合物中的任何有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的异源蛋白或RNA。
如本文所用，术语“植物细胞外囊泡”、“植物EV”、或“EV”是指植物中天然存在的封闭的脂质双层结构。任选地，该植物EV包含一种或多种植物EV标记物。如本文所用，术语“植物EV标记物”是指与植物天然缔合的组分，诸如植物蛋白、植物核酸、植物小分子、植物脂质、或其组合，包括但不限于附录中列出的任何植物EV标记物。在一些情况下，该植物EV标记物是植物EV的鉴定标记物，但不是杀有害生物剂。在一些情况下，该植物EV标记物是植物EV的鉴定标记物，而且还是杀有害生物剂(例如，与多个PMP缔合或被其包封的、或不直接与多个PMP缔合或被其包封的)。
如本文所用，术语“植物信使包”或“PMP”是指直径为约5-2000nm(例如，至少5-1000nm、至少5-500nm、至少400-500nm、至少25-250nm、至少50-150nm、或至少70-120nm)的脂质结构(例如，脂质双层，单层、多层结构；例如，囊泡状脂质结构)，该脂质结构源自(例如，富集、分离或纯化自)植物源或其节段、部分或提取物，包括与其缔合的脂质或非脂质组分(例如，肽、核酸、或小分子)，并且已从植物、植物部分或植物细胞中富集、分离或纯化，该富集或分离从源植物中除去一种或多种污染物或不希望的组分。PMP可以是天然存在的EV的高度纯化制剂。优选地，除去至少1％的来自源植物的污染物或不希望的组分(例如，至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、或100％)来自源植物的一种或多种污染物或不希望的组分，例如植物细胞壁组分；果胶；植物细胞器(例如，线粒体；质体，诸如叶绿体、白色体或淀粉质体；和核)；植物染色质(例如，植物染色体)；或植物分子聚集体(例如，蛋白质聚集体、蛋白质-核酸聚集体、脂蛋白聚集体、或脂质-蛋白质结构)。优选地，PMP是相对于来自源植物的该一种或多种污染物或不希望的组分至少30％纯的(例如，至少40％纯的、至少50％纯的、至少60％纯的、至少70％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的、至少99％纯的、或100％纯的)，如通过重量(w/w)、光谱成像(透射率％)、或电导率(S/m)测量。
PMP可以任选地包含另外的药剂，诸如异源功能剂，例如杀有害生物剂、肥料剂、植物修饰剂、治疗剂、多核苷酸、多肽、或小分子。PMP可以以多种方式携带另外的药剂(例如，异源功能剂)或与其缔合，以使该药剂能够递送至靶植物，例如通过包封该药剂、将该药剂结合在脂质双层结构中、或将该药剂(例如，通过缀合)与脂质双层结构的表面缔合。异源功能剂可以体内(例如，在植物体内)或体外(例如，在组织培养物中、在细胞培养物中、或合成地结合)掺入PMP中。
如本文所用，术语“稳定的PMP组合物”(例如，包含负载或未负载的PMP的组合物)是指在一定时间段(例如，至少24小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少30天、至少60天、或至少90天)内任选地在限定的温度范围下(例如，至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、或30℃)、至少20℃(例如，至少20℃、21℃、22℃、或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃、或15℃)、至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃)、或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、或-30℃)的温度)相对于PMP组合物中PMP的数量(例如，在生产或配制时)保留初始PMP数量(例如，PMP/mL溶液)的至少5％(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％)的PMP组合物；或任选地在限定的温度范围下(例如，至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、或30℃)、至少20℃(例如，至少20℃、21℃、22℃、或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃、或15℃)、至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃)、或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、或-30℃)的温度)相对于PMP的初始活性(例如，在生产或配制时)保留其活性(例如，杀有害生物和/或驱避剂活性)的至少5％(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％)。
如本文所用，术语“未处理的”是指未接触或递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的植物或植物有害生物，包括未递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的单独的植物、经受在递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物之前的时间点评价的处理的相同植物、或经受在植物的未处理部分评价的处理的相同植物。
如本文所用，术语“汁囊”或“汁囊泡”是指柠檬果(例如，柑橘果实)的内果皮(心皮)的含有汁的膜结合组分。在一些方面，将汁囊与果实的其他部分(例如，皮(外果皮或黄皮(flavedo))、内皮(中果皮、白皮(albedo)、或橘络(pith))、中心柱(胎座)、瓣壁、或种子)分离。在一些方面，这些汁囊是葡萄柚、柠檬、酸橙或橙子的汁囊。
附图说明
图1A是示意图，其示出了使用破坏性榨汁步骤(涉及使用共混器)、然后超速离心和蔗糖梯度纯化进行葡萄柚PMP生产的方案。图像包括在以1000x g离心10min后的葡萄柚汁以及在以150,000x g超速离心2小时后的蔗糖梯度条带图案。
图1B是由Spectradyne NCS1测量的PMP颗粒分布的图。
图2是示意图，其示出了使用温和榨汁步骤(涉及使用网过滤器)、然后超速离心和蔗糖梯度纯化进行葡萄柚PMP生产的方案。图像包括在以1000x g离心10min后的葡萄柚汁以及在以150,000x g超速离心2小时后的蔗糖梯度条带图案。
图3A是示意图，其示出了使用超速离心、然后尺寸排阻色谱法(SEC)分离含有PMP的级分来进行葡萄柚PMP生产的方案。分析洗脱的SEC级分的颗粒浓度(NanoFCM)、中值粒度(NanoFCM)和蛋白质浓度(BCA)。
图3B是曲线图，其示出了颗粒浓度/mL洗脱的尺寸排阻色谱法(SEC)级分(NanoFCM)。含有大部分PMP的级分(“PMP级分”)用箭头指示。PMP洗脱在级分2-4中。
图3C是一组曲线图和表，其示出了如使用NanoFCM测量的所选SEC级分的以nm计粒度。这些曲线图示出了级分1、3、5和8中的PMP尺寸分布。
图3D是曲线图，其示出了如使用BCA测定测量的SEC级分中的以μg/mL计的蛋白质浓度。含有大部分PMP的级分(“PMP级分”)被标记，并且箭头指示含有污染物的级分。
图4A是示意图，其示出了用于从使用榨汁机得到1升葡萄柚汁(约7个葡萄柚)、然后差异离心以除去大碎片、使用TFF对汁进行100x浓缩、以及尺寸排阻色谱法(SEC)分离含有PMP的级分的规模化PMP生产。分析SEC洗脱级分的颗粒浓度(NanoFCM)、中值粒度(NanoFCM)和蛋白质浓度(BCA)。
图4B是一对曲线图，其示出了来自1000ml葡萄柚汁的规模化起始材料的SEC洗脱物体积(ml)的蛋白质浓度(BCA测定，上图)和颗粒浓度(NanoFCM，下图)，示出了晚期SEC洗脱体积中高量的污染物。
图4C是曲线图，其示出了孵育最终浓度为50mM EDTA(pH 7.15)的粗葡萄柚PMP级分、然后使用300kDa膜进行过夜透析成功除去了晚期SEC洗脱级分中存在的污染物，如通过在280nm下的吸光度所示。所用的透析缓冲液(不含钙/镁pH 7.4、MES pH 6、Tris pH 8.6的PBS)中没有差异。
图4D是曲线图，其示出了孵育最终浓度为50mM EDTA(pH 7.15)的粗葡萄柚PMP级分、然后使用300kDa膜进行过夜透析成功除去了在SEC后晚期洗脱级分中存在的污染物，如通过BCA蛋白质分析所示，该BCA蛋白质分析除了检测蛋白质外，还对糖和果胶的存在敏感。所用的透析缓冲液(不含钙/镁pH 7.4、MES pH 6、Tris pH 8.6的PBS)中没有差异。
图5A是示意图，其示出了从使用榨汁机得到葡萄柚汁、然后差异离心以除去大碎片、与EDTA一起孵育以减少形成果胶大分子、顺序过滤以除去大颗粒、通过TFF进行5x浓缩/洗涤、透析过夜以除去污染物、通过TFF进一步浓缩(最终20x)、以及SEC以分离含有PMP的级分来进行PMP生产的方案。
图5B是示出了使用多个SEC柱洗脱的葡萄柚SEC级分的在280nm处的吸光度(A.U.)的曲线图。PMP洗脱在早期级分4-6中，并且污染物洗脱在晚期级分中。
图5C是示出了使用多个SEC柱洗脱的葡萄柚SEC级分的蛋白质浓度(μg/ml)的曲线图。PMP洗脱在早期级分4-6中，并且污染物洗脱在晚期级分中。
图5D是示出了使用多个SEC柱洗脱的柠檬SEC级分的在280nm处的吸光度(A.U.)的曲线图。PMP洗脱在早期级分4-6中，并且污染物洗脱在晚期级分中。
图5E是示出了使用多个SEC柱洗脱的柠檬SEC级分的蛋白质浓度(μg/ml)的曲线图。PMP洗脱在早期级分4-6中，并且污染物洗脱在晚期级分中。
图5F是散点图和曲线图，其示出了在0.22um过滤器灭菌后含有葡萄柚PMP的SEC级分的粒度。上图是如通过纳米流式细胞仪(NanoFCM)测量的合并的SEC级分中颗粒的散点图。下图是门控颗粒的尺寸(nm)分布曲线图(减去背景)。根据NanoFCM的说明，使用珠标准品确定PMP浓度(颗粒/ml)和中值尺寸(nm)。
图5G是散点图和曲线图，其示出了在0.22um过滤器灭菌后含有柠檬PMP的SEC级分的粒度。上图是如通过纳米流式细胞仪(NanoFCM)测量的合并的SEC级分中颗粒的散点图。下图是门控颗粒的尺寸(nm)分布曲线图(减去背景)。根据NanoFCM的说明，使用珠标准品确定PMP浓度(颗粒/ml)和中值尺寸(nm)。
图5H是曲线图，其示出了如通过NanoFCM测量的在不同时间点(生产后的天数)由PMP浓度(PMP颗粒/ml)确定的在4摄氏度下葡萄柚和柠檬PMP稳定性。
图5I是条形图，其示出了与在4摄氏度下储存的柠檬PMP相比，在-20摄氏度和-20摄氏度下的一个冻融循环后柠檬(LM)PMP的稳定性，如在指示的温度下储存1周后由PMP浓度(PMP颗粒/ml)确定，如通过NanoFCM测量。
图6A是曲线图，其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的洗脱的BMS植物细胞培养物SEC级分中的颗粒浓度(颗粒/ml)。PMP洗脱在SEC级分4-6中。
图6B是曲线图，其示出了在
Figure GDA0002918049650000151
分光光度计上测量的洗脱的BMS SEC级分中的在280nm处的吸光度(A.U.)。PMP洗脱在级分4-6中；级分9-13含有污染物。
图6C是曲线图，其示出了如通过BCA分析确定的洗脱的BMS SEC级分中的蛋白质浓度(μg/ml)。PMP洗脱在级分4-6中；级分9-13含有污染物。
图6D是散点图，其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的合并的含有BMSPMP的SEC级分中的颗粒。根据NanoFCM的说明，使用珠标准品确定PMP浓度(颗粒/ml)。
图6E是曲线图，其示出了图6D的门控颗粒的BMS PMP的尺寸分布(nm)(减去背景)。根据NanoFCM的说明，使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸(nm)。
图7A是散点图和曲线图，其显示了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的DyLight800nm标记的葡萄柚PMP。上图是合并的SEC级分中颗粒的散点图。根据NanoFCM的说明，使用珠标准品确定PMP浓度(4.44x 1012PMP/ml)。下图是葡萄柚DyLight800-PMP的尺寸(nm)分布曲线图。根据NanoFCM的说明，使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸。中值葡萄柚DyLight800-PMP尺寸是72.6nm+/-14.6nm(SD)。
图7B是散点图和曲线图，其显示了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的DyLight800nm标记的柠檬PMP。根据NanoFCM的说明，使用珠标准品确定中值PMP浓度(5.18Ex1012 PMP/ml)。下图是葡萄柚DyLight800-PMP的尺寸(nm)分布曲线图。根据NanoFCM的说明，使用Exo珠标准品确定PMP尺寸。中值柠檬DyLight800-PMP尺寸是68.5nm+/-14nm(SD)。
图7C是柱状图，其示出了在处理后2小时细菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌、和丁香假单胞菌)和酵母(酿酒酵母)对葡萄柚和柠檬来源的DyL800nm标记的PMP的摄取。摄取定义为相对荧光强度(A.U.)，归一化至仅染料处理的微生物对照的相对荧光强度。
图8A是散点图和曲线图，其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的纯化柠檬PMP(合并和沉淀的PMP SEC级分)。上图是合并的SEC级分中颗粒的散点图。根据NanoFCM的说明，使用珠标准品确定最终柠檬PMP浓度(1.53x1013PMP/ml)。下图是纯化柠檬PMP的尺寸(nm)分布曲线图。下图是门控颗粒的尺寸(nm)分布曲线图。根据NanoFCM的说明，使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸。中值柠檬PMP尺寸是72.4nm+/-19.8nm(SD)。
图8B是散点图和曲线图，其显示了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的Alexa
Figure GDA0002918049650000161
488-(AF488)标记的柠檬PMP。上图是散点图。相对于未标记的颗粒和背景信号，颗粒门控在FITC荧光信号上。标记效率为99％，如通过荧光颗粒数量相对于检测的颗粒总数确定。从荧光颗粒的数量并且根据NanoFCM的说明使用已知浓度的珠标准品来确定最终AF488-PMP浓度(1.34x1013PMP/ml)。下图是AF488标记的柠檬PMP的尺寸(nm)分布曲线图。根据NanoFCM的说明，使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸。中值柠檬PMP尺寸是72.1nm+/-15.9nm(SD)。
图9A是曲线图，其示出了在
Figure GDA0002918049650000162
分光光度计上测量的从不同SEC柱(柱A、B、C、D和E)产生的洗脱的葡萄柚SEC级分的在280nm处的吸光度(A.U.)。PMP洗脱在级分4-6中。
图9B是散点图，其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的纯化葡萄柚PMP(合并和沉淀的PMP SEC级分)。根据NanoFCM的说明，使用珠标准品确定最终葡萄柚PMP浓度(6.34x1012PMP/ml)。
图9C是示出了纯化的葡萄柚PMP的尺寸分布(nm)的曲线图。根据NanoFCM的说明，使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸。中值葡萄柚PMP尺寸是63.7nm+/-11.5nm(SD)。
图9D是曲线图，其示出了在
Figure GDA0002918049650000171
分光光度计上测量的所用的不同SEC柱的洗脱的柠檬SEC级分的在280nm处的吸光度(A.U.)。PMP洗脱在级分4-6中。
图9E是散点图，其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的纯化柠檬PMP(合并和沉淀的PMP SEC级分)。根据NanoFCM的说明，使用珠标准品确定最终柠檬PMP浓度(7.42x1012PMP/ml)。
图9F是示出了纯化柠檬PMP的尺寸分布(nm)的曲线图。根据NanoFCM的说明，使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸。中值柠檬PMP尺寸是68nm+/-17.5nm(SD)。
图9G是条形图，其示出了主动(超声处理/挤出)或被动(孵育)负载阿霉素的柠檬(LM)和葡萄柚(GF)PMP的DOX负载容量(pg DOX/1000PMP)。通过PMP-DOX样品中DOX的总浓度(pg/mL)(使用
Figure GDA0002918049650000172
分光光度计通过荧光强度测量(Ex/Em＝485/550nm)进行评价)除以样品中的总PMP浓度(PMP/mL)来计算负载容量。
图9H是曲线图，其示出了如通过NanoFCM测量的在不同时间点(生产后的天数)如由PMP浓度(PMP颗粒/ml)确定的在4摄氏度下葡萄柚和柠檬的负载DOX的PMP的稳定性。
图10A是示意图，其示出了从用果胶酶和EDTA处理4升葡萄柚汁、使用300kDa TFF浓缩5x、通过6体积的PBS交换进行洗涤、以及浓缩至20x的最终浓度来生产PMP的方案。使用尺寸排阻色谱法来洗脱含有PMP的级分。
图10B是曲线图，其示出了穿过所用的9个不同SEC柱(SEC柱A-J)洗脱的SEC级分的在280nm处的吸光度(A.U.)。PMP洗脱在SEC级分3-7中。
图10C是曲线图，其示出了穿过所用的9个不同SEC柱(SEC柱A-J)洗脱的SEC级分的蛋白质浓度(μg/ml)。PMP洗脱在SEC级分3-7中。箭头指示含有污染物的级分。
图10D是散点图，其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的纯化葡萄柚PMP(合并和沉淀的PMP SEC级分)。根据NanoFCM的说明，使用珠标准品确定最终葡萄柚PMP浓度(7.56x1012PMP/ml)。
图10E是示出了纯化的葡萄柚PMP的尺寸分布(nm)的曲线图。根据NanoFCM的说明，使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸。中值葡萄柚PMP尺寸是70.3nm+/-12.4nm(SD)。
图10F是曲线图，其示出了负载阿霉素(DOX)的葡萄柚PMP处理对铜绿假单胞菌的细胞毒性作用。用PMP-DOX至0(阴性对照)、5μM、10μM、25μM、50μM和100μM的有效DOX浓度一式两份地处理细菌。进行在600nm处的动力学吸光度测量(
Figure GDA0002918049650000181
分光光度计)，以监测在指示时间点的培养物的OD。首先将每个处理剂量的所有OD值均归一化至该剂量下第一时间点的OD，以归一化在高浓度下在600nm处的DOX荧光渗出。为了确定PMP-DOX对细菌的细胞毒性作用，与未处理的对照组(设为100％)相比，确定每个处理组内的相对OD。
图10G是曲线图，其示出了负载阿霉素(DOX)的葡萄柚PMP处理对大肠杆菌的细胞毒性作用。用PMP-DOX至0(阴性对照)、5μM、10μM、25μM、50μM和100μM的有效DOX浓度一式两份地处理细菌。进行在600nm处的动力学吸光度测量(
Figure GDA0002918049650000182
分光光度计)，以监测在指示时间点的培养物的OD。首先将每个处理剂量的所有OD值均归一化至该剂量下第一时间点的OD，以归一化在高浓度下在600nm处的DOX荧光渗出。为了确定PMP-DOX对细菌的细胞毒性作用，与未处理的对照组(设为100％)相比，确定每个处理组内的相对OD。
图10H是曲线图，其示出了负载阿霉素(DOX)的葡萄柚PMP处理对酿酒酵母的细胞毒性作用。用PMP-DOX至0(阴性对照)、5μM、10μM、25μM、50μM和100μM的有效DOX浓度一式两份地处理酵母细胞。进行在600nm处的动力学吸光度测量(
Figure GDA0002918049650000183
分光光度计)，以监测在指示时间点的培养物的OD。首先将每个处理剂量的所有OD值均归一化至该剂量下第一时间点的OD，以归一化在高浓度下在600nm处的DOX荧光渗出。为了确定PMP-DOX对酵母的细胞毒性作用，与未处理的对照组(设为100％)相比，确定每个处理组内的相对OD。
图10I是曲线图，其示出了负载阿霉素(DOX)的葡萄柚PMP处理对丁香假单胞菌的细胞毒性作用。用PMP-DOX至0(阴性对照)、5μM、10μM、25μM、50μM和100μM的有效DOX浓度一式两份地处理细菌。进行在600nm处的动力学吸光度测量(
Figure GDA0002918049650000191
分光光度计)，以监测在指示时间点的培养物的OD。首先将每个处理剂量的所有OD值均归一化至该剂量下第一时间点的OD，以归一化在高浓度下在600nm处的DOX荧光渗出。为了确定PMP-DOX对细菌的细胞毒性作用，与未处理的对照组(设为100％)相比，确定每个处理组内的相对OD。
图11是曲线图，其示出了在重复样品中用超纯水(阴性对照)、3ng游离荧光素酶蛋白(仅蛋白质的对照)或用3ng有效荧光素酶蛋白剂量的负载荧光素酶蛋白的PMP(PMP-Luc)在室温下处理2h的铜绿假单胞菌细菌的发光(R.L.U.，相对发光单位)。使用ONE-GloTM荧光素酶测定试剂盒(普洛麦格公司(Promega))通过发光测量并且在
Figure GDA0002918049650000192
分光光度计上测量上清液和沉淀细菌中的荧光素酶蛋白。
图12A是散点图和曲线图，其显示了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的AF488标记的柠檬PMP中的粒度。上图是散点图，其示出了AF488标记的柠檬PMP。相对于未标记的颗粒和背景信号，颗粒门控在FITC荧光信号上。标记效率为89.4％，如通过荧光颗粒数量相对于检测的颗粒总数确定。从荧光颗粒的数量并且根据NanoFCM的说明使用已知浓度的珠标准品来确定最终AF488-PMP浓度(2.91x1012PMP/ml)。下图是488标记的柠檬PMP的尺寸(nm)分布曲线图。根据NanoFCM的说明，使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸。中值柠檬AF488-PMP尺寸是79.4nm+/-14.7nm(SD)。
图12B是一组显微照片，其示出了植物细胞系橹豆(大豆)、普通小麦(小麦)和玉蜀黍BMS细胞培养物对标记Alexa
Figure GDA0002918049650000193
488(AF488)的柠檬(LM)PMP的摄取。明视野图示出了细胞的位置；标记“GFP”的图示出了AF488的荧光。细胞中AF488信号的存在指示细胞对PMP的摄取。游离AF488(“游离染料”)显示为对照。
图13是一对图示和一组显微照片，其示出了拟南芥幼苗和苜蓿芽对标记有DL800的柠檬(LM)和葡萄柚(GF)PMP的摄取。显示了DL800染料的荧光强度。对于拟南芥幼苗在22hpt(处理后小时)并且对于苜蓿芽在24hpt测量荧光强度。不与染料(“阴性对照”)以及与游离DL800染料(“仅DL800染料”)一起孵育的幼苗显示为对照。
具体实施方式
本文的特征是基于有害生物防治的用于防治植物有害生物的组合物和相关方法，例如包含植物信使包(PMP)(全部或部分地从植物细胞外囊泡(EV)或其节段、部分或提取物产生的脂质组件)的生物驱避剂或生物型杀有害生物剂组合物。PMP可以具有杀有害生物或昆虫驱避活性，而不包含另外的药剂(例如，异源功能剂，例如杀有害生物剂或驱避剂)，但是可以任选地被修饰为包含另外的杀有害生物或有害生物驱避剂。还包括其中PMP以基本上纯的形式或浓缩形式提供的配制品。可以将本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和配制品直接递送至植物以处理或预防有害生物侵染并且从而增加该植物(诸如农业作物)的适应度。另外地或可替代地，可以将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至多种植物有害生物，诸如有害于对农业或商业重要的植物的那些，以降低该植物有害生物的适应度。
I.有害生物防治组合物
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含多个植物信使包(PMP)。PMP是包含植物EV或其节段、部分或提取物(例如，脂质提取物)的脂质(例如，脂质双层，单层或多层结构)结构。植物EV是指天然存在于植物中的封闭的脂质双层结构。植物EV的直径可以是约5-2000nm。植物EV可以来源于多种植物生物合成途径。在自然界中，植物EV可以发现于植物的细胞内隔室和细胞外隔室，诸如植物质外体(位于质膜外部并且由连续的细胞壁和细胞外空间形成的隔室)。可替代地，PMP可以是在从植物细胞分泌后在细胞培养基中发现的富集的植物EV。可以通过本文进一步描述的多种方法从植物中(例如，从质外体流体中)分离出植物EV，从而提供PMP。
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以包含针对植物有害生物具有杀有害生物活性或驱避活性的PMP，而不进一步包含另外的杀有害生物或驱避剂。然而，PMP可以另外包含可体内或体外引入的异源有害生物防治剂，例如杀有害生物剂或驱避剂。因此，PMP可以包含具有杀有害生物活性或驱避活性的物质，该物质被从其中生产PMP的植物负载到PMP中或上。例如，体内负载到PMP中的杀有害生物剂可以是对植物是内源性的因子或对植物是外源性的因子(例如，如通过异源遗传构建体在遗传工程化植物中表达的)。可替代地，PMP可以体外负载异源功能剂(例如，在通过本文进一步描述的多种方法生产后)。
PMP可以包括植物EV或其节段、部分或提取物，其中植物EV的直径是约5-2000nm。例如，PMP可以包含平均直径为约5-50nm、约50-100nm、约100-150nm、约150-200nm、约200-250nm、约250-300nm、约300-350nm、约350-400nm、约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm、约650-700nm、约700-750nm、约750-800nm、约800-850nm、约850-900nm、约900-950nm、约950-1000nm、约1000-1250nm、约1250-1500nm、约1500-1750nm、或约1750-2000nm的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP包含平均直径为约5-950nm、约5-900nm、约5-850nm、约5-800nm、约5-750nm、约5-700nm、约5-650nm、约5-600nm、约5-550nm、约5-500nm、约5-450nm、约5-400nm、约5-350nm、约5-300nm、约5-250nm、约5-200nm、约5-150nm、约5-100nm、约5-50nm、或约5-25nm的植物EV或其节段、部分或提取物。在某些情况下，该植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约50-200nm。在某些情况下，该植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约50-300nm。在某些情况下，该植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约200-500nm。在某些情况下，该植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约30-150nm。
在一些情况下，PMP可以包含平均直径为至少5nm、至少50nm、至少100nm、至少150nm、至少200nm、至少250nm、至少300nm、至少350nm、至少400nm、至少450nm、至少500nm、至少550nm、至少600nm、至少650nm、至少700nm、至少750nm、至少800nm、至少850nm、至少900nm、至少950nm、或至少1000nm的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP包含平均直径小于1000nm、小于950nm、小于900nm、小于850nm、小于800nm、小于750nm、小于700nm、小于650nm、小于600nm、小于550nm、小于500nm、小于450nm、小于400nm、小于350nm、小于300nm、小于250nm、小于200nm、小于150nm、小于100nm、或小于50nm的植物EV或其节段、部分或提取物。可以使用本领域中多种标准方法(例如，动态光散射方法)来测量该植物EV或其节段、部分或提取物的粒径。
在一些情况下，PMP可以包含平均表面积为77nm2至3.2x106nm2(例如，77-100nm2、100-1000nm2、1000-1x104nm2、1x104-1x105nm2、1x105-1x106nm2、或1x106-3.2x106nm2)的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP可以包含平均体积为65nm3至5.3x108nm3(例如，65-100nm3、100-1000nm3、1000-1x104nm3、1x104-1x105nm3、1x105-1x106nm3、1x106-1x107nm3、1x107-1x108nm3、1x108-5.3x108nm3)的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP可以包含平均表面积为至少77nm2(例如，至少77nm2、至少100nm2、至少1000nm2、至少1x104nm2、至少1x105nm2、至少1x106nm2、或至少2x106nm2)的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下，PMP可以包含平均体积为至少65nm3(例如，至少65nm3、至少100nm3、至少1000nm3、至少1x104nm3、至少1x105nm3、至少1x106nm3、至少1x107nm3、至少1x108nm3、至少2x108nm3、至少3x108nm3、至少4x108nm3、或至少5x108nm3的植物EV或其节段、部分或提取物。
在一些情况下，PMP的尺寸可以与植物EV或其节段、提取物或部分相同。可替代地，PMP的尺寸可以与产生PMP的初始植物EV不同。例如，PMP的直径可以是约5-2000nm的直径。例如，PMP的平均直径可以是约5-50nm、约50-100nm、约100-150nm、约150-200nm、约200-250nm、约250-300nm、约300-350nm、约350-400nm、约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm、约650-700nm、约700-750nm、约750-800nm、约800-850nm、约850-900nm、约900-950nm、约950-1000nm,约1000-1200nm、约1200-1400nm、约1400-1600nm、约1600-1800nm、或约1800-2000nm。在一些情况下，PMP的平均直径可以是至少5nm、至少50nm、至少100nm、至少150nm、至少200nm、至少250nm、至少300nm、至少350nm、至少400nm、至少450nm、至少500nm、至少550nm、至少600nm、至少650nm、至少700nm、至少750nm、至少800nm、至少850nm、至少900nm、至少950nm、至少1000nm、至少1200nm、至少1400nm、至少1600nm、至少1800nm、或约2000nm。可以使用本领域中多种标准方法(例如，动态光散射方法)来测量PMP的粒径。在一些情况下，在负载异源功能剂之后或在PMP的其他修饰之后确定PMP的尺寸。
在一些情况下，PMP的平均表面积可以是77nm2至1.3x107nm2(例如，77-100nm2、100-1000nm2、1000-1x104nm2、1x104-1x105nm2、1x105-1x106nm2、或1x106-1.3x107nm2)。在一些情况下，PMP的平均体积可以是65nm3至4.2x109nm3(例如，65-100nm3、100-1000nm3、1000-1x104nm3、1x104-1x105nm3、1x105-1x106nm3、1x106-1x107nm3、1x107-1x108nm3、1x108-1x109nm3、或1x109-4.2x109nm3)。在一些情况下，PMP的平均表面积是至少77nm2(例如，至少77nm2、至少100nm2、至少1000nm2、至少1x104nm2、至少1x105nm2、至少1x106nm2、或至少1x107nm2)。在一些情况下，PMP的平均体积是至少65nm3(例如，至少65nm3、至少100nm3、至少1000nm3、至少1x104nm3、至少1x105nm3、至少1x106nm3、至少1x107nm3、至少1x108nm3、至少1x109nm3、至少2x109nm3、至少3x109nm3、或至少4x109nm3)。
在一些情况下，PMP可以包含完整的植物EV。可替代地，PMP可以包括植物EV的囊泡的整个表面积的节段、部分或提取物(例如，包括囊泡的整个表面积的小于100％(例如，小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于10％、小于5％、或小于1％)的节段、部分或提取物)。该节段、部分或提取物可以是任何形状，诸如圆周节段、球形节段(例如，半球)、曲线节段、线性节段、或平坦节段。在节段是囊泡的球形节段的情况下，该球形节段可以表示通过将球形囊泡沿一对平行线分裂而产生的球形节段或者通过将球形囊泡沿一对非平行线分裂而产生的球形节段。因此，多个PMP可以包括多个完整的植物EV，多个植物EV节段、部分或提取物，或完整的植物EV和节段的植物EV的混合物。本领域技术人员应当理解，完整的植物EV与节段的植物EV的比率将取决于所使用的特定分离方法。例如，与诸如真空渗透的非破坏性提取方法相比，将植物或其一部分研磨或共混可以产生含有更高百分比的植物EV节段、部分或提取物的PMP。
在其中PMP包含植物EV的节段、部分或提取物的情况下，该EV节段、部分或提取物可以具有小于完整的囊泡的平均表面积的平均表面积，例如小于77nm2、100nm2、1000nm2、1x104nm2、1x105nm2、1x106nm2、或3.2x106nm2的平均表面积)。在一些情况下，该EV节段、部分或提取物的表面积小于70nm2、60nm2、50nm2、40nm2、30nm2、20nm2、或10nm2)。在一些情况下，PMP可以包含具有小于完整的囊泡的平均体积的平均体积(例如，小于65nm3、100nm3、1000nm3、1x104nm3、1x105nm3、1x106nm3、1x107nm3、1x108nm3、或5.3x108nm3的平均体积)的植物EV或其节段、部分或提取物)。
在其中PMP包含植物EV的提取物的情况下，例如在PMP包含从植物EV中提取(例如，用氯仿)的脂质的情况下，PMP可以包含至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或更多的从植物EV提取(例如，用氯仿)的脂质。多个中的PMP可以包含植物EV节段和/或植物EV提取的脂质或其混合物。
本文进一步概述了关于生产PMP、可与PMP缔合的植物EV标记物、和用于包含PMP的组合物的配制品的方法的细节。
A.生产方法
可以从植物EV或其节段、部分或提取物(例如，脂质提取物)中生产PMP，PMP天然存在于植物或其部分(包括植物组织或植物细胞)中。用于生产PMP的示例性方法包括(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；和(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。该方法可以进一步包括另外的步骤(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在该粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。每个生产步骤将在下面进一步详细讨论。关于PMP的分离和纯化的示例性方法例如在以下中找到：Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1)：728-741,2017；Rutter等人,Bio.Protoc.[生物方案]7(17)：e2533,2017；Regente等人,J of Exp.Biol.[实验生物学杂志]68(20)：5485-5496,2017；Mu等人,Mol.Nutr.Food Res.[分子营养与食品研究],58,1561-1573,2014，和Regente等人,FEBS Letters.[欧洲生化学会联合会快报]583：3363-3366,2009，将其中每个通过引用并入本文。
例如，可以通过包括以下步骤的方法从植物中分离出多个PMP：(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分(例如，降低至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、或100％的水平)；以及(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在该粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分(例如，降低至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、或100％的水平)。
本文提供的PMP可以包含从多种植物中分离的植物EV或其节段、部分或提取物。可以从任何属植物(维管或非维管)中分离出PMP，该任何属植物包括但不限于被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类、卷柏、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、藻类(例如，单细胞或多细胞的，例如原始色素体生物)或苔藓植物。在某些情况下，PMP可以从维管植物产生，该维管植物例如单子叶植物或双子叶植物或裸子植物。例如，PMP可以产生自：苜蓿、苹果、拟南芥属、香蕉、大麦、卡诺拉油菜、蓖麻籽、菊苣、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉花、棉籽、玉米、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、石斛兰、薯蓣、桉树、羊茅草、亚麻、唐菖蒲、百合科、亚麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麦、油棕、油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草皮草、小麦或蔬菜作物(诸如莴苣、芹菜、西兰花、花椰菜、葫芦)；水果树和坚果树，诸如苹果、梨、桃、橙子、葡萄柚、柠檬、酸橙、扁桃、山核桃、胡桃、榛子；藤本植物，诸如葡萄、猕猴桃、蛇麻子；水果灌木和悬钩子，诸如覆盆子、黑莓、醋栗；林木，诸如水曲柳、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树、杨树(popular)；与苜蓿、卡诺拉油菜、蓖麻籽、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻籽、芥菜、油棕、油菜、花生、马铃薯、水稻、红花、芝麻、大豆、甜菜、向日葵、烟草、番茄、或小麦。
PMP可以产生自整株植物(例如，整个莲座丛或幼苗)或可替代地产自一种或多种植物部分(例如，叶、种子、根、果实、营养部分、花粉、韧皮汁液、或木质部汁液)。例如，PMP可以产生自芽营养器官/结构(例如，叶、茎、或块茎)、根、花和花器官/结构(例如，花粉、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药、或胚珠)、种子(包括胚、胚乳、或胚胎)、果实(成熟的子房)、汁液(例如，韧皮部或木质部汁液)、植物组织(例如，维管组织、基本组织、肿瘤组织等)、和细胞(例如，单细胞、原生质体、胚、愈伤组织、保卫细胞、卵细胞等)、或其子代。例如，分离步骤可以涉及(a)提供植物或其一部分。在一些实例中，该植物部分是拟南芥属叶。该植物可以处在任何发育阶段。例如，PMP可以产生自幼苗，例如1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、或8周龄幼苗(例如，拟南芥属幼苗)。其他示例性PMP可以包括从根(例如，姜根)、果汁(例如，葡萄柚汁)、蔬菜(例如，西兰花)、花粉(例如，橄榄花粉)、韧皮汁液(例如，拟南芥属韧皮汁液)、或木质部汁液(例如，番茄植物木质部汁液)产生的PMP。
PMP可以通过多种方法从植物或其一部分产生。允许释放植物的含有EV的质外体级分、或含有包含分泌的EV的PMP的其他细胞外级分(例如，细胞培养基)的任何方法适用于本发明的方法。EV可以通过破坏性(例如，研磨或共混植物或任何植物部分)或非破坏性(洗涤或真空渗透植物或任何植物部分)方法从植物或植物部分中分离。例如，可以将该植物或其一部分真空渗透、研磨、共混或其组合，以从该植物或植物部分中分离EV，从而产生PMP。例如，分离步骤可以涉及(b)从初始样品(例如，植物、植物部分、或源自植物或植物部分的样品)中分离出粗PMP级分，其中该分离步骤涉及真空渗透植物(例如，用囊泡分离缓冲液)以释放和收集质外体级分。可替代地，分离步骤可以涉及将植物研磨或共混以释放EV，从而产生PMP。
在分离植物EV(从而产生PMP)后，可以将PMP分离或收集到粗PMP级分(例如，质外体级分)中。例如，分离步骤可以涉及使用离心(例如，差异离心或超速离心)和/或过滤将多个PMP分离到粗PMP级分中，以从大污染物，包括植物组织碎片、植物细胞、或植物细胞的细胞器(例如，核或叶绿体)中分离含有PMP的级分。因此，与来自源植物或植物部分的初始样品相比，该粗PMP级分将具有降低数量的大污染物，包括植物组织碎片、植物细胞、或植物细胞的细胞器(例如，核、线粒体或叶绿体)
在一些情况下，分离步骤可以涉及使用离心(例如，差异离心或超速离心)和/或过滤将多个PMP分离到粗PMP级分中，以从植物细胞或细胞碎片中分离含有PMP的级分。在此类情况下，与来自源植物或植物部分的初始样品相比，该粗PMP级分将具有降低数量的植物细胞或细胞碎片。
可以通过另外的纯化方法进一步纯化该粗PMP级分，以产生多个纯PMP。例如，可以通过超速离心，例如使用密度梯度(碘克沙醇或蔗糖)和/或使用除去聚集的组分的其他方法(例如，沉淀或尺寸排阻色谱法)，将该粗PMP级分与其他植物组分分离。相对于在较早分离步骤中产生的一个或多个级分、或相对于预先确定的阈值水平(例如，商业释放规格)，所得的纯PMP可以具有降低水平的来自源植物的污染物或不希望的组分(例如，一种或多种非PMP组分，诸如蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体、游离脂蛋白、脂质-蛋白质结构)、核、细胞壁组分、细胞的细胞器、或其组合)。例如，相对于在初始样品中的水平，纯PMP可以具有降低水平(例如，降低约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％；或降低约2x倍、4x倍、5x倍、10x倍、20x倍、25x倍、50x倍、75x倍、100x倍、或大于100x倍)的植物细胞器或细胞壁组分。在一些情况下，纯PMP基本上不含(例如，具有不可检测水平的)一种或多种非PMP组分，诸如蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体、游离脂蛋白、脂质-蛋白质结构)、核、细胞壁组分、细胞的细胞器、或其组合。释放和分离步骤的其他实例可以在实施例1中发现。PMP的浓度可以是例如1x109、5x109、1x1010、5x1010、5x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012、9x1012、1x1013、或大于1x1013PMP/mL。
例如，可以从分离的PMP中除去蛋白质聚集体。例如，可以使分离的PMP溶液经受一定范围的pH(例如，如使用pH探针测量)，以沉淀出溶液中的蛋白质聚集体。可以通过添加例如氢氧化钠或盐酸将pH调节至例如pH 3、pH 5、pH 7、pH 9或pH 11。一旦溶液处在指定的pH，就可以将其过滤以除去微粒。可替代地，可以使用诸如Polymin-P或Praestol 2640的带电聚合物的添加将分离的PMP溶液絮凝。简而言之，将Polymin-P或Praestol 2640添加到溶液中并且与叶轮混合。然后可以将溶液过滤以除去微粒。可替代地，可以通过增加盐浓度来增溶聚集体。例如，可以将NaCl添加到分离的PMP溶液中，直到其处于例如1mol/L。然后可以将溶液过滤以分离PMP。可替代地，通过增加温度来增溶聚集体。例如，可以将分离的PMP在混合下加热直到溶液达到例如50℃的均匀温度持续5分钟。然后可以将PMP混合物过滤以分离PMP。可替代地，可溶性污染物可以通过尺寸排阻色谱柱根据标准程序从PMP溶液中分离，其中PMP洗脱在第一级分中，而蛋白质和核糖核蛋白以及一些脂蛋白则随后洗脱。蛋白质聚集体去除的效率可以通过在除去蛋白质聚集体之前和之后经由BCA/Bradford蛋白质定量测量和比较蛋白质浓度来确定。
本文描述的任何生产方法可以补充有本领域已知的任何定量或定性方法，以在生产过程的任何步骤中表征或鉴定PMP。可以通过估计PMP产率、PMP浓度、PMP纯度、PMP组成、或PMP尺寸的多种分析方法来表征PMP。可以通过本领域中已知的能够进行PMP的可视化、定量、或定性表征(例如，组成鉴定)的许多方法，诸如显微镜术(例如，透射电子显微镜术)、动态光散射、纳米颗粒跟踪、光谱法(例如，傅立叶变换红外分析)、或质谱法(蛋白质和脂质分析)，来评估PMP。在某些情况下，可以使用方法(例如，质谱法)来鉴定PMP上存在的植物EV标记物，诸如附录中披露的标记物。为了帮助分析和表征PMP级分，可以另外对PMP进行标记或染色。例如，可以将PMP用3,3’-二己基氧杂羰花青碘化物(DIOC6)(荧光亲脂性染料，PKH67(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))；Alexa
Figure GDA0002918049650000281
488(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))、或DyLightTM 800(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))染色。在没有复杂形式的纳米颗粒追踪的情况下，这种相对简单的方法定量总膜含量并且可以用于间接测量PMP的浓度(Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1)：728-741,2017；Rutter等人,Bio.Protoc.[生物方案]7(17)：e2533,2017)。为了更精确的测量以及为了评价PMP的尺寸分布，可以使用纳米颗粒跟踪。
在生产过程中，可以任选地制备PMP，使得相对于对照或初始样品中的EV水平，PMP具有增加的浓度(例如，增加约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％；或增加约2x倍、4x倍、5x倍、10x倍、20x倍、25x倍、50x倍、75x倍、100x倍、或大于100x倍)。分离的PMP可以占有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的约0.1％至约100％，诸如约0.01％至约100％、约1％至约99.9％、约0.1％至约10％、约1％至约25％、约10％至约50％、约50％至约99％、或约75％至约100％中的任一者。在一些情况下，该组合物包含至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中的任一者的PMP，例如，如通过wt/vol百分比PMP蛋白组成和/或百分比脂质组成(例如，通过测量荧光标记的脂质)测量；参见例如实例3)。在一些情况下，浓缩的药剂用作商业产品，例如最终使用者可以使用稀释的药剂，该稀释的药剂具有显著较低浓度的活性成分。在一些实施例中，将该组合物配制成有害生物防治浓缩物配制品，例如超低体积浓缩物配制品。
如实例1所展示，PMP可以产生自多种植物或其部分(例如，叶质外体、种子质外体、根、果实、营养部分、花粉、韧皮部、或木质部汁液)。例如，PMP可以分离自植物的质外体级分，诸如叶的质外体(例如，拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶的质外体)或种子的质外体(例如，向日葵种子的质外体)。其他示例性PMP产生自根(例如，姜根)、果汁(例如，葡萄柚汁)、植物(例如，西兰花)、花粉(例如，橄榄花粉)、韧皮汁液(例如，拟南芥属韧皮汁液)、木质部汁液(例如，番茄植物木质部汁液)、或细胞培养物上清液(例如，BY2烟草细胞培养物上清液)。此实例进一步证明了从这些不同的植物源中生产PMP。
如实例2所展示，可以通过多种方法(例如通过使用密度梯度(碘克沙醇或蔗糖)结合超速离心和/或除去聚集的污染物的方法(例如，沉淀或尺寸排阻色谱法))纯化PMP。例如，实例2展示了通过实例1中概述的分离步骤获得的PMP的纯化。此外，PMP可以根据实例3中展示的方法来表征。
在一些情况下，可以从植物或其一部分中分离出本发明组合物和方法的PMP，并且不经进一步修饰PMP来使用。在其他情况下，可以在使用之前修饰PMP，如本文进一步概述。
B.植物EV标记物
本发明的组合物和方法的PMP可以具有一系列标记物，这些标记物将PMP鉴定为是从植物EV产生的和/或包括其节段、部分或提取物。如本文所用，术语“植物EV标记物”是指与植物天然缔合并且在植物体内掺入植物EV中或上的组分，诸如植物蛋白、植物核酸、植物小分子、植物脂质、或其组合。植物EV标记物的实例可以在例如以下中发现：Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017；Raimondo等人,Oncotarget.[肿瘤靶标]6(23):19514,2015；Ju等人,Mol.Therapy.[分子疗法]21(7):1345-1357,2013；Wang等人,Molecular Therapy.[分子疗法]22(3)：522-534,2014；和Regente等人,J ofExp.Biol.[实验生物学杂志]68(20):5485-5496,2017；将其中每个通过引用并入本文。植物EV标记物的另外实例在附录中列出并且在本文中进一步概述。
植物EV标记物可以包括植物脂质。可以在PMP中发现的植物脂质标记物的实例包括植物固醇、菜油固醇、β-谷固醇、豆固醇、燕麦固醇(avenasterol)、糖基肌醇磷酰基神经酰胺(GIPC)、糖脂(例如，单半乳糖基二酰基甘油(MGDG)或二半乳糖基二酰基甘油(DGDG))、或其组合。例如，PMP可以包括GIPC，GIPC表示植物中的主要鞘脂并且是植物中最丰富的膜脂质之一。其他植物EV标记物可以包括响应于非生物胁迫原或生物胁迫原(例如，细菌感染或真菌感染)而在植物中积累的脂质，诸如磷脂酸(PA)或磷脂酰肌醇-4-磷酸酯(PI4P)。
可替代地，植物EV标记物可以包括植物蛋白。在一些情况下，蛋白质植物EV标记物可以是植物天然产生的抗微生物蛋白，包括植物响应于非生物胁迫原或生物胁迫原(例如，细菌感染或真菌感染)而分泌的防御蛋白。植物病原体防御蛋白包括可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子缔合蛋白受体蛋白(SNARE)的蛋白质(例如，突触融合蛋白-121(SYP121；GenBank登录号：NP_187788.1或NP_974288.1)、渗透(Penetration)1(PEN1；GenBank登录号：NP_567462.1))或ABC转运蛋白渗透3(PEN3；GenBank登录号：NP_191283.2)。植物EV标记物的其他实例包括促进在植物中长距离转运RNA的蛋白质，包括韧皮部蛋白(例如，韧皮部蛋白2-A1(PP2-A1)，GenBank登录号：NP_193719.1)、钙依赖性脂质结合蛋白、或凝集素(例如，木菠萝相关凝集素，例如向日葵(Helianthus annuus)木菠萝(Helja；GenBank：AHZ86978.1)。例如，RNA结合蛋白可以是富含甘氨酸的RNARNA结合蛋白-7(GRP7；GenBank登录号：NP_179760.1)。另外，在一些情况下，调节胞间连丝功能的蛋白质可以在植物EV(包括蛋白质，诸如Synap-Totgamin AA(GenBank登录号：NP_565495.1))中发现。在一些情况下，植物EV标记物可以包括参与脂质代谢的蛋白质，诸如磷脂酶C或磷脂酶D。在一些情况下，植物蛋白EV标记物是植物中的细胞运输蛋白。在植物EV标记物是蛋白质的某些情况下，该蛋白质标记物可能缺少典型地与分泌的蛋白质相关的信号肽。非常规的分泌蛋白似乎共有若干个共同特征，如(i)缺少前导序列，(ii)缺少对ER或高尔基体具有特异性的PTM，和/或(iii)不受布雷菲德菌素A影响的分泌，布雷菲德菌素A阻断经典的ER/高尔基体依赖性分泌途径。本领域技术人员可以使用公众可免费获取的多种工具(例如，SecretomeP数据库；SUBA3(拟南芥属蛋白的亚细胞定位数据库(SUBcellular localization database forArabidopsis proteins)))来评估信号序列的蛋白质或其缺少。
在植物EV标记物是蛋白质的某些情况下，该蛋白质可以具有与植物EV标记物(诸如附录中列出的植物EV标记物)具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。例如，该蛋白质可以具有与来自拟南芥的PEN1(GenBank登录号：NP_567462.1)具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，植物EV标记物包括在植物中编码的核酸，例如植物RNA、植物DNA、或植物PNA。例如，PMP可以包括由植物编码的dsRNA、mRNA、病毒RNA、微RNA(miRNA)、或小干扰RNA(siRNA)。在一些情况下，该核酸可以是与促进在植物中长距离转运RNA的蛋白质相关的核酸，如本文所讨论。在一些情况下，核酸植物EV标记物可以是参与宿主诱导的基因沉默(HIGS)的核酸植物EV标记物，HIGS是植物沉默植物有害生物(例如，病原体，诸如真菌)的外来转录物的过程。例如，该核酸可以是使细菌基因或真菌基因沉默的核酸。在一些情况下，该核酸可以是微RNA，诸如miR159或miR166，该微RNA靶向真菌病原体(例如，大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae))中的基因。在一些情况下，该蛋白质可以是参与携带植物防御化合物的蛋白质，诸如参与芥子油苷(GSL)转运和代谢的蛋白质，包括芥子油苷转运蛋白-1-1(GTR1；GenBank登录号：NP_566896.2)、芥子油苷转运蛋白-2(GTR2；NP_201074.1)、或环硫特异性(Epithiospecific)修饰子1(ESM1；NP_188037.1)。
在植物EV标记物是核酸的情况下，该核酸可以具有与植物EV标记物具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，例如诸如编码附录中列出的植物EV标记物的那些。例如，该核酸可以具有与miR159或miR166具有至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、或100％序列同一性的多核苷酸序列。
在一些情况下，植物EV标记物包括由植物产生的化合物。例如，该化合物可以是响应于非生物胁迫原或生物胁迫原而产生的防御化合物，诸如次生代谢物。在PMP中发现的一种此类次生代谢物是芥子油苷(GSL)，GSL是主要在十字花科(Brassicaceae)植物中发现的含有氮和硫的次生代谢物。其他次生代谢物可以包括化感物质。
在一些情况下，基于典型地不是由植物产生的但通常与其他生物体相关的(例如，动物EV、细菌EV、或真菌EV的标记物)某些标记物(例如，脂质、多肽、或多核苷酸)的缺少，PMP也可以被鉴定为是从植物EV产生的。例如，在一些情况下，PMP缺少典型地在动物EV、细菌EV或真菌EV中发现的脂质。在一些情况下，PMP缺少作为动物EV的典型特征的脂质(例如，鞘磷脂)。在一些情况下，PMP不含作为细菌EV或细菌膜的典型特征的脂质(例如，LPS)。在一些情况下，PMP缺少作为真菌膜的典型特征的脂质(例如，麦角固醇)。
可以使用本领域已知的能够鉴定小分子(例如，质谱法、质谱法)、脂质(例如，质谱法、质谱法)、蛋白质(例如，质谱法、免疫印迹法)、或核酸(例如，PCR分析)的任何方法来鉴定植物EV标记物。在一些情况下，本文描述的PMP组合物包含可检测量(例如，预定阈值量)的本文描述的植物EV标记物。
C.药剂的负载
PMP可以被修饰为包含异源功能剂，例如杀有害生物剂或驱避剂，诸如本文描述的那些。PMP可以通过多种手段携带此类药剂或与其缔合，以使该药剂能够递送至靶植物或植物有害生物，例如通过包封该药剂、将该组分结合在脂质双层结构中、或将该组分(例如，通过缀合)与PMP的脂质双层结构的表面缔合。
可以通过本领域已知的允许直接或间接在PMP与药剂之间缔合的任何方法将异源功能剂结合或负载到PMP中或上。可以通过体内方法(例如，在植物体内，例如通过从包含异源剂的转基因植物中生产PMP)、或体外(例如，在组织培养物中或在细胞培养物中)、或体内和体外方法两者，将异源功能剂掺入PMP中。
在体内向PMP负载异源功能剂(例如，杀有害生物剂或驱避剂)的情况下，PMP可以产生自已在植物体内、在组织培养物中、或在细胞培养物中负载的EV或其节段、部分或提取物。植物体内方法包括在已遗传修饰为表达异源功能剂的植物中表达异源功能剂(例如，杀有害生物剂或驱避剂)。在一些情况下，异源功能剂对植物是外源的。可替代地，异源功能剂可以天然发现于植物中，但以相对于在非遗传修饰的植物中发现的其水平升高的水平表达。
在一些情况下，PMP可以体外负载。该物质可以使用但不限于物理、化学和/或生物学方法负载到PMP上或中(例如，可以被PMP包封)。例如，可以通过电穿孔、超声处理、被动扩散、搅拌、脂质提取、或挤出中的一种或多种将异源功能剂掺入PMP中。可以使用多种方法来评价负载的PMP，以确认负载的药剂的存在或水平，这些方法诸如HPLC(例如，用于评价小分子)；免疫印迹法(例如，用于评价蛋白质)；和定量PCR(例如，用于评价核苷酸)。然而，本领域技术人员应当认识到，将感兴趣的物质负载到PMP中不限于以上展示的方法。
在一些情况下，可以将异源功能剂与PMP缀合，其中异源功能剂间接或直接地连接或接连至PMP。例如，可以将一种或多种杀有害生物剂化学连接至PMP，使得该一种或多种杀有害生物剂直接接连(例如，通过共价键或离子键)至PMP的脂质双层。在一些情况下，各种杀有害生物剂与PMP的缀可以通过首先将一种或多种异源功能剂与适当的交联剂(例如，N-乙基碳二亚胺(“EDC”)，EDC通常用作与伯胺进行酰胺键合的羧基活化剂并且还与磷酸酯基团反应)在合适的溶剂中混合啦实现。在足以允许异源功能剂附接至交联剂的孵育时间段后，然后可以将交联剂/异源功能剂混合物与PMP键合，并且在另一个孵育时间段后，经受蔗糖梯度(例如，和8％、30％、45％、和60％蔗糖梯度)以将游离的异源功能剂和游离的PMP与缀合至PMP的杀有害生物剂分离。作为将混合物与蔗糖梯度混合以及伴随的离心步骤的一部分，与杀有害生物剂缀合的PMP然后在蔗糖梯度中作为条带被看见，使得然后可以将缀合的PMP收集、洗涤并且溶解在如本文描述使用的合适溶液中。
在一些情况下，在将PMP递送至例如植物或有害生物之前和之后，PMP与异源功能剂稳定缔合。在其他情况下，PMP与异源功能剂缔合，使得在将PMP递送至例如植物或有害生物之后，该异源功能剂变成与PMP解离的。
可以将PMP用其他组分(例如，脂质、例如固醇，例如胆固醇；或小分子)进一步修饰，以进一步改变PMP的功能和结构特征。例如，可以将PMP用稳定分子进一步修饰，这些稳定分子增加PMP的稳定性(例如，在室温下持续至少一天和/或在
Figure GDA0002918049650000341
下稳定至少一周)。
PMP可以负载有各种浓度的异源功能剂，取决于特定的药剂或用途。例如，在一些情况下，负载PMP，使得本文披露的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含约0.001、0.01、0.1、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或95(或在约0.001与95之间的任何范围)或更大wt％的杀有害生物剂和/或驱避剂。在一些情况下，负载PMP，使得有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含约95、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.0、0.1、0.01、0.001(或在约95与0.001之间的任何范围)或更小wt％的杀有害生物剂和/或驱避剂。例如，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以包含约0.001至约0.01wt％、约0.01至约0.1wt％、约0.1至约1wt％、约1至约5wt％、或约5至约10wt％、约10至约20wt％的杀有害生物剂和/或驱避剂。在一些情况下，PMP可以负载有约1、5、10、50、100、200、或500、1,000、2,000(或在约1与2,000之间的任何范围)或更大μg/ml的杀有害生物剂和/或驱避剂。本发明的脂质体可以负载有约2,000、1,000、500、200、100、50、10、5、1(或在约2,000与1之间的任何范围)或更小μg/ml的杀有害生物剂和/或驱避剂。
在一些情况下，负载PMP，使得本文披露的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含至少0.001wt％、至少0.01wt％、至少0.1wt％、至少1.0wt％、至少2wt％、至少3wt％、至少4wt％、至少5wt％、至少6wt％、至少7wt％、至少8wt％、至少9wt％、至少10wt％、至少15wt％、至少20wt％、至少30wt％、至少40wt％、至少50wt％、至少60wt％、至少70wt％、至少80wt％、至少90wt％、或至少95wt％的杀有害生物剂和/或驱避剂。在一些情况下，PMP可以负载有至少1μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少200μg/ml、至少500μg/ml、至少1,000μg/ml、至少2,000μg/ml的杀有害生物剂和/或驱避剂。
可以负载到PMP中的特定杀有害生物剂或驱避剂的实例在标题为“异源功能剂”的部分中进一步概述。
D.配制品
为了允许易于应用、处理、转运、储存和活性，可以将活性剂(在此为PMP)与其他物质一起配制。可以将PMP配制成例如诱饵、浓缩乳液、粉剂、可乳化浓缩物、熏剂、凝胶、颗粒剂、微胶囊、种子处理剂、悬浮液浓缩物、悬乳剂、片剂、水溶性液体、水可分散颗粒剂或干燥可流动剂、可湿性粉剂、和超低容量溶液。关于配制品类型的进一步信息，参见“Catalogueof Pesticide Formulation Types and International Coding System[杀有害生物剂配制品类型目录和国际编码系统]”Technical Monograph[技术专论]n°2,第5版,CropLifeInternational[国际作物生命协会](2002)。
活性剂(例如，PMP、另外的杀有害生物剂)可以以从此类药剂的浓缩制配制品制备的水性悬浮液或乳液的形式应用。此类水溶性、水可悬浮性、或可乳化配制品是固体，通常称为可湿性粉剂或水可分散颗粒剂；或液体，通常称为可乳化浓缩物或水性悬浮液。可压实形成水可分散颗粒剂的可湿性粉剂包含杀有害生物剂、载体和表面活性剂的紧密混合物。载体通常选自绿坡缕石(attapulgite)粘土、蒙脱石(montmorillonite)粘土、硅藻土、或纯化硅酸盐。占可湿性粉剂的约0.5％至约10％的有效表面活性剂经发现于磺化木质素、缩合萘磺酸盐、萘磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、和诸如烷基苯酚的环氧乙烷加合物的非离子表面活性剂。
可乳化浓缩物可以包含合适浓度的溶解于载体中的PMP(诸如从约50至约500克/升液体)，该载剂是水混溶性溶剂或水不可混溶性有机溶剂和乳化剂的混合物。可用的有机溶剂包括芳族化合物(尤其是二甲苯)和石油馏分(尤其是石油的高沸点萘和烯部分，诸如重芳族石脑油)。也可以使用其他有机溶剂，诸如包括松香衍生物的萜烯溶剂、诸如环己酮的脂族酮、和诸如2-乙氧基乙醇的复杂醇。用于可乳化浓缩物的合适乳化剂选自常规的阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂。
水性悬浮液包括水不溶性杀有害生物剂以按重量计从约5％至约50％的浓度分散在水性载体中的悬浮液。悬浮液通过以下方式制备：精细研磨杀有害生物剂并且将其剧烈混合到由水和表面活性剂构成的载体中。还可以添加诸如无机盐和合成胶或天然胶的成分以增加水性载体的密度和粘度。
PMP也可以以颗粒组合物的形式应用，这些颗粒组合物特别可用于应用于土壤。颗粒组合物通常含有按重量计从约0.5％至约10％的杀有害生物剂，该杀有害生物剂分散于包含粘土或类似物质的载体中。通常通过将配制品溶解于合适的溶剂中并且将其应用到已预先形成为在从约0.5mm至约3mm的适当粒度的颗粒载体中来制备此类组合物。也可以通过制造载体和化合物的粘团或糊剂并且挤压和干燥以获得所希望的颗粒粒度来配制此类组合物。
通过将呈粉末形式的PMP与合适的粉尘状农业载体(诸如高岭土、研磨的火山岩等)紧密混合来制备含有本发明的PMP配制品的粉剂。粉剂可以适当地含有从约1％至约10％的小包。它们可以以拌种的形式或以用喷粉机的叶面应用的形式来应用。
同样实用的是以在适当的有机溶剂(通常为石油，诸如广泛用于农业化学的喷淋油)中的溶液的形式应用本发明的配制品。
PMP也可以以气雾剂组合物的形式应用。在此类组合物中，小包溶解或分散于作为产生压力的推进剂混合物的载体中。将气雾剂组合物包装在通过雾化阀分配混合物的容器中。
另一个实施例是水包油乳液，其中该乳液包含各自具备层状液晶包衣并且分散在水相中的油性小珠，其中每个油性小珠包含至少一种具有农业活性的化合物并且单独地被单层状层或多层状层包覆，该单层状层或多层状层包含：(1)至少一种非离子亲脂性表面活性剂，(2)至少一种非离子亲水性表面活性剂，和(3)至少一种离子表面活性剂，其中这些小珠具有小于800纳米的平均粒径。在2007年2月1日公开的美国专利公开20070027034中披露了有关该实施例的更多信息。为了易于使用，此实施例将被称为“OIWE”。
另外，通常，当以上披露的分子用于配制品时，此类配制品还可以含有其他组分。这些组分包括但不限于(这是非详尽且非互相排他性列表)润湿剂、铺展剂、粘着剂、渗透剂、缓冲液、螯合剂、减漂剂、相容剂、消泡剂、清洁剂、和乳化剂。接着描述数种组分。
润湿剂是当被添加到液体中时通过减小液体与它在上面铺展的表面之间的界面张力而增加液体的铺展或渗透能力的物质。润湿剂因两个主要功能而用于农业化学配制品：在加工和制造期间，增加粉末在水中润湿的速率以制造可溶性液体的浓缩物或悬浮液浓缩物；以及在将产品与水在喷洒罐中混合期间，减少可湿性粉剂的润湿时间并且改进水到水可分散颗粒剂中的渗透。用于可湿性粉剂、悬浮液浓缩物和水可分散颗粒剂配制品的润湿剂的实例是：月桂基硫酸钠；磺基琥珀酸二辛酯钠；烷基酚乙氧基化物；和脂族醇乙氧基化物。
分散剂是吸附于颗粒表面上并且有助于保持颗粒的分散状态并且防止其再聚集的物质。将分散剂添加到农业化学配制品中以促进在制造期间的分散和悬浮并且确保颗粒再分散于喷洒罐中的水中。它们广泛用于可湿性粉剂、悬浮液浓缩物、和水可分散颗粒剂。用作分散剂的表面活性剂具有强烈吸附于颗粒表面上并且对颗粒再聚集提供带电荷的壁垒或空间壁垒的能力。最常用的表面活性剂是阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、或两种类型的混合物。对于可湿性粉剂配制品，最常见的分散剂是木质素磺酸钠。对于悬浮液浓缩物，使用聚电解质(诸如萘磺酸钠甲醛缩合物)获得非常好的吸附和稳定。也使用三苯乙烯基酚乙氧基化物磷酸酯。诸如烷基芳基环氧乙烷缩合物和EO-PO嵌段共聚物的非离子表面活性剂有时与作为分散剂的阴离子表面活性剂组合用于悬浮液浓缩物。近年来，已开发出新型的非常高分子量的聚合物表面活性剂作为分散剂。它们具有非常长的疏水性“主链”和大量环氧乙烷链，这些环氧乙烷链形成“梳型”表面活性剂的“齿”。这些高分子量聚合物可以赋予悬浮液浓缩物非常好的长期稳定性，因为疏水性主链具有到颗粒表面上的许多锚点。用于农业化学配制品的分散剂的实例是：木质素磺酸钠；萘磺酸钠甲醛缩合物；三苯乙烯基酚乙氧基化物磷酸酯；脂族醇乙氧基化物；烷基乙氧基化物；EO-PO(环氧乙烷-环氧丙烷)嵌段共聚物；和接枝共聚物。
乳化剂是使一种液相的液滴在另一个液相中的悬浮液稳定的物质。在无乳化剂的情况下，可以将两种液体分成两种不可混溶性液相。最常用的乳化剂共混物含有具有十二个或更多个环氧乙烷单元的烷基酚或脂族醇和油溶性的十二烷基苯磺酸钙盐。从8至18的亲水亲油平衡(“HLB”)值将通常提供良好的稳定乳液。乳液稳定性有时可以通过添加少量EO-PO嵌段共聚物表面活性剂来改进。
增溶剂是将以高于临界胶束浓度的浓度在水中形成胶束的表面活性剂。这些胶束然后能够溶解或增溶胶束的疏水性部分内的水不溶性材料。通常用于增溶的表面活性剂的类型是非离子表面活性剂、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯乙氧基化物、和油酸甲酯。
表面活性剂有时单独使用或与作为用于喷洒罐混合料的佐剂的其他添加剂(诸如矿物油或植物油)一起使用，以改进杀有害生物剂对于标靶的生物性能。用于生物增强的表面活性剂的类型通常取决于杀有害生物剂的性质和作用方式。然而，它们通常是非离子表面活性剂，诸如：烷基乙氧基化物；线性脂族醇乙氧基化物；脂族胺乙氧基化物。
农业配制品中的载体或稀释剂是添加到杀有害生物剂中以给出所希望的强度的产品的材料。载体通常是具有高吸收能力的材料，而稀释剂通常是具有低吸收能力的材料。载体和稀释剂用于粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、和水可分散颗粒剂的配制。
有机溶剂主要用于配制可乳化浓缩物、水包油乳液、悬乳剂、和超低容量配制品，并且在较小程度上用于配制颗粒配制品。有时使用溶剂混合物。第一主组的溶剂是脂族石蜡油，诸如煤油或精制石蜡。第二主组(并且最常用的)包括芳族溶剂，诸如二甲苯和较高分子量的C9和C10芳族溶剂馏分。氯化烃可用作助溶剂以便当配制品乳化在水中时防止杀有害生物剂结晶。醇有时用作助溶剂以增加溶解能力。其他溶剂可以包括植物油、种子油、和植物油和种子油的酯。
增稠剂或胶凝剂主要用于配制悬浮液浓缩物、乳液和悬乳剂，以改变液体的流变学或流动特性以及防止分散的颗粒或液滴的分离和沉降。增稠剂、胶凝剂和防沉剂通常分成两个类别，即水不溶性微粒和水溶性聚合物。可以使用粘土和二氧化硅来生产悬浮液浓缩物配制品。这些类型的材料的实例包括但不限于蒙脱石、膨润土、硅酸镁铝、和绿坡缕石。水溶性多糖已被用作增稠胶凝剂多年。最常用的多醣类型是种子和海草的天然提取物或是纤维素的合成衍生物。这些类型的材料的实例包括但不限于瓜尔胶；刺槐豆胶；卡拉胶；藻酸酯；甲基纤维素；羧甲基纤维素钠(SCMC)；羟乙基纤维素(HEC)。其他类型的防沉剂基于改性淀粉、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、和聚环氧乙烷。另一种良好的防沉剂是黄原胶。
微生物可以导致配制产品的腐败。因此，使用防腐剂来消除或减小其作用。此类药剂的实例包括但不限于：丙酸及其钠盐；山梨酸及其钠盐或钾盐；苯甲酸及其钠盐；对羟基苯甲酸钠盐；对羟基苯甲酸甲酯；和1,2-苯并噻唑啉-3-酮(BIT)。
表面活性剂的存在通常在生产中和在通过喷洒罐进行的应用中的混合操作期间导致基于水的配制品起泡。为了减少起泡的倾向，通常在生产阶段期间或在填充至瓶中之前添加消泡剂。通常，存在两种类型的消泡剂，即硅酮和非硅酮。硅酮通常是二甲基聚硅氧烷的水性乳液，而非硅酮消泡剂是水不溶性油(诸如辛醇和壬醇)或二氧化硅。在两种情况下，消泡剂的功能是使表面活性剂从空气-水界面移位。
“绿色”剂(例如，佐剂、表面活性剂、溶剂)可以减少作物保护配制品的整体环境足迹。绿色剂是可生物降解的并且通常源自天然和/或可持续源，例如植物源和动物源。具体实例是：植物油、种子油、及其酯，以及烷氧基化烷基聚葡萄糖苷。
在某些情况下，可以将PMP冷冻干燥或冻干。参见美国专利号4,311,712。PMP可以随后在与水或另一种液体接触后重构。可以将其他组分添加到冻干或重构的脂质体中，例如其他杀有害生物剂、农业上可接受的载体、或根据本文描述的配制品的其他材料。
组合物的其他任选特征包括保护有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物免受UV和/或酸性条件的载体或递送媒介物。在一些情况下，该递送媒介物含有pH缓冲液。在一些情况下，将组合物配制为具有在约4.5至约9.0的范围(包括例如约5.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约6.5至约7.0中任一者的pH范围)内的pH。
可以将组合物另外与将有害生物吸引到组合物附近的引诱剂(例如，化学引诱剂)一起配制。引诱剂包括信息素(由动物(尤其是有害生物)分泌的化学物)或化学引诱剂，它们影响相同物种的其他个体的行为或发育。其他引诱剂包括糖和蛋白水解产物糖浆、酵母和腐肉。还可以将引诱剂与活性成分组合并且喷雾到处理区域中的叶子或其他物品上。已知各种引诱剂影响有害生物的行为，如有害生物对食物、产卵或交配地点或配偶的搜寻。可用于本文描述的方法和组合物的引诱剂包括：例如，丁香酚、丙酸苯乙酯、二甲基异丁基环丙烷甲酸乙酯、苯并二噁烷甲酸丙酯、顺式-7,8-环氧-2-甲基十八烷、反式-8,反式-0-十二碳二烯醇、顺式-9-十四烯醛(具有顺式-11-十六烯醛)、反式-11-十四烯醛、顺式-11-十六烯醛、(Z)-11,12-十六碳二烯醛、顺式-7-十二烯基乙酸酯、顺式-8-十二烯基乙酸酯、顺式-9-十二烯基乙酸酯、顺式-9-十四碳烯基乙酸酯、顺式-11-十四碳烯基乙酸酯、反式-11-十四碳烯基乙酸酯(具有顺式-11)、顺式-9,反式-11-十四碳二烯基乙酸酯(具有顺式-9,反式-12)、顺式-9,反式-12-十四碳二烯基乙酸酯、顺式-7,顺式-11-十六碳双烯乙酸酯(具有顺式-7,反式-11)、顺式-3,顺式-13-十八碳二烯基乙酸酯、反式-3,顺式-13-十八碳二烯基乙酸酯、茴香脑和水杨酸异戊酯。
关于农业配制品的进一步信息，参见D.A.Knowles编辑的“Chemistry andTechnology of Agrochemical Formulations[农业化学配制品的化学和技术]”,版权1998归属于Kluwer Academic Publishers[克鲁维尔学术出版社]。还参见A.S.Perry,I.Yamamoto,I.Ishaaya,和R.Perry的“Insecticides in Agriculture and Environment-Retrospects and Prospects[农业杀昆虫剂与环境-回顾与展望]”,版权1998归属于Springer-Verlag[施普林格出版社]。
II.农业方法
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可用于多种农业方法，特别是用于预防或减少植物有害生物的侵害。
本发明的方法涉及将本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至植物或植物有害生物，诸如本文中包括的描述的那些。这些组合物和相关方法可以用于预防在植物、植物部分(例如，根、果实和种子)上，在土壤中或上，或在另一种植物介质上植物有害生物的侵染或减少其数量。因此，这些组合物和方法可以通过例如杀死、伤害或减慢有害生物的活性来减小植物有害生物对植物的损伤作用，并且从而增加植物的适应度。植物有害生物包括例如昆虫、线虫、软体动物、细菌、真菌、卵菌、原生动物、和杂草(参见关于“植物有害生物”的部分)。本发明的组合物可以用于防治、杀死、伤害、麻痹处于任何发育阶段(例如，它们的卵、若虫、龄虫、幼虫(larvae)、成虫、幼龄虫(juvenile)、或干燥形式)的这些有害生物中的任何一种或多种、或减少其活动。该方法还可以进一步可用于防治杂草。这些方法中的每一种的细节将在下面进一步描述。
A.向植物的递送
本文提供了向植物递送本文披露的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的方法。包括用于通过使植物或其一部分与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至植物的方法。这些方法可以用于例如通过处理或预防植物有害生物侵染增加植物的适应度。
因此，这些方法可以用于增加植物的适应度。在一个方面，本文提供了一种增加植物的适应度的方法，该方法包括向该植物递送本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，以有效的量和持续时间)以相对于未处理的植物(例如，未递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的植物)增加该植物的适应度。
作为递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的结果而导致的植物适应度的增加可以以许多种方式显现，例如从而导致植物的生产更好，例如改进的产率、改进的植物活力或从植物收获的产品的品质。改进的植物产率涉及相对于在相同条件下但不应用本发明组合物而生产的植物的相同产品的产率或与应用常规杀有害生物剂相比，按可测量量计植物的产品的产率的增加(例如，如通过植物生物质、谷粒、种子或果实产率、蛋白质含量、碳水化合物或油含量或叶面积测量的)。例如，产率可以增加至少约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、或大于100％。产率可以以在某种基础上植物或植物的产品的按重量或体积计量来表示。基础可以以时间、生长面积、生产的植物的重量、或所用原料的量来表示。例如，此类方法可以增加植物组织的产率，这些植物组织包括但不限于：种子、果实、仁、圆荚、块茎、根和叶。
作为递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的结果而导致的植物适应度的增加也可以通过其他手段来测量，诸如相对于在相同条件下但不施用本发明组合物或施用常规杀有害生物剂而生产的植物的活力等级、植株密度(stand)(植物数量/单位面积)、植物高度、秆围、秆长、叶数量、叶尺寸、植物冠层、视觉外观(诸如更绿的叶颜色)、根等级、出苗、蛋白质含量、增加的分蘖、更大的叶、更多的叶、更少的死的基生叶、更强的分蘖、更少的所需肥料、更少的所需种子、更多产的分蘖、更早开花、提早的谷粒或种子成熟度、更少的植物节(verse)(倒伏)、增加的芽生长、更早萌发、或这些因素的任何组合，按可测量或可察觉的量计相同因素的增加或改进。
i.有害生物处理
本文包括一种降低具有侵染的植物中的有害生物侵染的方法，其中该方法包括将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至植物(例如，以有效量和有效持续时间)以相对于未处理的植物中的侵染降低侵染。例如，相对于未处理的植物，该方法可以有效地将侵染降低约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％、或大于100％。在一些情况下，相对于未处理的植物，该方法有效地将侵染降低约2x倍、5x倍、10x倍、25x倍、50x倍、75x倍、100x倍、或大于100x倍。在一些情况下，相对于未处理的植物中的侵染，该方法显著消除侵染。可替代地，该方法可以减缓植物侵染的进展或降低与植物侵染相关的症状的严重性。与对照相比，该组合物可以充分减少(例如，杀死或驱除)有害生物，例如至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以用于促进植物的生长。例如，通过减小有害的有害生物的适应度，本文提供的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以有效地促进典型地被有害生物侵害的植物的生长。这可能涉及或可能不涉及将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物直接应用于植物。例如，在原生有害生物生境不同于植物生长区域的情况下，可以将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物应用于原生有害生物生境、感兴趣的植物、或两者的组合。
在一些情况下，该植物可以是农业粮食作物，诸如谷物、谷粒、豆类、水果、或蔬菜作物；或非粮食作物，例如，草类、开花植物、棉花、干草、大麻。可以在收获谷物、谷粒、豆类、水果、蔬菜、或其他作物之前或之后的任何时间将本文描述的组合物递送至作物。作物产率是通常用于作物植物的度量，并且通常以公吨/公顷(或千克/公顷)测量。作物产率还可以指植物的实际种子产生。在一些情况下，与参考水平(例如，未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的作物)相比，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以有效地将作物产率(例如，增加谷物、谷粒、豆类、水果、或蔬菜的公吨/公顷和/或增加种子产生)增加约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更大。
侵染的降低是指植物上或周围的有害生物的数量的降低或由有害生物直接或间接引起的植物症状或体征的降低。可以在处理后的任何时间测量植物中的侵染程度，并且将其与处理时间时或之前的症状进行比较。植物可能显示或可能不显示出侵染的症状。例如，植物可能被有害生物侵染，但尚未显示出侵染体征，例如超敏反应(HR)。可以通过观察植物上的疾病症状来鉴定受侵染的植物。表达的疾病症状将取决于疾病，但是通常，症状包括病变、脓疱、坏死、超敏反应、萎蔫、萎黄、防御相关基因(例如，SAR基因)的诱导等。
技术人员应当认识到，用于确定由植物有害生物导致的植物侵染和疾病的方法取决于所测试的有害生物和植物。侵染或相关症状可以通过鉴定侵染或相关症状的任何手段来鉴定。多种方法可用来鉴定受侵染的植物和相关症状。在一个方面，这些方法可以涉及宏观或微观筛选感染和/或症状、定量PCR、或使用用于检测感染相关基因(例如，系统获得性抗性基因、防御素基因等)的微阵列。用于确定植物中的侵染的宏观和微观方法是本领域中已知的，并且包括鉴定由侵染或由病变、坏死、孢子、菌丝、真菌菌丝体生长、萎蔫、枯萎、果实上的斑、腐烂、瘿瘤和矮化等的存在引起的对植物组织的损害。可以将此类症状与未被侵染的植物、受感染的植物的照片或展示图或其组合进行比较，以确定感染的存在或病原体的鉴定或两者。病原体感染的症状的照片和展示图是本领域中广泛可获得的，并且可例如从American Phytopathological Society[美国植物病理学会],圣保罗，明尼苏达州55121-2097获得。在一些情况下，症状肉眼可见或通过指定的放大倍率(例如，2x、3x、4x、5x、10x、或50x)可见。
在一些情况下，可以使用可商购的检测试剂盒来鉴定侵染或相关症状，以鉴定植物中的有害生物。此类测试试剂盒可从例如当地的农业推广机构或合作机构获得。在一些情况下，通过预测有利于疾病发展的天气和环境条件来鉴定需要处理的作物植物。在一些情况下，考察作物植物田地的植物疾病的技术人员鉴定需要处理的作物。
在一些情况下，可以使用基于聚合酶链反应(PCR)的诊断测定来鉴定感染或相关症状。基于PCR的测定可以用于对有害生物具有特异性的DNA或RNA序列(包括染色体DNA、线粒体l DNA、或核糖体RNA)执行PCR扩增。具体鉴定方法将取决于病原体。
可以预先确定该植物具有有害生物侵染。可替代地，该方法还可以包括鉴定具有侵染的植物。因此，还提供了通过以下方式处理植物有害生物侵染的方法：鉴定被植物有害生物侵染的(即，侵染后)植物，并且使受感染的植物与有效量的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触，使得侵染被处理。侵染可以通过任何可重复的测量手段进行测量。例如，可以通过计数植物上肉眼可见或在指定的放大倍数(例如，2x、3x、4x、5x、10x、或50x)下可见的病变数量来测量侵染。在其他情况下，可以通过在提供的植物区域或植物周围的区域内测量有害生物的浓度来测量侵染。
ii.有害生物预防
本文包括一种预防植物(例如，处于侵染风险的植物)中植物侵染的方法，其中该方法包括将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至该植物(例如，以有效的量和持续时间)以相对于未处理的植物中侵染的可能性降低侵染的可能性。例如，相对于未处理的植物，该方法可以将侵染的可能性降低约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％、或大于100％。在一些情况下，相对于未处理的植物，该方法可以将侵染的可能性降低约2x倍、5x倍、10x倍、25x倍、50x倍、75x倍、100x倍、或大于100x倍。可以预防或减少有害生物引起疾病、相关的疾病症状、或两者。
本文描述的方法和组合物可以用于通过减小侵染植物的有害生物的适应度来减少或预防处于发展侵染风险的植物中的有害生物侵染。在一些情况下，与参考水平(例如，未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的作物)相比，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以有效地将侵染(例如，减少受侵染的植物数量，减小有害生物群体规模，减小对植物的损害)减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更大。在其他情况下，与参考水平(例如，未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的作物)相比，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以有效地将作物侵染的可能性预防或减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更大。
这些预防方法可以用于预防处于被植物有害生物侵染的风险的植物中的侵染。例如，该植物可以是尚未暴露于植物有害生物的植物，但是在有害生物更可能侵染植物的情况下，例如在有害生物最佳气候条件下，该植物可能处于感染风险中。在植物位于生境中的杂草已经用除草剂处理并且从垂死的植物到矗立的植物的疾病交叉是可能的生境中的情况下，植物风险可能进一步增加。在一些情况下，通过预测有利于疾病发展的天气和环境条件来鉴定需要处理的作物植物。
这些方法可以在用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物处理后一定时间段内预防侵染。例如，这些方法可以在应用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物后若干周内预防植物侵染。例如，可以在用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物处理后至少约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35天内预防疾病。在一些情况下，在将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至植物后至少约40天内预防疾病。疾病的预防可以通过任何可重复的测量手段进行测量。在某些情况下，在递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物后7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30天，评价侵染。
B.向植物有害生物的递送
本文提供了向植物有害生物递送本文披露的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的方法。包括用于将通过使有害生物与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至有害生物的方法。这些方法可以用于降低有害生物的适应度，例如以作为递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的结果而预防或处理有害生物侵染。
因此，这些方法可以用于降低有害生物的适应度。在一个方面，本文提供了一种降低有害生物的适应度的方法，该方法包括向该有害生物递送本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，以有效的量和有效的持续时间)以相对于未处理的有害生物(例如，未递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物)降低有害生物的适应度。
在一个方面，本文提供了一种降低(例如，处理)具有真菌感染的植物中的真菌感染的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，本文描述的任何有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物)。
在另一个方面，本文提供了一种降低(例如，处理)具有真菌感染的植物中的真菌感染的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，本文描述的任何有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物)，并且其中该多个PMP包含抗真菌剂。在一些情况下，该抗真菌剂是核酸，该核酸抑制引起真菌感染的真菌中基因(例如，dcl1和dcl2(即，dcl1/2)的表达。在一些情况下，真菌感染是由真菌引起的，该真菌属于核盘霉属物种(Sclerotiniaspp.)(例如，核盘菌)、葡萄孢属物种(Botrytis spp.)(例如，灰葡萄孢菌)、曲霉属物种(Aspergillus spp.)、镰孢属物种(Fusarium spp.)、或青霉属物种(Penicillium spp.)。在一些情况下，该组合物包含从拟南芥属质外体EV产生的PMP。在一些情况下，该方法降低或显著消除真菌感染。
在另一个方面，本文提供了一种降低(例如，处理)具有细菌感染的植物中的细菌感染的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，本文描述的任何有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物)。
在另一个方面，本文提供了一种降低(例如，处理)具有细菌感染的植物中的细菌感染的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物，并且其中该多个PMP包含抗细菌剂。在一些情况下，抗细菌剂是链霉素。在一些情况下，细菌感染是由细菌引起的，该细菌属于假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)(例如，丁香假单胞菌或铜绿假单胞菌)。在一些情况下，该组合物包含从拟南芥属质外体EV产生的PMP。在一些情况下，该方法降低或显著消除细菌感染。在一些情况下，抗细菌剂是阿霉素或万古霉素。
在另一个方面，本文提供了一种降低昆虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该昆虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，本文描述的任何有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物)。
在另一个方面，本文提供了一种降低昆虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该昆虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，本文描述的任何有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物)，并且其中该多个PMP包含杀昆虫剂。在一些情况下，该杀昆虫剂是肽核酸。在一些情况下，该昆虫植物有害生物是蚜虫。在一些情况下，该昆虫植物有害生物是鳞翅目昆虫(例如，草地贪夜蛾)。在一些情况下，相对于未处理的昆虫植物有害生物，该方法降低昆虫植物有害生物的适应度
在另一个方面，本文提供了一种降低线虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该线虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，本文描述的任何有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物)。
在另一个方面，本文提供了一种降低线虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该线虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，本文描述的任何有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物)，并且其中该多个PMP包含杀线虫剂。在一些情况下，杀线虫剂是神经肽(例如，Mi-NLP-15b)。在一些情况下，线虫植物有害生物是玉米根结线虫。在一些情况下，相对于未处理的线虫植物有害生物，该方法降低该线虫植物有害生物的适应度。
在另一个方面，本文提供了一种降低杂草的适应度的方法，其中该方法包括向该杂草递送包含多个PMP的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，本文描述的任何有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物)。
在另一个方面，本文提供了一种降低杂草的适应度的方法，其中该方法包括向该杂草递送包含多个PMP的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，本文描述的任何有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物)，并且其中该多个PMP包含除草剂(例如，阿霉素或草铵膦)。在一些情况下，杂草是印度牛筋草(Indian goosegrass)(蟋蟀草(Eleusine indica))。在一些情况下，相对于未处理的杂草，该方法降低杂草的适应度。
作为递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的结果的有害生物适应度降低可以以许多种方式显现。在一些情况下，作为递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的结果，有害生物适应度的降低可以显现为有害生物的生理学的恶化或下降(例如，健康或存活降低)。在一些情况下，与未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比，生物体的适应度可以通过一种或多种参数来测量，该一种或多种参数包括但不限于繁殖速率、生育力、寿限、生存力、移动性、繁殖力、有害生物发育、体重、代谢速率或活动、或存活。例如，本文提供的方法或组合物可以有效地降低有害生物的总体健康或降低有害生物的总体存活。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物中发现的水平)，降低的有害生物存活大约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，与未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比，这些方法和组合物有效地降低有害生物繁殖(例如，繁殖速率、生育力)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物中发现的水平)，这些方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比，有害生物适应度的降低可以显现为有害生物中的一种或多种营养物(例如，维生素、碳水化合物、氨基酸、或多肽)的生产的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物中的营养物(例如，维生素、碳水化合物、氨基酸、或多肽)的生产降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比，有害生物适应度的降低可以显现为有害生物对杀有害生物剂的敏感性的增加和/或有害生物对杀有害生物剂的抗性的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物对杀有害生物剂的敏感性增加约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。该杀有害生物剂可以是本领域已知的任何杀有害生物剂，包括杀昆虫剂。在一些情况下，与未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比，本文提供的方法或组合物可以通过降低有害生物的将杀有害生物剂代谢或降解成可用底物的能力来增加有害生物对杀有害生物剂的敏感性。
在一些情况下，与未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比，有害生物适应度的降低可以显现为有害生物对化感剂的敏感性的增加和/或有害生物对化感剂的抗性的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物对化感剂的抗性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，化感剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂(soyacystatin)、杀螟松、单萜、二萜酸、或酚类化合物(例如，丹宁酸、类黄酮)。在一些情况下，与未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比，本文提供的方法或组合物可以通过降低有害生物的将化感剂代谢或降解成可用底物的能力来增加有害生物对化感剂的敏感性。
在一些情况下，与未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比，本文提供的方法或组合物可以有效地降低有害生物对寄生生物或病原体(例如，真菌的、细菌的、或病毒的病原体或寄生生物)的抗性。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物对病原体或寄生生物(例如，真菌的、细菌的、或病毒的病原体；或寄生螨)的抗性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，与未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比，本文提供的方法或组合物可以有效地降低有害生物的携带或传播植物病原体(例如，植物病毒(例如，TYLCV)或植物细菌(例如，农杆菌属物种(Agrobacterium spp))的能力。例如，相对于参考水平(例如，在未接受有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物中发现的水平)，本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物的携带或传播植物病原体(例如，植物病毒(例如，TYLCV)或植物细菌(例如，农杆菌属物种))的能力降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
另外或替代地，在PMP或其组合物中包含除草剂的情况下，这些方法可以进一步用于降低杂草的适应度或杀死杂草。在此类情况下，与未处理的杂草(例如，未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的杂草)相比，该方法可以有效地将杂草的适应度降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更大。例如，该方法可以有效地杀死杂草，从而与未处理的植物相比，将杂草群体降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更大。在一些情况下，该方法显著消除杂草。本文进一步描述了可以根据本发明的方法处理的杂草的实例。
在一些情况下，与未施用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比，有害生物适应度的降低可以显现为其他适应度劣势，诸如对某些环境因素的耐受性(例如，高温或低温耐受性)降低、在某些生境中存活的能力降低、或维持某种饮食的能力降低。在一些情况下，本文提供的方法或组合物可以以本文描述的任何多种方式有效地降低有害生物适应度。此外，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以降低任何数量的有害生物纲、目、科、属、或物种(例如，1个有害生物物种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、200、250、500、或更多个有害生物物种)中的有害生物适应度。在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物作用于单一有害生物纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估有害生物适应度。在一些情况下，可以通过评价单独的有害生物来评估有害生物适应度。可替代地，可以通过评价有害生物群体来评估有害生物适应度。例如，有害生物适应度的降低可以显现为与其他昆虫的成功竞争的降低，从而导致有害生物群体规模的减小。
C.应用方法
本文描述的有害生物可以以允许将组合物递送或施用于有害生物的任何合适方式暴露于本文描述的任何组合物。有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以单独递送或与其他活性(例如，杀有害生物剂)或非活性物质组合递送，并且可以通过例如喷雾、注射(例如，显微注射)、通过植物、倾倒、浸渍，以浓缩液体、凝胶、溶液、悬浮液、喷雾、粉剂、丸剂、块剂、砖剂等(配制成递送有效浓度的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物)的形式来应用。应用本文描述的组合物的量和位置通常通过有害生物的生境、有害生物可被有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物靶向所处的生命周期阶段、进行应用的位点、和有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的物理和功能特征来确定。本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以通过经口摄食施用于有害生物，但也可以通过允许渗透穿过角质层或渗透有害生物呼吸系统的手段来施用。
在一些情况下，可以简单地用包含有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的溶液“浸泡”或“喷雾”有害生物。可替代地，可以将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物与有害生物的食物组分(例如，可食用组分)连接，以易于递送和/或以便增加有害生物对有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的摄取。用于经口引入的方法包括：例如，直接将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物与有害生物的食物混合，将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物喷雾在有害生物的生境或田地中，以及工程化方法，其中将用作食物的物种工程化以表达有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物，然后饲喂受影响的有害生物。在一些情况下，例如，可以将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物掺入有害生物的饮食中或覆盖在其顶部。例如，可以将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物喷雾到有害生物栖息的作物的田地上。
在一些情况下，可以通过例如背包喷雾、空中喷雾、作物喷雾/尘剂等将组合物直接喷雾到植物(例如，作物)上。在将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至植物的情况下，接受有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的植物可以处于任何植物生长阶段。例如，配制的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以在植物生长的早期阶段以种子包衣或根处理剂的形式或在作物周期的后期阶段以总植物处理剂的形式来应用。在一些情况下，可以将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以局部药剂的形式应用于植物，使得有害生物摄食或在其他方面与植物相互作用后接触植物。
此外，可以将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以内吸剂的形式应用(例如，在植物生长的土壤中或在用于浇灌植物的水中)，该内吸剂被吸收和分布于植物或动物有害生物的组织中，使得以其为食的有害生物将获得有效剂量的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物。在一些情况下，植物或食物生物体可以经遗传转化以表达有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物，使得以植物或食物生物体为食的有害生物将摄食有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物。
延迟释放或持续释放也可以通过以下方式完成：向有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物或具有一种或多种有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的组合物包覆可溶解或生物可侵蚀的包衣层(诸如明胶)，该包衣在使用环境中溶解或侵蚀，从而然后使有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可用，或者通过将药剂分散在可溶解或可侵蚀的基质中。此类持续释放和/或分配手段装置可以有利地用于始终维持本文描述的一种或多种有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物在特定有害生物生境中的有效浓度。
也可以将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物掺入有害生物生长、生活、繁殖、进食或侵染的培养基中。例如，可以将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物掺入食物容器、进食站、保护性包装或蜂巢中。对于一些应用，可以将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物与固体支持物结合，用于以粉剂形式或于捕获器或进食站中施用。例如，对于其中组合物将被用于捕获器中或作为特定有害生物的诱饵的应用，也可以将这些组合物与固体支持物结合或包封在定时释放材料中。例如，可以通过将组合物递送至其中农业有害生物(例如，蚜虫)生长、生活、繁殖或进食的至少一个生境来施用本文描述的组合物。
通常建议将杀有害生物剂以杀有害生物剂/公顷(g/ha或kg/ha)的量或活性成分或酸等效物/公顷(kg a.i./ha或g a.i./ha)的量用于田地应用。在一些情况下，可能需要将在本发明组合物中的较低量的杀有害生物剂应用于土壤、植物培养基、种子植物组织、或植物以达到与在缺少PMP的组合物中应用杀有害生物剂的情况下相同的结果。例如，杀有害生物剂的量可以以比在非PMP组合物中应用的相同杀有害生物剂(例如直接应用相同杀有害生物剂)小约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、或100倍(或在约2与约100倍之间的任何范围，例如约2至10倍；约5至15倍、约10至20倍；约10至50倍)的水平应用。本发明的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以以各种量/公顷(例如以约0.0001、0.001、0.005、0.01、0.1、1、2、10、100、1,000、2,000、5,000(在约0.0001与5,000之间的任何范围)kg/ha)来应用。例如，约0.0001至约0.01、约0.01至约10、约10至约1,000、约1,000至约5,000kg/ha。
III.植物
可以将多种植物递送至本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物或用其处理。可以根据本发明方法递送有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(即，“处理的”)植物包括整株植物及其部分，包括但不限于芽营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳、子叶、和胚胎)和果实(成熟的子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)及其子代。植物部分可以进一步指诸如以下的植物部分：芽、根、茎、种子、托叶、叶、花瓣、花、胚珠、苞片、枝、叶柄、节间、树皮、短柔毛、分蘖、根茎、叶状体(frond)、叶片、花粉、雄蕊等。
可以在本文披露的方法中处理的植物的类别包括高等植物和低等植物类别，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、苔藓植物、和藻类(例如，多细胞藻类或单细胞藻类)。可以根据本发明方法处理的植物进一步包括任何维管植物，例如单子叶或双子叶植物或裸子植物，包括但不限于苜蓿、苹果、拟南芥属、香蕉、大麦、卡诺拉油菜、蓖麻籽、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉花、棉籽、玉米、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、石斛兰、薯蓣、桉树、羊茅草、亚麻、唐菖蒲、百合科、亚麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麦、油棕、油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草皮草、小麦和蔬菜作物(诸如莴苣、芹菜、西兰花、花椰菜、葫芦)；水果树和坚果树，诸如苹果、梨、桃、橙子、葡萄柚、柠檬、酸橙、扁桃、山核桃、胡桃、榛子；藤本植物，诸如葡萄(例如，葡萄园)、猕猴桃、蛇麻子(hop)；水果灌木和悬钩子，诸如覆盆子、黑莓、醋栗；林木，诸如水曲柳、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树、杨树(popular)；与苜蓿、卡诺拉油菜、蓖麻籽、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻籽、芥菜、油棕、油菜、花生、马铃薯、水稻、红花、芝麻、大豆、甜菜、向日葵、烟草、番茄、和小麦。可以根据本发明的方法处理的植物包括任何作物植物，例如，草料作物、油籽作物、谷物作物、水果作物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、香料作物、草皮作物、糖作物、饮料作物、和森林作物。在某些情况下，在该方法中处理的作物植物是大豆植物。在其他某些情况下，作物植物是小麦。在某些情况下，作物植物是玉米。在某些情况下，作物植物是棉花。在某些情况下，作物植物是苜蓿。在某些情况下，作物植物是甜菜。在某些情况下，作物植物是水稻。在某些情况下，作物植物是马铃薯。在某些情况下，作物植物是番茄。
在某些情况下，植物是作物。此类作物植物的实例包括但不限于单子叶植物和双子叶植物，包括但不限于饲养料或草料豆类、观赏植物、食物作物、树木、或灌木，选自枫属物种(Acer spp.)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、凤梨(Ananascomosus)、旱芹(Apium graveolens)、花生属物种(Arachis spp)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如，欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁(Brassica rapa ssp.)(卡诺拉油菜、油菜、白菜型油菜(turniprape))、野茶树(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis saliva)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、栗属物种(Castanea spp.)、栽培菊苣(Cichoriumendivia)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocosspp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、黄瓜属物种(Cucumis spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、水青冈属物种(Fagus spp.)、无花果(Ficuscarica)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属违章(Glycinespp.)(例如，大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)(例如，向日葵)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(例如，大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、胡桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、莲属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、蕃茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如，番茄(Lycopersicon esculenturn))、圣女果(Lycopersicon lycopersicum)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、苹果属物种(Malus spp.)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、稻属物种(Oryzaspp.)(例如，稻(Oryza sativa))、宽叶野生稻(Oryza latifolia)、黍稷(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、西番莲(Passiflora edulis)、欧芹(Petroselinum crispum)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、李属物种(Prunus spp.)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercusspp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharumspp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis spp.)、茄属物种(Solanum spp.)(例如，马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanumlycopersicum))、双色高粱(Sorghum bicolor)、石茅(Sorghum halepense)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、罗晃子(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、三叶草属物种(Trifolium spp.)、小黑麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属物种(Triticum spp.)(例如，普通小麦(Triticum aestivum))、硬粒小麦(Triticum durum)、圆锥小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、Triticum sativum或Triticum vulgare)、越橘属物种(Vaccinium spp.)、蚕豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、和玉米(Zea mays)。在某些实施例中，作物植物是水稻、油菜、卡诺拉油菜、大豆、玉米(玉蜀黍(maize))、棉花、甘蔗、苜蓿、高粱、或小麦。
在某些情况下，这些组合物和方法可以用于处理收获后的植物或植物部分、食物或饲料产品。在一些情况下，食物或饲料产品是非植物性食物或饲料产品(例如，人类、兽医动物、或牲畜可食用的产品(例如，蘑菇))。
用于本发明的植物或植物部分包括任何植物发育阶段的植物。在某些情况下，可以在萌发、幼苗生长、营养生长、和繁殖生长的阶段进行递送。在某些情况下，向植物的递送在营养生长和繁殖生长阶段期间进行。可替代地，可以进行向种子的递送。营养生长和繁殖生长阶段在本文中也称为“成株”或“成熟”植物。
IV.有害生物
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法可用于降低植物有害生物的适应度并且从而处理或预防植物中的有害生物侵染。“有害生物”是指无脊椎动物，例如昆虫、线虫、或软体动物；微生物(例如，植物病原体、内生植物、专性寄生生物、兼性寄生生物、或兼性腐生植物)，诸如细菌、真菌、或病毒、或杂草。此类有害生物对植物或其他生物体造成损害，存在于不希望它们的地方，或在其他方面例如通过影响人类农业方法或产品而对人不利。
本文进一步描述了可以用本发明的组合物或相关方法处理的植物有害生物的实例。
A.真菌
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法可以用于降低真菌的适应度，例如以预防或处理植物中的真菌感染。包括用于将通过使真菌与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至真菌的方法。另外或替代地，这些方法包括通过使植物与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至处于真菌感染的风险或具有真菌感染的植物。
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法适用于递送至真菌，这些真菌引起植物中的真菌疾病，包括由以下引起的疾病：白粉病病原体，例如白粉菌属(Blumeria)物种，例如小麦白粉菌(Blumeria graminis)；叉丝单囊壳属(Podosphaera)物种，例如白叉丝单囊壳(Podosphaera leucotricha)；单丝壳属(Sphaerotheca)物种，例如单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)；钩丝壳属(Uncinula)物种，例如葡萄钩丝壳(Uncinula necator)；由以下引起的疾病：锈病病原体，例如胶锈菌属(Gymnosporangium)物种，例如褐色胶锈菌(Gymnosporangium sabinae)；驼孢锈菌属(Hemileia)物种，例如咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)；层锈菌属(Phakopsora)物种，例如豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)；柄锈菌属(Puccinia)物种，例如隐匿柄锈菌(Puccinia recondite)、小麦叶锈菌(P.triticina)、禾柄锈菌(P.graminis)或条形柄锈菌(P.striiformis)或大麦柄锈菌(P.hordei)；单胞锈菌属(Uromyces)物种，例如疣顶单胞锈菌(Uromycesappendiculatus)；由来自以下各项的组的病原体引起的疾病：卵菌纲(Oomycetes)，例如白锈菌属(Albugo)物种，例如白锈菌(Algubo candida)；盘梗霉属(Bremia)物种，例如莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)；霜霉属(Peronospora)物种，例如豌豆霜霉(Peronospora pisi)、寄生霜霉(P.parasitica)或芸苔霜霉(P.brassicae)；疫霉属(Phytophthora)物种，例如致病疫霉(Phytophthora infestans)；单轴霉属(Plasmopara)物种，例如葡萄单轴霉(Plasmopara viticola)；假霜霉属(Pseudoperonospora)物种，例如葎草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)或古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis)；腐霉属(Pythium)物种，例如极腐霉(Pythium ultimum)；例如由以下引起的叶疱病和叶萎蔫病：链格孢属(Alternaria)物种，例如茄链格孢(Alternaria solani)；尾孢属(Cercospora)物种，例如甜菜生尾孢(Cercospora beticola)；枝孢属(Cladiosporium)物种，例如黄瓜枝孢(Cladiosporium cucumerinum)；旋孢腔菌属(Cochliobolus)物种，例如禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)(分生孢子形式：内脐蠕孢属(Drechslera)，同义：长蠕孢属(Helminthosporium)、宫部旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus)；炭疽菌属(Colletotrichum)物种，例如莱豆炭疽菌(Colletotrichum lindemuthanium)；锈斑病菌属(Cycloconium)物种，例如油橄榄孔雀斑病菌(Cycloconium oleaginum)；间座壳属(Diaporthe)物种，例如柑桔间座壳(Diaporthe citri)；痂囊腔菌属(Elsinoe)物种，例如柑橘痂囊腔菌(Elsinoe fawcettii)；盘长孢属(Gloeosporium)物种，例如悦色盘长孢(Gloeosporium laeticolor)；小丛壳属(Glomerella)物种，例如于围小丛壳(Glomerellacingulata)；球座菌属(Guignardia)物种，例如葡萄球座菌(Guignardia bidwelli)；小球腔菌属(Leptosphaeria)物种，例如斑点小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、颖枯壳小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)；稻瘟菌属(Magnaporthe)物种，例如稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；微座孢属(Microdochium)物种，例如雪霉微座孢(Microdochiumnivale)；球腔菌属(Mycosphaerella)物种，例如禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)、落花生球腔菌(M.arachidicola)和香蕉叶斑病(M.fifiensis)；暗球腔菌属(Phaeosphaeria)物种，例如颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)；核腔菌属(Pyrenophora)物种，例如圆核腔菌(Pyrenophora teres)、偃麦草核腔菌(Pyrenophoratritici repentis)；柱隔孢属(Ramularia)物种，例如柱隔孢叶斑病菌(Ramularia collo-cygni)、白斑柱隔孢(Ramularia areola)；喙孢属(Rhynchosporium)物种，例如大麦云纹病菌(Rhynchosporium secalis)；壳针孢属(Septoria)物种，例如芹菜壳针孢菌(Septoriaapii)、茄壳针孢菌(Septoria lycopersii)；核瑚菌属(Typhula)物种，例如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)；黑星菌属(Venturia)物种，例如苹果黑星病菌(Venturiainaequalis)；例如由以下引起的根病和茎病：伏革菌属(Corticium)物种，例如禾伏革菌(Corticium graminearum)；镰孢属(Fusarium)物种，例如尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)；顶囊壳属(Gaeumannomyces)物种，例如禾顶囊壳(Gaeumannomycesgraminis)；丝核菌属(Rhizoctonia)物种，例如像立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；例如由稻帚枝霉(Sarocladium oryzae)引起的帚枝霉(Sarocladium)病；例如由以下引起的小核菌(Sclerotium)病：小球菌核菌(Sclerotium oryzae)；Tapesia属物种，例如Tapesiaacuformis；根串珠霉属(Thielaviopsis)物种，例如烟草根黑腐病菌(Thielaviopsisbasicola)；例如由以下引起的穗和圆锥花序疾病(包括玉米穗轴)：链格孢属(Alternaria)物种，例如链格孢属物种(Alternaria spp.)；曲霉属(Aspergillus)物种，例如黄曲霉菌(Aspergillus flavus)；枝孢属(Cladosporium)物种，例如芽枝状枝孢(Cladosporiumcladosporioides)；麦角菌属(Claviceps)物种，例如黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)；镰孢属物种，例如黄色镰孢(Fusarium culmorum)；赤霉属(Gibberella)物种，例如玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)；明梭孢属(Monographella)物种，例如雪腐明梭孢(Monographella nivalis)；壳针孢属物种，例如颖枯壳针孢(Septoria nodorum)；由以下引起的疾病：黑穗病真菌，例如轴黑粉菌属(Sphacelotheca)物种，例如丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)；腥黑粉菌属(Tilletia)物种，例如小麦网腥黑粉菌(Tilletiacaries)、小麦矮腥黑穗病菌(T.controversa)；条黑粉菌属(Urocystis)物种，例如隐条黑粉菌(Urocystis occulta)；黑粉菌属(Ustilago)物种，例如裸黑粉菌(Ustilago nuda)、U.nuda tritici；例如由以下引起的果腐病：曲霉属物种，例如黄曲霉菌；葡萄孢属(Botrytis)物种，例如灰葡萄孢菌；青霉属(Penicillium)物种，例如扩展青霉(Penicillium expansum)和产紫青霉(P.purpurogenum)；核盘霉属物种，例如核盘菌；轮枝孢属(Verticilium)物种，例如黑白轮枝孢(Verticilium alboatrum)；种子和土壤传播的腐烂、霉、萎蔫、腐烂和猝倒病，这些疾病例如是由以下引起的：链格孢属(Alternaria)物种，例如由甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)引起；丝囊霉属(Aphanomyces)物种，例如由根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)引起；壳二孢属(Ascochyta)物种，例如由兵豆壳二孢(Ascochyta lentis)引起；曲霉属物种，例如由黄曲霉菌引起；枝孢属(Cladosporium)物种，例如由多主枝孢(Cladosporium herbarum)引起；旋孢腔菌属(Cochliobolus)物种，例如由禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)；(分生孢子形式：内脐蠕孢属(Drechslera)、平脐蠕孢属(Bipolaris)，同义：长蠕孢属(Helminthosporium)引起；炭疽菌属(Colletotrichum)物种，例如由球状炭疽菌(Colletotrichum coccodes)引起；镰孢物种，例如由黄色镰孢引起；赤霉属物种，例如由玉蜀黍赤霉引起；壳球孢属(Macrophomina)物种，例如由菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)引起；明梭孢属物种，例如由雪腐明梭孢引起；青霉属物种，例如由扩展青霉引起；茎点霉属(Phoma)物种，例如由黑胫茎点霉(Phoma lingam)引起；拟茎点霉属(Phomopsis)物种，例如由大豆拟茎点菌(Phomopsis sojae)引起；疫霉属(Phytophthora)物种，例如由恶疫霉菌(Phytophthoracactorum)引起；核腔菌属(Pyrenophora)物种，例如由麦类核腔菌(Pyrenophoragraminea)引起；梨孢属(Pyricularia)物种，例如由稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)引起；腐霉属物种，例如由极腐霉引起；丝核菌属(Rhizoctonia)物种，例如由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起；根霉属(Rhizopus)物种，例如由稻根霉菌(Rhizopus oryzae)引起；小菌核属(Sclerotium)物种，例如由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起；壳针孢属物种，例如由颖枯壳针孢引起；核瑚菌属物种，例如由肉孢核瑚菌引起；轮枝孢属(Verticillium)物种，例如由大丽花轮枝孢引起；例如由以下引起的癌、瘿瘤和鬼帚病(witches’broom)：丛赤壳属(Nectria)物种，例如仁果干癌丛赤壳菌(Nectriagalligena)；例如由以下引起的萎蔫病：链核盘菌属(Monilinia)物种，例如核果链核盘菌(Monilinia laxa)；例如由以下引起的叶疱病或叶卷缩病：外担菌属(Exobasidium)物种，例如坏损外担菌(Exobasidium vexans)；外囊菌属(Taphrina)物种，例如畸形外囊菌(Taphrina deformans)；木质植物的衰退病，其例如由以下引起：埃斯卡病(Escadisease)，例如由根霉格孢菌(Phaemoniella clamydospora)、Phaeoacremoniumaleophilum和地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea)；葡萄顶枯病(Eutypadyeback)，例如由葡萄弯孢壳(Eutypa lata)引起；例如由岛灵芝(Ganoderma boninense)引起的灵芝(Ganoderma)病；例如由木硬孔菌(Rigidoporus lignosus)引起的硬孔菌(Rigidoporus)病；例如由以下引起的花和种子的疾病：葡萄孢属(Botrytis)物种，例如灰葡萄孢菌；例如由以下引起的植物块茎的疾病：丝核菌属物种，例如立枯丝核菌；长蠕孢属(Helminthosporium)物种，例如茄长蠕孢(Helminthosporium solani)；例如由以下引起的根肿病：根肿菌属(Plasmodiophora)物种，例如芸苔根肿菌(Plamodiophora brassicae)；由以下引起的疾病：细菌病原体，例如黄单胞菌属(Xanthomonas)物种，例如野油菜黄单胞菌稻致病变体(Xanthomonas campestris pv.oryzae)；假单胞菌属(Pseudomonas)物种，例如丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)；欧文氏菌属(Erwinia)物种，例如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。
例如由以下引起的叶、茎、荚和种子上的真菌疾病：链格孢属叶斑病(Alternarialeaf spot)(链格孢属种细极链格孢(Alternaria spec.atrans tenuissima)、炭疽病(Anthracnose)(Colletotrichum gloeosporoides dematium var.truncatum)、褐斑病(brown spot)(大豆壳针孢菌(Septoria glycines))、尾孢属(cercospora)叶斑病和枯萎病(菊池尾孢菌(Cercospora kikuchii))、笄霉属(choanephora)叶枯病(Choanephorainfundibulifera trispora(同义))、dactuliophora叶枯病(Dactuliophora glycines)、霜霉病(大豆霜霉病(Peronospora manshurica))、内脐蠕孢属枯萎病(Drechsleraglycini)、蛙眼叶斑病(frogeye leaf spot)(大豆尾孢菌(Cercospora sojina))、小光壳属(leptosphaerulina)叶斑病(三叶草小光壳(Leptosphaerulina trifolii))、叶点霉属(phyllostica)叶斑病(大豆生叶点霉(Phyllosticta sojaecola))、荚和茎枯萎病(大豆拟茎点菌(Phomopsis sojae))、白粉病(扩散叉丝壳(Microsphaera diffusa))、棘壳孢属(pyrenochaeta)叶斑病(大豆棘壳孢(Pyrenochaeta glycines))、丝核菌空气枯萎病、叶子枯萎病和网枯萎病(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani))、锈病(豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)、山马蝗层锈菌)、疮痂病(大豆痂圆孢(Sphaceloma glycines))、匍柄霉属(stemphylium)叶枯萎病(葱叶枯匍柄霉Stemphylium botryosum))、靶斑病(target spot)(多主棒孢霉(Corynespora cassiicola))。
例如由以下引起的根和茎基部上的真菌疾病：黑根腐病(猪屎豆丽赤壳菌(Calonectria crotalariae))、木炭腐病(charcoal rot)(菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina))、镰孢枯萎病或萎蔫病、根腐病、以及荚和颈腐病(尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、直啄镰孢(Fusarium orthoceras)、半裸镰孢(Fusarium semitectum)、木贼镰孢(Fusarium equiseti))、mycoleptodiscus根腐病(Mycoleptodiscus terrestris)、新赤壳属(neocosmospora)(侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta))、荚和颈枯萎病(菜豆间座壳(Diaporthe phaseolorum))、茎溃疡病(菜豆间座壳北方大豆变种(Diaporthephaseolorum var.caulivora))、疫霉属(phytophthora)腐病(大雄疫霉(Phytophthoramegasperma))、褐茎腐病(brown stem rot)(大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata))、腐霉属(pythium)腐病(瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、群结腐霉(Pythium myriotylum)、极腐霉(Pythium ultimum))、丝核菌属(rhizoctonia)根腐病、茎腐烂、和猝倒病(立枯丝核菌)、核盘菌属(sclerotinia)茎腐烂(核盘菌)、核盘菌属南方枯萎病(齐整小核菌)、根串珠霉属(thielaviopsis)根腐病(基生根串珠霉(Thielaviopsis basicola))。
在某些情况下，真菌是核盘菌属物种(Sclerotinia spp.)(核盘菌(Scelrotiniasclerotiorum))。在某些情况下，真菌是葡萄孢属物种(例如，灰葡萄孢菌)。在某些情况下，真菌是曲霉属物种(Aspergillus spp.)。在某些情况下，真菌是镰孢属物种。在某些情况下，真菌是青霉属物种。
本发明的组合物可用于各种真菌防治应用中。以上描述的组合物可以用于在真菌病原体收获前或收获后防治真菌植物病原体。在一个实施例中，以上描述的任何组合物用于通过将组合物应用于植物、植物周围的区域、或可食用的栽培蘑菇、蘑菇菌柱、或蘑菇堆肥来防治靶病原体，诸如镰孢属物种、葡萄孢属物种、轮枝孢属物种、丝核菌属物种、木霉属物种、或腐霉属物种。在另一个实施例中，本发明的组合物用于防治收获后病原体，诸如青霉属、地丝菌属(Geotrichum)、黑曲霉(Aspergillus niger)和炭疽菌属物种。
表1提供了可以使用本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法处理或预防的真菌和与其相关的植物疾病的进一步实例。
表1.真菌有害生物
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B.细菌
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法可以用于降低细菌的适应度，例如以预防或处理植物中的细菌感染。包括用于将通过使细菌与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至细菌的方法。另外或替代地，这些方法包括通过使植物与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将生物型杀有害生物剂递送至处于真菌感染的风险或具有真菌感染的植物。
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法适用于递送至细菌或被其感染的植物，包括以下进一步描述的任何细菌。例如，细菌可以是属于放线菌门(Actinobacteria)或变形菌门(Proteobacteria)的细菌，诸如伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、和根瘤菌科(Rhizobiaceae)中的细菌。
在一些情况下，细菌是燕麦食酸菌亚种(Acidovorax avenae subsp.)，包括例如燕麦食酸菌燕麦亚种(Acidovorax avenae subsp.avenae)(＝燕麦假单胞菌燕麦亚种(Pseudomonas avenae subsp.avenae))、燕麦食酸菌卡特来兰亚种(Acidovorax avenaesubsp.cattleyae)(＝卡特来兰假单胞菌(Pseudomonas cattleyae))、或燕麦食酸菌瓜类亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)(＝假产碱假单胞菌瓜类亚种(Pseudomonaspseudoalcaligenes subsp.citrulli))、(Pseudomonas avenae subsp.citrulli))。
在一些情况下，细菌是伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp.)，包括例如须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)(＝须芒草假单胞菌(Pseudomonasandropogonis)、伍氏假单胞菌(Pseudomonas woodsii))、石竹伯克霍尔德氏菌(Burkholderia caryophylli)(＝石竹假单胞菌(Pseudomonas caryophylli))、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)(＝洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)(＝唐菖蒲假单胞菌(Pseudomonasgladioli))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌栖伞菌致病变种(Burkholderia gladiolipv.agaricicola)(＝唐菖蒲假单胞菌栖伞菌致病变种(Pseudomnas gladiolipv.agaricicola))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌葱生致病变种(Burkholderia gladiolipv.alliicola)(即，唐菖蒲假单胞菌葱生致病变种(Pseusomonas gladiolipv.alliicola))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌唐菖蒲致病变种(Burkholderia gladiolipv.gladioli)(即，唐菖蒲假单胞菌(Pseudomonas gladioli)、唐菖蒲假单胞菌唐菖蒲致病变种(Pseudomonas gladioli pv.gladioli))、荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaglumae)(即，荚壳假单胞菌(Pseudomonas glumae))、植物伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaplantarii)(即，植物假单胞菌(Pseudomonas plantarii))、茄伯克霍尔德氏菌(Burkholderia solanacearum)(即，茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum))、或青枯菌属物种(Ralstonia spp.)。
在一些情况下，细菌是韧皮部杆菌属物种(Liberibacter spp.)，包括暂定韧皮部杆菌属物种(Candidatus Liberibacter spec.)，包括例如暂定亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)、非洲韧皮部杆菌(Liberibacter africanus)(Laf)、美洲韧皮部杆菌(Liberibacter americanus)(Lam)、亚洲韧皮部杆菌(Liberibacter asiaticus)(Las)、欧洲韧皮部杆菌(Liberibacter europaeus)(Leu)、Liberibacter psyllaurous、或茄韧皮部杆菌(Liberibacter solanacearum)(Lso)。
在一些情况下，细菌是棒杆菌属物种(Corynebacterium spp.)，包括例如带状棒杆菌(Corynebacterium fascians)、萎蔫棒杆菌萎蔫致病变种(Corynebacteriumflaccumfaciens pv.flaccumfaciens)、密执安棒杆菌(Corynebacteriummichiganensis)、密执安棒杆菌小麦致病变种(Corynebacterium michiganensepv.tritici)、密执安棒杆菌尼布拉斯加致病变种(Corynebacterium michiganensepv.nebraskense)、或腐败棒杆菌(Corynebacterium sepedonicum)。
在一些情况下，细菌是欧文氏菌属物种(Erwinia spp.)，包括例如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、菠萝欧文氏菌(Erwinia ananas)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)(即，胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum))、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐亚种(Erwinia carotovora subsp.atroseptica)、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、菊欧文氏菌玉米致病变种(Erwinia chrysanthemi pv.zeae)、溶解欧文氏菌(Erwiniadissolvens)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontic)、斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartiii)、嗜管欧文嗜菌(Erwinia tracheiphila)、或噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)。
在一些情况下，细菌是丁香假单胞菌亚种(Pseudomonas syringae subsp.)，包括例如丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)(Psa)、丁香假单胞菌致黑致病变种(Pseudomonas syringae pv.atrofaciens)、丁香假单胞菌晕斑致病变种(Pseudomonas syringae pv.coronafaciens)、丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)、丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonassyringae pv.lachrymans)、丁香假单胞菌斑生致病变种(Pseudomonas syringaepv.maculicola)、丁香假单胞菌疱疹致病变种(Pseudomonas syringae pv.papulans)、丁香假单胞菌条纹致病变种(Pseudomonas syringae pv.striafaciens)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)、丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)、或丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonassyringae pv.tabaci)。
在一些情况下，细菌是铜绿假单胞菌。
在一些情况下，细菌是链霉菌属物种(Streptomyces ssp.)，包括例如酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)、纯白链霉菌(Streptomyces candidus)(即，闪白放线菌(Actinomyces candidus))、晶体链霉菌(Streptomyces caviscabies)、山丘链霉菌(Streptomyces collinus)、Streptomyceseuropaeiscabiei、中间型链霉菌(Streptomyces intermedius)、番薯链霉菌(Streptomyces ipomoeae)、Streptomyces luridiscabiei、Streptomyces niveiscabiei、Streptomyces puniciscabiei、Streptomyces retuculiscabiei、Streptomyces scabiei、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)、西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)、Streptomyces steliiscabiei、Streptomyces turgidiscabies、或Streptomyceswedmorensis。
在一些情况下，地毯草黄单胞菌亚种(Xanthomonas axonopodis subsp.)，包括例如地毯草黄单胞菌苜蓿致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.alfalfae)(＝苜蓿黄单胞菌(Xanthomonas alfalfae))、地毯草黄单胞菌莱檬致病变种(Xanthomonas axonopodispv.aurantifolii)(＝褐色黄单胞菌莱檬亚种(Xanthomonas fuscanssubsp.aurantifolii))、Xanthomonas axonopodis pv.allii(＝Xanthomonas campestrispv.allii)、地毯草黄单胞菌地毯草致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.axonopodis)、地毯草黄单胞菌羊蹄甲致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.bauhiniae)(＝野油菜黄单胞菌羊蹄甲致病变种(Xanthomonas campestris pv.bauhiniae))、地毯草黄单胞菌秋海棠致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.begoniae)(＝野油菜黄单胞菌秋海棠致病变种(Xanthomonas campestris pv.begoniae))、地毯草黄单胞菌萎叶致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.betlicola)(＝野油菜黄单胞菌萎叶致病变种(Xanthomonas campestrispv.betlicola))、地毯草黄单胞菌感应草致病变种(Xanthomonas axonopodispv.biophyti)(＝野油菜黄单胞菌感应草致病变种(Xanthomonas campestrispv.biophyti))、地毯草黄单胞菌木豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cajani)(＝野油菜黄单胞菌木豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.cajani))、地毯草黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cassavae)(＝木薯黄单胞菌(Xanthomonascassavae)、野油菜黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas campestris pv.cassavae))、地毯草黄单胞菌山扁豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cassiae)(＝野油菜黄单胞菌山扁豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.cassiae))、地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)(＝柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri))、地毯草黄单胞菌柑蜜致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citrumelo)(＝苜蓿黄单胞菌柑蜜亚种(Xanthomonas alfalfae subsp.citrumelonis))、地毯草黄单胞菌蝶豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.clitoriae)(＝野油菜黄单胞菌蝶豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.clitoriae))、地毯草黄单胞菌糁子致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.coracanae)(＝野油菜黄单胞菌糁子致病变种((Xanthomonas campestrispv.coracanae)))、地毯草黄单胞菌瓜尔豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.cyamopsidis)(＝野油菜黄单胞菌瓜尔豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.cyamopsidis))、地毯草黄单胞菌山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodispv.desmodii)(＝野油菜黄单胞菌山马蝗致病变种(Xanthomonas campestrispv.desmodii))、地毯草黄单胞菌恒河山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodispv.desmodiigangetici)(＝野油菜黄单胞菌恒河山马蝗致病变种(Xanthomonascampestris pv.desmodiigangetici))、地毯草黄单胞菌疏花山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.desmodiilaxiflori)(＝野油菜黄单胞菌疏花山马蝗致病变种(Xanthomonas campestris pv.desmodiilaxiflori))、地毯草黄单胞菌园叶山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.desmodiirotundifolii)(＝野油菜黄单胞菌园叶山马蝗致病变种(Xanthomonas campestris pv.desmodiirotundifolii))、地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae)(＝野油菜黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas campestris pv.dieffenbachiae))、地毯草黄单胞菌印度刺桐致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.erythrinae)(＝野油菜黄单胞菌印度刺桐致病变种(Xanthomonas campestris pv.erythrinae))、地毯草黄单胞菌簇生致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.fascicularis)(＝野油菜黄单胞菌簇生致病变种(Xanthomonas campestris pv.fasciculari))、地毯草黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)(＝野油菜黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonascampestris pv.glycines))、地毯草黄单胞菌红木致病变种(Xanthomonas axonopodispv.khayae)(＝野油菜黄单胞菌红木致病变种(Xanthomonas campestris pv.khayae))、地毯草黄单胞菌胡枝子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.lespedezae)(＝野油菜黄单胞菌胡枝子致病变种(Xanthomonas campestris pv.lespedezae))、地毯草黄单胞菌栀子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.maculifoliigardeniae)(＝野油菜黄单胞菌栀子致病变种(Xanthomonas campestris pv.maculifoliigardeniae))、地毯草黄单胞菌锦葵致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.malvacearum)(＝柑橘黄单胞菌锦葵亚种(Xanthomonas citri subsp.malvacearum))、地毯草黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.manihotis)(＝野油菜黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas campestrispv.manihotis))、地毯草黄单胞菌栖角胡麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.martyniicola)(＝野油菜黄单胞菌栖角胡麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.martyniicola))、地毯草黄单胞菌梅氏致病变种(Xanthomonas axonopodispv.melhusii)(＝野油菜黄单胞菌梅氏致病变种(Xanthomonas campestrispv.melhusii))、地毯草黄单胞菌中田氏黄麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.nakataecorchori)(＝野油菜黄单胞菌中田氏黄麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.nakataecorchori))、地毯草黄单胞菌西番莲致病变种(Xanthomonas axonopodispv.passiflorae)(＝野油菜黄单胞菌西番莲致病变种(Xanthomonas campestrispv.passiflorae))、地毯草黄单胞菌印度麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.patelii)(＝野油菜黄单胞菌印度麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.patelii))、Xanthomonas axonopodis pv.pedalii(＝Xanthomonas campestrispv.pedalii)、地毯草黄单胞菌菜豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli)(＝野油菜黄单胞菌菜豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.phaseoli)、菜豆黄单胞菌(Xanthomonas phaseoli))、地毯草黄单胞菌菜豆致病变种褐色变种(Xanthomonasaxonopodis pv.phaseoli var.fuscans)(＝褐色黄单胞菌(Xanthomonas fuscans))、地毯草黄单胞菌叶下珠致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.phyllanthi)(＝野油菜黄单胞菌叶下珠致病变种(Xanthomonas campestris pv.phyllanthi))、地毯草黄单胞菌栖酸浆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.physalidicola)(＝野油菜黄单胞菌栖酸浆致病变种(Xanthomonas campestris pv.physalidicola))、地毯草黄单胞菌栖猩猩木致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.poinsettiicola)(＝野油菜黄单胞菌栖猩猩木致病变种(Xanthomonas campestris pv.poinsettiicola))、地毯草黄单胞菌安石榴致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.punicae)(＝野油菜黄单胞菌安石榴致病变种(Xanthomonas campestris pv.punicae))、地毯草黄单胞菌鹿藿致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.rhynchosiae)(＝野油菜黄单胞菌鹿藿致病变种(Xanthomonascampestris pv.rhynchosiae))、地毯草黄单胞菌蓖麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.ricini)(＝野油菜黄单胞菌蓖麻致病变种(Xanthomonas campestris pv.ricini))、地毯草黄单胞菌田菁致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.sesbaniae)(＝野油菜黄单胞菌田菁致病变种(Xanthomonas campestris pv.sesbaniae))、地毯草黄单胞菌罗望子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.tamarindi)(＝野油菜黄单胞菌罗望子致病变种(Xanthomonas campestris pv.tamarindi))、地毯草黄单胞菌维管束致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.vasculorum)(＝野油菜黄单胞菌维管束致病变种(Xanthomonas campestris pv.vasculorum)、地毯草黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria)(＝野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)、辣椒斑点病黄单胞菌(Xanthomonasvesicatoria))、地毯草黄单胞菌绿豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vignaeradiatae)(＝野油菜黄单胞菌绿豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.vignaeradiatae))、地毯草黄单胞菌栖豇豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vignicola)(＝野油菜黄单胞菌栖豇豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.vignicola))、或地毯草黄单胞菌葡萄蔓致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vitians)(＝野油菜黄单胞菌葡萄蔓致病变种(Xanthomonas campestrispv.vitians))。
在一些情况下，细菌是野油菜黄单胞菌香蕉致病变种(Xanthomonas campestrispv.musacearum)、野油菜黄单胞菌桃李致病变种(Xanthomonas campestris pv.pruni)(＝树生黄单胞菌桃李致病变种(Xanthomonas arboricola pv.pruni))、或草莓黄单胞菌(Xanthomonas fragariae)。
在一些情况下，细菌是半透明黄单胞菌(Xanthomonas translucens supsp.)(＝野油菜黄单胞菌大麦致病变种(Xanthomonas campestris pv.hordei))，包括例如半透明黄单胞菌燕麦草致病变种(Xanthomonas translucens pv.arrhenatheri)(＝野油菜黄单胞菌燕麦草致病变种(Xanthomonas campestris pv.arrhenatheri))、半透明黄单胞菌谷物致病变种(Xanthomonas translucens pv.cerealis)(＝野油菜黄单胞菌谷物致病变种(Xanthomonas campestris pv.cerealis))、半透明黄单胞菌禾谷致病变种(Xanthomonastranslucens pv.graminis)(＝野油菜黄单胞菌禾谷致病变种(Xanthomonas campestrispv.graminis))、半透明黄单胞菌梯牧草属致病变种(Xanthomonas translucenspv.phlei)(＝野油菜黄单胞菌梯牧草属致病变种(Xanthomonas campestris pv.phlei))、半透明黄单胞菌梯牧草致病变种(Xanthomonas translucens pv.phleipratensis)(＝野油菜黄单胞菌梯牧草致病变种(Xanthomonas campestris pv.phleipratensis))、半透明黄单胞菌早熟禾致病变种(Xanthomonas translucens pv.poae)(＝野油菜黄单胞菌早熟禾致病变种(Xanthomonas campestris pv.poae))、半透明黄单胞菌黑麦致病变种(Xanthomonas translucens pv.secalis)(＝野油菜黄单胞菌黑麦致病变种(Xanthomonascampestris pv.secalis))、半透明黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas translucenspv.translucens)(＝野油菜黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas campestrispv.translucens))、或半透明黄单胞菌波形致病变种(Xanthomonas translucenspv.undulosa)(＝野油菜黄单胞菌波形致病变种(Xanthomonas campestrispv.undulosa))。
在一些情况下，细菌是稻黄单胞菌亚种(Xanthomonas oryzae supsp.)、稻黄单胞菌稻亚种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)(＝野油菜黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonascampestris pv.oryzae))、或野油菜黄单胞菌oryzicola致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)(＝野油菜黄单胞菌oryzicola致病变种(Xanthomonas campestrispv.oryzicola))。
在一些情况下，细菌是来自黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)的苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)。
表2示出了可以使用本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法处理或预防的细菌和与其相关的疾病的进一步实例。
表2.细菌性有害生物
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C.昆虫
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法可以用于降低降低昆虫的适应度，例如以预防或处理植物中的昆虫侵染。术语“昆虫”包括在任何发育阶段(即，未成熟昆虫和成虫昆虫)的属于节肢动物门以及属于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物体。包括用于将通过使昆虫与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至昆虫的方法。另外或替代地，这些方法包括通过使植物与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将生物型杀有害生物剂递送至处于昆虫侵染的风险或具有昆虫侵染的植物。
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法适用于预防或处理昆虫侵染或被其侵染的植物，包括属于以下目的昆虫：蜱螨目(Acari)、蜘蛛目(Araneae)、虱目(Anoplura)、鞘翅目(Coleoptera)、弹尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)(例如，斑翅果蝇(spotted-wing Drosophila))、纺足目(Embioptera)、蜉蝣目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)(例如，蚜虫、温室白粉虱)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨尾目(Thysanura)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)、或缺翅目。
在一些情况下，昆虫来自蛛形纲(Arachnida)，例如粉螨属物种(Acarus spp.)、柑橘瘤瘿螨(Aceria sheldoni)、刺皮瘿螨属物种(Aculops spp.)、刺瘿螨属物种(Aculusspp.)、花蜱属物种(Amblyomma spp.)、山楂叶螨(Amphitetranychus viennensis)、锐缘蜱属物种(Argas spp.)、牛蜱属物种(Boophilus spp.)、短须螨属物种(Brevipalpus spp.)、麦苔螨(Bryobia graminum)、苜蓿苔螨(Bryobia praetiosa)、刺尾蝎属物种(Centruroides spp.)、皮螨属物种(Chorioptes spp.)、鸡皮刺螨(Dermanyssusgallinae)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)、始叶螨属物种(Eotetranychus spp.)、梨上瘿螨(Epitrimerus pyri)、真叶螨属物种(Eutetranychus spp.)、瘿螨属物种(Eriophyesspp.)、家食甜螨(Glycyphagus domesticus)、Halotydeus destructor、Hemitarsonemus属物种、璃眼蜱属物种(Hyalomma spp.)、硬蜱属物种(Ixodes spp.)、蛛属物种(Latrodectusspp.)、Loxosceles属物种、Metatetranychus属物种、Neutrombicula autumnalis、奴合撒属物种(Nuphersa spp.)、小爪螨属物种(Oligonychus spp.)、钝缘蜱属物种(Ornithodorus spp.)、禽刺螨属物种(Ornithonyssus spp.)、全爪螨属物种(Panonychusspp.)、柑桔锈螨(Phyllocoptruta oleivora)、侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemuslatus)、痒螨(Psoroptes spp.)、扇头蜱属物种(Rhipicephalus spp.)、根螨属物种(Rhizoglyphus spp.)、疥螨属物种(Sarcoptes spp.)、中东金蝎(Scorpio maurus)、狭跗线螨属物种(Steneotarsonemus spp.)、斯氏狭跗线螨(Steneotarsonemus spinki)、跗线螨属物种(Tarsonemus spp.)、叶螨属物种(Tetranychus spp.)、阿氏真恙螨(Trombiculaalfreddugesi)、愈神蝎属物种(Vaejovis spp.)、或柑橘瘤瘿螨(Vasates lycopersici)。
在一些情况下，昆虫来自唇足纲(Chilopoda)，例如地蜈蚣属物种(Geophilusspp.)或蚰蜒属物种(Scutigera spp.)。
在一些情况下，昆虫来自弹尾目(Collembola)，例如武装棘跳虫(Onychiurusarmatus)。
在一些情况下，昆虫来自倍足纲(Diplopoda)，例如Blaniulus guttulatus；
来自昆虫纲(Insecta)，例如来自蜚蠊目(Blattodea)，例如亚洲小蠊(Blattellaasahinai)、德国小蠊(Blattella germanica)、东方蜚蠊(Blatta orientalis)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、古巴蠊属物种(Panchlora spp.)、木蠊属物种(Parcoblattaspp.)、大蠊属物种(Periplaneta spp.)、或棕带蜚蠊(Supella longipalpa)。
在一些情况下，昆虫来自鞘翅目(Coleoptera)，例如Acalymma vittatum、菜豆象(Acanthoscelides obtectus)、喙丽金龟属物种(Adoretus spp.)、Agelastica alni、叩甲属物种(Agriotes spp.)、小粉虫(Alphitobius diaperinus)、粉吹金龟子(Amphimallonsolstitialis)、家具窃蠹(Anobium punctatum)、星天牛属物种(Anoplophora spp.)、花象属物种(Anthonomus spp.)、圆皮蠹属物种(Anthrenus spp.)、长喙小象属物种(Apionspp.)、甘蔗金龟属物种(Apogonia spp.)、Atomaria属物种、毛皮蠹属物种(Attagenusspp.)、Bruchidius obtectus、豆象属物种(Bruchus spp.)、龟金花虫属物种(Cassidaspp.)、Cerotoma trifurcata、象甲(Ceutorrhynchus spp.)、凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)、宽胸口口头虫属物种(Cleonus mendicus、宽胸金针虫(Conoderusspp.)、象甲属物种(Cosmopolites spp.)、褐新西兰肋翅鳃角金龟(Costelytrazealandica)、金针虫属物种(Ctenicera spp.)、象虫属物种(Curculio spp.)、锈赤扁谷盗(Cryptolestes ferrugineus)、杨干隐喙象(Cryptorhynchus lapathi)、细枝象属物种(Cylindrocopturus spp.)、皮蠹属物种(Dermestes spp.)、条叶甲属物种(Diabroticaspp.)(例如，玉米根虫)、蛀野螟属物种(Dichocrocis spp.)、铁甲虫(Dicladispaarmigera)、阿根廷小兜属物种(Diloboderus spp.)、食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)、毛跳甲属物种(Epitrix spp.)、Faustinus属物种、裸蛛甲(Gibbium psylloides)、阔角谷盗(Gnathocerus cornutus)、菜心螟(Hellula undalis)、黑异爪庶金龟(Heteronychusarator)、寡节鲍金龟属物种(Heteronyx spp.)、Hylamorpha elegans、北美家天牛(Hylotrupes bajulus)、紫苜蓿叶象(Hypera postica)、蓝绿象(Hypomeces squamosus)、咪小蠢属物种(Hypothenemus spp.)、甘蔗大褐齿爪鳃金龟(Lachnosternaconsanguinea)、烟草甲(Lasioderma serricorne)、长头谷盗(Latheticus oryzae)、Lathridius属物种、负泥虫属物种(Lema spp.)、马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)、银潜蛾属物种(Leucoptera spp.)、稻水象(Lissorhoptrusoryzophilus)、筒喙象属物种(Lixus spp.)、萤叶甲属物种(Luperodes spp.)、粉蠹属物种(Lyctus spp.)、美洲叶甲属物种(Megascelis spp.)、梳爪叩头虫属物种(Melanotusspp.)、油菜花露尾甲(Meligethes aeneus)、鳃金龟属物种(Melolontha spp.)、Migdolus属物种、墨天牛属物种(Monochamus spp.)、象甲(Naupactus xanthographus)、隐跗郭公虫属物种(Necrobia spp.)、褐蛛甲(Niptus hololeucus)、椰蛀犀金龟(Oryctesrhinoceros)、锯胸粉扁虫(Oryzaephilus surinamensis)、Oryzaphagus oryzae、耳喙象属物种(Otiorrhynchus spp.)、小青花金龟(Oxycetonia jucunda)、辣根猿叶虫(Phaedoncochleariae)、食叶鳃金龟属物种(Phyllophaga spp.)、Phyllophaga helleri、黄条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)、日本弧丽金龟(Popillia japonica)、象甲属物种(Premnotrypes spp.)、大谷蠹(Prostephanus truncatus)、油菜金头跳甲属物种(Psylliodes spp.)、蛛甲属物种(Ptinus spp.)、暗色瓢虫(Rhizobius ventralis)、谷蠹(Rhizopertha dominica)、谷象属物种(Sitophilus spp.)、米象(Sitophilus oryzae)、尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)、药材甲(Stegobium paniceum)、茎干象属物种(Sternechus spp.)、Symphyletes属物种、纤毛象属物种(Tanymecus spp.)、黄粉虫(Tenebrio molitor)、大谷盗(Tenebrioides mauretanicus)、拟谷盗属物种(Triboliumspp.)、斑皮蠹属物种(Trogoderma spp.)、籽象属物种(Tychius spp.)、脊虎天牛属物种(Xylotrechus spp.)、或距步甲属物种(Zabrus spp.)。
在一些情况下，昆虫来自双翅目(Diptera)，例如伊蚊属物种(Aedes spp.)、潜蝇属物种(Agromyza spp.)、按实蝇属物种(Anastrepha spp.)、按蚊属物种(Anophelesspp.)、瘿蚊属物种(Asphondylia spp.)、实蝇属物种(Bactrocera spp.)、花园毛蚊(Bibiohortulanus)、天青丽蝇(Calliphora erythrocephala)、红头丽蝇(Calliphora vicina)、地中海实蝇(Ceratitis capitata)、摇蚊属物种(Chironomus spp.)、金蝇属物种(Chrysomyia spp.)、斑虻属物种(Chrysops spp.)、高额麻虻(Chrysozona pluvialis)、锥蝇属物种(Cochliomyia spp.)、康瘿蚊属物种(Contarinia spp.)、人皮蝇(Cordylobiaanthropophaga)、稻环摇蚊(Cricotopus sylvestris)、库蚊属物种(Culex spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、脉毛蚊属物种(Culiseta spp.)、黄蝇属物种(Cuterebra spp.)、橄榄大实蝇(Dacus oleae)、叶瘿蚊属物种(Dasyneura spp.)、地种蝇属物种(Deliaspp.)、人肤蝇(Dermatobia hominis)、果蝇属物种(Drosophila spp.)、果蝇属物种(Echinocnemus spp.)、厕蝇属物种(Fannia spp.)、胃蝇属物种(Gasterophilus spp.)、舌蝇属物种(Glossina spp.)、麻虻属物种(Haematopota spp.)、毛眼水蝇属物种(Hydrelliaspp.)、大麦毛眼水蝇(Hydrellia griseola)、黑蝇属物种(Hylemya spp.)、虱蝇属物种(Hippobosca spp.)、皮蝇属物种(Hypoderma spp.)、斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、Lutzomyia属物种、曼蚊属物种(Mansonia spp.)、家蝇属物种(Musca spp.)(例如，Musca domestica)、狂蝇属物种(Oestrus spp.)、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit)、Paratanytarsus属物种、Paralauterborniella subcincta、泉蝇属物种(Pegomyia spp.)、白蛉属物种(Phlebotomus spp.)、草种蝇属物种(Phorbia spp.)、草种蝇属物种(Phormia spp.)、酪蝇(Piophila casei)、Prodiplosis属物种、胡萝卜茎蝇(Psila rosae)、绕实蝇属物种(Rhagoletis spp.)、麻蝇属物种(Sarcophaga spp.)、蚋属物种(Simulium spp.)、螫蝇属物种(Stomoxys spp.)、虻属物种(Tabanus spp.)、根斑蝇属物种(Tetanops spp.)、或大蚊属物种(Tipula spp.)。
在一些情况下，昆虫来自异翅目(Heteroptera)，例如南瓜缘蝽(Anasa tristis)、拟丽蝽属物种(Antestiopsis)物种、Boisea属物种、土长蝽属物种(Blissus spp.)、俊盲蝽属物种(Calocoris)物种、斑腿微剌盲蝽(Campylomma livida)、异背长蝽属物种(Cavelerius spp.)、臭虫属物种(Cimex spp.)、白辧麦寄蝇属物种(Collaria spp.)、绿盲蝽(Creontiades dilutus)、胡椒缘蝽(Dasynus piperis)、Dichelops furcatus、厚氏长棒网蝽(Diconocoris hewetti)、棉红蝽属物种(Dysdercus spp.)、美洲蝽属物种(Euschistus spp.)、扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)、刺盲蝽属物种(Heliopeltisspp.)、Horcias nobilellus、稻缘蝽属物种(Leptocorisa spp.)、异稻缘蝽(Leptocorisavaricornis)、叶喙缘蝽(Leptoglossus phyllopus)、草盲蝽属物种(Lygus spp.)、蔗黑长蝽(Macropes excavatus)、盲蝽科(Miridae)、金光绿盲蝽(Monalonion atratum)、绿蝽属物种(Nezara spp.)、稻蝽属物种(Oebalus spp.)、蝽科(Pentatomidae)、方背皮蝽(Piesmaquadrata)、壁蝽属物种(Piezodorus spp.)、杂盲蝽属物种(Psallus spp.)、Pseudacystapersea、红猎蝽属物种(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergella singularis)、Scaptocoris castanea、黑蝽属物种(Scotinophora spp.)、梨冠网蝽(Stephanitisnashi)、Tibraca属物种、或锥猎蝽属物种(Triatoma spp.)。
在一些情况下，昆虫来自同翅目(Homiptera)、例如Acizzia acaciaebaileyanae、Acizzia dodonaeae、Acizzia uncatoides、长头蝗(Acrida turrita)、无网长管蚜属物种(Acyrthosipon spp.)、Acrogonia属物种、Aeneolamia属物种、隆脉木虱属物种(Agonoscena spp.)、甘蓝粉虱(Aleyrodes proletella)、甘蔗穴粉虱(Aleurolobusbarodensis)、丝绒粉虱(Aleurothrixus floccosus)、植莲木虱(Allocaridaramalayensis)、杧果叶蝉属物种(Amrasca spp.)、飞廉短尾蚜(Anuraphis cardui)、肾圆盾蚧属物种(Aonidiella spp.)、苏联黄粉蚜(Aphanostigma pini)、蚜属物种(Aphis spp.)(例如，Apis gossypii)、葡萄叶蝉(Arboridia apicalis)、Arytainilla属物种、小圆盾蚧属物种(Aspidiella spp.)、圆盾蚧属物种(Aspidiotus spp.)、Atanus属物种、茄沟无网蚜(Aulacorthum solani)、烟草粉虱(Bemisia tabaci)、Blastopsylla occidentalis、Boreioglycaspis melaleucae、李短尾蚜(Brachycaudus helichrysi)、Brachycolus属物种、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)、Cacopsylla属物种、小褐稻虱(Calligyponamarginata)、黄头大叶蝉(Carneocephala fulgida)、甘蔗粉角蚜(Ceratovacunalanigera)、沫蝉科(Cercopidae)、蜡蚧属物种(Ceroplastes spp.)、草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii)、蔗黄雪盾蚧(Chionaspis tegalensis)、茶绿叶蝉(Chlorita onukii)、棉蝗(Chondracris rosea)、核桃黑斑蚜(Chromaphisjuglandicola)、黑褐圆盾蚧(Chrysomphalus ficus)、玉米叶蝉(Cicadulina mbila)、Coccomytilus halli、软蚧属物种(Coccus spp.)、茶藨隐瘤蚜(Cryptomyzus ribis)、Cryptoneossa属物种、Ctenarytaina属物种、Dalbulus属物种、柑橘粉虱(Dialeurodescitri)、柑桔木虱(Diaphorina citri)、白背盾蚧属物种(Diaspis spp.)、履绵蚧属物种(Drosicha spp.)、西圆尾蚜属物种(Dysaphis spp.)、灰粉蚧属物种(Dysmicoccus spp.)、小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.)、绵蚜属物种(Eriosoma spp.)、斑叶蝉属物种(Erythroneura spp.)、Eucalyptolyma属物种、褐木虱属物种(Euphyllura spp.)、殃叶蝉(Euscelis bilobatus)、拂粉蚧属物种(Ferrisia spp.)、咖啡地粉蚧(Geococcuscoffeae)、Glycaspis属物种、银合欢木虱(Heteropsylla cubana)、棘状异木虱(Heteropsylla spinulosa)、假桃病毒叶蝉(Homalodisca coagulata)、翅尖头叶蝉(Homalodisca vitripennis)、梅大尾蚜(Hyalopterus arundinis)、吹绵蚧属物种(Iceryaspp.)、片角叶蝉属物种(Idiocerus spp.)、扁喙叶蝉属物种(Idioscopus spp.)、灰飞虱(Laodelphax striatellus)、Lecanium属物种、蛎盾蚧属物种(Lepidosaphes spp.)、萝卜蚜(Lipaphis erysimi)、长管蚜属物种(Macrosiphum spp.)、二点叶蜂(Macrostelesfacifrons)、Mahanarva属物种、高粱蚜(Melanaphis sacchari)、Metcalfiella属物种、麦无网蚜(Metopolophium dirhodum)、黑缘平翅斑蚜(Monellia costalis)、Monelliopsispecanis、瘤蚜属物种(Myzus spp.)、莴苣衲长管蚜(Nasonovia ribisnigri)、黑尾叶蝉属物种(Nephotettix spp.)、Nettigoniclla spectra、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、Oncometopia属物种、普来隆旌蚧(Orthezia praelonga)、中华稻蝗(Oxya chinensis)、Pachypsylla属物种、杨梅缘粉虱(Parabemisia myricae)、Paratrioza属物种、片盾蚧属物种(Parlatoria spp.)、片盾蚧属物种(Pemphigus spp.)、及蝽科物种(Pentatomidae)(例如，褐翅椿象(Halyomorpha halys))、玉米蜡蝉(Peregrinus maidis)、绵粉蚧属物种(Phenacoccus spp.)、杨平翅绵蚜(Phloeomyzus passerinii)、忽布疣蚜(Phorodonhumuli)、葡萄根瘤蚜属物种(Phylloxera spp.)、苏铁褐点并盾蚧(Pinnaspisaspidistrae)、臀纹粉蚧属物种(Planococcus spp.)、Prosopidopsylla flava、梨形原绵蚧(Protopulvinaria pyriformis)、桑白盾蚧(Pseudaulacaspis pentagona)、粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)、Psyllopsis属物种、木虱属物种(Psylla spp.)、金小蜂属物种(Pteromalus spp.)、Pyrilla属物种、笠圆盾蚧属物种(Quadraspidiotus spp.)、Quesadagigas、平刺粉蚧属物种(Rastrococcus spp.)、缢管蚜属物种(Rhopalosiphum spp.)、黑盔蚧属物种(Saissetia spp.)、葡萄带叶蝉(Scaphoideus titanus)、麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)、苏铁刺圆盾蚧(Selenaspidus articulatus)、长唇基飞虱属物种(Sogataspp.)、白背飞虱(Sogatella furcifera)、Sogatodes属物种、三角蝶(Stictocephalafestina)、梣粉虱(Siphoninus phillyreae)、Tenalaphara malayensis、台诺非拉属物种(Tetragonocephela spp.)、美国核桃黑蚜(Tinocallis caryaefoliae)、广胸沫蝉属物种(Tomaspis spp.)、声蚜属物种(Toxoptera spp.)、温室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、木虱属物种(Trioza spp.)、小叶蝉属物种(Typhlocyba spp.)、尖盾蚧属物种(Unaspis spp.)、葡萄根瘤虱(Viteus vitifolii)、么叶蝉属物种(Zygina spp.)；
来自膜翅目(Hymenoptera)，例如顶切叶蚁属物种(Acromyrmex spp.)、菜叶蜂属物种(Athalia spp.)、切叶蚁属物种(Atta spp.)、松叶蜂属物种(Diprion spp.)、实叶蜂属物种(Hoplocampa spp.)、毛蚁属物种(Lasius spp.)、小黄家蚁(Monomorium pharaonisspp.)、树蜂属物种(Sirex spp.)、入侵红火蚁(Solenopsis invicta)、酸臭蚁属物种(Tapinoma spp.)、大树蜂属物种(Urocerus spp.)、胡蜂属物种(Vespa spp.)、或黑树蜂属物种(Xeris spp.)。
在一些情况下，该昆虫来自等足目(Isopoda)，例如，鼠妇(Armadillidiumvulgare)、栉水虱潮虫(Oniscus asellus)、或球鼠妇(Porcellio scaber)。
在一些情况下，该昆虫来自等翅目(Isoptera)，例如，乳白蚁属物种(Contariniaspp.)、Cornitermes cumulans、堆砂白蚁属物种(Cryptotermes spp.)、楹白蚁属物种(Incisitermes spp.)、稻麦小白蚁(Microtermes obesi)、土白蚁属物种(Odontotermesspp.)、或散白蚁属物种(Reticulitermes spp)。
在一些情况下，该昆虫来自鳞翅目(Lepidoptera)，例如小蜡螟(Achroiagrisella)、桑剑纹夜蛾(Acronicta major)、褐带卷蛾属物种(Adoxophyes spp.)、白纹伊蚊(Aedia leucomelas)、地夜蛾属物种(Agrotis spp.)、阿拉巴马属物种(Alabama spp.)、脐橙螟(Amyelois transitella)、条麦蛾属物种(Anarsia spp.)、干煞夜蛾属物种(Anticarsia spp.)、Argyroploce属物种、甘蓝夜蛾(Barathra brassicae)、禾弄蝶(Borbocinnara)、棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella)、松尺蠖(Bupalus piniarius)、干夜蛾属物种(Busseola spp.)、Cacoecia属物种、茶细蛾(Caloptilia theivora)、烟卷蛾(Capuareticulana)、苹果蠹蛾(Carpocapsa pomonella)、桃小食心虫(Carposina niponensis)、冬尺蛾(Cheimatobia brumata)、禾草螟属物种(Chilo spp.)、卷蛾属物种(Choristoneuraspp.)、葡萄果蠹蛾(Clysia ambiguella)、Cnaphalocerus属物种、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、云卷蛾属物种(Cnephasia spp.)、蒂蛀虫属物种(Conopomorpha spp.)、球颈象属物种(Conotrachelus spp.)、Copitarsia属物种、小卷蛾属物种(Cydia spp.)、Dalaca noctuides、绢野螟属物种(Diaphania spp.)、蔗螟(Diatraea saccharalis)、钻夜蛾属物种(Earias spp.)、Ecdytolopha aurantium、Elasmopalpus lignosellus、甘薯杆螟(Eldana saccharina)、粉斑螟属物种(Ephestiaspp.)、叶小卷蛾属物种(Epinotia spp.)、苹果褐卷蛾(Epiphyas postvittana)、荚斑螟属物种(Etiella spp.)、Eulia属物种、女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella)、毒蛾属物种(Euproctis spp.)、切夜蛾属物种(Euxoa spp.)、脏切叶蛾属物种(Feltia spp.)、大蜡螟(Galleria mellonella)、细蛾属物种(Gracillaria spp.)、小食心虫属物种(Grapholithaspp.)、甘蔗螟属物种(Hedylepta spp.)、铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)、实夜蛾属物种(Heliothis spp.)、褐家蛾(Hofmannophila pseudospretella)、同斑螟属物种(Homoeosoma spp.)、长卷蛾属物种(Homona spp.)、苹果巢蛾(Hyponomeuta padella)、柿举肢蛾(Kakivoria flavofasciata)、夜蛾属物种(Laphygma spp.)、梨小食心虫(Laspeyresia molesta)、茄黄斑螟(Leucinodes orbonalis)、银潜蛾属物种(Leucopteraspp.)、紫藤潜叶细蛾属物种(Lithocolletis spp.)、绿果冬夜蛾(Lithophaneantennata)、花翅小蛾属物种(Lobesia spp.)、豆白隆切根虫(Loxagrotis albicosta)、毒蛾属物种(Lymantria spp.)、潜蛾属物种(Lyonetia spp.)、天幕毛虫(Malacosomaneustria)、豆荚野螟(Maruca testulalis)、甘蓝夜蛾(Mamstra brassicae)、稻暮眼蝶(Melanitis leda)、毛胫夜蛾属物种(Mocis spp.)、Monopis obviella、粘虫(Mythimnaseparata)、橡长角蛾(Nemapogon cloacellus)、水螟属物种(Nymphula spp.)、Oiketicus属物种、Oria属物种、瘤丛螟属物种(Orthaga spp.)、秆野螟属物种(Ostrinia spp.)、负泥虫(Oulema oryzae)、小眼夜蛾(Panolis flammea)、稻弄蝶属物种(Parnara spp.)、红铃虫属物种(Pectinophora spp.)、潜叶蛾属物种(Perileucoptera spp.)、茄麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)、柑橘潜叶蛾(Phyllocnistis citrella)、小潜细蛾属物种(Phyllonorycter spp.)、粉蝶属物种(Pieris spp.)、荷兰石竹小卷蛾(Platynotastultana)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、金翅夜蛾属物种(Plusia spp.)、小菜蛾(Plutella xylostella)、小白巢蛾属物种(Prays spp.)、斜纹夜蛾属物种(Prodeniaspp.)、烟草天蛾属物种(Protoparce spp.)、拟粘液蛾属物种(Pseudaletia spp.)、一星黏虫(Pseudaletia unipuncta)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、玉米螟(Pyraustanubilalis)、Rachiplusia nu、禾螟属物种(Schoenobius spp.)、白禾螟属物种(Scirpophaga spp.)、稻白螟(Scirpophaga innotata)、Scotia segetum、蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)、大螟(Sesamia inferens)、长须卷蛾属物种(Sparganothis spp.)、夜蛾属物种(Spodoptera spp.)、Spodoptera praefica、展足蛾属物种(Stathmopoda spp.)、花生麦蛾(Stomopteryx subsecivella)、透翅蛾属物种(Synanthedon spp.)、安第斯马铃薯块茎蛾(Tecia solanivora)、Thermesia gemmatalis、木塞谷蛾(Tinea cloacella)、袋谷蛾(Tinea pellionella)、幕谷蛾(Tineola bisselliella)、卷叶蛾属物种(Tortrixspp.)、毛毡衣蛾(Trichophaga tapetzella)、粉夜蛾属物种(Trichoplusia spp.)、三化螟(Tryporyza incertulas)、番茄斑潜蝇(Tuta absoluta)、或灰蝶属物种(Viracholaspp.)。
在一些情况下，该昆虫来自以下目：直翅目(Orthoptera)或跳跃目(Saltatoria)，例如，家蟋蟀(Acheta domesticus)、Dichroplus属物种、蝼蛄属物种(Gryllotalpa spp.)、蔗蝗属物种(Hieroglyphus spp.)、飞蝗属物种(Locusta spp.)、黑蝗属物种(Melanoplusspp.)、或Schistocerca gregaria。
在一些情况下，该昆虫来自虱目(Phthiraptera)，例如，毛虱属物种(Damaliniaspp.)、血虱属物种(Haematopinus spp.)、毛虱属物种(Linognathus spp.)、虱属物种(Pediculus spp.)、阴虱(Ptirus pubis)、毛虱属物种(Trichodectes spp.)。
在一些情况下，该昆虫来自啮虫目(Psocoptera)，例如，Lepinatus属物种、或书虱属物种(Liposcelis spp)。
在一些情况下，该昆虫来自蚤目(Siphonaptera)，例如，角叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)、栉首蚤属物种(Ctenocephalides spp.)、致痒蚤(Pulexirritans)、穿皮潜蚤(Tunga penetrans)、或Xenopsylla cheopsis。
在一些情况下，该昆虫来自缨翅目(Thysanoptera)，例如玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscurus)、稻蓟马(Baliothrips biformis)、鲜食葡萄镰蓟马(Drepanothrips reuteri)、Enneothrips flavens、花蓟马属物种(Frankliniella spp.)、阳蓟马属物种(Heliothrips spp.)、温室条蓟马(Hercinothrips femoralis)、腹钩蓟马(Rhipiphorothrips cruentatus)、硬蓟马属物种(Scirtothrips spp.)、Taeniothripscardamomi、或蓟马属物种(Thrips spp)。
在一些情况下，该昆虫来自衣鱼目(Zygentoma)(＝缨尾目(Thysanura))，例如毛衣鱼属物种(Ctenolepisma spp.)、家衣鱼(Lepisma saccharina)、盗火虫(Lepismodesinquilinus)、或小灶衣鱼(Thermobia domestica)。
在一些情况下，该昆虫来自综合纲(Symphyla)，例如小幺蚰属物种(Scutigerellaspp)。
在一些情况下，该昆虫是螨，包括但不限于跗线螨，诸如Phytonemus pallidus、侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)、Tarsonemus bilobatus等；真足螨，诸如白菜螨(Penthaleus erythrocephalus)、叶爪螨(Penthaleus major)等；叶螨，诸如真梶小爪螨(Oligonychus shinkaji)、桔全爪螨(Panonychus citri)、桑全爪螨(Panonychus mori)、苹果全爪螨(Panonychus ulmi)、神泽氏叶螨(Tetranychus kanzawai)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)等；瘿螨，诸如茶尖叶节蜱(Acaphylla theavagrans)、曲瘿螨(Aceria tulipae)、番茄刺皮瘿螨(Aculops lycopersici)、皮氏刺皮瘿螨(Aculopspelekassi)、苹果刺锈螨(Aculus schlechtendali)、Eriophyes chibaensis、柑橘锈螨(Phyllocoptruta oleivora)等；粉螨，诸如罗宾根螨(Rhizoglyphus robini)、腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)、三叶螨(Tyrophagus similis)等；蜂窝螨，诸如大蜂螨(Varroa jacobsoni)、狄斯瓦螨(Varroa destructor)等；蜱亚目，诸如微小牛蜱(Boophilus microplus)、血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)、长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)、褐黄血蜱(Haemophysalis flava)、铃头血蜱(Haemophysalis campanulata)、卵形硬蜱(Ixodes ovatus)、全沟硬蜱(Ixodespersulcatus)、花蜱属物种(Amblyomma spp.)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)等；肉食螨科(Cheyletidae)，诸如Cheyletiella yasguri、布氏姬螯螨(Cheyletiella blakei)等；蠕形螨科(Demodicidae)，诸如犬蠕形螨(Demodex canis)、猫蠕形螨(Demodex cati)等；痒螨科(Psoroptidae)，诸如羊痒螨(Psoroptes ovis)等；Scarcoptidae，诸如人疥螨(Sarcoptes scabiei)、猫耳螨(Notoedres cati)、膝螨属物种(Knemidocoptes spp.)等。
表3示出了可以使用本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法处理或预防的引起侵染的昆虫的进一步实例。
表3.昆虫有害生物
Figure GDA0002918049650000921
Figure GDA0002918049650000931
Figure GDA0002918049650000941
D.软体动物
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法可以用于降低软体动物的适应度，例如以预防或处理植物中的软体动物侵染。术语“软体动物”包括属于软体动物门的任何生物体。包括用于将通过使软体动物与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至软体动物的方法。另外或替代地，这些方法包括通过使植物与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将生物型杀有害生物剂递送至处于软体动物侵染的风险或具有软体动物侵染的植物。
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法适用于预防或处理农业和园艺中陆生腹足类(例如，蛞蝓和蜗牛)的侵染。它们包括主要作为杂食性有害生物出现在农业和园艺作物上的所有陆生蛞蝓和蜗牛。在一些情况下，该软体动物可以属于以下科：玛瑙螺科(Achatinidae)、野蛞蝓科(Agriolimacidae)、瓶螺科(Ampullariidae)、阿勇蛞蝓科(Arionidae)、巴蜗牛科(Bradybaenidae)、大蜗牛科(Helicidae)、Hydromiidae、椎实螺科(Lymnaeidae)、小蛞蝓科(Milacidae)、尾环蜗牛科(Urocyclidae)、或蛞蝓科(Veronicellidae)。
例如，在一些情况下，软体动物是玛瑙螺属物种(Achatina spp.)、Archachatina属物种(例如，Archachatina marginata)、野蛞蝓属物种(Agriolimax spp.)、Arion属物种(例如，A.ater、A.circumscriptus、A.distinctus、A.fasciatus、A.hortensis、A.intermedius、红色蛞蝓(A.rufus)、A.subfuscus、A.silvaticus、A.lusitanicus)、Arliomax属物种(例如，Ariolimax columbianus)、双脐螺属物种(Biomphalaria spp)、缓行螺属物种(Bradybaena spp.)(例如，B.fruticum)、小泡螺属物种(Bulinus spp.)、蜗牛属物种(Cantareus spp.)(例如，棕色庭园蜗牛(C.asperses))、葱蜗牛属物种(Cepaeaspp.)(例如，花园葱蜗牛(C.hortensis)、森林蜗牛(C.nemoralis)、花园葱蜗牛(C.hortensis))、白蜗牛属(Cernuella spp.)、螺蜗牛属(Cochlicella spp.)、Cochlodina属物种(例如，C.laminata)、颈蛞蝓属物种(Deroceras spp.)(例如，田地颈蛞蝓(D.agrestis)、D.empiricorum、光滑颈蛞蝓(D.laeve)、D.panornimatum、网纹颈蛞蝓(D.reticulatum))、圆盘蜗牛属物种(Discus spp.)(例如，圆形圆盘蜗牛(D.rotundatus))、Euomphalia属物种、土蜗属物种(Galba spp.)(例如，截形土蜗(G.trunculata))、大蜗牛属物种(Helicella spp.)(例如，H.itala、H.obvia)、Helicigona属物种(例如，H.arbustorum)、Helicodiscus属物种、Helix属物种(例如，H.aperta、H.aspersa、H.pomatia)、Limax属物种(例如，L.cinereoniger、L.flavus、L.marginatus、L.maximus、L.tenellus)、Limicolaria属物种(例如，Limicolaria aurora)、椎实螺属物种(Lymnaea spp.)(例如，静水椎实螺(L.stagnalis))、Mesodon属物种(例如，Mesonthyroidus)、蒙纳螺属物种(Monadenia spp.)(例如，信念蒙纳螺(Monadenia fidelis))、Milax属物种(例如，M.gagates、M.marginatus、M.sowerbyi、M.budapestensis)、钉螺属物种(Oncomelania spp.)、Neohelix属物种(例如，Neohelix albolabris)、钻螺属物种(Opeas spp.)、Otala属物种(例如，Otala lacteal)、Oxyloma属物种(例如，O.pfeifferi)、福寿螺属物种(Pomacea spp.)(例如，小管福寿螺(P.canaliculata))、琥珀螺属物种(Succinea spp.)、Tandonia属物种(例如，T.budapestensis、T.sowerbyi)、Theba属物种、瓦娄蜗牛属物种(Vallonia spp.)、或琥珀蜗牛属物种(Zonitoides spp.)(例如，光洁琥珀蜗牛(Z.nitidus))。
E.线虫
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法可以用于降低线虫动物的适应度，例如以预防或处理植物中的线虫侵染。术语“线虫”包括属于线虫动物门的任何生物体。包括用于将通过使线虫与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至线虫的方法。另外或替代地，这些方法包括通过使植物与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将生物型杀有害生物剂递送至处于线虫侵染的风险或具有线虫侵染的植物。
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法适用于预防或处理引起损害植物的线虫的侵染，这些线虫包括例如，根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)(根结)、异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、球异皮线虫属物种(Globodera spp.)、短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)、螺旋线虫属物种(Helicotylenchus spp.)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)、剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)和芹刺线虫(Belonolaimuslongicaudatus)。在一些情况下，线虫是植物寄生线虫或生活在土壤中的线虫。植物寄生线虫包括但不限于，体外寄生生物，诸如剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、长针线虫属物种(Longidorus spp.)、和毛刺线虫属物种(Trichodorus spp.)；半寄生生物，诸如垫刃线虫属物种(Tylenchulus spp.)；移栖体内寄生生物，诸如短体线虫属物种(Pratylenchusspp.)、穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)、和盾线虫属物种(Scutellonema spp.)；定栖寄生生物，诸如异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、球异皮线虫属物种(Globoderaspp.)、和根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)；以及茎叶体内寄生生物，诸如茎线虫属物种(Ditylenchus spp.)、滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)、和潜根线虫属物种(Hirschmaniella spp.)。特别有害的根寄生土壤线虫是诸如异皮线虫属(Heterodera)或球异皮线虫属(Globodera)的囊肿形成线虫、和/或根结线虫属(Meloidogyne)的根结线虫。这些属的有害物种是例如南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)(soybean cyst nematode)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)，这些物种有效地被本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物防治。然而，本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的使用决不限于这些属或物种，而且还以相同的方式扩展至其他线虫。
可以通过本文描述的方法和组合物靶向的线虫的其他实例包括但不限于例如居农粗纹膜垫刃线虫(Aglenchus agricola)、小麦粒线虫(Anguina tritici)、花生滑刃线虫(Aphelenchoides arachidis)、草莓滑刃线虫(Aphelenchoides fragaria)以及一般的滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)类茎和叶体内寄生虫、细小刺线虫(Belonolaimusgracilis)、长尾剌线虫(Belonolaimus longicaudatus)、诺顿刺线虫(Belonolaimusnortoni)、椰子伞滑刃线虫(Bursaphelenchus cocophilus)、Bursaphelenchus eremus、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)以及一般的伞滑刃属物种(Bursaphelenchus spp.)、胡桃线虫(Cacopaurus pestis)、弯曲小环线虫(Criconemella curvata)、刻线小环线虫(Criconemella onoensis)、装饰小环线虫(Criconemella ornata)、Criconemella rusium、薄叶小环线虫(Criconemella xenoplax)(＝Mesocriconema xenoplax)和一般的小环线虫属物种(Criconemella spp.)、Criconemoides femiae、Criconemoides onoense、Criconemoides ornatum和一般的轮线虫属物种(Criconemoides spp.)、腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、食菌茎线虫(Ditylenchus myceliophagus)和一般的茎线虫属物种(Ditylenchus spp.)类茎和叶体内寄生虫、Dolichodorus heterocephalus、马铃薯白线虫(Globodera pallida)(＝Heterodera pallida)、马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)(马铃薯胞囊线虫(potato cyst nematode))、茄球异皮线虫(Globoderasolanacearum)、烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、弗吉尼亚球异皮线虫(Globoderavirginia)和一般的球异皮线虫属物种(Globodera spp.)类固着性胞囊形成寄生虫、双角螺旋线虫(Helicotylenchus digonicus)、双宫双角螺旋线虫(Helicotylenchusdihystera)、刺桐双角螺旋线虫(Helicotylenchus erythrine)、多带双角螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、短小双角螺旋线虫(Helicotylenchus nannus)、假强壮双角螺旋线虫(Helicotylenchus pseudorobustus)和一般的螺旋线虫属物种(Helicotylenchus spp.)、半轮线虫(Hemicriconemoides)、蚤缀鞘线虫(Hemicycliophoraarenaria)、Hemicycliophora nudata、微细鞘线虫(Hemicycliophora parvana)、Heterodera avenae、十字花科异皮线虫(Heterodera cruciferae)、大豆异皮线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)、水稻异皮线虫(Heterodera oryzae)、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、玉米异皮线虫(Heterodera zeae)和一般的异皮线虫属物种(Heterodera spp.)类固着性囊孢形成寄生虫、纤细潜根线虫(Hirschmaniellagracilis)、水稻潜根线虫(Hirschmaniella oryzae)、刺尾潜根线虫(Hirschmaniellaspinicaudata)和一般的潜根线虫属物种(Hirschmaniella spp.)类茎和叶的内寄生虫、埃及纽带线虫(Hoplolaimus aegyptii)、加州纽带线虫(Hoplolaimus califomicus)、哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、印度纽带线虫(Hoplolaimus indicus)、大针纽带线虫(Hoplolaimus magnistylus)、不强纽带线虫(Hoplolaimus pararobustus)、非洲长针线虫(Longidorus africanus)、短环长针线虫(Longidorus breviannulatus)、逸去长针线虫(Longidorus elongatus)、光头长针线虫(Longidorus laevicapitatus)、藤蔓长针线虫(Longidorus vineacola)和一般的长针线虫属物种(Longidorus spp.)类外寄生虫、高粱根结线虫(Meloidogyne acronea)、非洲根结线虫(Meloidogyne africana)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、泰晤士花生根结线虫(Meloidogyne arenaria thamesi)、Meloidogyne artiella、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、咖啡根结线虫(Meloidogyne coffeicola)、埃塞俄比亚根结线虫(Meloidogyne ethiopica)、短小根结线虫(Meloidogyne exigua)、伪哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne fallax)、禾草根结线虫(Meloidogyne graminicola)、禾本科根结线虫(Meloidogyne graminis)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、Meloidogyne incognita acrita、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)、吉库尤根结线虫(Meloidogyne kikuyensis)、微小根结线虫(Meloidogyneminor)、纳西根结线虫(Meloidogyne naasi)、巴拉那根结线虫(Meloidogyneparanaensis)、泰晤士根结线虫(Meloidogyne thamesi)和一般的根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)类固着性囊孢形成寄生虫、瓢线虫属物种(Meloinema spp.)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、Neotylenchus vigissi、Paraphelenchuspseudoparietinus、葱副毛刺线虫(Paratrichodorus allius)、裂片副毛刺线虫(Paratrichodorus lobatus)、微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、矮小拟毛刺(Paratrichodorus nanus)、胼胝副毛刺线虫(Paratrichodorus porosus)、光滑副毛刺线虫(Paratrichodorus teres)和一般的副毛刺线虫属物种(Paratrichodorus spp.)、弯钩针线虫(Paratylenchus hamatus)、微小针线虫(Paratylenchus minutus)、突出针线虫(Paratylenchus projectus)和一般的针线虫属物种(Paratylenchus spp.)、敏捷短体线虫(Pratylenchus agilis)、艾氏短体线虫(Pratylenchus alleni)、安第斯短体线虫(Pratylenchus andinus)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、谷类短体线虫(Pratylenchus cerealis)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、刻痕短体线虫(Pratylenchus crenatus)、德式短体线虫(Pratylenchus delattrei)、圆尾短体线虫(Pratylenchus giibbicaudatus)、古氏短体线虫(Pratylenchus goodeyi)、钩状短体线虫(Pratylenchus hamatus)、六纹短体线虫(Pratylenchus hexincisus)、卢斯短体线虫(Pratylenchus loosi)、落选短体线虫(Pratylenchus neglectus)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、草地短体线虫(Pratylenchus pratensis)、Pratylenchusscribneri、精美短体线虫(Pratylenchus teres)、索氏短体线虫(Pratylenchusthornei)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)和一般的短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)类迁移性内寄生虫、Pseudohalenchusminutus、大齿平滑垫刃线虫(Psilenchus magnidens)、肿大平滑垫刃线虫(Psilenchustumidus)、查尔斑皮线虫(Punctodera chalcoensis)、锐利五沟线虫(Quinisulciusacutus)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、相似穿孔线虫(Radopholussimilis)、一般的穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)类迁移性内寄生虫、北方小盘旋线虫(Rotylenchulus borealis)、小肾状线虫(Rotylenchulus parvus)、肾形小盘旋线虫(Rotylenchulus reniformis)和一般的小盘旋线虫属物种(Rotylenchulus spp.)、直沟盘旋线虫(Rotylenchus laurentinus)、Rotylenchus macrodoratus、强壮盘旋线虫(Rotylenchus robustus)、单型盘旋线虫(Rotylenchus uniformis)和一般的盘旋线虫属物种(Rotylenchus spp.)、小班盾线虫(Scutellonema brachyurum)、缓慢盾线虫(Scutellonema bradys)、格尾盾线虫(Scutellonema clathricaudatum)和一般的盾线虫属物种(Scutellonema spp.)类迁移性内寄生虫、根瘿亚蟃线虫(Subanguina radiciola)、烟草头线虫(Tetylenchus nicotianae)、圆筒毛刺线虫(Trichodorus cylindricus)、微小毛刺线虫(Trichodorus minor)、原始毛刺线虫(Trichodorus primitivus)、最近毛刺线虫(Trichodorus proximus)、相似毛刺线虫(Trichodorus similis)、少见毛刺线虫(Trichodorus sparsus)和一般的毛刺线虫属物种(Trichodorus spp.)类体外寄生虫、农田矮化线虫(Tylenchorhynchus agri)、甘蓝矮化线虫(Tylenchorhynchus brassicae)、清亮矮化线虫(Tylenchorhynchus clarus)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchusclaytoni)、指状矮化线虫(Tylenchorhynchus digitatus)、伊布里矮化线虫(Tylenchorhynchus ebriensis)、最大矮化线虫(Tylenchorhynchus maximus)、裸矮化线虫(Tylenchorhynchus nudus)、普通矮化线虫(Tylenchorhynchus vulgaris)和一般的矮化线虫属物种(Tylenchorhynchus spp.)、半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)和一般的小垫刃属物种(Tylenchulus spp.)类半寄生虫、美洲剑线虫(Xiphinemaamericanum)、短颈剑线虫(Xiphinema brevicolle)、裂尾剑线虫(Xiphinemadimorphicaudatum)、标准剑线虫(Xiphinema index)和一般的剑线虫属物种(Xiphinema)类外寄生生物。
线虫有害生物的其他实例包括属于以下科的物种：环线虫科(Criconematidae)、刺线虫科(Belonolaimidae)、枪形科(Hoploaimidae)、异皮线虫科(Heteroderidae)、长针线虫科(Longidoridae)、短体线虫科(Pratylenchidae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、或粒线虫科(Anguinidae)。
表4示出了可以使用本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法处理或预防的线虫和与其相关的疾病的进一步实例。
表4.线虫有害生物
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F.病毒
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法可以用于降低细菌的适应度，例如以预防或处理植物中的病毒感染。包括用于将通过使病毒与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至病毒的方法。另外或替代地，这些方法包括通过使植物与有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物接触而将有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物递送至处于病毒感染的风险或具有病毒感染的植物。
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和相关方法适用于递送至引起植物中的病毒疾病的病毒，包括表5中列出的病毒和疾病。
表5.病毒性植物病原体
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G.杂草
如本文所用，术语“杂草”是指在不希望其生长的地方生长的植物。此类植物典型地是侵入性的，并且有时是有害的或具有变得有害的风险。可以用本发明的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物处理杂草来减小或消除植物的存在、生存力、或繁殖。例如并且不限于此，这些方法可以用于靶向已知损害植物的杂草。例如并且不限于此，杂草可以是以下科的组的任何成员：禾本科(Gramineae)、伞形花科(Umbelliferae)、蝶形花科(Papilionaceae)、十宇花科(Cruciferae)、锦葵科(Malvaceae)、大戟科(Eufhorbiaceae)、菊科(Compositae)、藜科(Chenopodiaceae)、紫堇科(Fumariaceae)、Charyophyllaceae、报春花科(Primulaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、蓼科(Polygonaceae)、灯芯草科(Juncaceae)、莎草科(Cyperaceae)、番杏科(Aizoaceae)、菊科(Asteraceae)、旋花科(Convolvulaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、蓼科(Polygonaceae)、马齿苋科(Portulaceae)、茄科(Solanaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、苦木科(Simaroubaceae)、木通科(Lardizabalaceae)、百合科(Liliaceae)、苋科(Amaranthaceae)、葡萄科(Vitaceae)、豆科(Fabaceae)、报春花科(Primulaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、五加科(Araliaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、萝摩科(Asclepiadaceae)、卫矛科(Celastraceae)、罂粟科(Papaveraceae)、柳叶菜科(Onagraceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、唇形科(Lamiaceae)、鸭跖草科(Commelinaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、川续断科(Dipsacaceae)、紫草科(Boraginaceae)、木賊科(Equisetaceae)、牛儿苗科(Geraniaceae)、茜草科(Rubiaceae)、大麻科(Cannabaceae)、金丝桃科(Hyperiacaceae)、凤仙花科(Balsaminaceae)、半边莲科(Lobeliaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、紫茉莉科(Nyctaginaceae)、酢浆草料(Oxalidaceae)、葡萄科(Vitaceae)、荨麻科(Urticaceae)、水龙骨科(Polypodiaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、菝葜科(Smilacaceae)、天南星科(Araceae)、桔梗科(Campanulaceae)、香蒲科(Typhaceae)、败酱科(Valerianaceae)、马鞭草科(Verbenaceae)、堇菜科(Violaceae)。例如并且不限于此，杂草可以是由以下组成的组的任何成员：硬直黑麦草(Lolium Rigidum)、Amaramthus palmeri、苘麻(Abutilontheopratsi)、假高粱(Sorghum halepense)、加拿大蓬(Conyza Canadensis)、倒刺狗尾草(Setaria verticillata)、荠(Capsella pastoris)、和Cyperus rotundas.另外的杂草包括例如刺轴含羞草(Mimosapigra)、槐叶苹属(salvinia)、香苦草属(hyptis)、决明属(senna)、noogoora、毛刺草(burr)、棉叶麻风树(Jatropha gossypifolia)、扁轴木(Parkinsonia aculeate)、香泽兰(Chromolaena odorata)、橡胶紫茉莉(Cryptoslegiagrandiflora)、或须芒草(Andropogon gayanus)。杂草可以包括单子叶植物(例如，剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)、燕麦属(Avena)、雀麦属(Bromus)、莎草属(Cyperus)、马唐属(Digitaria)、稗属(Echinochloa)、黑麦草属(Lolium)、雨久花属(Monochoria)、筒轴茅属(Rottboellia)、慈姑属(Sagittaria)、藨草属(Scirpus)、狗尾草属(Setaria)、黄花稔属(Sida)或蜀黍(Sorghum))或双子叶植物(苘麻属(Abutilon))、苋属(Amaranthus)、藜属(Chenopodium)、菊属(Chrysanthemum)、假蓬属(Conyza)、猪殃殃属(Galium)、番薯属(Ipomoea)、旱金莲属(Nasturtium)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、繁缕属(Stellaria)、婆婆纳属(Veronica)、堇菜属(Viola)或苍耳属(Xanthium))。
V.异源功能剂
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以进一步包括异源功能剂，诸如异源有效药剂(例如，杀有害生物剂或驱避剂)。在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10)不同的杀有害生物和/或驱避剂。在一些情况下，异源功能剂(例如，杀有害生物剂和/或驱避剂)包含在PMP中。例如，PMP可以包封异源功能剂(例如，杀有害生物剂和/或驱避剂)。可替代地，异源功能剂(例如，杀有害生物剂和/或驱避剂)可以包埋在PMP的表面上或与其缀合。
在其他情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以配制成包含异源功能剂(例如，杀有害生物剂和/或驱避剂)，并且它不一定与PMP缀合。在配制品中以及在由这些配制品制备的使用形式中，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以包含另外的活性化合物，诸如杀有害生物剂(例如，杀昆虫剂、灭菌剂、杀蜱螨亚纲动物剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀病毒剂、或除草剂)、引诱剂、或驱避剂。
杀有害生物剂可以是抗真菌剂、抗细菌剂、杀昆虫剂、杀软体动物剂、杀线虫剂、杀病毒剂、或其组合。杀有害生物剂可以是化学剂，诸如本领域中熟知的那些。替代地或另外地，杀有害生物剂可以是肽、多肽、核酸、多核苷酸、或小分子。杀有害生物剂可以是可以降低各种植物有害生物的适应度的药剂，或者可以是一种或多种特定靶植物有害生物(例如，特定物种或属的植物有害生物)的药剂。
在一些情况下，可以修饰异源功能剂(例如，化学物、核酸分子、肽、多肽、或小分子)。例如，修饰可以是化学修饰，例如缀合至标记物，例如荧光标记物或放射性标记物。在其他实例中，修饰可以包括缀合或操作性连接至部分，该部分增强药剂(例如，脂质、聚糖、聚合物(例如，PEG)、阳离子部分)的稳定性、递送、靶向、生物利用度、或半衰期。
可以用于本发明公开的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物和方法的异源功能剂(例如，杀有害生物或驱避剂)的实例概述在以下。
A.抗细菌剂
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以进一步包含抗细菌剂。在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10)不同的抗细菌剂。例如，抗细菌剂可以降低(例如，降低生长或杀死)细菌植物有害生物(例如，细菌植物病原体)的适应度。可以使包含如本文描述的抗生素的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶有害生物或其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到靶有害生物内或上抗生素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低靶有害生物的适应度。本文描述的抗细菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“抗细菌剂”是指杀死或抑制细菌(诸如植物病原体细菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或扩散的材料，并且包括杀细菌剂(例如，消毒化合物、抗菌化合物、或抗生素)或抑细菌剂(例如，化合物或抗生素)。杀细菌抗生素杀死细菌，而抑细菌抗生素仅减缓其生长或繁殖。
杀细菌剂可以包括消毒剂、抗菌剂、或抗生素。最多使用的消毒剂可以包括：活性氯(即，次氯酸盐(例如，次氯酸钠)、氯胺、二氯异氰脲酸酯和三氯异氰脲酸酯、湿氯、二氧化氯等)；活性氧(过氧化物，诸如乙酸、过硫酸钾、过硼酸钠、过碳酸钠和尿素过水合物)；碘(碘聚维酮(聚维酮-碘、必妥碘(Betadine))；鲁哥氏溶液(Lugol’s solution)、碘酊、碘化非离子型表面活性剂)；浓缩醇(主要是乙醇、1-丙醇(也称为正丙醇)和2-丙醇(称为异丙醇)及其混合物；此外，使用2-苯氧基乙醇以及1-和2-苯氧基丙醇)；酚类物质(诸如苯酚(也称为石炭酸)，甲酚(与液体钾皂组合称为Lysole)，卤化(氯化、溴化)苯酚，诸如六氯酚、三氯生、三氯苯酚、三溴苯酚、五氯苯酚、Dibromol及其盐)；阳离子表面活性剂，诸如一些季铵阳离子(诸如氯化苯甲烃铵、十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、十六烷基吡啶鎓氯化物、苯乙铵氯化物)以及其他；非季铵盐化合物，诸如双氯苯双胍己烷(chlorhexidine)、glucoprotamine、奥替尼啶二盐酸盐等)；强氧化剂，诸如臭氧和高锰酸盐溶液；重金属及其盐，诸如胶质银、硝酸银、氯化汞、苯基汞盐、硫酸铜、氧化-氯化铜、氢氧化铜、辛酸铜、硫酸氯氧化铜、硫酸铜、五水硫酸铜等。重金属及其盐是最大毒性的且对环境有害的杀细菌剂，并且因此，其使用被强烈压制或取消；此外，还有适当浓缩的强酸(磷酸、硝酸、硫酸、氨基磺酸、甲苯磺酸)和碱(氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙)。
作为抗菌剂(即，可以在人体或动物体、皮肤、粘膜、伤口等上使用的杀菌剂)，可以在适当的条件(主要是浓度、pH、温度和对人/动物的毒性)下使用上述几种消毒剂。其中重要的是：适当稀释的氯制剂(即，达康氏溶液(Daquin’s solution)、0.5％次氯酸钠或次氯酸钾溶液(pH调节至pH 7-8)、或0.5％-1％苯磺酰氯胺钠盐溶液(氯胺B))；一些碘制剂，诸如呈各种盖仑制剂(软膏、溶液、伤口膏药)的碘聚维酮、在过去还有鲁哥氏溶液；作为尿素过水合物溶液和pH缓冲的0.1％-0.25％过乙酸溶液的过氧化物；主要用于皮肤抗菌的具有或不具有抗菌添加剂的醇；弱有机酸，诸如山梨酸、苯甲酸、乳酸和水杨酸；一些酚类化合物，诸如六氯酚、三氯生和Dibromol；以及阳离子活性化合物，诸如0.05％-0.5％苯甲烃铵、0.5％-4％双氯苯双胍己烷、0.1％-2％奥替尼啶溶液。
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以包含抗生素。可以使用本领域已知的任何抗生素。抗生素通常基于其作用机制、化学结构或活性谱进行分类。
本文描述的抗生素可以靶向任何细菌的功能或生长过程，并且可以是抑细菌的(例如，减缓或阻止细菌生长)或杀细菌的(例如，杀死细菌)。在一些情况下，该抗生素是杀细菌抗生素。在一些情况下，该杀细菌抗生素是靶向细菌细胞壁的杀细菌抗生素(例如，青霉素和头孢菌素)；靶向细胞膜的杀细菌抗生素(例如，多粘菌素)；或者抑制必需细菌酶的杀细菌抗生素(例如，利福霉素、闰年霉素(lipiarmycins)、喹诺酮类和磺胺类)。在一些情况下，该杀细菌抗生素是氨基糖苷类(例如，春雷霉素)。在一些情况下，该抗生素是抑细菌抗生素。在一些情况下，该抑细菌抗生素靶向蛋白质合成(例如，大环内酯类、林可胺类和四环素类)。本文可以使用的另外类别的抗生素包括环脂肽(诸如达托霉素)、甘氨酰环素(诸如替加环素)、噁唑烷酮类(诸如利奈唑胺)、或闰年霉素(lipiarmycins)(诸如非达霉素)。抗生素的实例包括利福平、环丙沙星、强力霉素、氨比西林、和多粘菌素B。本文描述的抗生素可以具有任何水平的靶特异性(例如，窄谱或广谱)。在一些情况下，该抗生素是窄谱抗生素，并且因此靶向特定类型的细菌，诸如革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。可替代地，该抗生素可以是靶向宽范围的细菌的广谱抗生素。在一些情况下，抗生素是阿霉素或万古霉素。
抗生素的其他非限制性实例发现于表6中。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种抗生素的合适的浓度取决于诸如功效、抗生素的稳定性、不同抗生素的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表6.抗生素的实例
Figure GDA0002918049650001231
B.抗真菌剂
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以进一步包含抗真菌剂。在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10)不同的抗真菌剂。例如，抗真菌剂可以降低(例如，降低生长或杀死)真菌植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的抗真菌剂的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶真菌有害生物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到靶真菌内或上抗生素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低靶真菌的适应度。本文描述的抗真菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“杀真菌剂(fungicide)”或“抗真菌剂(antifungal agent)”是指杀死或抑制真菌(诸如植物病原体真菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或扩散的物质。商业上已生产了许多不同类型的抗真菌剂。抗真菌剂的非限制性实例包括：嘧菌酯、代森锰、丙硫菌唑、灭菌丹、戊唑醇、苯醚甲环唑、克菌丹、乙嘧酚磺酸酯、或乙膦酸-Al。进一步示例性杀真菌剂包括但不限于嗜球果伞素、嘧菌酯、甲氧菌平、烯肟菌酯、氟嘧菌酯、醚菌酯-甲基、苯氧菌胺、啶氧菌酯、唑菌胺酯、三氟敏、肟醚菌胺、甲酰胺、甲酰苯胺、苯霜灵、精苯霜灵、麦锈灵、萎锈灵、灭锈胺、灭普宁、甲呋酰胺、环酰菌胺、福多宁、呋霜灵(furalaxyl)、二甲呋酰胺、呋吡菌胺、甲霜灵、精甲霜灵(metalaxyl-M)(mefenoxam)、呋菌胺、噻菌胺、呋酰胺(ofurace)、恶霜灵、氧化萎锈灵、吡噻菌胺、吡喃灵(pyracarbolid)、水杨酰苯胺、叶枯酞、噻呋酰胺、噻酰菌胺、N-联苯基酰胺、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、N-酰基吗啉(carboxylic acidmorpholide)、烯酰吗啉、氟吗啉、苯甲酰胺、氟联苯菌(flumetover)、氟啶酰菌胺(fluopicolid)(氟吡菌胺(picobenzamid))、苯酰菌胺、甲酰胺、环丙酰菌胺、双氯氰菌胺、双炔酰菌胺、硫硅菌胺、唑类、三唑、双苯三唑醇、溴菌唑、环丙唑醇、苯醚甲环唑、达克利、恩康唑、氟环唑、芬克座、氟硅唑、氟喹唑、粉唑醇、己唑醇、亚胺唑、环戊唑醇、叶菌唑、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、丙硫菌唑、硅氟唑、戊唑醇、四氟醚唑、唑菌醇、三唑酮、灭菌唑、咪唑、氰霜唑、抑霉唑、净种灵(pefurazoate)、咪鲜胺、氟菌唑、苯并咪唑、苯菌灵、多菌灵、呋喃基苯并咪唑(fuberidazole)、噻苯咪唑、噻唑菌胺、土菌灵(etridiazole)、恶霉灵、含氮杂环基化合物、吡啶、氟啶胺(fuazinam)、比芬诺、嘧啶、乙嘧酚磺酸酯、环丙嘧啶、嘧菌腙(ferimzone)、氯苯嘧啶醇、嘧菌胺(mepanipyrim)、氟苯嘧啶醇、嘧霉胺、哌嗪、嗪胺灵、吡咯、咯菌腈、拌种咯(fenpiclonil)、吗啉、aldimorph、吗菌灵(dodemorph)、丁苯吗啉、十三吗啉、二甲酰亚胺、异菌脲、速克灵、乙烯菌核利、活化酯-S-甲基、敌菌灵、克菌丹、敌菌丹、棉隆、哒菌清、稻瘟酰胺、灭菌丹、苯锈啶、噁唑酮菌、咪唑菌酮(fenamidon)、辛基异噻唑酮(octhilinone)、噻菌灵、丙氧喹啉、咯喹酮(pyroquilon)、喹氧灵、三环唑、氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯、福美铁、代森锰、代森锰、代森联、威百亩、甲基代森锌、福美双、代森锌、福美锌、乙霉威、苯噻菌胺(flubenthiavalicarb)、丙森锌(iprovalicarb)、霜霉威、胍、多果定、双胍辛胺、双胍盐、春雷霉素、多氧霉素、链霉素、有效霉素A、有机金属化合物、三苯锡盐、含硫杂环基化合物、稻瘟灵、二噻农、有机磷化合物、克瘟散、乙膦酸、乙膦酸铝、异稻瘟净、吡嘧磷、甲基立枯磷、有机氯化合物、甲基托布津、百菌清、抑菌灵、对甲抑菌灵、氟硫灭、四氯苯酞、六氯苯、戊菌隆、五氯硝基苯、硝基苯基衍生物、乐杀螨、敌螨普、消螨通、螺环菌胺、环氟菌胺、霜脲氰、苯菌酮(metrafenon)、N-2-氰基苯基-3,4-二氯异噻唑-5-甲酰胺(异噻菌胺(isotianil))、N-(3’,4’,5’-三氟联苯-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-甲酰胺、3-[5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基异噁唑烷-3-基]-吡啶、N-(3’,4’-二氯-4-氟联苯-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-甲酰胺、5-氯-7-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(2,4,6-三氟苯基)-[1,2,4]三-唑并[1,5-a]嘧啶、2-丁氧基-6-碘-3-丙基色烯-4-酮、N,N-二甲基-3-(3-溴-6-氟-2-甲基吲哚-1-磺酰基)-[1,2,4]三唑-1-磺胺、甲基-(2-氯-5-[1-(3-甲基苄氧基亚氨基)-乙基]苄基)氨基甲酸酯、甲基-(2-氯-5-[1-(6-甲基吡啶-2-基甲氧基-亚氨基)乙基]苄基)氨基甲酸酯、3-(4-氯苯基)-3-(2-异丙氧基羰基氨基-3-甲基丁酰基-氨基)丙酸甲酯、N-(1-(1-(4-氰基苯基)乙磺酰基)丁-2-基)氨基甲酸4-氟苯酯、N-(2-(4-[3-(4-氯苯基)丙-2-炔基氧基]-3-甲氧基苯基)乙基)-2-甲磺酰基氨基-3-甲基丁酰胺、N-(2-(4-[3-(4-氯苯基)丙-2-炔基氧基]-3-甲氧基苯基)乙基)-2-乙磺酰基氨基-3-甲基丁酰胺、N-(4’-溴联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、N-(4’-三氟甲基联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、N-(4’-氯-3’-氟联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、或2-(邻-((2,5-二甲基苯氧基-亚甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸甲脂。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种抗真菌剂的合适的浓度取决于诸如功效、抗真菌剂的稳定性、不同抗真菌剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
C.杀昆虫剂
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以进一步包含杀昆虫剂。在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10)不同的杀昆虫剂。例如，杀昆虫剂可以降低(例如，降低生长或杀死)昆虫植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的杀昆虫剂的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶昆虫有害生物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到靶昆虫内或上杀昆虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低靶昆虫的适应度。本文描述的杀昆虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“杀昆虫剂(insecticide)”或“杀昆虫剂(insecticidalagent)”是指杀死或抑制昆虫(诸如农业昆虫有害生物)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。杀昆虫剂的非限制性实例在表7中示出。合适的杀昆虫剂的另外的非限制性实例包括生物制剂、激素或信息素(诸如印楝素)、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、白僵菌属(Beauveria)物种、可得蒙(codlemone)、绿僵菌属(Metarrhizium)物种、拟青霉属(Paecilomyces)物种、thuringiensis、和轮枝孢属(Verticillium)物种；以及具有未知或非特定的作用机理的活性化合物，诸如熏剂(诸如磷化铝、甲基溴和硫酰氟)，和选择性进食抑制剂(诸如冰晶石、氟啶虫酰胺和吡蚜酮)。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种杀昆虫剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀昆虫剂的稳定性、不同杀昆虫剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表7.杀昆虫剂的实例
Figure GDA0002918049650001261
Figure GDA0002918049650001271
Figure GDA0002918049650001281
D.杀线虫剂
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以进一步包含杀线虫剂。在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10)不同的杀线虫剂。例如，杀线虫剂可以降低(例如，降低生长或杀死)线虫植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的杀线虫剂的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶线虫有害生物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到靶线虫内或上杀线虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低靶线虫的适应度。本文描述的杀线虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“杀线虫剂(nematicide)”或“杀线虫剂(nematicidal agent)”是指杀死或抑制线虫(诸如农业线虫有害生物)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。杀线虫剂的非限制性实例在表8中示出。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种杀线虫剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀线虫剂的稳定性、不同杀线虫剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表8.杀线虫剂的实例
Figure GDA0002918049650001291
E.杀软体动物剂
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以进一步包含杀软体动物剂。在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10)不同的杀软体动物剂。例如，杀软体动物剂可以降低(例如，降低生长或杀死)软体动物植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的杀软体动物剂的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶软体动物有害生物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到靶软体动物内或上杀软体动物剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低靶软体动物的适应度。本文描述的杀软体动物剂可以配制在用于本文描述的任何方法的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“杀软体动物剂”或“杀软体动物剂”是指杀死或抑制软体动物(诸如农业软体动物有害生物)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。许多化学物可以用作杀软体动物剂，包括金属盐，诸如磷酸铁(III)、硫酸铝、和EDTA铁钠、[3][4]、聚乙醛、甲硫威、或乙酰胆碱酯酶抑制剂。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种杀软体动物剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀软体动物剂的稳定性、不同杀软体动物剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
F.杀病毒剂
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以进一步包含杀病毒剂。在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10)不同的杀病毒剂。例如，杀病毒剂可以降低(例如，降低或消除)病毒植物病原体的适应度。可以使包含如本文描述的杀病毒剂的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶病毒或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到杀病毒剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低或消除靶病毒。本文描述的杀病毒剂可以配制在用于本文描述的任何方法的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“杀病毒剂(virucide)”或“杀病毒剂(antiviral)”是指杀死或抑制病毒(诸如农业病毒病原体)的生长、增殖、繁殖、发育、或扩散的物质。许多药剂可以用作杀病毒剂，包括化学物或生物药剂(例如核酸，例如dsRNA)。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种杀病毒剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀病毒剂的稳定性、不同杀病毒剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
G.除草剂
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以进一步包含一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10)除草剂。例如，除草剂可以降低(例如，降低或消除)杂草的适应度。可以使包含如本文描述的除草剂的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶杂草接触，该量和时间足以：(a)植物上除草剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)，和(b)降低杂草的适应度。本文描述的除草剂可以配制在用于本文描述的任何方法的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
如本文所用，术语“除草剂”是指杀死或抑制杂草的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。许多化学物可以用作除草剂，包括草铵膦、喔草酯、苯嗪草酮、吡草胺、二甲戊乐灵、氟噻草胺、吡氟酰草胺、异噁草酮、烟嘧磺隆、硝磺草酮、唑啉草酯、磺草酮、苄草丹、甲磺草胺、治草醚、喹草酸、野麦畏、特丁津、莠去津、乙氧氟草醚、敌草隆、氟乐灵、或绿麦隆。除草剂的进一步实例包括但不限于苯甲酸除草剂，诸如麦草畏酯；苯氧基烷酸除草剂，诸如2,4-D、MCPA和2,4-DB酯；芳氧基苯氧基丙酸除草剂，诸如炔草酯(clodinafop)、氰氟草酯(cyhalofop)、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、和喹禾灵酯；吡啶羧酸除草剂，诸如氯氨吡啶酸、毒莠定、和二氯吡啶酸酯；嘧啶羧酸除草剂，诸如环丙嘧啶酸酯；吡啶基氧基烷酸除草剂，诸如氯氟吡氧乙酸(fluoroxypyr)和绿草定(triclopyr)酯；以及羟基苄腈除草剂，诸如溴草腈和碘苯腈(ioxynil)酯；芳基吡啶羧酸的酯；以及美国专利号7,314,849、美国专利号7,300,907和美国专利号7,642,220中披露的通用结构的芳基嘧啶羧酸，将各专利通过引用以其整体并入本文。在某些实施例中，除草剂可以选自由以下组成的组：2,4-D、2,4-DB、乙草胺、氟锁草醚、甲草胺、莠灭净、杀草强、黄草灵、莠去津、唑啶草酮、氟草氨、苄嘧磺隆、地散灵、苯达松、除草定、溴草腈、丁草敌、唑草酮、草灭畏、氯嘧磺隆、chlorproham、氯磺隆、烯草酮、异噁草酮、二氯吡啶酸、氯酯磺草胺酸(cloransulam)、草净津、环草敌、DCPA、甜菜安、敌草腈、禾草灵、双氯磺草胺、乙酰甲草胺、燕麦枯、二氟吡隆、精二甲吩草胺、敌草快、敌草隆、DSMA、草多索、EPTC、丁氟消草、胺苯磺隆、乙氧呋草黄、噁唑禾草灵、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)、氟酮磺隆、氟噻草胺、唑嘧磺草胺、氟烯草酸、丙炔氟草胺、伏草隆、氟草烟、嗪草酸(fluthiacet)、氟磺胺草醚、甲酰胺磺隆、草铵膦、草甘膦、氯吡嘧磺隆、吡氟氯禾灵(haloxyfop)、环嗪酮、咪草酯(imazamethabenz)、甲氧咪草烟、甲基咪草烟、咪唑喹啉酸、咪唑乙烟酸、异噁酰草胺、异噁唑草酮、乳氟禾草灵、利谷隆、MCPA、MCPB、硝磺草酮、灭草唑、异丙甲草胺-s、赛克津、甲磺隆、草达灭、MSMA、敌草胺、抑草生、烟嘧磺隆、达草灭、黄草消、恶草灵、环氧嘧磺隆、乙氧氟草醚、百草枯、克草猛(pebulate)、壬酸、二甲戊乐灵、苯敌草、毒莠定、氟嘧磺隆、氨氟乐灵、扑草净、拿草特、毒草安、敌稗、氟磺隆、杀草敏(pyrazon)、哒草特、嘧硫草醚、快杀稗(quinclorac)、喹禾灵、砜嘧磺隆(rimsulfuron)、稀禾定、环草隆、西玛津、甲磺草胺、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、特丁噻草隆、特草定、噻草啶、噻吩磺隆、禾草丹、肟草酮(tralkoxydim)、野麦畏、醚苯磺隆、苯磺隆、绿草定、氟乐灵、氟胺磺隆、灭草猛。在一些实例中，除草剂是阿霉素。本领域技术人员应当认识到，组合物中每种除草剂的合适的浓度取决于诸如功效、除草剂的稳定性、不同除草剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
H.驱避剂
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以进一步包含驱避剂。在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10)不同的驱避剂。例如，驱避剂可以趋避本文描述的任何有害生物(例如，昆虫、线虫、或软体动物)；微生物(例如，植物病原体或内生植物，诸如细菌、真菌、或病毒)；或杂草。可以使包含如本文描述的驱避剂的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶植物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到驱避剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)相对于未处理的植物降低植物上有害生物的水平。本文描述的驱避剂可以配制在用于本文描述的任何方法的有害生物防治组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
在一些情况下，驱避剂是昆虫驱避剂。熟知的昆虫驱避剂的一些实例包括：苯偶酰；苯甲酸苄酯；2,3,4,5-双(丁-2-烯)四氢糠醛(MGK驱避剂11)；丁氧基聚丙二醇；N-丁基乙酰苯胺；正丁基-6,6-二甲基-5,6-二氢-1,4-吡喃酮-2-甲酸酯(避虫酮)；己二酸二丁酯；邻苯二甲酸二丁酯；琥珀酸二正丁酯(驱虫特)；N,N-二乙基-间甲苯酰胺(DEET)；驱蚊灵(内型,内型)-二甲基二环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酸酯)；邻苯二甲酸二甲酯；2-乙基-2-丁基-1,3-丙二醇；2-乙基-1,3-己二醇(Rutgers 612)；异辛可部酸二正丙酯(MGK驱避剂326)；2-苯基环己醇；对甲烷-3,8-二醇，和N,N-二乙基琥珀酰胺酸正丙酯。其他驱避剂包括香茅油、邻苯二甲酸二甲酯、正丁基均三甲苯基氧化物草酸酯和2-乙基己二醇-1,3(参见Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology[柯克-奥瑟默化学技术百科全书],第2版,第11卷：724-728；和The Condensed Chemical Dictionary[简明化学词典],第8版,第756页)。
昆虫驱避剂可以是合成或非合成昆虫驱避剂。合成昆虫驱避剂的实例包括邻氨基苯甲酸甲酯以及其他基于邻氨基苯甲酸酯的昆虫驱避剂、苯甲醛、DEET(N,N-二乙基-间甲苯酰胺)、驱蚊灵、邻苯二甲酸二甲酯、埃卡瑞丁(icaridin)(即，派卡瑞丁(picaridin)、羟哌酯(Bayrepel)、和KBR 3023)、避虫酮(例如，如用于“6-2-2”混合物(60％邻苯二甲酸二甲酯、20％避虫酮、20％乙基己二醇)、IR3535(3-[N-丁基-N-乙酰基]-氨基丙酸，乙酯)、甲氧苄氟菊酯、扑灭司林、SS220、或三环癸烯基烯丙基醚。天然昆虫驱避剂的实例包括紫珠(紫珠属(Callicarpa))叶、桦树树皮、香杨梅(bog myrtle)(Myrica Gale)、猫薄荷油(例如，荆芥内酯)、香茅油、柠檬桉(Corymbia citriodora；例如p-薄荷烷-3,8-二醇(PMD))的精油、苦楝油、柠檬草、来自互生叶白千层(Melaleuca alternifolia)叶的茶树油、烟草、或其提取物。
I.生物药剂
i.多肽
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物(例如，PMP)可以包含多肽，例如作为抗细菌剂、抗真菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀病毒剂、或除草剂的多塔。在一些情况下，本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含靶向有害生物中的途径的多肽或其功能片段或衍生物。例如，多肽可以降低植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的多肽的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶有害生物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到多肽浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低或消除靶有害生物。本文描述的多肽可以配制在用于本文描述的任何方法的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
本文可用的多肽的实例可以包括酶(例如，代谢重组酶、螺旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)、核糖蛋白、蛋白适体、或伴侣蛋白。
本文包括的多肽可以包括天然存在的多肽或重组产生的变体。在一些情况下，该多肽可以是其功能片段或变体(例如，其酶活性片段或变体)。例如，该多肽可以是本文描述的任何多肽的功能活性变体，例如在指定区域或整个序列上，与本文描述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些情况下，多肽可以与感兴趣的多肽具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、或更大)同一性。
可以在用于本文描述的任何用途的组合物中配制本文描述的多肽。本文披露的组合物可以包含任何数量或类型(例如，类别)的多肽，诸如至少约1种多肽、2、3、4、5、10、15、20、或更多种多肽中的任一者。组合物中每种多肽的合适的浓度取决于诸如功效、多肽的稳定性、组合物中不同多肽的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。在一些情况下，液体组合物中每种多肽是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种多肽是从约0.1ng/g至约100mg/g。
制造多肽的方法在本领域是常规的。通常，参见Smales和James(编辑),Therapeutic Proteins:Methods and Protocols[治疗性蛋白：方法和方案](Methods inMolecular Biology[分子生物学方法]),Humana Press[胡玛纳出版社](2005)；和Crommelin,Sindelar和Meibohm(编辑),Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentalsand Applications[药物生物技术：基础与应用],Springer[斯普林格出版社](2013)。
用于产生多肽的方法涉及在植物细胞中表达，尽管也可以使用昆虫细胞、酵母、细菌、哺乳动物细胞、或其他细胞，在适当的启动子控制下，产生重组蛋白。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，诸如复制起点、合适的启动子和增强子、以及其他5’或3’侧翼非转录序列；以及5’或3’非翻译序列，诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受位点；以及终止序列。源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体：Green&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆-实验室手册](第四版),Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012)。
不同哺乳动物细胞培养系统可以用于表达和制造重组多肽药剂。哺乳动物表达系统的实例包括但不限于CHO细胞、COS细胞、HeLA和BHK细胞系。在以下文献中描述了用于产生蛋白治疗剂的宿主细胞培养的过程：例如，Zhou和Kantardjieff(编辑)，Mammalian CellCultures for Biologics Manufacturing[用于生物制品制造的哺乳动物细胞培养](Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物科技的进展]),Springer[斯普林格出版社](2014)。在以下文献中描述了蛋白质的纯化：Franks,Protein Biotechnology:Isolation,Characterization,and Stabilization[蛋白生物技术：分离、表征、和稳定化],Humana Press[胡玛纳出版社](2013)；以及Cutler,ProteinPurification Protocols[蛋白纯化方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]),Humana Press[胡玛纳出版社](2010)。以下文献中描述了蛋白治疗剂的配制品：Meyer(编辑),Therapeutic Protein Drug Products：Practical Approaches toformulation in the Laboratory,Manufacturing,and the Clinic[治疗性蛋白药物产品：实验室、制造和临床中配制品的实践方法],Woodhead Publishing Series[伍德海德出版系列](2012)。
在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含抗体或其抗原结合片断。例如，本文描述的药剂可以是阻断或增强有害生物的组分的活性和/或功能的抗体。抗体可以充当有害生物中多肽(例如，酶或细胞受体)的拮抗剂或激动剂。针对有害生物中的靶抗原的抗体的制造和使用是本领域已知的。参见例如ZhiqiangAn(编辑),Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic[治疗性单克隆抗体，从实验室到临床],第1版,Wiley,2009，以及还有Greenfield(编辑),Antibodies:ALaboratory Manual[抗体：实验室手册],第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],2013获得制造重组抗体的方法，包括抗体工程、简并寡核苷酸的使用、5’-RACE、噬菌体展示、以及诱变；抗体测试和表征；抗体药代动力学和药效动力学；抗体纯化和储存；以及筛选和标记技术。
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以包含细菌素。在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阳性细菌天然产生的，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、或乳酸菌(LAB，诸如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))。在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阴性细菌天然产生的，诸如蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、Serratiaplymithicum、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、软腐欧氏杆菌(Erwiniacarotovora)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、或大肠杆菌(Escherichiacoli)。示例性细菌素包括但不限于I-IV类LAB抗生素(诸如羊毛硫抗生素)、大肠杆菌素、小菌素(microcin)和脓菌素。
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以包含抗微生物肽(AMP)。可以使用适用于抑制微生物的AMP。AMP是一组多样化的分子，基于其氨基酸组成和结构分为亚组。AMP可以源自或产生自天然产生AMP的任何生物体，该AMP包括源自植物的AMP(例如，copsin)、源自昆虫的AMP(例如，蜂毒肽(Mastoparan)、poneratoxin、杀菌肽、家蚕抗菌肽、蜂毒素)、源自蛙类的AMP(例如，爪蟾抗菌肽、皮抑菌肽、aurein)、以及源自哺乳动物的AMP(例如，组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)、防御素和抗菌肽)。
ii.核酸
许多核酸在本文描述的组合物和方法中是有用的。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的核酸(例如，DNA分子或RNA分子，例如，mRNA、指导RNA(gRNA)、或抑制性RNA分子(例如，siRNA、shRNA、或miRNA)，或杂交DNA-RNA分子)，诸如至少约1个核酸类别或变体，2、3、4、5、10、15、20或更多个核酸类别或变体。组合物中每种核酸的合适浓度取决于多种因素，诸如功效、核酸的稳定性、不同核酸的数量、配制品、以及组合物的应用方法。可用于本文的核酸的实例包括Dicer底物小干扰RNA(dsiRNA)、反义RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹(shRNA)、微RNA(miRNA)、(不对称干扰RNA)aiRNA、肽核酸(PNA)、吗啉代、锁核酸(LNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核糖酶、脱氧核酶(DNAzyme)、适体(DNA、RNA)、环状RNA(circRNA)、指导RNA(gRNA)、或DNA分子
可以使包含如本文描述的核酸的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶有害生物或被其侵染的植物接触，该量和时间足以：(a)达到核酸浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和(b)降低或消除靶有害生物。本文描述的核酸可以配制在用于本文描述的任何方法的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物中，并且在某些情况下，可以与其PMP缔合。
(a)编码肽的核酸
在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含编码多肽的核酸。编码多肽的核酸可以具有以下长度：从约10至约50,000个核苷酸(nts)、约25至约100nts、约50至约150nts、约100至约200nts、约150至约250nts、约200至约300nts、约250至约350nts、约300至约500nts、约10至约1000nts、约50至约1000nts、约100至约1000nts、约1000至约2000nts、约2000至约3000nts、约3000至约4000nts、约4000至约5000nts、约5000至约6000nts、约6000至约7000nts、约7000至约8000nts、约8000至约9000nts、约9000至约10,000nts、约10,000至约15,000nts、约10,000至约20,000nts、约10,000至约25,000nts、约10,000至约30,000nts、约10,000至约40,000nts、约10,000至约45,000nts、约10,000至约50,000nts、或其间的任何范围。
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物还可以包含感兴趣的核酸序列的功能活性变体。在一些情况下，核酸的变体与感兴趣的核酸的序列，例如在指定区域上或在整个序列上，具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些情况下，本发明包括由如本文描述的核酸变体编码的功能活性多肽。在一些情况下,由核酸变体编码的功能活性多肽与感兴趣的多肽的序列或天然来源的多肽序列，例如在指定区域上或在整个氨基酸序列上，具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。
一些用于表达编码蛋白的核酸的方法可以涉及在适当的启动子控制下，在细胞中表达，这些细胞包括昆虫、酵母细胞、细菌细胞、或其他细胞。表达载体可以包括非转录元件，诸如复制起点、合适的启动子和增强子、以及其他5’或3’侧翼非转录序列；以及5’或3’非翻译序列，诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点；以及终止序列。源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体：Green等人,Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆-实验室手册],第四版,ColdSpring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],2012。
使用重组方法的遗传修饰通常是本领域已知的。可以使用本领域已知的重组方法获得编码希望的基因的核酸序列，例如像使用标准技术，通过从表达该基因的细胞中筛选文库、通过从已知包括该基因的载体获得该基因、或通过从包含该基因的细胞和组织直接分离。可替代地，感兴趣的基因可以是以合成方式产生的，而不是克隆的。
天然的或合成的核酸的表达典型地通过以下实现：将编码感兴趣的基因的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体并入表达载体。表达载体可以适用于在细菌中复制和表达。表达载体还可以适用于在真核生物中复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列、和启动子，可用于希望的核酸序列的表达。
另外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。典型地，这些元件位于起始位点上游30-110个碱基对(bp)的区域中，尽管最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当反转元件或使元件相对彼此移动时能够保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以共同地或独立地发挥功能，以激活转录。
合适的启动子的一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、艾普斯登-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、连同人类基因启动子(诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子、以及肌酸激酶启动子)。
可替代地，启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，当希望这种表达时，该分子开关能够开启与该启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或当不希望表达时，则能够关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、和四环素启动子。
待引入的表达载体还可以含有选择性标记基因或报告基因或二者，从而便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞的群体中，鉴定和选择表达性细胞。在其他方面，选择性标记物可以在一段单独的DNA上进行，并且用于共转染程序。选择性标记物和报告基因二者侧翼可以是适当的调节序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记物包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。
报告基因可以用于鉴定潜在转化的细胞并且用于评估调节序列的功能性。通常，报告基因是不存在于受体源或不由受体源表达，并且编码其表达由一些易于检测特性(例如酶活性)所证明的多肽的基因。在将DNA引入受体细胞后，在适当的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82,2000)。合适的表达系统是熟知的，可以使用已知技术制备或商业获得。通常，具有显示报告基因最高表达水平的最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以连接至报告基因，并且用于评估药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些情况下，生物体可以被遗传修饰从而改变一种或多种蛋白的表达。一种或多种蛋白的表达可以被修饰用于具体时间，例如生物体的发育或分化状态。在一种情况下，本发明包括用来改变一种或多种蛋白(例如影响活性、结构、或功能的蛋白)的表达的组合物。一种或多种蛋白的表达可以限制在一个或多个具体位置，或遍布整个生物体中。
(b)合成的mRNA
有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以包含合成mRNA分子，例如编码多肽的合成mRNA分子。合成的mRNA分子可以被修饰，例如被化学修饰。mRNA分子可以是化学合成的，或在体外转录。mRNA分子可以设置在质粒上，例如，病毒载体、细菌载体、或真核表达载体。在一些实例中，可以通过转染、电穿孔、或转导(例如，腺病毒或慢病毒转导)，将mRNA分子递送至细胞。
在一些情况下，本文描述的经修饰的感兴趣的RNA药剂具有经修饰的核苷或核苷酸。此类修饰是已知的，并且描述于以下文献中：例如WO 2012/019168。在以下文献中描述了另外的修饰：例如WO 2015/038892；WO 2015/038892；WO 2015/089511；WO 2015/196130；WO 2015/196118和WO 2015/196128 A2。
在一些情况下，编码感兴趣的多肽的修饰的RNA具有一个或多个末端修饰，例如5’帽结构和/或多聚A尾(例如，长度在100-200个核苷酸之间)。5’帽结构可以选自由以下组成的组：CapO、Capl、ARCA、肌苷、Nl-甲基-鸟苷、2’氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、和2-叠氮-鸟苷。在一些情况下，经修饰的RNA还含有5’UTR(其包括至少一个Kozak序列)和3’UTR。此类修饰是已知的，并且描述于以下文献中：例如，WO 2012/135805和WO 2013/052523。以下文献中描述了另外的末端修饰，例如，WO 2014/164253和WO2016/011306、WO 2012/045075、以及WO 2014/093924。用于合成加帽RNA分子(例如，修饰的mRNA)(其可以包括至少一个化学修饰)的嵌合酶描述于WO 2014/028429中。
在一些情况下，修饰的mRNA可以环化或串联，从而产生具有翻译能力的分子，进而辅助多聚A结合蛋白和5’-端结合蛋白之间的相互作用。可以通过至少3种不同途径发生环化或串联机制：1)化学途径，2)酶途径，以及3)核酶催化途径。新形成的5’-/3’-键可以是分子内或分子间的。描述了此类修饰，例如在WO 2013/151736中。
制造和纯化修饰的RNA的方法是本领域已知的，并且已在本领域披露。例如，仅使用体外转录(IVT)酶合成制造修饰的RNA。制造IVT多核苷酸的方法是本领域已知的，并且描述于以下文献中：WO 2013/151666、WO 2013/151668、WO 2013/151663、WO 2013/151669、WO2013/151670、WO 2013/151664、WO 2013/151665、WO 2013/151671、WO 2013/151672、WO2013/151667和WO 2013/151736。纯化方法包括通过以下纯化包括多聚A尾在内的RNA转录物：在使得RNA转录物结合至与多个胸苷或其衍生物和/或多个尿嘧啶或其衍生物(多聚T/U)连接的表面的条件下使样品与该表面接触，并且从该表面洗脱纯化的RNA转录物(WO2014/152031)；经由可扩展的方法，使用允许长度高达10,000个核苷酸的较长RNA分离的离子(例如阴离子)交换色谱法(WO 2014/144767)；并且使修饰的mRNA样品经受DNA酶处理(WO2014/152030)。
修饰的RNA的配制品是已知的并且描述于例如WO 2013/090648中。例如，配制品可以是但不限于纳米颗粒、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球、类脂质、脂复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物类(包括简单糖)、阳离子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白封闭剂、纤维蛋白原、凝血酶、快速消除的脂质纳米颗粒(reLNP)及其组合。
在人类疾病、抗体、病毒和多种体内环境的领域中，编码多肽的修饰的RNA是已知的，并且披露于例如国际公开号WO 2013/151666、WO 2013/151668、WO 2013/151663、WO2013/151669、WO 2013/151670、WO 2013/151664、WO 2013/151665、WO 2013/151736的表6中；国际公开号WO 2013/151672的表6和表7中；国际公开号WO 2013/151671的表6、表178和表179中；国际公开号WO 2013/151667的表6、185和186中。可以将以上项中的任一种合成为IVT多核苷酸、嵌合多核苷酸或环状多核苷酸，并且各自可以包括一种或多种修饰的核苷酸或末端修饰。
(c)抑制性RNA
在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含抑制性RNA分子，例如该抑制性RNA分子经由RNA干扰(RNAi)途径发挥作用。在一些情况下，抑制性RNA分子降低有害生物中的基因表达水平和/或降低有害生物中的蛋白质水平。在一些情况下，抑制性RNA分子抑制有害生物基因的表达。例如，抑制性RNA分子可以包括短干扰RNA、短发夹RNA、和/或微RNA，其靶向有害生物中的基因。某些RNA分子可以通过RNA干扰(RNAi)的生物过程抑制基因表达。RNAi分子包括RNA或RNA样结构，这些结构典型地含有15-50个碱基对(诸如约18-25个碱基对)，并且具有与细胞内的表达的靶基因中的编码序列同一的(互补的)或接近同一的(基本上互补的)核碱基序列。RNAi分子包括但不限于：Dicer底物小干扰RNA(dsiRNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体(meroduplex)、dicer酶底物、和多价RNA干扰(美国专利号8,084,599、8,349,809、8,513,207和9,200,276)。shRNA是包含经由RNAi降低靶基因表达的发夹弯(发夹弯)的RNA分子。可以按质粒的形式，例如病毒或细菌载体，例如通过转染、电穿孔、或转导，将shRNA递送至细胞。微RNA是典型地具有约22个核苷酸的长度的非编码RNA分子。MiRNA结合mRNA分子上的靶位点，并且使该mRNA沉默，例如，通过引起该mRNA的切割，使该mRNA去稳定，或抑制该mRNA的翻译。在一些情况下，抑制性RNA分子降低负功能调节因子的水平和/或活性。在其他情况下，抑制性RNA分子降低正功能调节因子的抑制剂的水平和/或活性。抑制性RNA分子可以是化学合成的或在体外转录。
在一些情况下，核酸是DNA、RNA、或PNA。在一些情况下，RNA是抑制性RNA。在一些情况下，抑制性RNA抑制植物有害生物中的基因表达。在一些情况下，核酸是mRNA、经修饰的mRNA、或DNA分子，其增加有害生物中以下的表达：酶(例如，代谢重组酶、螺旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)、核糖蛋白、蛋白适体、或伴侣蛋白。在一些情况下，核酸是mRNA、经修饰的mRNA、或DNA分子，其增加以下的表达：酶(例如，代谢酶、重组酶、螺旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)、核糖蛋白、蛋白适体、或伴侣蛋白。在一些情况下，有害生物中表达的增加是相对于参考水平(例如，未处理的有害生物中的表达)约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％的表达增加。在一些情况下，有害生物中表达的增加是相对于参考水平(例如，未处理的有害生物中的表达)约2x倍、约4x倍、约5x倍、约10x倍、约20x倍、约25x倍、约50x倍、约75x倍、或约100x倍或更大的表达增加。
在一些情况下，核酸是反义RNA、dsiRNA、siRNA、shRNA、miRNA、aiRNA、PNA、morpholino、LNA、piRNA、核糖酶、DNAzyme、适体(DNA、RNA)、circRNA、gRNA、或DNA分子(例如，反义多核苷酸)，其作用是减少有害生物中以下的表达：例如酶(代谢酶、重组酶、螺旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、聚合酶、泛素化蛋白、超氧化物管理酶、或能量生产酶)、转录因子、分泌蛋白、结构因子(肌动蛋白、驱动蛋白、或微管蛋白)、核糖蛋白、蛋白适体、伴侣蛋白、受体、信号传导配体、或转运蛋白。在一些情况下，有害生物中表达的降低是相对于参考水平(例如，未处理的有害生物中的表达)约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％的表达降低。在一些情况下，有害生物中表达的降低是相对于参考水平(例如，未处理的有害生物中的表达)约2x倍、约4x倍、约5x倍、约10x倍、约20x倍、约25x倍、约50x倍、约75x倍、或约100x倍或更大的表达降低。
RNAi分子包括与靶基因的全部或片段基本上互补、或完全互补的序列。RNAi分子可以与内含子和外显子之间的边界处的序列互补，从而防止特异性基因的新产生的核RNA转录物成熟为用于转录的mRNA。与特异性基因互补的RNAi分子可以与靶基因的mRNA杂交，并且防止其翻译。反义分子可以是DNA、RNA、或其衍生物或杂交体。此类衍生物分子的实例包括但不限于肽核酸(PNA)和硫代磷酸酯基分子，诸如脱氧核糖核酸胍(DNG)或核糖核酸胍(RNG)。
RNAi分子可以作为体外合成的“即用型”RNA提供，或作为转染到细胞中的反义基因提供，当转录时，这些细胞将产生RNAi分子。与mRNA杂交导致杂交的分子被RNA酶H降解，和/或翻译复合物的形成的抑制。二者都导致不能产生原始基因的产物。
与感兴趣的转录物杂交的RNAi分子的长度可以是约10个核苷酸，约15或30个核苷酸之间，或约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸。反义序列与靶向的转录物的同一性程度可以是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。
RNAi分子还可以包括突出端，即典型地不成对的、悬突核苷酸，其不直接参与正常情况下由本文限定的正义链和反义链对的核心序列形成的双螺旋结构。RNAi分子可以含有独立地位于每条正义链和反义链上的约1-5个碱基的3’和/或5’突出端。在一些情况下，正义链和反义链二者都含有3’和5’突出端。在一些情况下，一条链的一个或多个3’突出端核苷酸与另一条链的一个或多个5’突出端核苷酸碱基配对。在其他情况下，一条链的一个或多个3’突出端核苷酸不与另一条链的一个或多个5’突出端核苷酸碱基配对。RNAi分子的正义和反义链可以含有或可以不含有相同数量的核苷酸碱基。反义和正义链可以形成双链体，其中仅5’端具有钝端，仅3’端具有钝端，5’和3’端都是钝端，或5’端和3’端都不是钝端。在另一个情况下，突出端中的一个或多个核苷酸含有硫代磷酸、硫代磷酸酯、反转的脱氧核苷酸(3’至3’连接的)核苷酸，或是修饰的核糖核苷酸或脱氧核苷酸。
小干扰RNA(siRNA)分子包括与靶mRNA的约15至约25个连续核苷酸同一的核苷酸序列。在一些情况下，siRNA序列以二核苷酸AA开始，包括含量为30％-70％(约30％-60％、约40％-60％、或约45％-55％)的GC，并且与除了待引入其中的基因组中的靶标之外的任何核苷酸序列不具有高同一性百分比，例如，如通过标准BLAST检索确定的。
siRNA和shRNA类似于内源性微RNA(miRNA)基因的加工途径中的中间体(Bartel,Cell[细胞]116:281-297,2004)。在一些情况下，siRNA可以作为miRNA起作用，反之亦然(Zeng等人,Mol.Cell[分子细胞学]9:1327-1333,2002；Doench等人,Genes Dev.[基因和发育]17:438-442,2003)。外源性siRNA下调与siRNA具有种子互补性的mRNA(Birmingham等人,Nat.Methods[自然方法]3：199-204,2006)。3’UTR内的多个靶位点给出了更强的下调(Doench等人,Genes Dev.[基因和发育]17:438-442,2003)。
已知的有效的siRNA序列和同源结合位点也很好地呈现在相关文献中。通过本领域已知的技术，RNAi分子易于设计和生产的。此外，存在增加发现有效并且特异性的基序的机会的计算工具(Pei等人,Nat.Methods[自然方法]3(9):670-676,2006；Reynolds等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术]22(3)：326-330,2004；Khvorova等人,Nat.Struct.Biol.[自然结构生物学]10(9)：708-712,2003；Schwarz等人,Cell[细胞]115(2)：199-208,2003；Ui-Tei等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]32(3)：936-948,2004；Heale等人,NucleicAcids Res.[核酸研究]33(3)：e30,2005；Chalk等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生化及生物物理研究通讯]319(1)：264-274,2004；以及Amarzguioui等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生化及生物物理研究通讯]316(4)：1050-1058,2004)。
RNAi分子调节由基因编码的RNA的表达。因为多个基因可能彼此共享一定程度的序列同源性，所以在一些情况下，可以设计RNAi分子以靶向具有充分序列同源性的一类基因。在一些情况下，RNAi分子可以含有与在不同基因靶标中共享的序列或对于特异性基因靶标而言是独特的序列具有互补性的序列。在一些情况下，可以设计RNAi分子以靶向在若干基因之间具有同源性的RNA序列的保守区，由此靶向一个基因家族中的若干基因(例如，不同基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在一些情况下，可以设计RNAi分子以靶向对于单个基因的特异性RNA序列而言是独特的序列。
抑制性RNA分子可以被修饰，例如，从而含有修饰的核苷酸，例如，2’-氟、2’-邻甲基、2’-脱氧、解锁核酸、2’-羟基、硫代磷酸酯、2’-硫尿核苷、4’-硫尿核苷、2’-脱氧尿苷。不希望受理论约束，据信此类修饰可以增加核酸酶抗性和/或血清稳定性，或降低免疫原性。
在一些情况下，经由生理上不稳定的键或接头将RNAi分子连接至递送聚合物。选择生理上不稳定的接头，使得存在于某些生理条件下时，经历化学转化(例如，切割)(例如，在细胞质的还原性环境下，经二硫键切割)。通过切割生理上不稳定的连接，从聚合物释放分子，促进了分子与对于活性而言适当的细胞组分的相互作用。
可以通过将分子与聚合物共价连接，形成RNAi分子-聚合物缀合物。聚合物是聚合的或修饰的，使得它含有反应性基团A。RNAi分子也是聚合的或经修饰的，使得它含有反应性基团B。选择反应性基团A和B，使得可以使用本领域已知的方法，经由可逆的共价键，连接它们。
在过量的聚合物存在下，可以进行RNAi分子与聚合物的缀合。因为在缀合期间，RNAi分子和聚合物可以具有相反的电荷，所以过量的聚合物的存在可以减少或消除缀合物的聚集。可替代地，可以使用过量的载体聚合物，诸如聚阳离子。可以在施用该缀合物之前，从缀合的聚合物除去过量聚合物。可替代地，可以与缀合物共施用过量聚合物。
在胚胎发生期间，注射双链RNA(dsRNA)到母体昆虫中有效抑制其后代的基因表达，参见例如，Khila等人,PLoS Genet.[公共科学图书馆遗传学]5(7)：e1000583,2009；以及Liu等人,Development[发育]131(7)：1515-1527,2004。Matsuura等人(PNAS112(30)：9376-9381,2015)已经显示，抑制Ubx消除了含菌细胞和含菌细胞的共生体定位。
基于非编码RNA，诸如核酶、RNA酶P、siRNA、和miRNA的抑制剂的制备和使用也是本领域已知的，例如，如在以下文献中描述的：Sioud,RNA Therapeutics:Function,Design, and Delivery[RNA治疗剂：功能、涉及、和递送](Methods in Molecular Biology[分子生 物学方法]).Humana Press[胡玛纳出版社](2010)。
(d)基因编辑
本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物可以包含基因编辑系统的组分。例如，药剂可以在有害生物中的基因中引入改变(例如，插入、缺失(例如，敲除)、易位、倒位、单点突变或其他突变)。示例性基因编辑系统包括锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活剂效应因子基核酸酶(TALEN)、和规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)系统。以下文献中描述了基于ZFN、TALEN、和CRISPR的方法：例如Gaj等人,TrendsBiotechnol.[生物技术趋势]31(7):397-405,2013。
在典型的CRISPR/Cas系统中，通过靶向单链或双链DNA序列的序列特异性的、非编码“指导RNA”，将内切核酸酶导向靶核苷酸序列(例如，待进行序列编辑的基因组中的位点)。已经鉴定了三类(I-III)CRISPR系统。II类CRISPR系统使用单个Cas内切核酸酶(而不是多个Cas蛋白)。一种II类CRISPR系统包括II类Cas内切核酸酶，诸如Cas9、CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。crRNA含有指导RNA，即典型地，对应于靶DNA序列的一个约20个核苷酸的RNA序列。crRNA还包含与tracrRNA结合的区域，以形成被RNase III切割的部分双链结构，产生crRNA/tracrRNA杂交体。RNA作为指导物以指导Cas蛋白使特异性DNA/RNA序列沉默，这取决于间隔子序列。参见例如，Horvath等人,Science[科学]327:167-170,2010；Makarova等人,Biology Direct[生物学指导]1：7,2006；Pennisi,Science[科学]341∶833-836,2013。靶DNA序列必须总体上邻近针对给定Cas内切核酸酶来说是特异性的原间隔子邻近基序(PAM)；然而，PAM序列似乎遍布整个给定基因组。从不同原核物种鉴定的CRISPR内切核酸酶具有独特的PAM序列要求；PAM序列的实例包括5’-NGG(SEQ ID NO:78)(酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、5’-NNAGAA(SEQ ID NO:79)(嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CRISPR1)、5’-NGGNG(SEQ ID NO:80)(嗜热链球菌CRISPR3)、和5’-NNNGATT(SEQ ID NO:81)(奈瑟氏脑膜炎双球菌(Neisseriameningiditis))。一些内切核酸酶，例如，Cas9内切核酸酶，与富含G的PAM位点(例如，5’-NGG(SEQ ID NO:78))相关，并且在距离PAM位点上游(距离PAM位点的5’)3个核苷酸的位置处，进行靶DNA的钝端切割。另一个II类CRISPR系统包括小于Cas9的V型内切核酸酶Cpf1；实例包括AsCpf1(来自氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.))和LbCpf1(来自毛螺菌科物种(Lachnospiraceae sp.))。Cpf1相关CRISPR阵列被加工成成熟crRNA，而不需要tracrRNA；换言之，Cpf1系统仅需要Cpf1核酸酶和crRNA来切割靶DNA序列。Cpf1内切核酸酶与富含T的PAM位点，例如，5’-TTN相关。Cpf1也可以识别5’-CTA PAM基序。Cpf1通过引入具有4或5个核苷酸的5’突出端的错位或交错的双链断裂来切割靶DNA，例如切割如下靶DNA，该靶DNA中的5个核苷酸的错位或交错的切割位于距离编码链上的PAM位点下游(3’)18个核苷酸的位置处和距离互补链上的PAM位点下游23个核苷酸的位置处；由这种错位切割产生的5个核苷酸突出端使得通过同源重组的DNA插入比在平末端切割的DNA的插入更精确地进行基因组编辑。参见例如，Zetsche等人,Cell[细胞]163:759-771,2015。
出于基因编辑的目的，可以设计CRISPR阵列以含有对应于希望的靶DNA序列的一个或多个指导RNA序列；参加例如，Cong等人,Science[科学]339:819-823,2013；Ran等人,Nature Protocols[自然实验手册]8:2281-2308,2013。用于进行DNA切割，Cas9需要gRNA序列的至少约16或17个核苷酸；对于Cpf1，需要gRNA序列的至少约16个核苷酸，从而实现可检测的DNA切割。在实践中，指导RNA序列通常被设计为具有17-24个核苷酸之间(例如，19、20、或21个核苷酸)的长度，并且与靶向的基因或核酸序列互补性。定制的gRNA生成器和算法可从商业上获得，用于设计有效的指导RNA。还使用嵌合的单指导RNA(sgRNA)，一种模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物并包含tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶指导至编辑目标序列)的工程化(合成)单RNA分子，实现了基因编辑。也已经证明，在基因组编辑中，化学修饰的sgRNA是有效的；参见例如，Hendel等人,Nature Biotechnol.[自然生物技术]985-991,2015。
而在由gRNA靶向的特异性DNA序列上，野生型Cas9产生双链断裂(DSB)，许多具有修饰的功能性的CRISPR内切核酸酶是可得的，例如：Cas9的切口酶形式仅产生单链断裂；无催化活性的Cas9(dCas9)不切割靶DNA，但是通过位阻干扰转录。dCas9可以进一步与效应因子融合，从而阻遏(CRISPRi)或激活(CRISPRa)靶基因的表达。例如，Cas9可以与转录阻遏因子(例如，KRAB结构域)或转录激活剂融合(例如，dCas9-VP64融合物)。融合至FokI核酸酶(dCas9-FokI)的无催化活性的Cas9(dCas9)可以用于在与两个gRNA同源的靶序列上产生DSB。参见例如，许多CRISPR/Cas9质粒披露于并且可公开获得自阿德基因质粒库(Addgenerepository)(阿德基因公司(Addgene),西德尼大街75号(Sidney St.),550A单元,剑桥郡,马萨诸塞州02139；addgene.org/crispr/)。引入两个单独的双链断裂(各自由单独的指导RNA指导)的双切口酶Cas9被以下文献描述为实现了更精确的基因组编辑：Ran等人,Cell[细胞]154:1380-1389,2013。
用于编辑真核生物的基因的CRISPR技术披露于以下文献中：美国专利申请公开US2016/0138008 A1和US 2015/0344912 A1，以及美国专利8,697,359、8,771,945、8,945,839、8,999,641、8,993,233、8,895,308、8,865,406、8,889,418、8,871,445、8,889,356、8,932,814、8,795,965、和8,906,616。Cpf1内切核酸酶和相应的指导RNA和PAM位点在美国专利申请公开2016/0208243 A1中披露。
在一些情况下，希望的基因组修饰涉及同源重组，其中由RNA指导的核酸酶和一种或多种指导RNA产生靶核苷酸序列中的一个或多个双链DNA断裂，随后使用同源重组机制(同源定向修复)，修复该一个或多个断裂。在这样的情况下，将编码待在双链断裂处插入或敲入的希望的核苷酸序列的供体模板提供至细胞或受试者；合适的模板的实例包括单链DNA模板和双链DNA模板(例如，与本文所述的多肽连接)。通常，以单链DNA的形式，提供编码小于约50个核苷酸的区域内的核苷酸变化的供体模板；更大的供体模板(例如，多于100个核苷酸)通常作为双链DNA质粒提供。在一些情况下，以足以实现希望的同源定向修复，但是在给定时间段后(例如在一个或多个细胞分裂周期后)不存留于细胞或受试者中的量，将供体模板提供至细胞或受试者。在一些情况下，供体模板具有与靶核苷酸序列(例如同源内源基因组区)相差至少1、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、或更多个核苷酸的核心核苷酸序列。此核心序列侧翼是同源性臂或与靶向的核苷酸序列具有高度序列同一性的区域；在一些情况下，具有高度同一性的区域包括在核心序列的每一侧上的至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少750、或至少1000个核苷酸。在一些情况下，其中供体模板处于单链DNA的形式，核心序列侧翼是同源性臂，该同源性臂包括在核心序列的每一侧上的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、或至少100个核苷酸。在多种情况下，其中供体模板处于双链DNA的形式，核心序列侧翼是同源性臂，该同源性臂包括在核心序列的每一侧上的至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、或至少1000个核苷酸。在一种情况下，用双切口酶Cas9，将两个单独的双链断裂引入细胞或受试者的靶核苷酸序列(参见Ran等人,Cell[细胞]154：1380-1389,2013)，随后是供体模板的递送。
在一些情况下，该组合物包括gRNA和靶向的核酸酶，例如，Cas9，例如，野生型Cas9、切口酶Cas9(例如，Cas9 D10A)、失活Cas9(dCas9)、eSpCas9、Cpf1、C2C1、或C2C3，或编码这样的核酸酶的核酸。通过靶向的突变是否是核苷酸的缺失、取代、或添加，例如靶向的序列的核苷酸缺失、取代、或添加，确定核酸酶和一种或多种gRNA的选择。无催化活性的内切核酸酶，例如，失活Cas9(dCas9，例如，D10A、H840A)与(一个或多个)效应因子结构域的全部或一部分(例如生物活性部分)链连的融合物产生可以与多肽连接的嵌合蛋白，从而通过一个或多个RNA序列(sgRNA)指导该组合物至特定的DNA位点，进而调节一个或多个靶核酸序列的活性和/或表达。
在多种情况下，药剂包括指导RNA(gRNA)，用于进行基因编辑的CRISPR系统。在一些情况下，药剂包括锌指核酸酶(ZFN)或编码ZFN的mRNA，其靶向(例如，切割)有害生物中基因的核酸序列(例如，DNA序列)。在一些情况下，药剂包括TALEN或编码TALEN的mRNA，其靶向(例如，切割)有害生物的基因的核酸序列(例如，DNA序列)。
例如，gRNA可以用于CRISPR系统以工程化有害生物中的基因的改变。在其他实例中，ZFN和/或TALEN可以用于工程化有害生物中的基因的改变。示例性改变包括插入、缺失(例如，敲除)、易位、反转、单点突变、或其他突变。可以将改变引入细胞中的基因中，例如体外、离体、或体内进行。在一些实例中，该改变增加有害生物中的基因的水平和/或活性。在其他实例中，该改变降低有害生物中的基因的水平和/或活性(例如，敲低或敲除)。在又另一个实例中，该改变纠正有害生物中的基因中的缺陷(例如，引起缺陷的突变)。
在一些情况下，CRISPR系统用于编辑(例如，添加或缺失碱基对)有害生物中的靶基因。在其他情况下，将CRISPR系统用于引入提前终止密码子，例如由此降低靶基因的表达。仍在其他情况下，将CRISPR系统用于以可逆的方式，例如类似于RNA干扰，关闭靶基因。在一些情况下，将CRISPR系统用于将Cas指导至基因的启动子，由此以位阻方式阻断RNA聚合酶。
在一些情况下，可以生成CRISPR系统以使用以下中描述的技术编辑有害生物中的基因：例如美国公开号20140068797,Cong,Science[科学]339:819-823,2013；Tsai,NatureBiotechnol.[自然生物技术]32:6 569-576,2014；美国专利号：8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；和8,697,359。
在一些情况下，CRISPR干扰(CRISPRi)技术可以用于转录阻遏有害生物中的特定基因。在CRISPRi中，工程化的Cas9蛋白(例如，无核酸酶的dCas9、或dCas9融合蛋白，例如，dCas9-KRAB或dCas9-SID4X融合物)可以与序列特异性指导RNA(sgRNA)配对。Cas9-gRNA复合物可以阻断RNA聚合酶，由此干扰转录延伸。该复合物还可以通过干扰转录因子结合，阻断转录起始。CRISPRi方法是特异性的，具有最小的脱靶效应并且是可多路共用的，例如可以同时阻遏多于一个基因(例如，使用多个gRNAs)。而且，CRISPRi方法允许可逆的基因抑制。
在一些情况下，CRISPR介导的基因激活(CRISPRa)可以用于有害生物中的基因的转录激活。在CRISPRa技术中，dCas9融合蛋白募集了转录激活剂。例如，dCas9可以与多肽(例如，激活结构域)(诸如VP64或p65激活结构域(p65D))融合，并且与sgRNA(例如，单个sgRNA或多个sgRNAs)一起使用，以激活有害生物中的一个或多个基因。可以使用多种sgRNA募集多种激活剂-这可以增加激活功效。可以使用多种激活结构域和单个或多个激活结构域。除了将dCas9工程化来募集激活剂，还可以将sgRNA工程化来募集激活剂。例如，可以将RNA适配体并入sgRNA来募集蛋白(例如，激活结构域)，诸如VP64。在一些实例中，协同激活介导因(SAM)系统可以用于转录激活。在SAM中，将MS2适配体添加至sgRNA。MS2募集融合至p65AD和热休克因子1(HSF1)的MS2外壳蛋白(MCP)。
以下文献更详细地描述了CRISPRi和CRISPRa技术，例如，Dominguez等人,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.[自然综述分子细胞生物学]17:5-15,2016，将其通过引用并入本文。另外，dCas9介导的表观遗传修饰以及使用CRISPR系统的同时激活和阻遏(如Dominguez等人所描述)可以用于调节有害生物中的基因。
iii.小分子
在一些情况下，有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含小分子，例如生物小分子。许多小分子药剂可用于本文描述的方法和组合物。
小分子包括但不限于小肽、模拟肽(例如，类肽)、氨基酸、氨基酸类似物、合成的多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核甘酸类似物、通常具有小于约5,000克/摩尔的分子量的有机和无机化合物(包括杂有机(heterorganic)化合物和有机金属化合物)，例如，具有小于约2,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物，例如，具有小于约1,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物，例如，具有小于约500克/摩尔的分子量的有机或无机化合物，以及此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。
本文描述的小分子可以配制在组合物中或与PMP缔合用于本文描述的任何有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物或相关方法。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的小分子，诸如至少约1个小分子、2、3、4、5、10、15、20、或更多个小分子中的任一者。组合物中每种小分子的合适浓度取决于多种因素，诸如功效、小分子的稳定性、不同小分子的数量、配制品、以及组合物的应用方法。在一些情况下，其中该组合物包含至少两种类型的小分子，每种类型的小分子的浓度可以是相同或不同的。
可以使包含如本文描述的小分子的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶有害生物接触，该量和时间足以：(a)达到靶有害生物或被其侵染的植物内或上小分子浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)，和(b)降低靶有害生物的适应度。
在一些情况下，本文描述的组合物和方法的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物包含次生代谢物。次生代谢物衍生自由生物体产生的有机分子。次生代谢物可以充当(i)用于抗细菌、真菌、变形虫、植物、昆虫和大型动物的竞争剂；(ii)金属输送剂(metal transporting agent)；(iii)微生物与植物、昆虫和高等动物之间共生的药剂；(iv)性激素；以及(v)区分效应器。
本文使用的次生代谢物可以包括来自任何已知的次生代谢物组的代谢物。例如，次生代谢物可以分类为以下几组：生物碱类、萜类、类黄酮类、糖苷类、天然酚类(例如，棉酚乙酸)、二烯醛类(例如，反式-肉桂醛)、吩嗪类、联苯酚类和氧芴类、聚酮类、脂肪酸合酶肽类、非核糖体肽类、核糖体合成和翻译后修饰肽类、多酚类、多糖类(例如，壳聚糖)和生物聚合物。有关次生代谢物的深入审查，参见例如，Vining,Annu.Rev.Microbiol.[微生物学年鉴]44:395-427,1990。
可以使包含如本文描述的次生代谢物的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以一定量和一定时间与靶有害生物接触，该量和时间足以：(a)达到靶有害生物或被其侵染的植物内或上次生代谢物浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)，和(b)降低靶有害生物的适应度。
VI.试剂盒
本发明还提供了一种用于防治、预防或处理植物疾病的试剂盒，其中该试剂盒包含具有本文描述的有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的容器。该试剂盒可以进一步包含用于根据本发明的方法应用或递送(例如，向植物或向植物有害生物)有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物以防治、预防或处理植物有害生物侵染的说明书材料。本领域技术人员应答认识到，用于在本发明的方法中应用有害生物防治(例如，生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的说明书可以是任何形式的说明书。此类说明书包括但不限于书面说明书材料(诸如标签、小册子、手册)、口述说明书材料(诸如在录音带或CD上)或视频说明书(诸如在录像带或DVD上)。
实例
以下是本发明的方法的实例。应理解，鉴于以上提供的一般性描述，可以实践各种其他的实施例。
实例1：从植物中分离植物信使包
此实例证实了各种植物源(包括叶质外体、种子质外体、根、果实、营养部分、花粉、韧皮部、木质部汁液、和植物细胞培养基)分离粗植物信使包(PMP)。
实验设计：
a)从拟南芥(Arabidopsisthaliana)叶的质外体分离PMP
将拟南芥属(拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0)种子用50％漂白剂进行表明灭菌并且铺板在含有0.8％琼脂的0.53Murashige和Skoog培养基。将种子在
Figure GDA0002918049650001531
下春化处理2d，然后移至短日条件(9-h天，22℃，150μEm-2)。1周后，将幼苗转移至Pro-Mix PGX。使植物生长4-6周，然后收获。
从4-6周龄拟南芥属莲座丛的质外体洗涤液分离PMP，如Rutter和Innes,PlantPhysiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017所描述。简而言之，在根处收获整个莲座丛，并且用囊泡分离缓冲液(20mM MES，2mM CaCl2和0.1M NaCl，pH6)真空渗透。将经渗透的植物小心地吸干以除去多余的液体，置于30mL注射器中，并且在50mL锥形管中在2℃下以700g离心20min，以收集含有EV的质外体细胞外液。接下来，将质外体细胞外液通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2中所描述纯化PMP。
b)向日葵种子的质外体分离PMP
将完整的向日葵种子(向日葵(H.annuus L.))在水中吸胀2小时，剥皮以除去种皮，并且将质外体细胞外液通过修改的真空渗透-离心程序进行萃取，该程序改编自Regente等人,FEBS Letters.[欧洲生化学会联合会快报]583:3363-3366,2009。简而言之，将种子浸入囊泡分离缓冲液(20mM MES，2mM CaCl2和0.1M NaCl，pH6)中，并且经受三个10s真空脉冲，在45kPa的压力下间隔30s。将经渗透的种子回收，在滤纸上干燥，置于烧结玻璃过滤器中，并且在4℃下以400g离心20min。将质外体细胞外液回收，通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2中所描述纯化PMP。
c)从姜根分离PMP
从当地供应商购买新鲜姜(生姜(Zingiber officinale)根茎根，并且用PBS洗涤3x。将总共200克的经洗涤的根在混合器(Osterizer 12速共混器)中以最高速度研磨10min(每共混1min暂停1min)，并且分离PMP，如Zhuang等人,J Extracellular Vesicles.[细胞外囊泡杂志]4(1):28713,2015中所描述。简而言之，将姜汁顺序地在1,000g 10min、3,000g20min和10,000g 40min下离心，以从含有PMP的上清液中除去大颗粒。如实例2中所述来纯化PMP。
d)从葡萄柚汁分离PMP
从当地供应商购买新鲜的葡萄柚(Citrus×paradisi)，除去它们的皮，并且将果实手动压制或在混合器(Osterizer 12速共混器)中以最高速度研磨10min(每共混1分钟暂停1min)以收集汁，如Wang等人,Molecular Therapy.[分子疗法]22(3):522-534,2014(有少量修改)所描述。简而言之，将汁/汁浆夜顺序地在1,000g 10min、3,000g 20min和10,000g 40min下离心，以从含有PMP的上清液中除去大颗粒。如实例2中所述来纯化PMP。
e)从西兰花头分离PMP
分离西兰花(羽衣甘蓝意大利变种(Brassica oleracea var.italica))PMP，如前所描述(Deng等人,Molecular Therapy[分子疗法],25(7)：1641-1654,2017)。简而言之，从当地供应商购买新鲜的西兰花，用PBS洗涤三次，并且在混合器(Osterizer 12速共混器)中以最高速度研磨10min(每共混1分钟暂停1min)。将西兰花汁顺序地在1,000g 10min、3,000g 20min和10,000g 40min下离心，以从含有PMP的上清液中除去大颗粒。如实例2中所述来纯化PMP。
f)从橄榄花粉分离PMP
分离橄榄(欧洲橄榄(Olea europaea))花粉PMP，如前在Prado等人,MolecularPlant.[分子植物]7(3):573-577,2014中所描述。简而言之，将橄榄花粉(0.1g)在潮湿的室中于室温水化30min，然后转移到含有20ml萌发培养基：10％蔗糖/0.03％Ca(NO3)2、0.01％KNO3、0.02％MgSO4和0.03％H3BO3的培养皿(直径15cm)中。花粉在黑暗中于30℃萌发16h。仅当管长于花粉粒的直径时，才认为花粉粒萌发。收集含有PMP的培养基，并且通过离心在0.85um过滤器上进行两次连续过滤，清除花粉碎片。如实例2中所述来纯化PMP。
g)从拟南芥属韧皮汁液分离PMP
将拟南芥属(拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0)种子用50％漂白剂进行表明灭菌并且铺板在含有0.8％琼脂的0.53Murashige和Skoog培养基。将种子在4℃下春化处理2d，然后移至短日条件(9-h天，22℃，150μEm-2)。1周后，将幼苗转移至Pro-Mix PGX。使植物生长4-6周，然后收获。
从4-6周龄拟南芥属莲座叶收集韧皮汁液，如Tetyuk等人,JoVE.[视觉实验杂志]80,2013所描述。简而言之，在叶柄的基部切下叶，堆叠，并且置于含有20mM K2-EDTA的反应管中在黑暗中一小时以防止伤口封合。将叶轻轻地从容器中取出，用蒸馏水彻底洗涤以除去全部EDTA，放入干净的管中，并且在黑暗中收集5-8小时韧皮汁液。弃去叶，将韧皮汁液通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2中所描述纯化PMP。
h)从番茄植物木质部汁液分离PMP
将番茄(Solanum lycopersicum)种子种植在单个盆中的富含有机物的土壤(诸如阳光混合物(Sunshine Mix)(Sun Gro园艺公司(Sun Gro Horticulture)，阿格瓦姆，马萨诸塞州))中，并且维持在22℃与28℃之间的温室中。萌发后约两周，在两个真叶阶段，将幼苗单独地移植到填充有含有90％沙和10％有机混合物的无菌沙质土壤的盆(直径10cm并且深17cm)中。将植物在22℃-28℃的温室中维持四周。
从4周龄番茄植物收集木质部汁液，如Kohlen等人,Plant Physiology.[植物生理学]155(2):721-734,2011所描述。简而言之，将番茄植物在下胚轴上方断头，并且在茎周围放置塑料环。断头后在90min内收集积累的木质部汁液。将木质部汁液通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒，并且如实例2中所描述纯化PMP。
i)从烟草BY-2细胞培养基分离PMP
将烟草BY-2(Nicotiana tabacum L cv.Bright Yellow 2)细胞在黑暗中于26℃，在振荡器上以180rpm，在包含补充有30g/L蔗糖、2.0mg/L磷酸二氢钾、0.1g/L myo肌醇、0.2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸、和1mg/L硫胺素HCl的MS盐(Duchefa，哈勒姆，荷兰，#M0221)的MS(Murashige和Skoog，1962)BY-2培养基(pH 5.8)中进行培养。将BY-2细胞每周通过将5％(v/v)7日龄细胞培养物转移到100mL新鲜液体培养基中进行传代培养。72-96小时后，收集BY-2培养基并且在4℃下以300g离心10分钟以除去细胞。收集含有PMP的上清液，并且通过在0.85um过滤器上过滤来清除碎片。如实例2中所述来纯化PMP。
实例2：纯化的植物信使包(PMP)的生产
此实例证实了使用超滤与尺寸排阻色谱法(密度梯度(碘克沙醇或蔗糖))的组合并且通过沉淀或尺寸排阻色谱法除去聚集体如实例1中所描述从粗PMP级分生产纯化的PMP。
实验设计：
a)使用超滤与尺寸排阻色谱法的组合生产纯化的葡萄柚PMP
使用100-kDA截留分子量(MWCO)Amicon旋转过滤器(默克密理博公司(MerckMillipore))浓缩来自实例1a的粗葡萄柚PMP级分。随后，将浓缩的粗PMP溶液负载到PURE-EV尺寸排阻色谱柱(HansaBioMed生命科学公司(HansaBioMed Life Sciences Ltd))上，并且根据制造商的说明进行分离。洗脱后合并纯化的含有PMP的级分。任选地，可以使用100kDa MWCO Amicon旋转过滤器或通过切向流过滤(TFF)进一步浓缩PMP。如实例3中所描述分析纯化的PMP。
b)使用碘克沙醇梯度生产纯化的拟南芥属质外体PMP
如实例1a中所描述分离粗拟南芥属叶质外体PMP，并且通过使用碘克沙醇梯度生产纯化的PMP，如在Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1)：728-741,2017中所描述。为了制备不连续的碘克沙醇梯度(OptiPrep；西格玛奥德里奇公司(Sigma–Aldrich))，通过将60％OptiPrep储备水溶液稀释在囊泡分离缓冲液(VIB；20mM MES、2mMCaCl2和0.1M NaCl，pH 6)中来产生40％(v/v)、20％(v/v)、10％(v/v)和5％(v/v)碘克沙醇的溶液。通过使3ml 40％溶液、3mL 20％溶液、3mL 10％溶液和2mL 5％溶液分层形成梯度。将来自实例1a的粗质外体PMP溶液在4℃下以40,000g离心60min。将沉淀物重悬于0.5mlVIB中并且在梯度顶部上分层。在4℃下以100,000g进行离心17h。弃去梯度的顶部的前4.5ml，并且随后收集3体积的含有质外体PMP的0.7ml，用VIB补足至3.5mL，并且在4℃下以100,000g离心60min。将沉淀物用3.5ml VIB洗涤，并且在相同的离心条件下再沉淀。将纯化的PMP沉淀物合并用于后续分析，如实例3所描述。
c)使用蔗糖梯度生产纯化的葡萄柚PMP
如实例1d中所描述分离粗葡萄柚汁PMP，以150,000g离心90min，并且然后将含有PMP的沉淀物重悬于1ml PBS中，如(Mu等人,Molecular Nutrition&Food Research.[分子营养与食物研究]58(7)：1561-1573,2014)所描述。将重悬的沉淀物转移至蔗糖步进梯度(8％/15％/30％/45％/60％)并且以150,000g离心120min以产生纯化的PMP。从30％/45％界面收获纯化的葡萄柚PMP，并且随后分析，如实例3中所描述。
d)从葡萄柚PMP中除去聚集体
为了从如实例1d中所描述的产生的葡萄柚PMP中除去蛋白质聚集体或从实例2a-c中除去纯化的PMP，可以包括另外的纯化步骤。使产生的PMP溶液经过一系列pH值，以使蛋白质聚集体沉淀在溶液中。通过添加氢氧化钠或盐酸将pH调节至3、5、7、9或11。使用校准的pH探针测量pH。一旦溶液处在指定的pH，就将其过滤以除去微粒。可替代地，可以使用诸如Polymin-P或Praestol 2640的带电聚合物的添加将分离的PMP溶液絮凝。简而言之，将2-5g/L Polymin-P或Praestol 2640添加到溶液中并且与叶轮混合。然后将溶液过滤以除去微粒。可替代地，通过增加盐浓度来增溶聚集体。将NaCl添加到PMP溶液中，直到它处于1mol/L。然后将溶液过滤以纯化PMP。可替代地，通过增加温度来增溶聚集体。将分离的PMP混合物在混合下加热，直到它达到50℃的均匀温度持续5分钟。然后将PMP混合物过滤以分离PMP。可替代地，可溶性污染物通过尺寸排阻色谱柱根据标准程序从PMP溶液中分离，其中PMP洗脱在第一级分中，而蛋白质和核糖核蛋白以及一些脂蛋白则随后洗脱。蛋白质聚集体去除的效率通过在除去蛋白质聚集体之前和之后经由BCA/Bradford蛋白质定量测量和比较蛋白质浓度来确定。如实例3中所描述分析产生的PMP。
实例3：植物信使包表征
此实例证实了如实例1或实例2中所描述产生的PMP的表征。
实验设计：
a)确定PMP浓度
根据制造商的说明，通过使用Malvern NanoSight的纳米颗粒跟踪分析(NTA)或使用iZon qNano的可调电阻脉冲传感(TRPS)确定PMP颗粒浓度。通过使用DC蛋白质测定(Bio-Rad)确定纯化的PMP的蛋白质浓度。使用荧光亲脂性染料(诸如DiOC6(ICN生物医学公司(ICN Biomedicals)))确定纯化的PMP的脂质浓度，如Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1)：728-741,2017所描述。简而言之，将来自实例2的纯化的PMP沉淀物重悬于100ml用MES缓冲液(20mM MES，pH 6)加1％植物蛋白酶抑制剂混合物(西格玛奥德里奇公司)和2mM 2,29-联吡啶二硫化物稀释的10mM DiOC6(ICN生物医学公司)。将重悬的PMP在37℃下孵育10min，用3mL MES缓冲液洗涤，再沉淀(40,000g，60min，在4℃下)，并且然后重悬于新鲜的MES缓冲液中。在485nm激发和535nm发射下测量DiOC6荧光强度。
b)PMP的生物物理学和分子表征
根据来自Wu等人,Analyst.[分析者]140(2)：386-406,2015的方案，在JEOL 1010透射电子显微镜上通过电子和低温电子显微镜术表征PMP。还根据制造商的说明，使用Malvern Zetasizer或iZon qNano测量PMP的尺寸和ζ电位。使用氯仿萃取从PMP中分离脂质，并且用LC-MS/MS进行表征，如Xiao等人Plant Cell.[植物细胞]22(10)：3193-3205,2010所证实。萃取和纯化单半乳糖基二酰基甘油(GIPC)脂质，如Cacas等人,PlantPhysiology.[植物生理学]170：367-384,2016所描述，并且通过LC-MS/MS分析，如上所描述。根据说明，使用来自赛默飞世尔公司的Quant-It试剂盒对总RNA、DNA和蛋白质进行表征。根据Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1)：728-741,2017中的方案，通过LC-MS/MS对PMP上的蛋白质进行表征。使用Trizol提取RNA和DNA，用来自依诺米那公司(Illumina)的具有Ribo-Zero植物试剂盒和Nextera配对文库制备型试剂盒(Nextera MatePair Library Prep Kit)的TruSeq总RNA制备成文库，并且根据制造商的说明在IlluminaMiSeq上测序。
实例4：植物信使包稳定性的表征
此实例证实了在许多种储存和生理条件下测量PMP的稳定性。
实验设计：
使如实例1和2所描述生产的PMP要经受各种条件。将PMP悬浮在水、5％蔗糖或PBS中，并且在-20℃、4℃、20℃、和37℃下放置1、7、30和180天。也将PMP悬浮在水中，并且使用旋转蒸发仪系统干燥，并且分别在4℃、20℃、和37℃下放置1、7、30和180天。也将PMP悬浮在水或5％蔗糖溶液中，在液氮中速冻并且冻干。在1、7、30和180天后，然后将干燥且冻干的PMP重悬于水中。还将在温度高于0℃的条件下进行的前三个实验暴露在人造阳光模拟器中，以便确定模拟室外紫外线条件下的含量稳定性。还使PMP经受在添加或不添加1单位胰蛋白酶的pH为1、3、5、7和9缓冲溶液中或在其他模拟胃液中在37℃、40℃、45℃、50℃、和55℃的温度下持续1、6和24小时。
在这些处理的每个之后，使PMP回到20℃，中和至pH 7.4，并且使用实例3中描述的一些或全部方法进行表征。
实例5：用植物信使包处理真菌
此实例证实了从植物(诸如拟南芥莲座丛)产生的PMP通过直接处理病原体真菌(例如核盘菌(S.sclerotorium))或在真菌暴露之前将质外体PMP溶液喷雾在拟南芥属叶上降低该真菌的适应度的能力。在此实例中，将拟南芥属用作模型植物，并且将核盘菌用作模型病原体真菌。
侵害性真核病原体(诸如真菌和卵菌)引发的植物疾病在全球范围内造成显著的作物损失。例如，宽范围病原体真菌灰葡萄孢菌和核盘菌在其收获前和收获后阶段分别通过引起灰霉病或白霉病，对几乎所有蔬菜和水果以及许多花卉构成严重威胁。杀真菌剂处理对于维持健康的作物和可靠的高品质产率至关重要。
治疗性设计：
在10ml无菌水或PBS中用来自实例1a的0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg PMP蛋白/ml来配制拟南芥属质外体PMP溶液。
实验设计：
a)用亲脂性膜染料标记质外体PMP
如实例1-2中所描述分离和纯化拟南芥质外体PMP，并且根据制造商的方案(具有一些修改)用PKH26(西格玛公司(Sigma))进行标记。简而言之，将在1mL PKH26标记试剂盒的稀C中的50mg质外体PMP与2ml 1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL 1％BSA停止标记。通过以150,000g离心90min将所有未标记的染料洗掉，并且然后将标记的PMP沉淀物重悬于无菌水中。
b)通过核盘菌子囊孢子的质外体PMP摄取
为了确定核盘菌(ATCC，#18687)子囊孢子的PMP摄取，将10,000个子囊孢子与0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的PKH26标记的质外体来源的PMP直接在载玻片上一起孵育。除了PBS对照外，还将核盘菌子囊孢子在PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当孢子的细胞质变红时，孢子吸收了质外体来源的PMP。记录与仅用PBS和PKH26染料的对照处理相比，具有红色细胞质的PMP处理的孢子的百分比。
c)在体外用拟南芥属质外体PMP溶液处理核盘菌
为了确定PMP处理对真菌孢子萌发的影响，将约1500个核盘菌子囊孢子与4％蔗糖和0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml PMP(以20μl的最终体积)使用标准方案在显微镜玻片上一起孵育，如Regente等人,J of Exp.Biol.[实验生物学杂志]68(20)：5485-5496,2017所描述。在25℃和100％相对湿度下孵育16h后，使用高分辨率光学显微镜术评估玻片上菌丝的存在和形态。使用比例尺记录菌丝长度，并且相对于阴性对照确定PMP处理后的相对生长。为了确定真菌的死亡，添加伊文思蓝染料(Evans Blue dye)至0.05％w/v的最终浓度，并且在室温下孵育10min，然后进行显微镜观察(当真菌变成蓝色时，它被视为死亡)。为了确定真菌的生存力，添加碘化丙啶(PI)至50μg/ml的最终浓度，并且在荧光显微镜下观察(当PI染色阳性(红色)时，认为真菌是活的)。确定经PMP处理与未处理的对照之间的相对生存力。
d)在植物体内用拟南芥属质外体PMP溶液处理核盘菌
为了确定外部应用的质外体PMP对真菌生长的植物体内影响，在真菌感染前2天、1天和2小时，将4周龄的拟南芥Col-0植物用配制在10mL无菌水中的浓度范围为0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的PMP的拟南芥属质外体PMP喷雾。
通过应用单个20μl液滴或通过喷雾接种整个植物(使用2x105个孢子/ml核盘菌)将植物叶用核盘菌感染，如Weiberg等人Science.[科学]342(6154)：118-123,2013.所描述。
初始感染后1、2、3和5天，通过测量病变尺寸评价疾病，并且使用基于DNA的实时PCR测定来相对于拟南芥叶生物质定量核盘菌生长，如通过Ross和Somssich,PlantMethods.[植物方法]12(1)：48,2016所描述。从来自6个单独的植物的6片叶收集DNA，并且根据制造商的说明，使用用于土壤的FastDNA SPIN试剂盒(MP生物医学公司(MPBiomedicals))提取DNA。对于qPCR分析，将33ng DNA与0.4mM基因特异性引物混合：核盘菌真菌生物质(AF342243，Reich等人,Letters in Applied Microbiology.[应用微生物学快报]62(5)：379-385,2016)：有义CCTACATTCTACTTGATCTAGTA，反义GTTGGTAGTTGTGGGTTA；拟南芥属植物生物质(At4g26410，Ross和Somssich,Plant Methods.[植物方法]12(1)：48,2016)，有义GAGCTGAAGTGGCTTCCATGAC，反义GGTCCGACATACCCATGATCC)，并且使用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(赛默科技公司(Thermo Scientific))根据以下方案进行三次技术重复来进行qPCR：在95℃下变性3min，95℃下20s、61℃下20s和72℃下15s的40次重复。
将真菌来源的PCR产物的丰度归一化为植物来源的PCR产物的丰度。通过以下方式确定拟南芥属质外体PMP对真菌生长的植物体内影响：计算ΔΔCt值，将阴性PBS对照中的归一化的真菌生长与PMP处理样品中的归一化的真菌生长进行比较。
实例6：用植物信使包处理细菌
此实例证实了来自植物(诸如拟南芥莲座丛)的纯化的质外体PMP被细菌摄取的能力以及通过直接处理细菌或通过在细菌暴露之前将质外体PMP溶液喷雾在拟南芥属叶上降低病原体细菌(例如丁香假单胞菌)的适应度的能力。在此实例中，将拟南芥属用作模型植物，并且将丁香假单胞菌用作模型细菌病原体。
由细菌病原体引发的植物疾病在全球范围内造成显著的作物损失。例如，宽范围病原体细菌(如丁香假单胞菌和野油菜黄单胞菌)对全球作物的生产构成了严重威胁。杀细菌剂处理对于维持健康的作物和可靠的高品质产率至关重要。
治疗性设计：
在10ml无菌水中用0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg PMP蛋白/ml配制拟南芥属质外体PMP溶液。
a)用亲脂性膜染料标记质外体PMP
拟南芥质外体PMP是如实例1-2中所描述生产的PMP，并且根据制造商的方案(具有一些修改)用PKH26(西格玛公司(Sigma))进行标记。简而言之，将50mg PMP稀释在1mLPKH26标记试剂盒的稀C中，并且与2ml 1mM PKH26混合并且在37℃下孵育5min。通过添加1mL 1％BSA停止标记。通过以150,000g离心90min将所有未标记的染料洗掉，并且然后将标记的PMP沉淀物重悬于无菌水中，并且如实例3中所描述进行分析。
b)通过丁香假单胞菌的质外体PMP摄取
从ATCC(#BAA-871)获得丁香假单胞菌番茄致病变体(Pseudomonas syringaepv.tomato)菌株DC3000细菌，并且根据制造商的说明在具有50mg/ml利福平的金氏培养基(King’s Medium)B琼脂上生长。为了确定丁香假单胞菌的PMP摄取，将1ml过夜细菌悬浮液的10ul与0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的PKH26标记的质外体PMP直接在载玻片上一起孵育。除了水对照外，还将丁香假单胞菌细菌在PKH26染料(最终浓度5μg/ml)的存在下孵育。在室温下孵育5min、30min和1h后，在高分辨率荧光显微镜上获取图像。与PKH26染料对细胞膜的专门染色相比，当细胞的细胞质变红时，细菌吸收了质外体PMP。记录与仅用PBS和PKH26染料的对照处理相比，具有红色细胞质的PKH26-PMP处理的细菌的百分比，以确定PMP摄取。
c)在体外用拟南芥属质外体PMP溶液处理丁香假单胞菌
确定拟南芥属质外体PMP影响丁香假单胞菌的生长的能力，如Hoefler等人CellChem.Bio.[细胞化学生物学]24(10)：1238-1249,2017所描述。简而言之，通过离心和重悬于培养基中，将处于静止期的丁香假单胞菌培养物浓缩至OD600＝4。将1.5mL浓缩的丁香假单胞菌培养物与4.5mL琼脂混合，并且均匀地铺展在25mL琼脂板上。固化后，将3uL 0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的PMP点样到覆盖物上并且允许干燥。将板孵育过夜，拍照并且扫描。测量点样区域周围的裂解区(无细菌的区域)的直径。比较对照区和PMP处理的裂解区以确定拟南芥属质外体PMP的杀细菌作用。
d)在植物体内用拟南芥属质外体PMP溶液处理丁香假单胞菌
为了确定外部应用的质外体PMP对细菌生长的植物体内影响，在细菌感染前2天、1天和2小时，将4周龄的拟南芥Col-0植物用配制在10mL无菌水中的浓度范围为0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的PMP的拟南芥属质外体PMP喷雾。
丁香假单胞菌在金氏培养基B琼脂上在30℃下过夜生长为菌苔。从板上刮下细菌菌苔，并且使用10mM MgCl2加0.01％Silwet L77重悬至在600nm处的光学密度为0.2。向Col-0拟南芥属植物喷雾细菌溶液或缺少细菌的对照溶液。将塑料圆顶放在植物上过夜以维持高湿度，并且在第二天早晨移除。
初始感染后1、2、3和5天，使用基于DNA的实时PCR测定来相对于拟南芥叶生物质定量丁香假单胞菌生长，如通过Ross和Somssich,Plant Methods.[植物方法]12(1)：48,2016所描述。从来自6个单独的植物的6片叶收集DNA，并且根据制造商的说明，使用用于土壤的FastDNA SPIN试剂盒(MP生物医学公司(MP Biomedicals))提取DNA。对于qPCR分析，将33ngDNA与以下混合：0.4mM基因特异性引物(丁香假单胞菌细菌生物质：有义AACTGAAAAACACCTTGGGC，反义CCTGGGTTGTTGAAGTGGTA(NC_004578.1)；拟南芥属植物生物质：拟南芥表达的蛋白质At4g26410，有义GAGCTGAAGTGGCTTCCATGAC，反义GGTCCGACATACCCATGATCC)，并且使用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(赛默科技公司(Thermo Scientific))根据以下方案进行三次技术重复来进行qPCR：在95℃下变性3min，95℃下20s、61℃下20s和72℃下15s的40次重复。
将细菌来源的PCR产物的丰度归一化为植物来源的PCR产物的丰度。通过以下方式确定拟南芥属质外体PMP对细菌生长的植物体内影响：计算ΔΔCt值，将阴性对照中的归一化的细菌生长与PMP处理样品中的归一化的细菌生长进行比较。
实例7：用植物信使包处理吸取汁液的昆虫
此实例证实了通过将蚜虫用从植物(诸如拟南芥莲座丛)产生的质外体PMP的溶液处理，杀死或降低蚜虫的适应度的能力。可以直接处理昆虫，或者在蚜虫侵染之前将溶液喷雾在作物叶上来处理。在此实例中，蚜虫用作吸取汁液的昆虫的模型生物体。
蚜虫是最重要的农业昆虫有害生物之一。它们对植物造成直接的进食损害，并且用作植物病毒的载体。此外，蚜虫蜜露促进了烟霉(sooty mold)的生长，并且吸引令人讨厌的蚂蚁。化学处理的使用导致选择抗性个体，这些个体的根除变得越来越困难。
治疗性设计：
在10ml无菌水或PBS中用0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg PMP蛋白/ml配制拟南芥属质外体PMP溶液。
实验设计：
a)蚜虫的培养
为了准备处理，使蚜虫在实验室环境和培养基中生长。在气候控制室(16h光照光周期；60±5％RH；20℃±2℃)中，在24℃，伴随16h的光照和8h的黑暗，蚕豆植物在蛭石和珍珠岩的混合物中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第二龄和第三龄蚜虫并且将其分成不同处理，使得每个处理从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
b)用拟南芥属质外体PMP溶液处理第三龄蚜虫
对于每次重复处理，将30-50只第二龄和第三龄蚜虫单独地置于96孔板的孔中，并且在其上方倒置进食小袋板，允许昆虫通过石蜡膜进食同时将它们限制在单独的孔中。将实验蚜虫与蚜虫集落保持在相同的环境条件下。在蚜虫进食24h后，将进食小袋用含有无菌人工饮食或补充有1、10、50、100、或250μg/ml质外体PMP的无菌人工饮食的新进食小袋替换，并且每24h提供新的无菌小袋，持续四天。在替换小袋时，还检查蚜虫的死亡率。如果蚜虫已经变成棕色或位于孔底并且在观察期间不移动，则将其视为死亡。如果蚜虫在进食小袋的石蜡膜上但没有移动，则认为它将进食并且存活。
将用PMP溶液处理的蚜虫的存活率与用阴性对照处理的蚜虫的存活率进行比较。每天还记录蚜虫的发育阶段和尺寸，以观察发育的任何延迟。
c)在植物体内用拟南芥属质外体PMP溶液处理蚜虫
为了确定外部应用的质外体PMP对蚜虫适应度的植物体内影响，从四周龄蚕豆植物摘取叶并且将其插入含有在10mL无菌水中配制的浓度范围为0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的PMP的溶液的Eppendorf管中。可替代地，将叶根据Wang等人,NaturePlants.[自然植物]2(10)：16151,2016中的方案进行喷雾，并且允许在室温下干燥2小时。然后将植物叶用100个第二龄和第三龄蚜虫感染。
将用PMP溶液处理的蚜虫的存活率与用阴性对照处理的蚜虫的存活率进行比较。每天记录蚜虫的发育阶段和尺寸，以观察发育的任何延迟。
实例8：用植物信使包处理玉米根结线虫
此实例证实了通过将线虫(例如玉米根结线虫(根结线虫属(Meliodogyne)))用从植物(诸如拟南芥莲座丛)分离的质外体PMP的溶液处理，杀死或降低线虫的适应度的能力。在此实例中，根结线虫属用作模型病原体线虫。
线虫动物门(Nematoda)的引起根结的线虫(根结线虫属)、引起胞囊的线虫(异皮线虫属(Heterodera))、引起肾形的线虫(肾状线虫属(Rotylenchulus))、和感染柑橘根的线虫(半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans))对农业生产有威胁。植物寄生线虫以活的植物根组织为食(将侵害叶的几种物种)，使用口部刺针刺穿植物细胞并且吸取其内含物。线虫引起与由营养物或水缺乏引起的那些症状(诸如产率损失、黄化、萎蔫)和由直接进食损害引起的根畸形相似的症状。另外，植物寄生线虫的侵袭通常为其他生物体(诸如细菌或真菌)提供了感染途径，因为线虫活动会产生可能原本不可用的进入根的通道。对这种有害生物的处理典型地涉及由于若干种化学杀线虫剂的广泛注销已引起对人类健康安全和环境影响的担忧的浓度而应用的化学杀线虫剂(诸如涕灭威)。
治疗性设计：
在10ml无菌水中用来自实例1a的0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg PMP蛋白/ml来配制拟南芥属质外体PMP溶液。
实验设计：
a)根结线虫属线虫的培养
为了准备处理，将番茄种子种植在单个盆中的富含有机物的土壤(诸如阳光混合物(Sunshine Mix)(Sun Gro园艺公司(Sun Gro Horticulture)，阿格瓦姆，马萨诸塞州))中，并且维持在22℃与28℃之间的温室中。萌发后约两周，在两个真叶阶段，将幼苗单独地移植到填充有含有90％沙和10％有机混合物的无菌沙质土壤的盆(直径10cm并且深17cm)中。将植物在22℃-28℃的温室中维持两周。
将约3000个处于J2期(紧随它们孵化后)的根结线虫属线虫用于接种植物。将线虫悬浮在6mL水中。使用铅笔在每个番茄根系周围的沙中制造三个约半盆深度的孔。通过使用移液管将J2递送到三个孔中接种每个植物。之后，将孔覆盖。将植物在24℃-27℃的温室中维持六至八周。
b)用拟南芥属质外体PMP处理根结线虫属卵
为了评价PMP溶液对根结线虫属线虫的卵的杀线虫活性，进行体外孵化测试。从受感染的根获得根结线虫属线虫的卵团。将含有平均300-350个卵的单个卵团置于Syracuse皿中并且用2ml浓度为0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的PMP溶液处理，并且在28±1℃下保持不同的暴露时间。在24、48和72h后计数从卵中生出的幼龄虫的数量。通过将来自无菌水对照的出生的幼龄虫的百分比与来自PMP处理的那些百分比进行比较来确定对卵孵化的影响。与对照相比，用PMP溶液处理过的线虫卵的孵化率降低。
c)用拟南芥属质外体PMP处理根结线虫属幼龄虫
为了评价PMP溶液对根结线虫属线虫的幼龄虫的杀线虫活性，进行体外死亡率测试。从受感染的根收集根结线虫属线虫的卵团，并且在水中孵育3天以允许卵孵化。3天后，将100个第二期幼龄虫添加到含有2ml浓度为0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的PMP溶液的Syracuse皿中，并且在28℃±1℃下孵育。使用立体镜记录在24、48和72h间隔的幼龄虫死亡率的观察结果。之后，将用PMP溶液处理的幼龄虫转移到蒸馏水中，并且在24h后再次观察以确认其死亡率。将用PMP溶液处理的线虫的存活率与用阴性对照处理的线虫的存活率进行比较。与对照相比，用PMP溶液处理过的线虫的存活率降低。
实例9：用植物信使包处理食草昆虫
此实例证实了通过将食草昆虫(例如斜纹夜蛾(Spodoptera litura)用从植物(诸如拟南芥莲座丛)分离的质外体PMP的溶液，杀死或降低食草昆虫的适应度的能力。可以直接处理鳞翅目，或者在有害生物侵染之前将拟南芥属质外体PMP溶液喷雾在作物叶上来处理。在此实例中，斜纹夜蛾用作食草病原体昆虫的模型生物体。
斜纹夜蛾在美洲、亚洲、大洋洲和印度是严重的杂食性有害生物。该物种通过幼虫旺盛的食用方式寄生于植物，常常使叶完全被破坏。蛾的影响相当惨重，破坏经济上重要的农业作物并且完全降低一些植物的产率。它们对许多不同的耕作作物以及随后的当地农业经济的影响已导致对防治有害生物做出巨大努力。
治疗性设计：
在10ml无菌水中用0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg PMP蛋白/ml配制拟南芥属质外体PMP溶液
实验设计：
a)在烟草植物上培养斜纹夜蛾
将斜纹夜蛾维持在烟草植物上持续连续两代。将烟草植物在28±1℃下在由冷白色荧光灯以约1600勒克斯的强度提供光照的16/8h(光照/黑暗)光周期下维持15天的时间段以进行种子萌发和充分的幼苗生长，用于转移到新的土壤混合物中。
斜纹夜蛾卵由Genralpest提供。孵化后，将第1龄期幼虫用人工饮食饲养，如Shu等人,Chemosphere.[化学圈]139:441-451,2015中所描述的。在气候室中，在27℃、65％相对湿度和12小时黑暗/12小时光照的恒定条件下进行饲养。将蛹和成虫保持在相同条件下。
b)用拟南芥属质外体PMP处理斜纹夜蛾卵
为了确定质外体PMP对斜纹夜蛾发育的影响，进行孵化和死亡率测试。对于孵化测试，将单个卵团置于Syracuse皿中并且用在无菌水中配制的2ml浓度为0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的PMP溶液处理，并且在26℃±1℃下保持不同的暴露时间。在24、48和72h后计数从卵中生出的幼龄虫的数量。
对于死亡率测试，收集卵团并且在水中孵育3天以允许卵孵化。3天后，将100个第二期幼龄虫添加到含有在无菌水中配制的2ml浓度为0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的PMP溶液的Syracuse皿中，并且在26℃±1℃下孵育。使用立体镜记录在24、48和72h间隔的幼龄虫死亡率的观察结果。之后，将用PMP溶液处理的幼龄虫转移到蒸馏水中，并且在24小时后再次观察以确认其死亡率。
将用PMP溶液处理的斜纹夜蛾的存活率、孵化率、化蛹率与用阴性对照处理的鳞翅目的存活率、孵化率、化蛹率进行比较。与对照相比，用PMP溶液处理的斜纹夜蛾的这些率降低，在每个发育阶段，适应度受到负面影响。
c)用拟南芥属质外体PMP处理斜纹夜蛾幼虫
为了确定质外体PMP对斜纹夜蛾幼虫适应度的影响，使用湿的骆驼毛刷从卵团小心地收集一百个新鲜的斜纹夜蛾卵，并且分布为10个卵培养皿(1.0×5.0cm)。孵化后，在接种之前两个小时，将幼虫单独地转移到含有已用0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的拟南芥属质外体PMP的溶液喷雾处理的烟草叶的塑料小瓶中。每天提供新鲜的叶。每天记录对幼虫发育、蛹的形成和成虫的成功羽化以及繁殖力的观察结果，持续两周。还记录在不同发育阶段(如幼虫、蛹和成虫)的年龄特异性死亡率。
d)用拟南芥属质外体PMP在植物体内处理斜纹夜蛾成虫
为了确定质外体PMP对斜纹夜蛾成虫适应度的影响，向未感染的4-6周龄烟草植物喷雾0(阴性对照)、1、10、50、100、或250μg/ml的如实例1-2中所描述分离和纯化的拟南芥属质外体PMP的溶液。喷雾接种后两小时，将孵化后48h收集的同步的斜纹夜蛾蛹转移到处理的植物中并且保持在26℃±1℃。72h后，将成虫从植物移除，进行计数，并且针对其发育阶段-按尺寸和形态性状-评价其适应度。接下来，将成虫转移到30×30×45cm衬有平纹细布的木质笼中，以评价其繁殖力。将前一天晚上一起放在交配笼中的五对蛾(5只雌性和5只雄性)在19.00h释放到笼中。第二天早晨，从笼中移除蛾，并且对笼中的叶和平纹细布上产下的卵进行计数。每只雌性仅使用一次，并且每种测试重复5次。当卵孵化时，在以不同浓度PMP为食的昆虫相比于阴性对照之间进行幼虫重量的比较。
实例10：用负载短核酸的植物植物信使包处理真菌
此实例证实了通过分离PMP脂质并且将其合成为含有短核酸的囊泡，PMP将短核酸递送至有害生物的能力。在此实例中，负载短双链RNA(dsRNA)的PMP可以用来敲低病原体真菌灰葡萄孢菌中的毒力因子，两者在植物中均如在收获后的产品中。它还证实，负载短核酸的PMP是稳定的，并且在一定范围的加工和环境条件下保持其活性。在此实例中，dsRNA用作模型核酸，并且灰葡萄孢菌用作模型病原体真菌，并且葡萄用作模型水果。
治疗剂量：
负载dsRNA的PMP，在水中配制为递送在无菌水中0、1、5、10和20ng/μl的有效dsRNA剂量的等效物的浓度。
实验方案：
a)从葡萄柚来源的PMP分离脂质
从纯化的PMP分离脂质，如实例1-2中所描述，改编自Xiao等人,Plant Cell[植物细胞],22(5):1463-1482,2010。简而言之，将3.75ml 2∶1(v/v)MeOH：CHCl3添加到1ml在PBS中的PMP中并且涡旋。顺序地添加CHCl3(1.25ml)和ddH2O(1.25ml)并且涡旋。然后将混合物在玻璃管中于22℃下以2,000r.p.m.离心10min，以将混合物分为两相(水相和有机相)。为了收集有机相，将玻璃移液器以温和的正压插入水相中，并且将底部相(有机相)吸出并且分配到新鲜的玻璃管中。将有机相样品等分并且通过在氮气下(2psi)通过加热干燥。
b)负载dcl1/2 dsRNA的葡萄柚PMP的合成
根据来自Wang等人,Nature Comm.[自然通讯],4：1867,2013的经修改的方案，将短核酸负载到PMP中。简而言之，根据实例1-2从葡萄柚产生纯化的PMP，并且分离葡萄柚PMP脂质，如实例10a中所描述。从IDT获得具有如Wang等人,Nature Plants.[自然植物]2(10):16151,2016中指定的序列的靶向灰葡萄孢菌dcl1/2的短双链RNA(dsRNA)和乱序dsRNA对照。通过混合脂质和短核酸(将其干燥以形成薄膜)，从靶dsRNA和对照dsRNA合成负载dsRNA的PMP。将膜分散在PBS中并且超声处理以形成负载的脂质体配制品。将PMP使用如实例2中所描述的蔗糖梯度进行纯化并且在使用之前通过超速离心进行洗涤以除去未结合的核酸。使用实例3中的方法对两个样品的一小部分进行表征，使用Quant-It RiboGreen RNA测定试剂盒测量RNA含量，并且如实例4中所描述测试其稳定性。
c)用负载靶向dcl1/2的dsRNA的葡萄柚PMP处理灰葡萄孢菌以在植物体内降低真 菌适应度
为了确定使用来自实例10b的负载dsRNA的PMP进行的真菌阻断的效率，在细菌接种前2d、1d和2h，向拟南芥植物喷雾具有在无菌水中0、1、5、10和20ng/μl的有效dsRNA剂量的PMP溶液。
将灰葡萄孢菌菌株B05在麦芽提取物琼脂(2％麦芽提取物，1％细菌蛋白胨)上培养。将孢子在1％Sabouraud麦芽糖肉汤缓冲液中稀释至105个孢子/ml的最终浓度，并且喷雾接种到4-6周龄拟南芥属叶上，修改自Wang等人,Nature Plants.[自然植物]2(10)：16151,2016。将用负载dcl1/2的PMP和20ng/μl dcl1/2shRNA的处理的作用和效率与乱序对照和阴性对照进行比较。
在初始感染后1、3和5天，通过使用来自Wang等人,Nature Plants.[自然植物]2(10):16151,2016的方案定量分离的拟南芥属叶中的Bc-DCL1/2转录物敲低量来评价疾病。使收集的样品经受使用Fisher BioReagentsTMSurePrepTM植物/真菌总RNA纯化试剂盒(飞世尔科技公司(Fisher scientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)的RNA提取、使用SuperScriptIII逆转录酶(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)的cDNA合成、和定量RT-PCR定量。使用以下引物测量在合成的Bc-DCL1/2-dsRNA的处理后葡萄孢菌中Bc-DCL1和Bc-DCL2的表达：Bc-DCL1-fw ACAATCCTATCTTTCGGAAGC、Bc-DCL1-revAGACTCTTCTTCTTGAAGACAG、Bc-DCL2-fw GATTGTGCAAAGTCTCAACA、和Bc-DCL2-revATTGGGTTTGACTATATGTCTTA。
另外，使用基于DNA的实时PCR测定来相对于拟南芥叶生物质定量葡萄孢菌生长，如通过Ross和Somssich,Plant Methods.[植物方法]12(1):48,2016所描述。从来自6个单独的植物的6片叶收集DNA，并且根据制造商的说明，使用用于土壤的FastDNA SPIN试剂盒(MP生物医学公司(MP Biomedicals))提取DNA。对于qPCR分析，将33ng DNA与以下混合：0.4mM特异性引物(葡萄孢菌真菌生物质(Bc3F，Suarez等人Plant Physiol Bioch.[植物生理学与生物化学]42(11):924-934,2005)：fw-GCTGTAATTT CAATGTGCAGAATCC、rev-GGAGCAACAATTAATCGCATTTC；拟南芥属植物生物质(At4g26410，Ross和Somssich,Plant Methods.[植物方法]12(1):48,2016)、fw-GAGCTGAAGTGGCTTCCATGAC、rev-GGTCCGACATACCCATGATCC)，并且使用SsoAdvancedTMUniversal
Figure GDA0002918049650001701
Green Supermix(伯乐公司(BioRad))根据以下方案用三个技术重复进行qPCR：在95℃下变性3min，95℃下20s、61℃下20s和72℃下15s的40次重复。
将真菌来源的PCR产物的丰度归一化为植物来源的PCR产物的丰度。通过以下方式确定拟南芥属质外体PMP对真菌生长的植物体内影响：计算ΔΔCt值，将阴性PBS对照中的归一化的真菌生长与PMP处理样品中的归一化的真菌生长进行比较。
d)用负载靶向dcl1/2的dsRNA的葡萄柚来源的PMP处理灰葡萄孢菌以在植物体内 降低收获后的葡萄上的真菌适应度
为了确定负载dcl1/2dsRNA的葡萄柚PMP对收获后果实中的真菌生长的影响，从当地超市购买葡萄，并且在使用前进行大量洗涤。
在根据Wang等人,Nature Plants.[自然植物]2(10):16151,2016通过滴接种20μl的105个孢子/ml进行灰葡萄孢菌真菌感染之前5d、3d、1d和2h，向葡萄喷雾具有在无菌水中0、1、5、10和20ng/μl的有效dsRNA剂量的负载dsRNA的PMP溶液或20ng/μl dcl1/2或乱序shRNA。在接种后5天测量受感染的葡萄样品的相对病变尺寸，并且通过ImageJ进行定量。通过定量PCR测量葡萄孢菌相对DNA含量(相对生物量)，如实例10c中描述。将用负载dcl1/2的PMP和dcl1/2shRNA的处理的作用和效率与乱序对照和阴性对照进行比较。
实例11：用负载肽核酸(PNA)的植物信使包处理昆虫
此实例证实了向PMP负载肽核酸构建体，以用于通过敲低有害生物中的基因，例如草地粘虫(草地贪夜蛾)中的超气门蛋白(Ultraspiracle)(USP)(这在其他鳞翅目昆虫中已被证实降低幼虫的生存力和蛹化率)降低昆虫适应度的目的。此实例还证实，负载PNA的PMP是稳定的，并且在一定范围的加工和环境条件下保持其活性。在此实例中，PNA用作模型蛋白，并且草地贪夜蛾用作模型病原体昆虫。
治疗剂量：
负载dsRNA的PMP，在水中配制为递送在无菌水中0、0.1、1、5和10μM的有效PNA剂量的等效物的浓度
实验方案：
a)针对草地贪夜蛾的肽核酸构建体的鉴定
设计十种针对草地贪夜蛾超气门蛋白(USP)的PNA并且由适当的厂商来合成。从赛默飞世尔科技公司获得Sf21和Sf9草地贪夜蛾细胞系，并且根据制造商的培养说明维持为悬浮培养物。使用改编自elc等人,PLoS One.[公共科学图书馆期刊]10(3),e0119283,2015的方案通过对细胞进行电穿孔来体外测试PNA。通过使用由适当的厂商设计的探针通过RT-qPCR测量USP敲低。选择在UPS敲低效率方面性能最好的PNA进行进一步的实验。
b)向葡萄柚PMP负载肽核酸
根据实例1从葡萄柚分离PMP。将PMP置于PNA在PBS中的溶液中。然后根据来自Wang等人,Nature Comm.[自然通讯],4：1867,2013的方案，将溶液进行超声处理以诱导穿孔并且扩散到PMP中。可替代地，可以根据来自Haney等人,J Contr.Rel.[控制释放期刊],207：18-30,2015的方案使溶液通过脂质挤出机。可替代地，可以根据来自Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.[核酸研究]40(17)：e130,2012的方案将它们电穿孔。1小时后，将PMP使用蔗糖梯度纯化并且在使用前如实例2所描述通过超速离心进行洗涤以除去未结合的核酸。
使用实例3中的方法测量尺寸、ζ电位和颗粒计数，并且如实例4中所描述测试其稳定性。根据Nikravesh等人,Mol.Ther.[分子疗法],15(8)：1537-1542,2007中的方案，使用电泳凝胶移位测定定量PMP中的PNA。简而言之，将与PNA反义的DNA与经洗涤剂处理以释放PNA的PNA-PMP混合。将PNA-DNA复合物在凝胶上运行，并且用ssDNA染料可视化。然后通过荧光成像对双链体进行定量。将负载的PMP和未负载的PMP进行比较，以确定负载效率。
c)用负载PNA的葡萄柚PMP处理草地贪夜蛾以降低昆虫适应度
根据上面描述的方法，向PMP负载有以上鉴定的USP PNA，并且将乱序PNA对照负载到PMP中。从合适的厂商处获得草地贪夜蛾，并且根据厂商的说明进行维护。根据改编自Yang和Han,J.Integ.Ag.[综合农业期刊]13(1)：115-123,2014的进食方案，向幼虫喂食在PMP中的针对USP的PNA和对照PNA。测量存活率和蛹化率以确定效果。
实例12：用负载小分子的植物信使包处理细菌
此实例证实了向PMP负载小分子(在此实施例中为链霉素)的方法，以用于减小细菌(例如丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv tomato))的适应度的目的。丁香假单胞菌表示一类种子传播的植物病原体细菌，这些植物病原体细菌充当很多重要的蔬菜疾病的主要接种物源。这些细菌疾病对其各自的宿主是经济上重要，并且在大多数情况下，受侵染的种子和幼苗用作温室和田地中流行病的主要接种物源。此实例进一步证实，在番茄(Solanum lycopersicum)种子上应用包含负载链霉素的PMP的包衣减小了丁香假单胞菌的适应度。它还证实，负载小分子的PMP是稳定的，并且在一定范围的加工和环境条件下保持其活性。在此实例中，链霉素用作模型小分子，并且丁香假单胞菌用作模型病原体细菌。
治疗剂量：
负载小分子的PMP，在水中配制为0、2.5、10、50、100、或200mg/ml的有效硫酸链霉素剂量的等效物的浓度
a)向葡萄柚PMP负载小分子
将如上所描述产生的PMP置于具有溶解的链霉素的PBS溶液中。根据Sun等人,MolTher.[分子疗法]9月；18(9)：1606-14,2010中的方案，将溶液在22℃下放置1小时。可替代地，根据来自Wang等人,Nature Comm.[自然通讯],4：1867,2013的方案，将溶液进行超声处理以诱导穿孔并且扩散到外泌体中。可替代地，可以根据来自Haney等人,J Contr.Rel.[控制释放期刊],207：18-30,2015的方案使溶液通过脂质挤出机。可替代地，可以根据来自Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.[核酸研究]40(17)：e130,2012的方案将它们电穿孔。1小时后，将负载的PMP使用蔗糖梯度纯化并且在使用前如实例2所描述通过超速离心进行洗涤以除去未结合的小分子。使用实例3中的方法表征负载链霉素的PMP的尺寸和ζ电位。少量PMP是链霉素，使用标准曲线使用在195nm处的UV-Vis评价含量。简而言之，制造各种感兴趣的浓度的链霉素的储备溶液，并且将100微升溶液置于平底透明96孔板中。使用UV-V读板器测量195nm处的吸光度。还将样品放在板上，并且使用回归确定根据标准的可能浓度。对于足够高的浓度，使用来自Kurosawa等人,J.Chromatogr.[色谱杂志],343：379-385,1985的方案来通过HPLC测量链霉素含量。如实例4中所描述测试负载链霉素的PMP的稳定性。
b)用负载链霉素的葡萄柚PMP处理丁香假单胞菌以减小细菌适应度
从ATCC获取丁香假单胞菌致病变种，并且根据制造商的说明进行生长，如实例6中所描述。根据改编自Hoefler等人Cell Chem.Bio.[细胞化学生物学]24(10)：1238-1249,2017的方案，测试链霉素、PMP、和负载链霉素的PMP的有效浓度的防治丁香假单胞菌生长的能力。简而言之，通过离心和重悬于培养基中，将处于静止期的丁香假单胞菌培养物浓缩至OD600＝4。将1.5mL浓缩的丁香假单胞菌培养物与4.5mL琼脂混合，并且均匀地铺展在25mL琼脂板上。固化后，将3uL 0(阴性对照)、2.5、10、50、100、或200mg/ml有效剂量的负载链霉素的PMP点样到覆盖物上并且允许干燥。将板孵育过夜，拍照并且扫描。测量点样区域周围的裂解区(无细菌的区域)的直径。将对照(PBS)、链霉素、PMP、和经负载链霉素的PMP处理的裂解区进行比较以确定杀细菌作用。固化后，将有效剂量(微升)的处理剂点样到覆盖层上并且允许其干燥。将板孵育过夜，拍照并且扫描。测量裂解区(无细菌的区域)的尺寸以确定功效。
c)用负载链霉素的葡萄柚PMP处理番茄种子以减小细菌适应度
将200个Micro-Tom番茄种子(USDA)/组浸泡在有效剂量为0、2.5、10、50、100、或200mg/ml的单独的链霉素或负载在PMP中的链霉素的悬浮液中在室温下2小时，并且在浸泡后立即播种。孵育1、2和5天后，通过将样品浸泡在含有大约108个集落形成单位(CFU)/ml的丁香假单胞菌番茄致病变体悬浮液中真空下30min来侵染种子。突然释放真空，以促进病原体进入种子腔。通过qPCR并且如实例6d中所描述来确定负载链霉素的PMP种子处理剂相比于单独的链霉素或对照处理对丁香假单胞菌生物质的相对作用。与单独的链霉素或未处理的对照相比，通过记录萌发时间和幼苗发育速率持续3-4周来评价负载链霉素的PMP种子处理剂对番茄种子的萌发的作用。
实例13：用负载蛋白质/肽的植物信使包处理线虫
此实例证实了向PMP负载肽构建体，用于减小寄生线虫的适应度。此实例证实了，负载GFP的PMP吸收在秀丽隐杆线虫(C.elegans)的消化道中，并且负载Mi-NLP-15b神经肽的PMP减少番茄植物的南方根结线虫的线虫。它还证实，负载肽的PMP是稳定的，并且在一定范围的加工和环境条件下保持其活性。在此实例中，GFP和杀线虫肽Mi-NLP-15b用作模型肽，并且南方根结线虫和秀丽隐杆线虫用作模型线虫。
植物寄生线虫(PPN)严重威胁全球食物安全。常规地，PPN管理的综合方法严重依赖于氨基甲酸酯、有机磷酸酯、和熏剂杀线虫剂，它们现在出于对环境健康和安全的担忧而正在被撤消。这种逐步撤销已使我们在管理这些经济上重要的寄生生物的能力上显著不足，并且突出了对新型且稳健的防治方法的需求。
治疗剂量：
负载肽的PMP，在水中配制为递送在无菌水中0(对照)、1nm、10nM、100nm、1μM、10μM、50μM、和100μM的有效肽剂量的等效物的浓度。负载GFP的PMP，在水中配制为递送0(未负载的PMP对照)、10、100、1000μg/ml负载在PMP中的GFP-蛋白的浓度
实验方案：
a)向葡萄柚PMP负载蛋白质或肽
将PMP置于蛋白质或肽在PBS中的溶液中。如果蛋白质或肽不可溶，则调节pH，直到它不可溶。如果蛋白质或肽仍不可溶，则使用不可溶的蛋白质或肽。然后根据来自Wang等人,Nature Comm.[自然通讯],4:1867,2013的方案，将溶液进行超声处理以诱导穿孔并且扩散到外泌体中。可替代地，可以根据来自Haney等人,J Contr.Rel.[控制释放期刊],207：18-30,2015的方案使溶液通过脂质挤出机。可替代地，可以根据来自Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.[核酸研究]40(17)：e130,2012的方案将它们电穿孔。1小时后，将PMP使用蔗糖梯度纯化并且在使用前如实例1所描述通过超速离心进行洗涤以除去未结合的蛋白质。如实例3所描述表征PMP来源的脂质体，并且如实例4所描述测试其稳定性。为了测量蛋白质或肽的负载量，对负载的PMP和未负载的PMP的少量样品使用Pierce定量肽测定。
b)用负载Mi-NLP-15b神经肽的葡萄柚PMP处理南方根结线虫卵
根据实例1-2从葡萄柚分离PMP。由商业厂家合成在Warnock,PLoS Pathogens[PLoS病原体],13(2)：e1006237,2017中鉴定的杀线虫的合成的神经肽Mi-NLP-15b(序列：SFDSFTGPGFTGLD)。然后根据以上方法将肽负载到PMP中。还负载乱序肽作为对照。将南方根结线虫维持在番茄植物中，并且收集卵和幼龄虫，如实例8中所描述
为了评价负载Mi-NLP-15b神经肽的葡萄柚PMP溶液对根结线虫属线虫的卵的杀线虫活性，进行体外孵化测试。从受感染的根获得根结线虫属线虫的卵团。将含有平均300-350个卵的单个卵团置于Syracuse皿中，并且用2ml浓度为0(对照)、1nm、10nM、100nm、1μM、10μM、50μM或100μM的裸Mi-NLP-15b，乱序肽，或有效剂量的负载Mi-NLP-15b的PMP、负载乱序肽的PMP、或未负载的PMP的PMP溶液处理，并且在28℃±1℃下保持不同的暴露时间。在24、48和72h后计数从卵中生出的幼龄虫的数量。通过将来自无菌水对照的出生的幼龄虫的百分比与来自PMP处理的那些百分比进行比较来确定对卵孵化的影响。
c)用负载Mi-NLP-15b神经肽的葡萄柚PMP在植物体内处理南方根结线虫幼龄虫
将南方根结线虫维持在番茄植物中，并且收集卵和幼龄虫，如实例8中所描述。测量南方根结线虫感染以评价负载神经肽的PMP减小线虫感染的能力，如Warnock,PLoSPathogens[PLoS病原体],13(2)：e1006237,2017中所示。简而言之，番茄种子在0.5％Murashige和Skoog板上萌发，并且将两日龄番茄幼苗用0(对照)、1nm、10nM、100nm、1μM、10μM、50μM和100μM的裸Mi-NLP-15b，乱序肽，或有效剂量的负载Mi-NLP-15b的PMP、负载乱序肽的PMP或未负载的PMP喷雾处理或浸泡，并且在感染之前放置干燥2h、6h、1d和2d。通过将500个预处理的南方根结线虫J2与琼脂浆料和单个处理的番茄幼苗在6孔板中混合来进行侵袭测定。在16h的光照和8h的黑暗周期下，将测定放置24h。将幼苗使用酸品红进行染色，并且将根内的线虫数量进行计数，并且将负载神经肽的PMP处理剂与对照进行比较。感染测定使用至少五个幼苗/种条件。
d)向线虫递送模型蛋白质
根据实例1从葡萄柚分离PMP。商业合成绿色荧光蛋白，并且溶解于PBS中。然后根据上面描述的方法将其负载到PMP中，并且通过蛋白质印迹或荧光测量PMP的GFP包封。将秀丽隐杆线虫野生型N2 Bristol菌株(秀丽隐杆线虫基因组学中心(C.elegans GenomicsCenter))维持在线虫生长培养基(NGM)琼脂板(3g/l NaCl、17g/l琼脂、2.5g/l蛋白胨、5mg/l胆固醇、25mM KH2PO4(pH 6.0)、1mM CaCl2、1mM MgSO4)上的大肠杆菌(菌株OP50)菌苔上在20℃下，从L1阶段知道L4阶段。
按照Conte等人,Curr.Protoc.Mol.Bio.[微生物学的当前方案],109：26.3.1-302015中的进食方案，将一日领秀丽隐杆线虫转移到新板中，并且进食在液体溶液中的0(未负载的PMP对照)、10、100、1000ug/ml负载GFP的PMP。然后将它们与PMP或无菌水对照相比，在荧光显微镜下检查沿消化道的绿色荧光。
实例14：用负载除草剂的植物信使包处理植物
此实例证实了将除草剂草铵膦负载和递送在PMP中以影响植物的适应度。此实例进一步证实，负载小分子的PMP是稳定的，并且在一定范围的加工和环境条件下保持其活性。在此实例中，草铵膦用作模型小分子除草剂，并且蟋蟀草用作模型杂草。
蟋蟀草(Eleusine indica(L.))(印度牛筋草)是世界上最糟糕的杂草之一，是极具竞争力和世界性的物种。蟋蟀草是生殖力旺盛的，发现于多种土壤和温度的范围中，并且侵染许多种作物，包括玉米、玉蜀黍、水稻、甘蔗以及许多水果和蔬菜园。有效且安全的除草剂对于防止因杂草引起的主要作物产率损失同时保护环境免受除草剂过度使用的毒性副作用而言是必须的。
治疗剂量：
负载小分子草铵膦的PMP，在水中配制为0、0.25、0.5、1、3、或6mg/ml草铵膦的有效剂量的等效物的浓度。
实验方案：
a)向葡萄柚PMP负载小分子除草剂草铵膦
根据实例1-2从葡萄柚产生PMP。将PMP置于具有固体或溶解的草铵膦(CAS 77182-82-2，西格玛-奥德里奇公司)的PBS溶液中。根据Sun等人,Mol Ther.[分子疗法]2010年9月；18(9)：1606-14中的方案，将溶液在22℃下放置1小时。
可替代地，根据来自Wang等人,Nature Comm.[自然通讯],4：1867,2013的方案，将溶液进行超声处理以诱导穿孔并且扩散到外泌体中。可替代地，可以根据来自Haney等人,JContr.Rel.[控制释放期刊],207：18-30,2015的方案使溶液通过脂质挤出机。可替代地，可以根据来自Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.[核酸研究]40(17)：e130,2012的方案将它们电穿孔。1小时后，将负载的PMP使用蔗糖梯度纯化并且在使用前如实例2所描述通过超速离心进行洗涤以除去未结合的小分子。使用实例3中的方法表征负载草铵膦的PMP的尺寸和ζ电位。
为了定量草铵膦包封，使用Bligh和Dayer方法分解负载草铵膦的PMP，草铵膦溶解在上层相中。根据Changa等人,Journal of the Chinese Chemical Society[中国化学会会志],52(4)：785-792,2005中描述的方法，使用具有二极管阵列检测的高效液相色谱法(HPLC-DAD)确定草铵膦。简而言之，氯甲酸9-芴基甲酯(FMOC-Cl)用于非吸收性草铵膦的柱前衍生。用HPLC-DAD在12min时用25mM硼酸缓冲液(pH 9)分离样品，然后用UV检测器在260nm下进行确定。
b)用负载草铵膦的PMP处理印度牛筋草杂草
测量印度牛筋草植物(蟋蟀草)中草铵膦处理的除草作用。使蟋蟀草种子在含有0.2％硝酸钾(KNO3)的水凝固的0.6％琼脂上萌发(Ismail等人,Weed Biology andManagement[杂草生物学与管理],2(4)：177-185,2002)。在3-5叶期，通过将整个植物用0(阴性对照)、0.25、0.5、1、3、或6mg/ml草铵膦，或0(未负载的PMP对照)0.25、0.5、1、3、或6mg/ml负载草铵膦的PMP以3株植物/组、1ml溶液/株植物进行喷雾来使幼苗经受不同的草铵膦处理。在处理后第22和35天根据表型(萎黄和萎蔫、坏死、植物死亡的体征)评价草铵膦活性。在第35天，收获地面之上的芽，并且在烘箱(65℃)中干燥3天以进行干重测量，并且将负载草铵膦的PMP的处理与仅PMP和草铵膦对照进行比较。
实例15：使用超速离心和蔗糖梯度纯化从共混果汁生产PMP
此实例证实，可以通过共混水果并且使用顺序离心以除去碎片、超速离心以沉淀粗PMP、和使用蔗糖密度梯度以纯化PMP的组合从水果生产PMP。在此实例中，葡萄柚用作模型水果。
a)通过超速离心和蔗糖密度梯度纯化生产葡萄柚PMP
用于使用共混器、超速离心和蔗糖梯度纯化生产葡萄柚PMP的工作流程在图1A中示出。从当地的
Figure GDA0002918049650001781
购买一个红色葡萄柚，并且除去白皮、黄皮、和节段膜以收集汁囊，将汁囊使用共混器以最大速度均化10分钟。将100mL汁用PBS稀释5x，然后以1000x g 10分钟、3000x g 20分钟、和10,000x g 40分钟进行顺序离心以除去大碎片。将28mL澄清的汁在4℃下在SorvallTM MX 120Plus微型超速离心机上使用S50-ST(4x7mL)旋转桶式转子以150,000x g超速分离90分钟以获得粗PMP沉淀物，将该PMP沉淀物重悬于PBS pH7.4中。接下来，在Tris-HCL pH 7.2中制备蔗糖梯度，将粗PMP在蔗糖梯度顶部上分层(从上到下：8％、15.30.45％和60％蔗糖)，并且通过在4℃下使用S50-ST(4x7mL)旋转桶式转子以150,000x g超速离心120分钟来旋转沉降。收集1mL级分，并且在30％-45％界面处分离PMP。通过在4℃下以150,000x g超速离心120分钟将级分用PBS洗涤，并且将沉淀物溶解在最少量PBS中。
使用Spectradyne nCS1TM颗粒分析仪使用TS-400筒确定PMP浓度(1x109PMP/mL)和中值PMP尺寸(121.8nm)(图1B)。使用Malvern Zetasizer Ultra确定ζ电位，并且为-11.5+/-0.357mV。
此实例证实，可以使用超速离心与蔗糖梯度纯化方法的组合来分离葡萄柚PMP。然而，此方法在所有PMP生产步骤中以及在最终PMP溶液中诱导严重的样品胶凝。
实例16：使用超速离心和蔗糖梯度纯化从网压制的果汁生产PMP
此实例证实，可以在PMP生产过程中通过使用较温和的榨汁方法(网式滤器)来减少细胞壁和细胞膜污染物。在此实例中，葡萄柚用作模型水果。
a)温和的榨汁减少了从葡萄柚PMP生产PMP过程中的胶凝
从红色葡萄柚分离汁囊，如实例15中所描述。为了减少PMP生产过程中的胶凝，代替使用破坏性的共混方法，将汁囊轻轻地压在茶滤器网上以收集汁并且减少细胞壁和细胞膜污染物。差异离心后，该汁比使用共混器的更澄清，并且在蔗糖密度梯度离心后观察到在30％-45％相交处的一个干净的含有PMP的蔗糖条带(图2)。在PMP的生产过程中和之后，存在总体较少的胶凝。
我们的数据显示，当与包括共混的方法相比时，温和的榨汁步骤的使用减少了PMP生产过程中由污染物引起的胶凝。
实例17：使用超速离心和尺寸排除色谱法生产PMP
此实例描述了通过使用超速离心(UC)和尺寸排除色谱法(SEC)从水果中生产PMP。在此实例中，葡萄柚用作模型水果。
a)使用UC和SEC生产葡萄柚PMP
从红色葡萄柚分离汁囊，如实例15a中所描述，并且轻轻地压在茶滤器网上以收集28ml汁。用于使用UC和SEC生产葡萄柚PMP的工作流程描绘在图3A中。简而言之，使汁经受1000x g 10分钟、3000x g 20分钟、和10,000x g 40分钟的差异离心以除去大碎片。
将28ml澄清的汁在4℃下在SorvallTM MX 120Plus微型超速离心机上使用S50-ST(4x7mL)旋转桶式转子以100,000x g超速分离60分钟以获得粗PMP沉淀物，将该PMP沉淀物重悬于MES缓冲液(20mM MES，NaCl，pH 6)中。将沉淀物用MES缓冲液洗涤两次后，将最终的沉淀物重悬于pH 7.4的1ml PBS中。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分。通过使用NanoFCM的纳米流式细胞术分析SEC洗脱级分，以使用由制造商提供的浓度和尺寸标准品确定PMP尺寸和浓度。另外，在SEC级分上确定280nm处的吸光度
Figure GDA0002918049650001801
和蛋白质浓度(PierceTM BCA测定，赛默飞世尔公司)，以鉴定PMP洗脱在哪些级分中(图3B-3D)。SEC级分2-4被鉴定为含有PMP的级分。对较早洗脱级分和较晚洗脱级分的分析表明，SEC级分3是主要的含有PMP的级分，其浓度为2.83x1011PMP/mL(所有颗粒中的57.2％在50-120nm尺寸范围内)，并且中值尺寸为83.6nm+/-14.2nm(SD)。尽管晚期洗脱级分8-13具有非常低的如NanoFCM所示的颗粒浓度，但通过BCA分析在这些级分中检测到蛋白质污染物。
我们的数据显示，TFF和SEC可以用于从晚期洗脱污染物分离纯化的PMP，并且在此使用的分析方法的组合可以从晚期洗脱污染物中鉴定出PMP级分。
实例18：使用切向流过滤和尺寸排阻色谱法与减少污染物的EDTA/透析的组合来进行规模化PMP生产
此实例描述了通过使用切向流过滤(TFF)和尺寸排阻色谱法(SEC)与减少果胶大分子形成的EDTA孵育以及减少污染物的过夜透析的组合从水果中大规模生产PMP。在此实例中，葡萄柚用作模型水果。
a)使用TFF和SEC生产葡萄柚PMP
从当地的Whole
Figure GDA0002918049650001811
获得红色葡萄柚，并且使用榨汁机分离1000ml果汁。用于使用TFF和SEC生产葡萄柚PMP的工作流程描绘在图4A中。使汁经受1000x g 10分钟、3000x g 20分钟、和10,000x g 40分钟的差异离心以除去大碎片。将澄清的葡萄柚汁浓缩并且使用TFF(5nm孔径)洗涤一次至2mL(100x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分。通过使用NanoFCM的纳米流式细胞术分析SEC洗脱级分，以使用由制造商提供的浓度和尺寸标准品确定PMP浓度。另外，确定SEC级分的蛋白质浓度(PierceTM BCA测定，赛默飞世尔)以鉴定PMP洗脱在其中的组分。从1升汁(100x浓缩)的规模化生产还在晚期SEC级分中浓缩了大量污染物，如可以通过BCA测定检测(图4B，上图)。当与单一葡萄柚分离相比时，该规模化生产中的总体的总PMP产率(图4B，下图)更低，这可以表明PMP的损失。
b)通过EDTA孵育和透析减少污染物
从当地的Whole
Figure GDA0002918049650001812
获得红色葡萄柚，并且使用榨汁机分离800ml果汁。使汁经受1000x g 10分钟、3000x g 20分钟、和10,000x g 40分钟的差异离心以除去大碎片，并且通过1μm和0.45μm过滤器过滤以除去大颗粒。将澄清的葡萄柚汁分为4个不同的处理组，各含有125ml汁。将处理组1如实例18a中所描述进行加工，浓缩并且洗涤(PBS)至63x的最终浓度，并且经受SEC。在TFF之前，将475ml汁与最终浓度50mM EDTA(pH 7.15)在室温下一起孵育1.5h以螯合铁并且减少果胶大分子的形成。之后，将汁分为三个处理组，这些处理组经受用PBS(不含钙/镁)pH 7.4、MES pH 6、或Tris pH 8.6洗涤液的TFF浓缩至63X的最终汁浓度。接下来，使用300kDa膜在4℃下将样品在相同的洗涤缓冲液中透析过夜，并且经受SEC。与仅TFF的对照的晚期洗脱级分中的高污染物峰相比，EDTA孵育然后进行过夜透析大大减少了污染物，如通过对糖和果胶的存在敏感的在280nm处的吸光度(图4C)和BCA蛋白分析(图4D)所示。所用的透析缓冲液(不含钙/镁pH 7.4、MES pH 6、Tris pH 8.6的PBS)中没有差异。
我们的数据表明，与EDTA一起孵育然后进行透析减少了共纯化的污染物的量，从而促进规模化PMP生产。
实例19：PMP稳定性
此实例证实，PMP在不同的环境条件下稳定。在此实例中，葡萄柚和柠檬PMP用作模型PMP。
a)使用TFF与SEC的组合生产葡萄柚PMP
从当地的Whole Foods
Figure GDA0002918049650001821
获得红色有机葡萄柚(佛罗里达)。PMP生产工作流程描绘在图5A中。使用榨汁机收集一升葡萄柚汁，并且随后以3000xg 20分钟，然后10,000x g 40分钟进行离心以除去大碎片。接下来，将500mM EDTA(pH 8.6)添加到最终浓度50mM EDTA(pH 7)中，并且将溶液孵育30分钟以螯合钙并且防止果胶大分子的形成。随后，使汁通过11μm、1μm和0.45μm过滤器，以除去大颗粒。将过滤的汁浓缩并且通过切向流过滤(TFF)(孔径5nm)洗涤(500ml PBS)至400ml(2.5x)，并且使用300kDa透析膜在pH 7.4的PBS中透析过夜(进行一次介质交换)以除去污染物。随后，通过TFF将透析的汁进一步浓缩至最终浓度50ml(20x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分，通过在280nm处的吸光度
Figure GDA0002918049650001822
和蛋白质浓度测定(PierceTM BCA测定，赛默飞世尔公司)分析这些级分，以验证含有PMP的级分和含有污染物的晚期级分(图5B和图5C)。SEC级分4-6含有纯化的PMP(级分8-14含有污染物)，合并在一起，并且通过使用0.8μm、0.45μm和0.22μm注射器式过滤器的顺序过滤进行过滤灭菌。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定合并的灭菌的含有PMP的级分中的最终PMP浓度(1.32x1011PMP/mL)和中值PMP尺寸(71.9nm+/-14.5nm)(图5F)。
b)使用TFF与SEC的组合生产柠檬PMP
从当地的Whole Foods
Figure GDA0002918049650001823
获得柠檬。使用榨汁机收集一升柠檬汁，并且随后以3000g 20分钟，然后10,000g 40分钟进行离心以除去大碎片。接下来，将500mM EDTA(pH 8.6)添加到最终浓度50mM EDTA(pH 7)中，并且将溶液孵育30分钟以螯合钙并且防止果胶大分子的形成。随后，使汁通过咖啡过滤器、1μm和0.45μm过滤器，以除去大颗粒。将过滤的汁通过切向流过滤(TFF)(孔径5nm)浓缩至400ml(2.5x浓缩)，并且使用300kDa透析膜在pH 7.4的PBS中透析过夜以除去污染物。随后，通过TFF将透析的汁进一步浓缩至最终浓度50ml(20x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分，通过在280nm处的吸光度
Figure GDA0002918049650001831
和蛋白质浓度测定(PierceTM BCA测定，赛默飞世尔公司)分析这些级分，以验证含有PMP的级分和含有污染物的晚期级分(图5D和图5E)。SEC级分4-6含有纯化的PMP(级分8-14含有污染物)，合并在一起，并且通过使用0.8μm、0.45μm和0.22μm注射器式过滤器的顺序过滤进行过滤灭菌。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定合并的灭菌的含有PMP的级分中的最终PMP浓度(2.7x1011PMP/mL)和中值PMP尺寸(70.7nm+/-15.8nm)(图5G)。
c)葡萄柚和柠檬PMP在4℃下的稳定性
生产葡萄柚和柠檬PMP，如实例19a和19b中所描述。通过使用NanoFCM随时间测量样品中总PMP的浓度(PMP/ml)来评价PMP的稳定性。在黑暗中于4℃下进行46天的稳定性研究。将PMP的等分试样储存在4℃并且在预定日期通过NanoFCM分析。分析样品中总PMP的浓度(图5H)。在实验开始与结束点之间第46天柠檬和葡萄柚PMP的相对测量PMP浓度分别为119％和107％。我们的数据表明，PMP在4℃下稳定至少46天。
d)柠檬PMP的冻融稳定性
为了确定PMP的冻融稳定性，从在当地的Whole Foods
Figure GDA0002918049650001833
购买的有机柠檬生产柠檬PMP。使用榨汁机收集一升柠檬汁，并且随后以3000g 20分钟，然后10,000g 40分钟进行离心以除去大碎片。接下来，将500mM EDTA(pH 8.6)添加到最终浓度50mM EDTA(pH7.5)中，并且孵育30分钟以螯合钙并且防止果胶大分子的形成。随后，使汁通过11μm、1μm和0.45μm过滤器，以除去大颗粒。将过滤的汁浓缩并且通过切向流过滤(TFF)用400ml PBS pH7.4洗涤至最终体积400ml(2.5x浓缩)，并且使用300kDa透析膜在pH 7.4的PBS中透析过夜以除去污染物。随后，通过TFF将透析的汁进一步浓缩至最终浓度60ml(约17x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分，通过在280nm处的吸光度
Figure GDA0002918049650001832
和蛋白质浓度测定(PierceTM BCA测定，赛默飞世尔公司)分析这些级分，以验证含有PMP的级分和含有污染物的晚期级分。SEC级分4-6含有纯化的PMP(级分8-14含有污染物)，合并在一起，并且通过使用0.8μm、0.45μm和0.22μm注射器式过滤器的顺序过滤进行过滤灭菌。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定合并的灭菌的含有PMP的级分中的最终PMP浓度(6.92x1012PMP/mL)。
将柠檬PMP在-20℃或-80℃下冷冻1周，在室温下解冻，并且通过NanoFCM测量浓度(图5I)。数据表明，柠檬PMP在-20℃或-80℃下储存1周后，经过1次冻融循环后是稳定的。
实例20：从植物细胞培养基生产PMP
此实例证实，可以从植物细胞培养物生产PMP。在此实例中，黑色墨西哥甜玉米(Zea mays Black Mexican Sweet)(BMS)细胞系用作模型植物细胞系。
a)玉蜀黍BMS细胞系PMP的生产
从ABRC购买黑色墨西哥甜玉米(BMS)细胞系，并且在含有4.3g/L Murashige和Skoog基础盐混合物(Sigma M5524)、2％蔗糖(S0389，密理博西格玛公司(MilliporeSigma))、1x MS维生素溶液(M3900，密理博西格玛公司)、2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(D7299，密理博西格玛公司)和250ug/L硫胺素HCL(V-014，密理博西格玛公司)的Murashige和Skoog基础培养基(pH 5.8)中在24℃下在搅拌(110rpm)下生长，并且每7天传代20％体积/体积。
传代后三天，收集160ml BMS细胞，并且以500x g旋转沉降5min以除去细胞以及以10,000x g旋转沉降40min以除去大碎片。使培养基通过0.45μm过滤器以除去大颗粒，并且将过滤的培养基浓缩并且通过TFF(5nm孔径)洗涤(100ml MES缓冲液、20mM MES、100mMNaCL，pH 6)至4mL(40x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分，通过NanoFCM得到PMP浓度(通过在280nm处的吸光度
Figure GDA0002918049650001841
)以及通过蛋白质浓度测定(PierceTM BCA测定，赛默飞世尔公司)分析这些级分，以验证含有PMP的级分和含有污染物的晚期级分(图6A-6C)。SEC级分4-6含有纯化的PMP(级分9-13含有污染物)，并且合并在一起。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定合并的含有PMP的级分中的最终PMP浓度(2.84x1010PMP/ml)和中值PMP尺寸(63.2nm+/-12.3nm SD)(图6D-6E)。
这些数据显示，可以从植物液体培养基分离、纯化和浓缩PMP。
实例21：细菌和真菌对PMP的摄取
此实例证实了PMP与细菌和真菌缔合并且被其吸收的能力。在此实例中，葡萄柚和柠檬PMP用作PMP，大肠杆菌、丁香假单胞菌和铜绿假单胞菌用作模型病原体细菌，并且酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)用作模型病原体真菌。
a)将葡萄柚和柠檬PMP用DyLight800NHS酯标记
生产葡萄柚和柠檬PMP，如实例19a和19b中所描述。将PMP用DyLight 800NHS酯(生命技术公司(Life Technologies)，#46421)共价膜染料(DyL800)标记。简而言之，将DyL800溶解在DMSO中至最终浓度为10mg/ml，并且将200μl PMP与5μl染料混合并且在室温下在振荡器上孵育1h。通过超速离心机在4℃下以100,000xg 1h将标记的PMP洗涤2-3次，并且将沉淀物重悬于1.5ml超纯水中。为了控制潜在染料聚集体的存在，根据相同的步骤制备仅染料的对照样品，添加200μl超纯水代替PMP。将最终DyL800标记的PMP沉淀物和仅DyL800染料的对照重悬于最少量的超纯水中，并且通过NanoFCM进行表征。葡萄柚DyL800标记的PMP的最终浓度为4.44x1012PMP/ml并且中值DyL800-PMP尺寸为72.6nm+/-14.6nm(图7A)，并且柠檬DyL800标记的PMP的最终浓度为5.18x1012PMP/ml并且平均DyL800-PMP尺寸为68.5nm+/-14nm(图7B)。
b.酵母对DyL800标记的葡萄柚和柠檬PMP的摄取
使酿酒酵母(ATCC，#9763)在酵母提取物蛋白胨右旋糖肉汤(YPD)上生长，并且维持在30℃。为了确定PMP是否可以被酵母吸收，使新鲜的5ml酵母培养物在30℃过夜生长，并且将细胞以1500x g沉淀5min并且重悬于10ml水中。将酵母细胞用10ml水洗涤一次，重悬于10ml水中，并且在30℃下在摇动下孵育2h以使细胞缺乏营养物。接下来，在1.5ml试管中，将95ul酵母细胞与5ul水(阴性对照)、仅DyL800染料的对照(染料聚集体对照)或至最终浓度5x1010DyL800-PMP/ml的DyL800-PMP混合。将样品在30℃下在摇动下孵育2h。接下来，将经处理的细胞用1ml洗涤缓冲液(补充有0.5％Triton X-100的水)洗涤，孵育5min，并且以1500xg旋转沉降5min。除去上清液，并且将酵母细胞洗涤另外3次以除去未被细胞吸收的PMP并且最后一次用水洗涤以除去洗涤剂。将酵母细胞重悬于100ul水中并且转移至透明底部96孔板中，并且在
Figure GDA0002918049650001861
CLx扫描仪(Li-Cor)上测量在800nm激发下的相对荧光强度(A.U.)。
为了评价酵母对DyL800-PMP的摄取，将样品归一化为仅DyL800染料的对照，并且比较葡萄柚和柠檬DyL800-PMP相对荧光强度。我们的数据表明，酿酒酵母吸收PMP，并且在柠檬与葡萄柚DyL800-PMP之间未观察到摄取差异(图7C)。
c)细菌对DyL800标记的葡萄柚和柠檬PMP的摄取
将细菌和酵母菌株如供应商指示的那样进行维护：使大肠杆菌(Ec，ATCC，#25922)在胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂/肉汤上在37℃下生长，使铜绿假单胞菌(Pa，ATCC)在具有50mg/ml利福平的胰蛋白酶大豆琼脂/肉汤上在37℃下生长，并且使丁香假单胞菌番茄致病变体菌株DC3000细菌(Ps，ATCC，#BAA-871)在具有50mg/ml利福平的金氏培养基B琼脂上在30℃下生长。
为了确定PMP是否能被细菌吸收，使新鲜的5ml细菌培养物过夜生长，并且将细胞以3000x g沉淀5min，重悬于5ml 10mM MgCl2中，用5ml 10mM MgCl2洗涤一次，并且重悬于5ml 10mM MgCl2。将细胞在摇动培养箱中以约200rpm在37℃下(Ec)或在30℃下(Pa，Ps)孵育2h，以使细胞缺乏营养物。测量OD600并且将细胞密度调节至约10x109CFU/ml。接下来，在1.5ml试管中，将95ul细菌细胞与5ul水(阴性对照)、仅DyL800染料的对照(染料聚集体对照)或最终浓度5x1010DyL800-PMP/ml的DyL800-PMP混合。将样品在30℃下在摇动下孵育2h。接下来，将经处理的细胞用1ml洗涤缓冲液(具有0.5％Triton X-100的10mM MgCl2)洗涤，孵育5min，并且以3000x g旋转沉降5min。除去上清液，并且将酵母细胞洗涤另外3次以除去未被细胞吸收的PMP并且用1ml 10mM MgCl2再洗涤一次以除去洗涤剂。将细菌细胞重悬于100ul 10mM MgCl2中并且转移至透明底部96孔板中，并且在
Figure GDA0002918049650001862
CLx扫描仪(Li-Cor)上测量在800nm激发下的相对荧光强度(A.U.)。
为了评价细菌对DyL800-PMP的摄取，将样品归一化为仅DyL800染料的对照，并且比较葡萄柚和柠檬DyL800-PMP相对荧光强度。我们的数据表明，测试的所有细菌物种均吸收PMP(图7C)。通常，优先吸收柠檬PMP(信号强度比葡萄柚PMP高)。大肠杆菌和铜绿假单胞菌显示出最高的DyL800-PMP摄取。
实例22：昆虫细胞对PMP的摄取
此实例证实了PMP与昆虫细胞缔合并且被其吸收的能力。在此实例中，sf9草地贪夜蛾(昆虫)细胞和S2黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(昆虫)细胞系用作模型昆虫细胞，并且柠檬PMP用作模型PMP。
a)柠檬PMP的生产
从当地的Whole Foods
Figure GDA0002918049650001871
获得柠檬。使用榨汁机收集柠檬汁(3.3L)，用NaOH将pH调节至pH 4，并且与0.5U/ml果胶酶(西格玛公司(Sigma)，17389)一起孵育以除去果胶污染物。将汁在搅拌下在室温下孵育1小时，并且储存在4C下过夜，并且随后意3000g离心20分钟，然后以10,000g离心40分钟以除去大碎片。接下来，在30分钟内将经加工的汁与500mMEDTA(pH 8.6)在室温下一起孵育至最终浓度50mM EDTA(pH 7.5)，以螯合钙并且防止果胶大分子的形成。随后，使EDTA处理的汁通过11μm、1μm和0.45μm过滤器，以除去大颗粒。通过切向流过滤(TFF)将过滤的汁洗涤(在TFF程序中，300ml PBS)并且浓缩2x至1350ml的总体积，并且使用300kDa透析膜透析过夜。随后，通过TFF将透析的汁进一步洗涤(在TFF程序中，500ml PMS)并且浓缩至最终浓度160ml(约20x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分，并且分析280nm吸光度
Figure GDA0002918049650001872
以确定来自含有污染物的晚期洗脱级分的含有PMP的级分。将含有纯化的PMP的SEC级分4-7合并在一起，使用0.85μm、0.4μm和0.22μm注射器过滤器的顺序过滤进行过滤灭菌，并且进一步通过以40,000x g沉淀PMP1.5h进行浓缩，并且最后将沉淀物重悬于超纯水中。通过纳米流式细胞术(NanoFCM)使用由制造商提供的浓度和尺寸标准确定最终PMP浓度(1.53x1013PMP/ml)和中值PMP尺寸(72.4nm+/-19.8nm SD)(图8A)，并且使用PierceTM BCA测定(赛默飞世尔公司)根据制造商的说明确定PMP蛋白浓度(12.317mg/ml)。
b)用Alexa Fluor 488 NHS酯标记柠檬PMP
将柠檬PMP用Alexa Fluor 488NHS酯(生命技术公司)共价膜染料(AF488)标记。简而言之，将AF488溶解在DMSO中至最终浓度10mg/ml，将200μl PMP(1.53x1013PMP/ml)与5μl染料混合，在振荡器上在室温下孵育1h，并且通过超速离心机在4℃下以100,000xg 1h将标记的PMP洗涤2-3次，并且将沉淀物用1.5ml超纯水重悬。为了控制潜在染料聚集体的存在，根据相同的步骤制备仅染料的对照样品，添加200ul超纯水代替PMP。将最终AF488标记的PMP沉淀物和仅AF488染料的对照重悬于最少量的超纯水中，并且通过NanoFCM进行表征。AF488标记的PMP的最终浓度为1.33x1013PMP/ml并且中值AF488-PMP尺寸为72.1nm+/-15.9nm SD，并且达到99％的标记效率(图8B)。
c)用柠檬AF488-PMP处理昆虫细胞
如实例22a和22b所描述生产和标记柠檬PMP。从赛默飞世尔科技公司获得sf9草地贪夜蛾细胞系(#B82501)，并且维持在补充有10％热灭活胎牛血清的TNM-FH昆虫培养基(西格玛奥德里奇公司，T1032)中。从ATCC(#CRL-1963)获得S2黑腹果蝇细胞系，并且维持在补充有10％热灭活胎牛血清的Schneider果蝇培养基(Gibco/赛默飞世尔科技公司#21720024)中。使两种细胞系在26℃下生长。对于PMP处理，将S2/Sf9细胞以50％汇合率接种在无菌0.01％聚-l-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上24孔板中2ml完全培养基中，并且允许粘附在盖玻片上过夜。接下来，通过以下方式处理细胞：将10ul仅AF488染料(染料聚集体对照)、柠檬PMP(仅PMP的对照)、或AF488-PMP添加到重复样品中，将其在26℃下孵育2h。最终浓度为1.33x1011PMP/AF488-PMP/孔。然后将细胞用1ml PBS洗涤两次，并且用在PBS中的4％甲醛固定15min。随后将细胞用PBS+0.02％triton X-100透化15min，并且将核用1:1000DAPI溶液染色30min。将细胞用PBS洗涤一次，并且将盖玻片封固在具有ProLongTM Gold Antifade(赛默飞世尔科技公司)的载玻片上以减少光漂白。将树脂放置过夜，并且在Olympus落射荧光显微镜上使用100x物镜检查细胞，并且拍摄具有0.25um的增量的10um的Z-堆叠图像。从S2黑腹果蝇和S9 L.frugiperda细胞两者获得相似的结果。在仅AF488染料的对照和仅PMP的对照中未观察到绿色焦点，而几乎所有用AF488-PMP处理的昆虫细胞都显示出在昆虫细胞内的绿色焦点。细胞质中存在强信号，其中内体隔室上指示了若干明亮的较大焦点。由于DAPI在488通道中渗出，因此无法评价核中AF488-PMP信号的存在。对于sf9细胞，94.4％(n＝38)的检查的细胞显示绿色焦点，而仅AF488染料(n＝68)或仅PMP(n＝42)的对照的对照样品中未观察到这样。
我们的数据表明，PMP可以与昆虫细胞膜缔合，并且可以被昆虫细胞高效吸收。
实例23：向PMP负载小分子
此实例证实了使用不同的PMP源和包封方法向PMP负载模型小分子，用于递送药剂的目的。在此实例中，阿霉素用作模型小分子，并且柠檬和葡萄柚PMP用作模型PMP。
我们显示PMP可以高效地负载阿霉素，并且负载的PMP在4℃下稳定至少8周。
a)使用TFF与SEC的组合生产葡萄柚PMP
从当地的Whole Foods
Figure GDA0002918049650001891
获得白色葡萄柚(佛罗里达)。使用榨汁机收集一升葡萄柚汁，并且随后以3000x g 20分钟，然后10,000x g 40分钟进行离心以除去大碎片。接下来，将500mM EDTA(pH 8.6)添加到最终浓度50mM EDTA(pH 7)中，并且孵育30分钟以螯合钙并且防止果胶大分子的形成。随后，使汁通过咖啡过滤器以及1μm和0.45μm过滤器，以除去大颗粒。将过滤的汁通过切向流过滤(TFF，孔径5nm)浓缩至400ml，并且使用300kDa透析膜在pH 7.4的PBS中透析过夜以除去污染物。随后，通过TFF将透析的汁进一步浓缩至最终浓度50ml(20x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分，将其通过280nm吸光度
Figure GDA0002918049650001892
进行分析以验证含有PMP的级分和含有污染物的晚期级分(图9A)。将含有纯化的PMP的SEC级分4-6合并在一起，并且进一步通过以40,000xg沉淀PMP 1.5h进行浓缩并且将沉淀物重悬于超纯水中。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定最终PMP浓度(6.34x 1012PMP/ml)和中值PMP尺寸(63.7nm+/-11.5nm(SD))(图9B和9C)。
b)使用TFF与SEC的组合生产柠檬PMP
从当地的Whole Foods
Figure GDA0002918049650001893
获得柠檬。使用榨汁机收集一升柠檬汁，并且随后以3000g 20分钟，然后10,000g 40分钟进行离心以除去大碎片。接下来，将500mM EDTA(pH 8.6)添加到最终浓度50mM EDTA(pH 7)中，并且孵育30分钟以螯合钙并且防止果胶大分子的形成。随后，使汁通过咖啡过滤器、1um和0.45um过滤器，以除去大颗粒。将过滤的汁通过切向流过滤(TFF，孔径5nm)浓缩至400ml，并且使用300kDa透析膜在pH 7.4的PBS中透析过夜以除去污染物。随后，通过TFF将透析的汁进一步浓缩至最终浓度50ml(20x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分，将其通过280nm吸光度
Figure GDA0002918049650001901
进行分析以验证含有PMP的级分和含有污染物的晚期级分(图9D)。将含有纯化的PMP的SEC级分4-6合并在一起，并且进一步通过以40,000xg沉淀PMP 1.5h进行浓缩并且将沉淀物重悬于超纯水中。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定最终PMP浓度(7.42x 1012PMP/ml)和中值PMP尺寸(68nm+/-17.5nm(SD))(图9E和9F)。
c)将阿霉素被动负载到柠檬和葡萄柚PMP中
葡萄柚(实例23a)和柠檬(实例23b)PMP用于负载阿霉素(DOX)。以在超纯水(UltraPureTM不含DNA酶/RNA酶的蒸馏水，赛默飞公司，10977023)中10mg/mL的浓度制备阿霉素储备溶液(DOX，Sigma PHR1789)，过滤灭菌(0.22μm)，并且储存在4℃。将0.5mL PMP与0.25mL DOX溶液混合。混合物中的最终DOX浓度为3.3mg/mL。葡萄柚(GF)PMP的初始颗粒浓度为9.8x1012PMP/mL并且柠檬(LM)PMP的初始颗粒浓度为1.8x1013PMP/mL。在黑暗中在25℃、100rpm下将混合物搅拌4小时。然后将混合物用超纯水稀释3.3倍(混合物中的最终DOX浓度为1mg/ml)并且分成两个相等部分(对于被动负载为1.25mL，并且对于主动负载为1.25mL(实例23d)。在黑暗中在25℃、100rpm下将两个样品孵育另外23h。所有步骤均在无菌条件下进行。
对于被动负载DOX，为了除去未负载的或弱结合的DOX，通过超速离心纯化样品。将混合物分成6个相等部分(各200uL)并且添加无菌水(1.3mL)。将样品在1.5mL超速离心管中旋转沉降(40,000xg，1.5h，4℃)。将PMP-DOX沉淀物重悬于无菌水中并且旋转沉降两次。将样品在4℃下保持三天。
在使用之前，通过超速离心(40,000xg，1.5h，4℃)将负载DOX的PMP再洗涤一次。将最终沉淀物重悬于无菌超纯水中，并且储存在4℃直到进一步使用。通过SpectraMax分光光度计(Ex/Em＝485/550nm)确定PMP中DOX的浓度，并且通过纳米流式细胞术(NanoFCM)确定颗粒总数的浓度。
d)将阿霉素主动负载到柠檬和葡萄柚PMP中
葡萄柚(实例23a)和柠檬(实例23b)PMP用于负载阿霉素(DOX)。以在超纯水(赛默飞公司，10977023)中10mg/mL的浓度制备阿霉素储备溶液(DOX，Sigma PHR1789)，灭菌(0.22um)，并且储存在4℃。将0.5mL PMP与0.25mL DOX溶液混合。混合物中的最终DOX浓度为3.3mg/mL。葡萄柚(GF)PMP的初始颗粒浓度为9.8x1012PMP/mL并且柠檬(LM)PMP的初始颗粒浓度为1.8x1013PMP/mL。在黑暗中在25℃、100rpm下将混合物搅拌4小时。然后将混合物用超纯水稀释3.3倍(混合物中的最终DOX浓度为1mg/ml)并且分成两个相等部分(对于被动负载为1.25mL(实例23c)，并且对于主动负载为1.25mL)。在黑暗中在25℃、100rpm下将两个样品孵育另外23h。所有步骤均在无菌条件下进行。
在25℃下孵育一天后，将混合物在4℃下保持4天。然后将混合物在42℃的超声浴(Branson 2800)中超声处理30min，涡旋，并且再超声处理20min。接下来，将混合物用无菌水稀释两次并且使用Avanti小型挤出机挤出(Avanti脂质)。为了减少脂质双层的数量和总体粒度，将负载DOX的PMP以逐步减少的方式挤出：对于葡萄柚(GF)PMP为800nm、400nm和200nm；并且对于柠檬(LM)PMP为800nm、400nm。为了除去未负载的或弱结合的DOX，使用超速离心方法洗涤样品。具体地，将样品(1.5mL)用无菌超纯水(总计6.5mL)稀释，并且在4℃下在7mL超速离心管中以40,000xg旋转沉降1h两次。将最终沉淀物重悬于无菌超纯水中，并且保持在4℃直到进一步使用。
e)通过被动负载和主动负载制备的负载DOX的PMP的负载容量的确定
为了评价PMP中DOX的负载容量，通过荧光强度测量(Ex/Em＝485/550nm)使用
Figure GDA0002918049650001911
分光光度计评价DOX浓度。使用从0至83.3ug/mL的游离DOX的校准曲线。为了解离负载DOX的PMP和DOX复合物(π-π堆积)，在荧光测量之前，将样品和标准品与1％SDS在37℃下一起孵育30min。负载容量(pg DOX/1000个颗粒)计算为DOX浓度(pg/mL)除以PMP总浓度(PMP/mL)(图9G)。对于1000个PMP，被动负载的PMP的负载容量为0.55pg DOX(GF PMP-DOX)和0.25pg DOX(LM PMP-DOX)。对于1000个PMP，主动负载的PMP的负载容量为0.23pgDOX(GF PMP-DOX)和0.27pg DOX(LM PMP-DOX)。
f)负载阿霉素的葡萄柚和柠檬PMP的稳定性
通过使用NanoFCM随时间测量样品中总PMP的浓度(PMP/ml)来评价负载DOX的PMP的稳定性。在黑暗中于4℃下进行8周的稳定性研究。将PMP-DOX的等分试样储存在4℃并且在预定日期通过NanoFCM分析。PMP-DOX的粒度未显著改变。因此，对于被动负载的GF PMP，在两个月内平均粒度范围为70-80nm。分析样品中总PMP的浓度(图9H)。在4℃下8周内，被动负载的GF PMP的浓度范围为从2.06x1011至3.06x1011PMP/ml，对于主动负载的GF PMP为从5.55x1011至9.97x1011PMP/ml，并且对于被动负载的LM PMP为从8.52x1011至1.76x1012PMP/ml。我们的数据表明，负载DOX的PMP在4℃下稳定8周。
实例24：用负载小分子的PMP处理细菌和真菌
此实例证实了PMP负载小分子的能力，目的是降低病原体细菌和真菌的适应度。在此实例中，葡萄柚PMP用作PMP，大肠杆菌、丁香假单胞菌和铜绿假单胞菌用作模型病原体细菌，酿酒酵母用作模型病原体真菌，并且阿霉素用作模型小分子。从波赛链霉菌青灰变种(Streptomyces peucetius var.caesius)的培养物分离阿霉素是细胞毒性蒽环抗生素。阿霉素通过插入与DNA相互作用，并且抑制DNA复制和RNA转录两者。阿霉素已显示具有抗生素活性(Westman等人,Chem Biol,19(10):1255-1264,2012.)
a)使用TFF与SEC的组合生产葡萄柚PMP
从当地的Whole Foods
Figure GDA0002918049650001921
获得红色有机葡萄柚。PMP生产工作流程的概览在图10A中给出。用榨汁机收集四升葡萄柚汁，用NaOH将pH调节至pH 4，与1U/ml果胶酶(西格玛公司，17389)一起孵育以除去果胶污染物，并且随后以3,000g离心20分钟，然后以10,000g离心40分钟以除去大碎片。接下来，在30分钟内将经加工的汁与500mM EDTA(pH 8.6)一起孵育至最终浓度50mM EDTA(pH 7.7)，以螯合钙并且防止果胶大分子的形成。随后，使EDTA处理的汁通过11μm、1μm和0.45μm过滤器，以除去大颗粒。将过滤的汁洗涤，并且使用300kDa TFF通过切向流过滤(TFF)进行浓缩。将汁浓缩5x，然后用PBS进行6体积交换洗涤，并且进一步过滤至最终浓度198mL(20x)。接下来，我们使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分，通过在280nm处的吸光度
Figure GDA0002918049650001922
和蛋白质浓度(PierceTM BCA测定，赛默飞世尔公司)分析这些级分，以验证含有PMP的级分和含有污染物的晚期级分(图10B和图10C)。SEC级分3-7含有纯化的PMP(级分9-12含有污染物)，合并在一起，通过使用0.8μm、0.45μm和0.22μm注射器式过滤器的顺序过滤进行过滤灭菌，并且进一步通过以40,000x g沉淀PMP 1.5h进行浓缩并且将沉淀物重悬于4ml UltraPureTM不含DNA酶/RNA酶的蒸馏水(赛默飞世尔公司，10977023)中。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定最终PMP浓度(7.56x1012PMP/ml)和平均PMP尺寸(70.3nm+/-12.4nm SD)(图10D和10E)。产生的葡萄柚PMP用于负载阿霉素。
b)将阿霉素负载在葡萄柚PMP中
实例24a中产生的葡萄柚PMP用于负载阿霉素(DOX)。以在超纯水中10mg/mL的浓度制备阿霉素储备溶液(Sigma PHR1789)并且过滤灭菌(0.22μm)。将无菌葡萄柚PMP(3mL，颗粒浓度为7.56x1012PMP/ml)与1.29mL DOX溶液混合。混合物中的最终DOX浓度为3mg/mL。将混合物在温度升至40℃的超声浴(Branson 2800)中超声处理20min，并且在不进行超声处理的情况下在浴中保持另外15分钟。在黑暗中在24℃、100rpm下将混合物搅拌4小时。接下来，将混合物使用Avanti小型挤出机挤出(Avanti脂质)。为了减少脂质双层的数量和总体粒度，将负载DOX的PMP以逐步减少的方式挤出：800nm、400nm和200nm。通过随后在TC罩中通过0.8μm和0.45μm过滤器(密理博公司(Millipore)，直径13mm)将挤出的样品过滤灭菌。为了除去未负载的或弱结合的DOX，使用超速离心方法纯化样品。具体地，将样品在4℃下在1.5mL超速离心管中以100,000x g旋转沉降1h。收集上清液进行进一步分析，并且储存在4℃。将沉淀物重悬于无菌水中并且在相同条件下超速离心。将此步骤重复四次。将最终沉淀物重悬于无菌超纯水中，并且保持在4℃直到进一步使用。
接下来，确定颗粒浓度和PMP的负载容量。使用NanoFCM确定样品中PMP的总数量(4.76x1012PMP/ml)和中值粒度(72.8nm+/-21nm SD)。通过荧光强度测量(Ex/Em＝485/550nm)使用
Figure GDA0002918049650001931
分光光度计评价DOX浓度。在无菌水中制作从0至50ug/mL的游离DOX的校准曲线。为了解离负载DOX的PMP和DOX复合物(π-π堆积)，在荧光测量之前，将样品和标准品与1％SDS在37℃下一起孵育45min。负载容量(pg DOX/1000个颗粒)计算为DOX浓度(pg/ml)除以PMP总数量(PMP/ml)。PMP-DOX负载容量为1.2pg DOX/1000PMP。然而，应当注意，无法评价负载效率(负载DOX的PMP相比于PMP的总数量的％)，因为无法在NanoFCM上检测到DOX荧光光谱。
我们的结果表明，PMP可以高效地负载小分子。
c)用负载Dox的葡萄柚PMP处理细菌和酵母
为了查实PMP可以递送细胞毒性剂，将若干种微生物物种用来自实例24b的负载阿霉素的葡萄柚PMP(PMP-DOX)处理。
将细菌和酵母菌株如供应商指示的那样进行维护：使大肠杆菌(ATCC，#25922)在胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂/肉汤上在37℃下生长，使铜绿假单胞菌(ATCC)在具有50mg/ml利福平的胰蛋白酶大豆琼脂/肉汤上在37℃下生长，使丁香假单胞菌番茄致病变体菌株DC3000细菌(ATCC，#BAA-871)在具有50mg/ml利福平的金氏培养基B琼脂上在30℃下生长，并且使酿酒酵母(ATCC，#9763)在酵母提取物蛋白胨右旋糖肉汤(YPD)上生长，并且维持在30℃。在处理之前，将新鲜的一天培养物生长过夜，在使用前用培养基将OD(600nm)调节至0.1OD，并且将细菌/酵母转移到96孔板中进行处理(重复样品，100μl/孔)。将细菌/酵母用50μl在超纯水中至有效DOX浓度0(阴性对照)、5μM、10μM、25μM、50μM和100μM(最终体积/孔为150μl)的PMP-DOX溶液进行处理。将板用铝箔覆盖，并且在37℃下(大肠杆菌、铜绿假单胞菌)或在30℃下(酿酒酵母、丁香假单胞菌)下孵育，并且以220rpm搅拌。
在
Figure GDA0002918049650001941
分光光度计上进行在600nm处的动力学吸光度测量，以在t＝0h、t＝1h、t＝2h、t＝3h、t＝4.5h、t＝16h(大肠杆菌、铜绿假单胞菌)或t＝0.5h、t＝1.5h、t＝2.5h、t＝3.5h、t＝4h、t＝16h(丁香假单胞菌、酿酒酵母)监测培养物的OD。由于阿霉素具有在高DOX浓度下部分渗出600nm吸光度的宽的荧光光谱，因此首先将每个治疗剂量的所有OD值归一化为所述剂量下第一个时间点的OD(对于大肠杆菌、铜绿假单胞菌为t＝0，对于丁香假单胞菌、酿酒酵母为t＝0.5)。
为了比较PMP-DOX处理对不同的细菌和酵母菌株的细胞毒性作用，在每个处理组中，与未处理的对照(设定为100％)相比，确定相对OD。测试的所有微生物物种均显示出由PMP-DOX引起的不同程度的细胞毒性(图10F-10I)，该细胞毒性是剂量依赖性的，酿酒酵母除外。酿酒酵母对PMP-DOX最敏感，在处理2.5h后已经显示出细胞毒性反应，并且在处理后16h在测试的最低有效剂量(5uM)下达到IC50，它比此系列中测试的任何其他微生物敏感10x。在孵育后16小时，丁香假单胞菌在50μM和100μM达到IC50。处理后从3小时，大肠杆菌仅对于100μM达到IC50。铜绿假单胞菌对PMP-DOX最不敏感，显示出在50和100μM有效DOX剂量下37％的最大生长减少。我们还测试了游离阿霉素，并且发现使用相同的剂量，细胞毒性比在PMP-DOX递送的情况下诱导更早。这表明，与脂质膜PMP相比，阿霉素小分子容易地扩散到单细胞生物体中，这些脂质膜PMP为释放其货物需要穿过微生物细胞壁并且与靶细胞膜融合，直接与质膜融合或在内吞摄取后与内体膜融合。
我们的数据显示，负载小分子的PMP可能负面影响各种细菌和酵母的适应度。
实例25：用负载蛋白质的PMP处理微生物
此实例证实，PMP可以外源负载蛋白质，PMP可以保护其货物免于降解，并且PMP可以将其功能性货物递送至生物体。在此实例中，葡萄柚PMP用作模型PMP，铜绿假单胞菌细菌用作模型生物体，并且荧光素酶蛋白用作模型蛋白。
尽管基于蛋白质和肽的药物具有影响具有抗性或难处理的许多种病原体细菌和真菌的适应度的很大潜力，但由于其不稳定性和配制挑战，因此其部署无法成功。
a)将荧光素酶蛋白负载到葡萄柚PMP中
生产葡萄柚PMP，如实例24a中所描述。荧光素酶(Luc)蛋白购自LSBio(目录号LS-G5533-150)，并且将其溶解于pH 7.4的PBS中至最终浓度为300μg/mL。使用改编自RachaelW.Sirianni和Bahareh Behkam(编辑),Targeted Drug Delivery:Methods and Protocols[靶向药物递送：方法和方案],Methods in Molecular Biology[分子生物学方法],第1831卷的方案通过电穿孔向过滤灭菌的PMP负载荧光素酶蛋白。将单独的PMP(PMP对照)、单独的荧光素酶蛋白(蛋白质对照)、或PMP+荧光素酶蛋白(负载蛋白质的PMP)与4.8x电穿孔缓冲液(在超纯水中的100％Optiprep(西格玛公司，D1556))混合以在反应混合物中具有最终21％Optiprep浓度(参见表9)。通过以下方式制造蛋白质对照：将荧光素酶蛋白与超纯水而不是Optiprep混合(蛋白质对照)，因为最终PMP-Luc沉淀物稀释在水中。将样品转移到冷却的比色皿中，并且使用Biorad
Figure GDA0002918049650001951
以0.400kV、125μF(0.125mF)、低100Ω-高600Ω电阻以两个脉冲(4-10ms)电穿孔。将反应在冰上放置10分钟，并且转移至预冰冷却的1.5ml超速离心管中。将含有PMP的所有样品通过以下方式洗涤3次：添加1.4ml超纯水，然后超速离心(在4℃下，100,000x g，1.5h)。将最终沉淀物重悬于最小体积的超纯水(50μL)中，并且保持在4℃直到使用。电穿孔后，仅含有荧光素酶蛋白的样品不通过离心洗涤，并且储存在4℃直到使用。
为了确定PMP的负载容量，使用1微升负载荧光素酶的PMP(PMP-Luc)和1微升未负载的PMP。为了确定负载在PMP中的荧光素酶蛋白的量，制作荧光素酶蛋白(LSBio，LS-G5533-150)标准曲线(10、30、100、300、和1000ng)。使用ONE-GloTM荧光素酶测定试剂盒(普洛麦格公司(Promega)，E6110)并且使用
Figure GDA0002918049650001962
分光光度计测量发光来测定所有样品和标准品中的荧光素酶活性。使用荧光素酶蛋白(LSBio，LS-G5533-150)的标准曲线确定负载在PMP中的荧光素酶蛋白的量，并且归一化为未负载的PMP样品中的发光。负载容量(ng荧光素酶蛋白/1E+9个颗粒)计算为荧光素酶蛋白浓度(ng)除以负载的PMP(PMP-Luc)的数量。PMP-Luc负载容量是2.76ng荧光素酶蛋白/1x109PMP。
我们的结果表明，PMP可以负载模型蛋白，该模型蛋白在包封后仍保持活性。
表9.使用电穿孔的荧光素酶蛋白负载策略。
Figure GDA0002918049650001961
注意：25μL荧光素酶等效于7.5μg荧光素酶蛋白。
b)用负载荧光素酶蛋白的葡萄柚PMP处理铜绿假单胞菌
根据供应商的说明，使铜绿假单胞菌(ATCC)在补充有50ug/ml利福平的胰蛋白酶大豆肉汤中在30℃下过夜生长。通过以3,000x g离心5min收集铜绿假单胞菌细胞(总体积5ml)。将细胞用10ml 10mM MgCl2洗涤两次，并且重悬于5ml 10mM MgCl2中。测量OD600并且调节至0.5。
在含有50μl补充有3ng PMP-Luc(稀释在超纯水中)、3ng游离荧光素酶蛋白(仅蛋白质的对照；稀释在超纯水中)、或超纯水(阴性对照)的重悬的铜绿假单胞菌细胞的1.5mlEppendorf管中一式两份地进行处理。将超纯水添加到75μl所有样品中。将样品混合并且在室温下孵育2h并且用铝箔覆盖。接下来将样品以6,000x g离心5min，并且收集70μl上清液并且保存用于荧光素酶检测。随后将细菌沉淀物用500μl含有0.5％Triton X-100的10mMMgCl2洗涤3次，以除去/爆破未被吸收的PMP。用1ml 10mM MgCl2进行最后洗涤以除去残余的Triton X-100。除去970μl上清液(将沉淀物留在30ul洗涤缓冲液中)，并且添加20μl 10mMMgCl2和25μl超纯水以重悬铜绿假单胞菌沉淀物。根据制造商的说明，通过使用ONE-GloTM荧光素酶测定试剂盒(普洛麦格公司，E6110)的发光测量荧光素酶蛋白。将样品(细菌沉淀物和上清液样品)孵育10分钟，并且在
Figure GDA0002918049650001971
分光光度计上测量发光。
用负载荧光素酶蛋白的葡萄柚PMP处理的铜绿假单胞菌具有比单独的游离荧光素酶蛋白或超纯水对照(阴性对照)的处理高19.3倍的荧光素酶表达，表明PMP能够高效地将其蛋白质货物递送到细菌中(图11)。另外，PMP似乎保护荧光素酶蛋白免受降解，因为在上清液和细菌沉淀物两者中的游离荧光素酶蛋白水平均非常低。考虑到处理剂量为3ng荧光素酶蛋白，基于荧光素酶蛋白标准曲线，在水中室温孵育2小时后的上清液或细菌沉淀物中的游离荧光素酶蛋白对应于<0.1ng荧光素酶蛋白，表明蛋白质降解。
我们的数据显示，PMP可以将蛋白质货物递送到生物体中，并且PMP可以保护其货物免受环境降解。
实例26：植物细胞对PMP的摄取
此实例证实了PMP与植物细胞缔合并且被其吸收的能力。在此实例中，柠檬PMP用作PMP，并且大豆、小麦和玉米细胞系用作模型植物细胞。
a)用Alexa Fluor 488 NHS酯标记柠檬PMP
生产柠檬PMP，如实例19b中所描述。将PMP用Alexa Fluor
Figure GDA0002918049650001972
NHS酯(生命技术公司，共价膜染料(AF488))标记。简而言之，将AF488溶解在DMSO中至最终浓度10mg/ml，将200ul PMP(1.53E+13PMP/ml)与5ul染料混合，在振荡器上在室温下孵育1h，并且通过超速离心机在4℃下以100,000xg 1h将标记的PMP洗涤2-3次。将沉淀物用1.5ml超纯水重悬。为了控制潜在染料聚集体的存在，根据相同的步骤制备仅染料的对照样品，添加200ul超纯水代替PMP。将最终AF488标记的PMP沉淀物和仅AF488染料的对照重悬于最少量的超纯水中，并且通过NanoFCM进行表征。柠檬488标记的PMP的最终浓度为2.91x1012PMP/ml并且中值AF488-PMP尺寸为79.4nm+/-14.7nm SD，并且标记效率为89.4％(图12A)。
b)植物细胞对AF488标记的柠檬PMP的摄取
植物细胞系购自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen[德国微生物和细胞培养物收录](DSMZ)(橹豆(Glycine max)，#PC-1026；普通小麦，#PC-998)和ABRC(黑色墨西哥甜玉米(BMS)，并且在黑暗中在带挡板的通气的250mL烧瓶中在24℃下在搅拌(110rpm)下生长。根据供应商的说明，使橹豆和普通小麦在3.2g/L补充有最少有机物的Gamborg B-5基础培养基(G5893，密理博西格玛公司)(pH 5.5)中生长，该基础培养基补充有2％蔗糖和2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4D)(D7299，密理博西格玛公司)。使BMS细胞在含有4.3g/L Murashige和Skoog基础盐混合物(Sigma M5524)、2％蔗糖(S0389，密理博西格玛公司)、1x MS维生素溶液(M3900，密理博西格玛公司)、2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(D7299，密理博西格玛公司)和250ug/L硫胺素HCL(V-014，密理博西格玛公司)的Murashige和Skoog基础培养基(pH 5.8)中生长。
对于用AF488-PMP的处理，取5mL细胞悬浮液以确定细胞压积(PCV)％。PCV定义为细胞体积除以细胞培养物等分试样的总体积，并且表示为百分比。将细胞以3900rpm离心5min，并且确定细胞沉淀物的体积。对于BMS、橹豆、和普通小麦的PCV％分别为20％、15％、和18％。对于摄取实验，通过将细胞稀释在适当的培养基中，将培养物的PCV％调节至2％。接下来，将125μl植物细胞悬浮液添加到24孔板中，并且将一式两份的样品用125μl单独的MES缓冲液(200mM MES+10mM NaCl，pH 6)(阴性对照)、仅AF488染料(仅染料的对照)或在MES缓冲液中稀释至125μl的最终浓度1x1012AF488-PMP/mL处理。将细胞在24℃下在黑暗中孵育2小时，用1mL MES缓冲液洗涤3次以除去未吸收的AF488-PMP或游离染料，并且重悬于300μL MES缓冲液中，用于在辐射荧光显微镜(EVOS FL Auto 2，英杰公司)上成像。与没有可检测荧光的仅AF488染料的对照相比，可以在所有植物细胞系中检测到可变的荧光信号，表明PMP摄取(图12B)。普通小麦细胞显示出最强的荧光信号，表明在所测试的三种植物细胞系中，它们具有最高的对AF488标记的柠檬PMP的摄取。
我们的数据显示，PMP可以在体外被植物细胞吸收。
实例27：PMP在植物中的摄取
此实例证实了PMP在植物体中被吸收和内吸地运送的能力。在此实例中，葡萄柚、柠檬和拟南芥幼苗PMP用作模型PMP，并且拟南芥属幼苗和苜蓿芽用作模型植物。
a)将柠檬和葡萄柚PMP用DyLight 800NHS酯标记
生产葡萄柚和柠檬PMP，如实例19a和19b中所描述。将PMP用DyLight 800NHS酯(生命技术公司(Life Technologies)，#46421)共价膜染料(DyL800)标记。简而言之，将Dyl800溶解在DMSO中至最终浓度10mg/ml，将200μl PMP与5μl染料混合，在振荡器上在室温下孵育1h，并且通过在4℃下以100,000x g超速离心1h将标记的PMP洗涤2-3次，并且将沉淀物用1.5ml超纯水重悬。为了控制潜在染料聚集体的存在，根据相同的步骤制备仅染料的对照样品，添加200μl超纯水代替PMP。将最终DyL800标记的PMP沉淀物和仅DyL800染料的对照重悬于最少量的超纯水中，并且通过NanoFCM进行表征。葡萄柚DyL800标记的PMP的最终浓度为4.44x1012PMP/ml，并且柠檬DyL800标记的PMP的最终浓度为5.18x1012PMP/ml。使用NanoFCM无法确定标记效率，因为它无法检测红外。
b)拟南芥幼苗的萌发和生长
从ABRC获得野生型拟南芥Col-0种子并且用70％乙醇进行表面灭菌，与50％漂白剂/0.1％triton X-100一起孵育10分钟，并且进行4次无菌ddH2O洗涤以除去漂白剂溶液。将种子在黑暗中在4℃下分层1d。每100cm2板(预先涂覆有在水中的0.5％胎牛血清)(含有20mL 0.5x MS培养基(2.15g/L Murashige和Skoog盐、1％蔗糖，pH 5.8)萌发大约250个种子，用3M手术胶带密封，并且在培养箱中以在23℃下16h光照/在21℃下8h黑暗的光周期生长。
c)拟南芥和苜蓿对的DyL800标记的葡萄柚、柠檬和AtPMP摄取
为了评价PMP是否可以在植物体内被内吸地吸收和运送，使拟南芥属幼苗在网过滤器的顶部上的如实例27b中描述的液体培养物中萌发，以允许根穿过网生长，并且允许At幼苗部分暴露于PMP溶液。从当地超市获得苜蓿芽。通过分别在23℃下部分根暴露(At幼苗在漂浮在PMP溶液中的网中、或苜蓿芽部分根暴露在1.5ml Eppendorf管中)22或24小时，将9日龄拟南芥属幼苗和苜蓿芽用0.5ml水(阴性对照)、仅DyL800染料(染料对照)DyL800标记的葡萄柚PMP(1.6x1010PMP/ml)、或柠檬(5.1x1010PMP/ml)PMP在0.5X MS培养基中的溶液处理。然后将植物在MS培养基中洗涤3次，并且使用
Figure GDA0002918049650002001
CLx红外成像仪(Li-Cor)成像。
与阴性对照(苜蓿芽叶中的一些自发荧光)和仅染料的对照相比，在拟南芥属幼苗和苜蓿芽两者中所有PMP源均显示荧光信号(白色为高荧光信号，黑色为无信号)，表明PMP被两种植物吸收(图13)。未暴露于PMP溶液的拟南芥属叶或苜蓿茎区域中荧光信号的存在表明在植物体内PMP的主动转运。由于在此实验中DyL800处理浓度未被归一化，可以评价源/靶摄取效率的差异。
我们的数据表明，源自各种植物源的PMP可以在植物体中吸收和转运。
实例28：用负载DOX的葡萄柚PMP处理拟南芥幼苗
此实例证实了PMP负载小分子的能力，目的是降低植物的适应度。在此实例中，阿霉素用作模型小分子，并且拟南芥用作模型植物。从波赛链霉菌青灰变种(Streptomycespeucetius var.caesius)的培养物分离阿霉素是细胞毒性蒽环抗生素。阿霉素通过插入与DNA相互作用，并且抑制DNA复制和RNA转录两者。已显示阿霉素在植物中具有细胞毒性(Culiarez-Mac等人,Plant Growth Regulation[植物生长调节],(5):155-164,1987。
有效且安全的除草剂对于防止因杂草引起的主要作物产率损失同时保护环境免受除草剂过度使用的毒性副作用而言是必须的。
a)用负载阿霉素的PMP处理拟南芥幼苗
生产葡萄柚PMP并且负载阿霉素，如实例24a和24b所描述。从ABRC获得野生型拟南芥Col-0种子，用50％漂白剂进行表面灭菌，在4℃下分层1-3d，并且在含有0.8％琼脂的补充有0.5％蔗糖、2.5mM MES的半强度(0.5x)Murashige和Skoog(MS)培养基(pH 5.6)上以23℃ 16h光照/21℃ 8h黑暗的光周期进行萌发。
为了测试PMP是否可以在植物体内递送小分子货物，将7日龄的拟南芥幼苗转移到在24孔板中的0.5X liquid MS培养基中(1个幼苗/孔)，并且用游离DOX或负载DOX的PMP以0(阴性对照)、25μM、50μM和100μM的包封DOX剂量进行处理。将板用铝箔覆盖并且孵育24小时。除去含有DOX的培养基，将幼苗用1/2X MS培养基洗涤两次，并且添加新鲜的培养基。将幼苗在正常的光周期(23℃ 16h光照/21℃ 8h黑暗)下孵育另外3天。接下来，从板中移出幼苗，并且用毛巾干燥以进行成像，并且通过分析叶活力、叶颜色和根长来评价细胞毒性。当与未处理的幼苗对照相比时，细胞毒性的定义是根缩短、叶活力丧失、和叶变色(黄色而不是绿色)。与仅在100μM DOX下显示出细胞毒性(根缩短和叶变色)的游离DOX相比，负载DOX的PMP在50μM和100μM DOX下具有细胞毒性。50μM PMP-DOX处理的幼苗显示出严重的叶黄化以及叶活力减小和根缩短。我们的数据表明，PMP可以负载有小分子并且可以在植物体内递送小分子，并且负载阿霉素的PMP诱导细胞毒性反应的效率是游离阿霉素的两倍。
其他实施例
本发明的一些实施例在以下编号的段落内。
1.一种有害生物防治组合物，其包含多个植物信使包(PMP)，其中该组合物被配制用于递送至植物，并且其中该组合物包含至少5％PMP。
2.一种有害生物防治组合物，其包含多个PMP，其中该组合物被配制用于递送至植物有害生物，并且其中该组合物包含至少5％PMP。
3.如段落1或2所述的有害生物防治组合物，其中该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。
4.一种有害生物防治组合物，其包含多个PMP，其中该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。
5.如段落4所述的有害生物防治组合物，其中该组合物被配制用于递送至植物。
6.如段落4所述的有害生物防治组合物，其中该组合物被配制用于递送至植物有害生物。
7.如段落1-6中任一项所述的有害生物防治组合物，其中这些PMP稳定至少24小时、48小时、7天、或30天。
8.如段落7所述的有害生物防治组合物，其中这些PMP在至少24℃、20℃、或4℃的温度下稳定。
9.如段落1-8中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该组合物中的多个PMP的浓度有效降低植物有害生物的适应度。
10.一种有害生物防治组合物，其包含多个PMP，并且其中该组合物中的多个PMP的浓度有效降低植物有害生物的适应度。
11.如段落10所述的有害生物防治组合物，其中该组合物被配制用于递送至植物。
12.如段落10所述的有害生物防治组合物，其中该组合物被配制用于递送至植物有害生物。
13.如段落10-12中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。
14.如段落9-13中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该PMP包含多种PMP蛋白，并且PMP的浓度是其中的PMP蛋白的浓度。
15.如段落9-14中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该组合物中的多个PMP的浓度是至少0.01ng、0.1ng、1ng、2ng、3ng、4ng、5ng、10ng、50ng、100ng、250ng、500ng、750ng、1μg、10μg、50μg、100μg、或250μg PMP蛋白/ml。
16.如段落1-15中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该多个PMP中的每一个包含纯化的植物细胞外囊泡(EV)、或其节段或提取物。
17.一种有害生物防治组合物，其包含多个PMP，其中这些PMP中的每一个是植物EV、或其节段或提取物，并且其中该组合物被配制用于递送至植物。
18.一种有害生物防治组合物，其包含多个PMP，其中该PMP是植物EV、或其节段或提取物，并且其中该组合物被配制用于递送至有害生物。
19.如段落17或18所述的有害生物防治组合物，其中该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。
20.如段落17-19中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该组合物中的多个PMP的浓度有效降低植物有害生物的适应度。
21.如段落16-20中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该植物EV是经修饰的植物细胞外囊泡(EV)。
22.如段落21所述的有害生物防治组合物，其中该分离的植物EV是植物外泌体或植物微囊泡。
23.如段落1-22中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该多个PMP进一步包含有害生物驱避剂。
24.一种有害生物防治组合物，其包含多个PMP，其中该多个PMP中的每一个包含异源杀有害生物剂，并且其中该组合物被配制用于递送至植物或植物有害生物。
25.如段落1所述的有害生物防治组合物，其中该异源杀有害生物剂是除草剂、抗细菌剂、抗真菌剂、杀昆虫剂、杀软体动物剂、或杀线虫剂。
26.如段落2所述的有害生物防治组合物，其中该除草剂是阿霉素。
27.如段落2所述的有害生物防治组合物，其中该除草剂是草铵膦、草甘膦、喔草酯、苯嗪草酮、吡草胺、二甲戊乐灵、氟噻草胺、吡氟酰草胺、异噁草酮、烟嘧磺隆、硝磺草酮、唑啉草酯、磺草酮、苄草丹、甲磺草胺、治草醚、喹草酸、野麦畏、特丁津、莠去津、乙氧氟草醚、敌草隆、氟乐灵、或绿麦隆。
28.如段落2所述的有害生物防治组合物，其中该抗细菌剂是阿霉素。
29.如段落2所述的有害生物防治组合物，其中该抗细菌剂是抗生素。
30.如段落6所述的有害生物防治组合物，其中该抗生素是万古霉素。
31.如段落6所述的有害生物防治组合物，其中该抗生素是青霉素、头孢菌素、四环素、大环内酯、磺胺、万古霉素、多粘菌素、短杆菌肽、氯霉素、克林霉素、大观霉素、环丙沙星、异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇(ethambutol)、乙胺丁醇(myambutol)、或链霉素。
32.如段落2所述的有害生物防治组合物，其中该抗真菌剂是嘧菌酯、代森锰、丙硫菌唑、灭菌丹、戊唑醇、苯醚甲环唑、克菌丹、乙嘧酚磺酸酯、或乙膦酸-Al。
33.如段落2所述的有害生物防治组合物，其中该杀昆虫剂是氯化烟酰、新烟碱、氨基甲酸酯、有机磷酸酯、拟除虫菊酯、噁二嗪、多杀菌素、环二烯、有机氯、苯基吡唑、菌素、双酰肼、苯甲酰脲、有机锡、吡咯、二硝基萜烯醇、METI、特窗酸、特特拉姆酸、或邻苯二甲酰胺。
34.如段落1所述的有害生物防治组合物，其中该异源杀有害生物剂是小分子、核酸、或多肽。
35.如段落11所述的有害生物防治组合物，其中该小分子是抗生素或次生代谢物。
36.如段落11所述的有害生物防治组合物，其中该核酸是抑制性RNA。
37.如段落1-13中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该异源杀有害生物剂被该多个PMP中的每一个包封。
38.如段落1-13中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该异源杀有害生物剂包埋在该多个PMP中的每一个的表面上。
39.如段落1-13中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该异源杀有害生物剂与该多个PMP中的每一个的表面缀合。
40.如段落1-16中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该多个PMP中的每一个进一步包含有害生物驱避剂。
41.如段落1-17中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该多个PMP中的每一个进一步包含另外的异源杀有害生物剂。
42.如段落1-18中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该植物有害生物是细菌或真菌。
43.如段落19所述的有害生物防治组合物，其中该细菌是假单胞菌属(Pseudomonas)物种。
44.如段落20所述的有害生物防治组合物，其中该假单胞菌属物种是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。
45.如段落19所述的方法，其中该真菌是核盘霉属(Sclerotinia)物种、葡萄孢属(Botrytis)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰孢属(Fusarium)物种、或青霉属(Penicillium)物种。
46.如段落1-28中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该植物有害生物是昆虫、软体动物、或线虫。
47.如段落23所述的有害生物防治组合物，其中该昆虫是蚜虫或鳞翅目昆虫。
48.如段落23所述的有害生物防治组合物，其中该线虫是玉米根结线虫。
49.如段落1-25中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该组合物在室温下稳定至少一天和/或在4℃下稳定至少一周。
50.如段落1-25中任一项所述的有害生物防治组合物，其中这些PMP在4℃下稳定至少24小时、48小时、7天、或30天。
51.如段落27所述的有害生物防治组合物，其中这些PMP在至少20℃、24℃、或37℃的温度下稳定。
52.如段落1-28中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该组合物中的多个PMP的浓度有效降低植物有害生物的适应度。
53.如段落1-29中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该组合物中的多个PMP的浓度是至少0.01ng、0.1ng、1ng、2ng、3ng、4ng、5ng、10ng、50ng、100ng、250ng、500ng、750ng、1μg、10μg、50μg、100μg、或250μg PMP蛋白/mL。
54.如段落1-30中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该组合物包含农业上可接受的载体。
55.如段落1-31中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该组合物被配制成稳定这些PMP。
56.如段落1-32中任一项所述的有害生物防治组合物，其中该组合物被配制成液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
57.如段落1所述的有害生物防治组合物，其中该组合物包含至少5％PMP。
58.一种有害生物防治组合物，其包含多个PMP，其中通过包括以下步骤的方法从植物中分离这些PMP：(a)提供来自植物或其一部分的初始样品，其中该植物或其一部分包含EV；(b)从该初始样品中分离出粗PMP级分，其中相对于在该初始样品中的水平，该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；(c)纯化该粗PMP级分，从而产生多个纯PMP，其中相对于在该粗EV级分中的水平，该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分；(d)向该多个纯PMP负载有害生物防治剂；以及(e)将步骤(d)的这些PMP配制用于递送至植物或植物有害生物。
59.一种植物，其包含如段落1-35中任一项所述的有害生物防治组合物。
60.一种植物有害生物，其包含如段落1-35中任一项所述的有害生物防治组合物。
61.一种将有害生物防治组合物递送至植物的方法，其包括使该植物与如段落1-35中任一项所述的组合物接触。
62.一种增加植物的适应度的方法，该方法包括向该植物递送如段落1-35中任一项所述的组合物，其中相对于未处理的植物，该方法增加该植物的适应度。
63.如段落38或39所述的方法，其中该植物具有由植物有害生物导致的侵染。
64.如段落40所述的方法，其中相对于未处理的植物中的侵染，该方法降低该侵染。
65.如段落40所述的方法，其中相对于未处理的植物中的侵染，该方法显著消除该侵染。
66.如段落38或39所述的方法，其中该植物易受由植物有害生物导致的侵染的影响。
67.如段落43所述的方法，其中相对于未处理的植物中侵染的可能性，该方法降低该植物中侵染的可能性。
68.如段落40-44中任一项所述的方法，其中该植物有害生物是细菌或真菌。
69.如段落45所述的方法，其中该细菌是假单胞菌属物种。
70.如段落45所述的方法，其中该真菌是核盘霉属(Sclerotinia)物种、葡萄孢属(Botrytis)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰孢属(Fusarium)物种、或青霉属(Penicillium)物种。
71.如段落40-44中任一项所述的方法，其中该植物有害生物是昆虫、软体动物、或线虫。
72.如段落48所述的方法，其中该昆虫是蚜虫或鳞翅目昆虫。
73.如段落48所述的方法，其中该线虫是玉米根结线虫。
74.如段落38-50中任一项所述的方法，其中将该有害生物防治组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送。
75.一种将有害生物防治组合物递送至植物有害生物的方法，其包括使该植物有害生物与如段落1-36中任一项所述的组合物接触。
76.一种降低植物有害生物的适应度的方法，该方法包括向该植物有害生物递送如段落1-36中任一项所述的组合物，其中相对于未处理的植物，该方法降低该植物有害生物的适应度。
77.如段落52或53所述的方法，其中该方法包括将该组合物递送至其中该植物有害生物生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境。
78.如段落52-54中任一项所述的方法，其中将该组合物作为植物有害生物可食用组合物递送，以被该植物有害生物摄食。
79.如段落52-55中任一项所述的方法，其中该植物有害生物是细菌或真菌。
80.如段落52-55中任一项所述的方法，其中该植物有害生物是昆虫、软体动物、或线虫。
81.如段落57所述的方法，其中该昆虫是蚜虫或鳞翅目昆虫。
82.如段落57所述的方法，其中该线虫是玉米根结线虫。
83.如段落52-59中任一项所述的方法，其中将该组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送。
84.一种处理具有真菌感染的植物的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物。
85.一种处理具有真菌感染的植物的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物，并且其中该多个PMP中的每一个包含抗真菌剂。
86.如段落62所述的方法，其中该抗真菌剂是核酸，该核酸抑制引起该真菌感染的真菌中基因的表达。
87.如段落63所述的方法，其中该基因是dcl1和/或dcl2。
88.如段落61-64中任一项所述的方法，其中该真菌感染是由真菌引起的，该真菌属于核盘霉属物种、葡萄孢属物种、曲霉属物种、镰孢属物种、或青霉属物种。
89.如段落65所述的方法，其中该核盘霉属物种是核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)。
90.如段落65所述的方法，其中该葡萄孢属物种是灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)。
91.如段落61-67中任一项所述的方法，其中该组合物包含源自拟南芥属(Arabidopsis)的PMP。
92.如段落61-68中任一项所述的方法，其中该方法降低或显著消除该真菌感染。
93.一种处理具有细菌感染的植物的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物。
94.一种处理具有细菌感染的植物的方法，其中该方法包括向该植物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物，并且其中该多个PMP中的每一个包含抗细菌剂。
95.如段落71所述的方法，其中该抗细菌剂是阿霉素。
96.如段落70-72中任一项所述的方法，其中该细菌感染是由细菌引起的，该细菌属于假单胞菌属物种。
97.如段落73所述的方法，其中该假单胞菌属物种是丁香假单胞菌。
98.如段落70-74中任一项所述的方法，其中该组合物包含源自拟南芥属(Arabidopsis)的PMP。
99.如段落70-75中任一项所述的方法，其中该方法降低或显著消除该细菌感染。
100.一种降低昆虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该昆虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物。
101.一种降低昆虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该昆虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物，并且其中该多个PMP中的每一个包含杀昆虫剂。
102.如段落78所述的方法，其中该杀昆虫剂是肽核酸。
103.如段落77-79中任一项所述的方法，其中该昆虫植物有害生物是蚜虫。
104.如段落77-79中任一项所述的方法，其中该昆虫植物有害生物是鳞翅目昆虫。
105.如段落81所述的方法，其中该鳞翅目昆虫是草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)。
106.如段落77-82中任一项所述的方法，其中相对于未处理的昆虫植物有害生物，该方法降低该昆虫植物有害生物的适应度。
107.一种降低线虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该线虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物。
108.一种降低线虫植物有害生物的适应度的方法，其中该方法包括向该线虫植物有害生物递送包含多个PMP的有害生物防治组合物，并且其中该多个PMP中的每一个包含杀线虫剂。
109.如段落85所述的方法，其中该杀线虫剂是肽。
110.如段落86所述的方法，其中该肽是Mi-NLP-15b。
111.如段落84-88中任一项所述的方法，其中该线虫植物有害生物是玉米根结线虫。
112.如段落84-88中任一项所述的方法，其中相对于未处理的线虫植物有害生物，该方法降低该线虫植物有害生物的适应度。
113.一种降低杂草的适应度的方法，其中该方法包括向该杂草递送包含多个PMP的有害生物防治组合物。
114.一种降低杂草的适应度的方法，其中该方法包括向该杂草递送包含多个PMP的有害生物防治组合物，并且其中该多个PMP中的每一个包含除草剂。
115.如段落90或91所述的方法，其中相对于未处理的杂草，该方法降低该杂草的适应度。
尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实例稍详细地描述了前述发明，但是描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。将本文引用的所有专利和科学文献的披露都明确地通过引用以其全文并入。
其他实施例在权利要求中。
附录
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Claims (13)

1.一种将有害生物防治组合物递送至植物的方法，其包括使该植物与组合物接触，该组合物包含：
a)农业上可接受的载体；以及
b)从植物或植物部分分泌的多个植物信使包PMP，其中该多个PMP包含阿霉素，
其中该有害生物是假单胞菌属物种，该假单胞菌属物种是铜绿假单胞菌或丁香假单胞菌。
2.如权利要求1所述的方法，其中该植物具有由植物有害生物导致的侵染。
3.如权利要求2所述的方法，其中相对于未处理的植物中的侵染，该方法降低该侵染。
4.如权利要求2所述的方法，其中相对于未处理的植物中的侵染，该方法显著消除该侵染。
5.如权利要求1所述的方法，其中该植物易受由植物有害生物导致的侵染的影响。
6.如权利要求5所述的方法，其中相对于未处理的植物中侵染的可能性，该方法降低该植物中侵染的可能性。
7.如权利要求1所述的方法，其中将该有害生物防治组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送。
8.一种将有害生物防治组合物递送至植物有害生物的方法，其包括使该植物有害生物与组合物接触，该组合物包含：
a)农业上可接受的载体；以及
b)从植物或植物部分分泌的多个植物信使包PMP，其中该多个PMP包含阿霉素，
其中该植物有害生物是假单胞菌属物种，该假单胞菌属物种是铜绿假单胞菌或丁香假单胞菌。
9.如权利要求8所述的方法，其中该方法包括将该组合物递送至其中该植物有害生物生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境。
10.如权利要求8所述的方法，其中将该组合物作为植物有害生物可食用组合物递送，以被该植物有害生物摄食。
11.如权利要求8所述的方法，其中将该组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送。
12.一种降低植物有害生物的适应度的方法，该方法包括向该植物有害生物递送有害生物防治组合物，该有害生物防治组合物包含：
a)农业上可接受的载体；以及
b)从植物或植物部分分泌的多个植物信使包PMP，其中该多个PMP包含阿霉素，以及其中相对于未处理的植物有害生物，该方法降低该植物有害生物的适应度，
其中该植物有害生物是假单胞菌属物种，该假单胞菌属物种是铜绿假单胞菌或丁香假单胞菌。
13.一种将有害生物防治组合物递送至植物的方法，其包括使该植物与包含阿霉素的多个植物信使包PMP接触，
其中该有害生物是假单胞菌属物种，该假单胞菌属物种是铜绿假单胞菌或丁香假单胞菌。
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