CN112390741B - 含氮双环丁烷衍生物及其制备方法和抗肿瘤活性 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含氮双环丁烷衍生物及其制备方法和抗肿瘤活性，属于环丁烷骨架化合物合成技术领域，所述含氮双环丁烷衍生物是由含双烯烃配体S‑1,3‑bpeb与金属原子镉形成配位聚合物[Cd2(S‑1,3‑bpeb)2(OCA)4]n，再经由[2+2]光环加成反应得到。本发明还提供了配体、含氮双环丁烷衍生物的制备方法。本发明还发现当配体为4‑甲基‑1,3‑二(4‑乙烯基吡啶)苯(4‑CH3‑1,3‑bpeb)时，合成的含氮双环丁烷衍生物(结构式Ⅱ)对Hela细胞、HepG‑2细胞、T‑24细胞、7402细胞、MGC80‑3细胞具较高的抑制性。本发明解决了原有合成此类双环丁烷衍生物条件复杂，产率低，结构不稳定的状况。此外还具有生产工艺简单，能量消耗低，绿色环保等优良性质。
Description
技术领域
本发明涉及环丁烷骨架化合物合成技术领域，具体涉及构建一种新的含氮双环丁烷衍生物及其制备方法和抗肿瘤活性。
背景技术
多氮环丁烷衍生物因其在抗菌、抗肿瘤等方面表现出良好的生物活性和药用价值，因此被广泛作为各类药物分子中的基本骨架，特别是目前一段时间多氮环丁烷越来越被广泛地使用在生物碱、氨基酸及其非天然和天然药物活性或生物活性等合成领域。特别是有研究表明具有相同取代基结构中含有环丁烷结构的生物活性比不含环丁烷结构的生物活性要好很多。由此看来，研究多氮环丁烷骨架的合成在天然药物和非天然药物的全合成中将会发挥巨大的作用。
目前，多氮环丁烷骨架在药物领域的合成方法采用的合成方式主要可以分为两大类。一类是在现有环丁烷的基础上通过化学方法引入一些官能团进行修饰。另一类是在利用非环状材料加以环化，生成多取代环丁烷衍生物。其中，光环加成[2+2]基于烯烃之间的环加成构建环丁烷骨架在天然产物的合成中应用最多也是最绿色的合成手段。
公布号为CN 109705027 A的中国发明专利公开了1，2-二(吡啶基)-3，4-二(4-吡啶乙烯基-3-氟苯)环丁烷及其制备方法，是利用光化学反应得到一种单环丁烷结构，且具有荧光效果。然而，溶液中的[2+2]光环加成反应由于自由基聚合或者交叉偶联作用，容易出现同分异构现象或者很难发生环化反应，副产物多而且效率低等问题。
对于双环丁烷衍生物的合成，原有合成此类双环丁烷衍生物条件复杂，产率低，结构不稳定，且易产生同分异构体，化合物的同分异构体会产生很多意想不到的性质差异，比如不同的构型可能会产生不同的生物活性。因此，现需研究一种新方法以形成稳定的双环丁烷结构。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种含氮双环丁烷衍生物及其制备方法和抗肿瘤活性，利用金属镉与含双烯烃配体共同形成配位聚合物，进而合成含氮双环丁烷衍生物，制备工艺简单、且产率高；得到的含氮双环丁烷衍生物结构稳定，还具有抗癌活性，在抗菌、抗肿瘤等方面表现出良好的生物活性和药用价值。
一种含氮双环丁烷衍生物，其化学结构通式为如式(Ⅰ)：
(Ⅰ)
其中，R为-CH3。式(Ⅰ)中R的位置均可选在苯环的不同位置上，R的数量不低于1。
进一步地，所述含氮双环丁烷衍生物的化学结构式为:
本发明提供所述含氮双环丁烷衍生物的制备方法，所述含氮双环丁烷衍生物是由中心离子Cd2+、含双烯烃配体S-1,3-bpeb吡啶上质子化的氮离子和含有取代基的苯甲酸HOCA上的 COO-离子相互连接，三者形成一维配位聚合物[Cd2(S-1,3-bpeb)2(OCA)4]n，再经由[2+2]光环加成反应得到含氮双环丁烷衍生物。
进一步地，所述S-1,3-bpeb为二-(4-乙烯基吡啶)苯衍生物；其化学结构通式如式(Ⅴ)：
(Ⅴ)
其中，R为-CH3。如图5所示，式(Ⅴ)中R的位置均可选在苯环的不同位置上，R的数量不低于1。
优选地，所述S-1,3-bpeb为4-CH3-1,3-bpeb、2-CH3-1,3-bpeb或4,6-CH3-1,3-bpeb。化学结构式依次如图8-图10所示。
进一步地，所述S-1,3-bpeb是由双溴代苯衍生物与4-乙烯基吡啶在N’N-二甲基甲酰胺溶剂中加入催化剂，经heck偶联反应后分离提纯得到；所述双溴代苯衍生物的化学结构通式如式(Ⅵ)：
进一步地，所述催化剂为钯催化剂。
进一步地，所述S-1,3-bpeb的制备方法是：利用heck反应的原理，将双溴代苯衍生物与 4-乙烯基吡啶在钯催化剂下，在无水碳酸钾、N’N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，于92-95℃油浴下进行亲核取代反应2.5-3小时，即生成目标产物；反应停止后，用水稀释目标产物，稀释后二氯甲烷萃取，合并有机层，用无水硫酸钠进行干燥，真空蒸发溶剂得固体粉末即为S-1,3-bpeb。
进一步地，所述HOCA的化学结构通式为式(Ⅶ)：
优选地，所述HOCA为对氟苯甲酸(4-F)、对氯苯甲酸(4-Cl)、对溴苯甲酸(4-Br)、间氟苯甲酸(3-F)、间氯苯甲酸(3-Cl)、间溴苯甲酸(3-Br)、3,5-二甲基苯甲酸(3,5-CH3)、 3,5-二氟苯甲酸(3,5-F)、3,5-二溴苯甲酸(3,5-Br)任一种。
优选地，所述配位聚合物为[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(4-F)4]n、[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(4-Cl)4]n、 [Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(4-Br)4]n、[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(3-F)4]n、[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(3-Cl)4]n、 [Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-CH3)4]n、[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-Br)4]n、 [Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-F)4]n、[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(4-F)4]n、[Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(4-Cl)4]n、[Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(4-Br)4]n、 [Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(3-F)4]n、[Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(3-Cl)4]n、 [Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-F)4]n、[Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-CH3)4]n、 [Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-Br)4]n、[Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(4-Cl)4]n、 [Cd2(4-CH3-1,3-bpeb)2(4-F)4]n、[Cd2(4-CH3-1,3-bpeb)2(4-Br)4]n、[Cd2(4-CH3-1,3-bpeb)2(3-Cl)4]n、 [Cd2(4-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-F)4]n、[Cd2(4-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-Br)4]n、 [Cd2(4-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-CH3)4]n任一种。
所述含氮双环丁烷衍生物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将镉盐、S-1,3-bpeb和HOCA放置于装有混合溶剂的玻璃耐压管中，加入浓硝酸调节pH至5～7后密闭反应，将所得物质冷却、洗涤、干燥，即得到配位聚合物；
(2)将所述配位聚合物置于光源下光照8h～15h，得到光照后物质；
(3)将光照后物质经分解、萃取、除水后，即得含氮双环丁烷衍生物。
进一步地，步骤(1)所述混合溶剂是N,N’-二甲基甲酰胺、甲醇、乙腈中任一种与水的混合物；所述镉盐为3CdSO4·8H2O、Cd(NO3)2·4H2O、CdCl2·H2O、Cd(CH3COO)2·3H2O任一种；所述S-1,3-bpeb、镉盐、HOCA的摩尔比为0.20～0.25：0.30～0.4：0.75～0.9；所述反应是在温度120～140℃下反应10～12h。
进一步地，步骤(2)所述光照是于波长245nm～420nm、功率为300W～500W的汞灯下光照处理。
进一步地，步骤(3)所述分解是于3.5～4mol/L的NaOH或KOH溶液中常温搅拌25-30min；所述萃取是用二氯甲烷进行萃取；所述含氮双环丁烷衍生物的产率为88％～99％。
本发明提供所述含氮双环丁烷衍生物的抗肿瘤活性，所述含氮双环丁烷衍生物a化学结构式如式(Ⅱ)时，其对Hela细胞、HepG-2细胞、T-24细胞、7402细胞、MGC80-3细胞具较高的抑制性，可应用于制备治疗肿瘤疾病的药物制剂。
本发明提供一种抗肿瘤药物组合物，所述药物组合物的活性成分为式(Ⅱ)所述含氮双环丁烷衍生物，所述药物组合物还包括药物上可接受的辅料。药物组合物通过调整辅料可制作成溶液、悬浮液、片剂、胶囊、粉末、颗粒或糖浆。式(Ⅱ)所述含氮双环丁烷衍生物作为活性成分的有效施用剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。
本发明所用原料：双溴代苯衍生物、4-乙烯基吡啶、钯催化剂、无水碳酸钾、N,N’-二甲基甲酰胺、甲醇、乙腈、二氯甲烷、3CdSO4·8H2O、Cd(NO3)2·4H2O、CdCl2·H2O、Cd(CH3COO)2·3H2O、HOCA、浓硝酸，均来自国内外化学原料公司，可直接利用。
本发明的原理：
本发明通过固相光催化反应与晶体工程的手段相结合，利用晶体工程手段由含双烯烃配体S-1,3-bpeb与金属原子镉形成配位聚合物，通过配位聚合物合成含氮双环丁烷衍生物，通过配位键使C＝C双键平行排列，并控制它们之间的距离，极大的提高区位选择性、立体选择性、产率，同时还不需要催化剂的特点，符合绿色化学的理念。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明利用金属镉与含双烯烃配体共同形成配位聚合物，进而合成含氮双环丁烷衍生物，制备工艺简单、且产率高；得到的含氮双环丁烷衍生物结构稳定，还具有抗癌活性，在抗菌、抗肿瘤等方面表现出良好的生物活性和药用价值。
2.本发明制备了含有双烯烃配体分子，由双溴代苯衍生物与4-乙烯基吡啶在N’N-二甲基甲酰胺溶剂中加入催化剂，经heck偶联反应后分离提纯得到，为制备具有特定构型的配位聚合物做好了准备。
3.本发明利用含有双烯烃配体分子S-1,3-bpeb合成了一系列具有镉离子的配位聚合物，光照下可以生成含有特定构型的含氮双环丁烷衍生物，并且可以将其提取出来。
4.本发明当含有双烯烃配体分子为4-CH3-1,3-bpeb时，合成的含氮双环丁烷衍生物式 (Ⅱ)，具有良好地生物活性，其对Hela细胞、HepG-2细胞、T-24细胞、7402细胞、MGC80-3 细胞具较高的抑制性，可应用于制备治疗肿瘤疾病的药物制剂。
附图说明
图1为本发明含氮双环丁烷衍生物的化学结构通式(Ⅰ)。
图2为本发明含氮双环丁烷衍生物a的化学结构通式(Ⅱ)。
图3为本发明含氮双环丁烷衍生物b的化学结构通式(Ⅲ)。
图4为本发明含氮双环丁烷衍生物c的化学结构通式(Ⅳ)。
图5为本发明含双烯烃配体S-1,3-bpeb(即，二-(4-乙烯基吡啶)苯衍生物)的化学结构通式(Ⅴ)。
图6为本发明双溴代苯衍生物的化学结构通式(Ⅵ)。
图7为本发明HOCA的化学结构通式(Ⅶ)。
图8为本发明S-1,3-bpeb为4-CH3-1,3-bpeb的化学结构式。
图9为本发明S-1,3-bpeb为2-CH3-1,3-bpeb的化学结构式。
图10为本发明S-1,3-bpeb为4,6-CH3-1,3-bpeb的化学结构式。
图11为本发明S-1,3-bpeb为4-CH3-1,3-bpeb时的1H NMR的图谱。
图12为本发明S-1,3-bpeb为2-CH3-1,3-bpeb时的1H NMR的图谱。
图13为本发明S-1,3-bpeb为4,6-CH3-1,3-bpeb时的1H NMR的图谱。
图14为本发明含氮双环丁烷衍生物a的1H NMR的图谱。
图15为本发明含氮双环丁烷衍生物b的1H NMR的图谱。
图16为本发明含氮双环丁烷衍生物c的1H NMR的图谱。
图17为本发明含氮双环丁烷衍生物a对7402细胞作用24小时后对其细胞中活性氧的影响图。
图18为本发明含氮双环丁烷衍生物a对7402细胞作用24小时后对其细胞凋亡的影响图。
图19为本发明含氮双环丁烷衍生物a对7402细胞作用24小时后对其细胞核皱缩Hoechst 33342染色的影响图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
一、制备含双烯烃配体
实施例1
制备含双烯烃配体4-甲基-1,3-二(4-乙烯基吡啶)苯(即：4-CH3-1,3-bpeb)
反应步骤：(1)利用heck反应的原理，卤代烃与活化不饱和烃在钯催化下，生成反式产物；用2.50g(0.01mol)的2,4-二溴甲苯、2.1g(0.02mol)的4-乙烯基吡啶、0.2g(0.00028mol)的钯催化剂、2.76g(0.02mol)的无水碳酸钾在30ml的DMF溶剂中，于95℃油浴下进行亲核取代反应3小时，即生成目标产物；
(2)反应停止后收集目标产物，用水稀释(300ml)，并用二氯甲烷萃取，合并有机层，用无水硫酸钠进行干燥，真空蒸发溶剂得固体粉末。得到产物的化学结构式如图8所示。
产量：基于2,4-二溴甲苯用量，计算4-CH3-1,3-bpeb的产率为90％。
将所得4-CH3-1,3-bpeb进行核磁共振氢谱图分析(1H NMR)；图11即为4-CH3-1,3-bpeb 的1H NMR的图谱。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.60(m,4H,py-H),7.74(s,1H,Ph-H),7.40(d, 1H,Ph-H),7.37(m,4H,py-H),7.23(d,1H,Ph-H),7.53&7.34&7.02&6.97(d,4H,CH＝CH), 2.47(s,3H,CH3).
实施例2
制备含双烯烃配体2-甲基-1,3-二(4-乙烯基吡啶)苯(即：2-CH3-1,3-bpeb)
反应步骤：(1)利用heck反应的原理，卤代烃与活化不饱和烃在钯催化下，生成反式产物；用2.50g(0.01mol)的2,6-二溴甲苯、2.1g(0.02mol)的4-乙烯基吡啶、0.2g(0.00028mol)的钯催化剂、2.76g(0.02mol)的无水碳酸钾在30ml的DMF溶剂中，于92℃油浴下进行亲核取代反应2.5小时，即生成目标产物；
(2)反应停止后收集目标产物，用水稀释(300ml)，并用二氯甲烷萃取，合并有机层，用无水硫酸钠进行干燥，真空蒸发溶剂得固体粉末。得到产物的化学结构式如图9所示。
产量：基于2,6-二溴甲苯用量，计算2-CH3-1,3-bpeb的产率为95％。
将所得2-CH3-1,3-bpeb进行核磁共振氢谱图分析(1H NMR)；图12即为2-CH3-1,3-bpeb 的1H NMR的图谱。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.60(d,2H,py-H),7.60(d,2H,CH＝CH),7.56 (d,2H,Ph-H),7.38(d,4H,py-H),7.30(d,1H,Ph-H),6.86(d,2H,CH＝CH),2.49(s,3H,CH3)
实施例3
制备含双烯烃配体4,6-甲基-1,3-二(4-乙烯基吡啶)苯(即：4,6-CH3-1,3-bpeb)
反应步骤：(1)利用heck反应的原理，卤代烃与活化不饱和烃在钯催化下，生成反式产物；用2.50g(0.01mol)的1,3-二甲基-4,6-二溴苯、2.1g(0.02mol)的4-乙烯基吡啶、0.2g (0.00028mol)的钯催化剂、2.76g(0.02mol)的无水碳酸钾在30ml的DMF溶剂中，于94℃油浴下进行亲核取代反应2.8小时，即生成目标产物；
(2)反应停止后收集目标产物，用水稀释(300ml)，并用二氯甲烷萃取，加活性炭并加热过滤取二氯甲烷相以除去催化剂等杂质，用无水硫酸钠进行干燥，真空蒸发溶剂得固体粉末。得到产物的化学结构式如图10所示。
产量：基于1,3-二甲基-4,6-二溴苯用量，计算4,6-甲基-CH3-1,3-bpeb的产率为88％。将所得4,6-甲基-CH3-1,3-bpeb进行核磁共振氢谱图分析(1H NMR)；图13即为4,6-甲基 -CH3-1,3-bpeb的1H NMR的图谱。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.59(d,2H,py-H),7.81(s,1H,Ph-H),7.50(d,2H,CH＝CH),7.38(d,4H,py-H),7.05(S,1H,Ph-H),6.94(d,2H,CH＝CH),2.42(s, 6H,CH3).
二、制备配位聚合物
实施例4
配位聚合物为[Cd2(4-CH3-1,3-bpeb)2(4-Cl)4]n的合成
反应步骤：(1)称取3CdSO4·8H2O(280mg，0.36mmol),4-CH3-1,3-bpeb(60mg，0.21mmol)，对氯苯甲酸(4-Cl-benzoic acid)(120mg，0.86mmol)，放置于装有体积比为1:4的N’N- 二甲基甲酰胺和水的混合溶剂的厚壁玻璃耐压管内并加入浓硝酸调节pH至5，在密闭140℃下反应12h。
(2)冷却到室温得淡黄色晶体，用水和乙醇洗涤干净，室温下干燥，即得到配位聚合物。通过计算得到配位聚合物的产率为94％。
实施例5
配位聚合物为[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(4-F)4]n的合成
反应步骤：(1)称取3CdSO4·8H2O(0.4mmol),2-CH3-1,3-bpeb(0.20mmol)，对氟苯甲酸(4-F-benzoic acid)(0.75mmol)，放置于装有体积比为1:4的甲醇和水的混合溶剂的厚壁玻璃耐压管内并加入浓硝酸调节pH至6，在密闭120℃下反应11h。
(2)冷却到室温得淡黄色晶体，用水和乙醇洗涤干净，室温下干燥，即得到配位聚合物。通过计算得到配位聚合物的产率为90％。
实施例6
配位聚合物为[Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(4-Br)4]n的合成
反应步骤：(1)称取3CdSO4·8H2O(0.30mmol),4,6-CH3-1,3-bpeb(0.25mmol)，对溴苯甲酸(4-Br-benzoic acid)(0.9mmol)，放置于装有体积比为1:4的乙腈和水的混合溶剂的厚壁玻璃耐压管内并加入浓硝酸调节pH至7，在密闭130℃下反应11h。
(2)冷却到室温得淡黄色晶体，用水和乙醇洗涤干净，室温下干燥，即得到配位聚合物。通过计算得到配位聚合物的产率为89％。
三、含氮双环丁烷衍生物的合成
实施例7
含氮双环丁烷衍生物a的合成
反应步骤：(1)将实施例4合成的配位聚合物[Cd2(4-CH3-1,3-bpeb)2(4-Cl)4]n称取其0.5g 置于玻璃皿上，将玻璃皿放置在波长300nm、500W的高压汞灯下照射15h；
(2)将步骤(1)照射过的配位聚合物置于30ml 4mol/L的NaOH溶液中常温搅拌0.5h直至完全分解；
(3)将步骤(2)中分解出的环丁烷衍生物用二氯甲烷萃取出，得到纯净的含氮双环丁烷衍生物a。图2为本发明含氮双环丁烷衍生物a的化学结构通式(Ⅱ)。
通过计算得到含氮双环丁烷衍生物a的产率为88％。
将所得含氮双环丁烷衍生物a进行核磁共振氢谱图分析(1H NMR)；图14即为含氮双环丁烷衍生物a的1H NMR的图谱。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.45(m,8H,py-H),7.14&7.05(d,8H,py-H),6.73～6.67(m,4H,Ph-H),6.96(s,2H,Ph-H),4.69(s,8H,C4H8),2.08(s,12H,CH3).
实施例8
含氮双环丁烷衍生物b的合成
反应步骤：(1)将实施例5合成的配位聚合物[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(4-F)4]n称取其0.5g 置于玻璃皿上，将玻璃皿放置在波长420nm、300W的高压汞灯下照射10h；
(2)将步骤(1)照射过的配位聚合物置于30ml 4mol/L的NaOH溶液中常温搅拌25min 直至完全分解；
(3)将步骤(2)中分解出的环丁烷衍生物用二氯甲烷萃取出，得到纯净的含氮双环丁烷衍生物b。图3为本发明含氮双环丁烷衍生物b的化学结构通式(Ⅲ)。
通过计算得到含氮双环丁烷衍生物b的产率为90％。
将所得含氮双环丁烷衍生物b进行核磁共振氢谱图分析(1H NMR)；图15即为含氮双环丁烷衍生物b的1H NMR的图谱。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.45(d,8H,py-H),7.10(d,8H,py-H),6.72(d,4H,Ph-H),6.65(t,2H,Ph-H),4.78&4.47(d,8H,C4H8),2.26(s,6H,CH3).
实施例9
含氮双环丁烷衍生物c的合成
反应步骤：(1)将实施例6合成的配位聚合物[Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(4-Br)4]n称取其 0.5g置于玻璃皿上，将玻璃皿放置在波长245nm、400W的高压汞灯下照射8h；
(2)将步骤(1)照射过的配位聚合物置于30ml 4mol/L的KOH溶液中常温搅拌28min直至完全分解；
(3)将步骤(2)中分解出的环丁烷衍生物用二氯甲烷萃取出，得到纯净的含氮双环丁烷衍生物c。图4为本发明含氮双环丁烷衍生物c的化学结构通式(Ⅳ)。
通过计算得到含氮双环丁烷衍生物c的产率为96％。
将所得含氮双环丁烷衍生物c进行核磁共振氢谱图分析(1H NMR)；图16即为含氮双环丁烷衍生物c的1H NMR的图谱。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.45(d,8H,py-H),7.06(d,8H,py-H),7.25(s,2H,Ph-H),6.51(s,2H,Ph-H),4.69(s,8H,C4H8),2.08(s,12H,CH3).
四、应用验证
对实施例7得到的含氮双环丁烷衍生物a进行如下生物活性检测：
1.抗肿瘤活性测试
采用MTT法对化合物进行了宫颈癌细胞(Hela)，肝癌细胞(HepG-2)，人膀胱移行细胞癌细胞(T-24)，人肝癌体外细胞株(7402)，胃癌细胞(MGC80-3)等肿瘤细胞等五种肿瘤细胞株的体外抗肿瘤活性测试。初筛实验中用含体积分数10％新生牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔4 000～5 000个细胞接种到96孔板，每孔体积190μL，培养12h待细胞贴壁后，每孔分别加入不同浓度的受试含氮双环丁烷衍生物a(分别为1.25、2.5、5、10、20μg/mL)，每个浓度平行设4个复孔，其中助溶剂DMSO终体积分数小于等于1％，每个组也平行设4个复孔，药物作用时间48h。培养结束前4h每孔加入10μL MTT(5g/L PBS)，继续培养4h，生成的蓝色结晶加入DMSO(150μL/孔)，平板震荡器振荡5min，充分溶解结晶物，最后比色以空白调零。用酶标仪以570nm/630nm双波长测定去除本底光吸收值后的吸光度值(OD)，计算出细胞增殖抑制率。抑制率＝(1－样品组OD值/对照组OD值)×100％；Bliss法拟合计算 IC50；所有实验重复3次后取平均值。
所述含氮双环丁烷衍生物a对肿瘤细胞【宫颈癌细胞(Hela)、肝癌细胞(HepG-2)、人膀胱移行细胞癌细胞(T-24)、人肝癌体外细胞株(7402)、胃癌细胞(MGC80-3)】生长的抑制率见表1；对肿瘤细胞及人正常肝细胞株(7702)的IC50值见表2。
表1 20μM浓度下含氮双环丁烷衍生物a对各细胞株的抑制率
由结果可知，含氮双环丁烷衍生物a对上述5种肿瘤细胞株的体外抗肿瘤活性较好。
2.活性氧ROS的检测
取处于对数期人肝癌体外细胞株(7402)用PBS缓冲液洗涤后，用胰蛋白酶消化，1000r/min 离心10min，收集细胞，用血球计数板计数取约2mL细胞悬浮液(约1×106个细胞)，接种于六孔板中后放入细胞培养箱继续培养；待单层细胞贴壁85％左右时，换新的10％新生牛血清的培养液，同时按一定浓度梯度(0μM、8μM、12μM、15μM)分别含氮双环丁烷衍生物a 储备液，摇匀后重新放入细胞培养箱在作用8h，弃掉培养基，加入1：1000稀释好的DCFH-DA，置于细胞培养箱中37℃孵育30min，每隔3～5min颠倒摇匀一次，然后用不含血清的培养基洗涤三次，应用Cytation 5细胞成像微孔板检测仪检测细胞中ROS变化的情况。活性氧自由基ROS在正常的细胞中处于一种平衡、稳定的状态；若细胞受到外界的刺激，其细胞内ROS水平将被打破，ROS增大，对细胞造成损伤，从而引起细胞凋亡。DCFH-DA本身没有荧光，能穿过细胞膜进入细胞，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成DCFH，而DCFH 不能穿过细胞膜，DCFH进一步被细胞内的活性氧氧化成发绿色荧光的DCF，所以可以通过 DCF的荧光强度来反映细胞内的活性氧水平。
图17为本发明含氮双环丁烷衍生物a对7402细胞作用24小时后对其细胞中活性氧的影响图。实验结果表明含氮双环丁烷衍生物a能升高7402细胞内的活性氧水平。如图17所示，不同浓度的含氮双环丁烷衍生物a对7402细胞作用24h后，经Cytation 5细胞成像微孔板检测仪检测，与空白对照组7402细胞(图15中-control)相比较，加药组的细胞显现出明显的绿色荧光，且含氮双环丁烷衍生物a浓度越大，绿光荧光越明显，实验结果表明含氮双环丁烷衍生物a诱导7402细胞中活性氧增加，进而引起细胞凋亡。
3.AO/EB染色检测凋亡
取处于对数期人肝癌体外细胞株(7402)用PBS缓冲液洗涤后，用胰蛋白酶消化，1000r/min 离心10min，收集细胞，用血球计数板计数取约2mL细胞悬浮液(约1×106个细胞)，接种于共聚焦小皿后放入细胞培养箱继续培养；待单层细胞贴壁长至85％左右时，换新的10％新生牛血清的培养液，同时按一定浓度梯度(0μM、4μM、8μM)分别加入含氮双环丁烷衍生物a 储备液，摇匀后重新放入细胞培养箱在作用24h，弃去培养液，PBS洗涤三次，滴加100μg/mL的丫碇橙(AO)和溴乙啶(EB)染色液，37℃染色30min，弃去染色液，PBS洗涤三次，分别在第0h、12h、24h时，于荧光显微镜下观察、拍照记录。
图18为本发明含氮双环丁烷衍生物a对7402细胞作用24小时后对其细胞凋亡的影响图。如图18所示，随着含氮双环丁烷衍生物a浓度的增加，7402细胞凋亡数目增多，细胞体积变小，染色细胞颜色加深，这是细胞凋亡的特征。说明含氮双环丁烷衍生物a能高效率地诱导7402细胞的凋亡。
4.Hoechst 33342染色检测凋亡
取处于对数期人肝癌体外细胞株(7402)用PBS缓冲液洗涤后，用胰蛋白酶消化，1000r/min 离心10min，收集细胞，用血球计数板计数取约2mL细胞悬浮液(约1×106个细胞)，接种于共聚焦小皿后放入细胞培养箱继续培养；待单层细胞贴壁长至85％左右时，换新的10％新生牛血清的培养液，同时按一定浓度梯度(0μM、4μM、8μM)分别加入含氮双环丁烷衍生物a，进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行Hoechst 33342染色。对贴壁细胞加入少量Hoechst 33342染色液，覆盖住样品。室温放置5～8min。轻轻吸除Hoechst33342染色液。用无菌的PBS或生理盐水清洗2～3次，每次3～5min。直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。
图19为本发明含氮双环丁烷衍生物a对7402细胞作用24小时后对其细胞核皱缩Hoechst 33342染色的影响图。如图19所示，随着含氮双环丁烷衍生物a浓度的增加，7402细胞凋亡数目增多，细胞体积变小，染色加深，这是细胞凋亡的特征。说明含氮双环丁烷衍生物a能高效率地诱导7402细胞的凋亡。
5.Ca2+离子释放的检测
取处于对数期人肝癌体外细胞株(7402)用PBS缓冲液洗涤后，用胰蛋白酶消化，1000r/min 离心10min，收集细胞，用血球计数板计数取约2mL细胞悬浮液(约1×106个细胞)，接种于六孔板中后放入细胞培养箱继续培养；待单层细胞贴壁85％左右时，换新的10％新生牛血清的培养液，同时按一定浓度梯度(0μM、8μM、12μM)的含氮双环丁烷衍生物a储备液，摇匀后重新放入细胞培养箱在作用24h，弃掉培养基，加入1：2000稀释好的Fluo-3AM，置于细胞培养箱中37℃孵育30min，每隔3～5min颠倒摇匀一次，然后用不含血清的培养基洗涤三次，应用Cytation 5细胞成像微孔板检测仪检测细胞中Ca2+离子变化的情况。Fluo-3AM是一种用于检测细胞内钙离子的荧光探针，其自身荧光强度非常弱，但其可以穿透细胞膜，当 Fluo-3AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，Fluo-3可以和细胞内钙离子结合而产生较强的荧光，且荧光强度随着钙离子浓度的升高而不断增强。
不同浓度的含氮双环丁烷衍生物a对7402细胞作用24h后，与空白组相比较，加药组中Fluo-3AM与细胞中的Ca2+离子结合荧光强度明显增强，含氮双环丁烷衍生物a浓度越大，荧光越明显，说明含氮双环丁烷衍生物a可使7402细胞中Ca2+离子大量释放，从而导致细胞凋亡。
实施例10
配位聚合物[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(3-F)4]n的制备方法:与实施例5的区别在于：以等摩尔的间氟苯甲酸(3-F)代替对氟苯甲酸。
实施例11
配位聚合物[Cd2(4-CH3-1,3-bpeb)2(3-Cl)4]n的制备方法:与实施例4的区别在于：以等摩尔的间氯苯甲酸(3-Cl)代替对氯苯甲酸。
实施例12
配位聚合物[Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-Br)4]n的制备方法:与实施例6的区别在于：以等摩尔的间溴苯甲酸(3-Br)代替对溴苯甲酸。
实施例13
配位聚合物[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-CH3)4]n的制备方法:与实施例5的区别在于：以等摩尔的3,5-二甲基苯甲酸(3,5-CH3)代替对氟苯甲酸。
实施例14
配位聚合物[Cd2(4,6-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-F)4]n的制备方法:与实施例6的区别在于：以等摩尔的3,5-二氟苯甲酸(3,5-F)代替对溴苯甲酸。
实施例15
配位聚合物[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-Br)4]n的制备方法:与实施例5的区别在于：以等摩尔的3,5-二溴苯甲酸(3,5-Br)代替对氟苯甲酸。
实施例16
配位聚合物[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-Br)4]n的制备方法:与实施例5的区别在于：以等摩尔的Cd(NO3)2·4H2O代替3CdSO4·8H2O。
实施例17
配位聚合物[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-Br)4]n的制备方法:与实施例4的区别在于：以等摩尔的CdCl2·H2O代替3CdSO4·8H2O。
实施例18
配位聚合物[Cd2(2-CH3-1,3-bpeb)2(3,5-Br)4]n的制备方法:与实施例6的区别在于：以等摩尔的Cd(CH3COO)2·3H2O代替3CdSO4·8H2O。
实施例19
一种抗肿瘤药物组合物，所述药物组合物是将实施例7所述含氮双环丁烷衍生物与药物上可接受的辅料制成片剂。
实施例20
一种抗肿瘤药物组合物，所述药物组合物是将实施例7所述含氮双环丁烷衍生物与药物上可接受的辅料制成胶囊。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种含氮双环丁烷衍生物，其特征在于，其化学结构通式为如式(Ⅰ)：
(Ⅰ)
其中，R为-CH3。
2.根据权利要求1所述含氮双环丁烷衍生物，其特征在于，其化学结构式为:
(Ⅱ)
(Ⅲ)
(Ⅳ)
3.一种如权利要求1或2所述含氮双环丁烷衍生物的制备方法，其特征在于，所述含氮双环丁烷衍生物是由中心离子Cd2+、含双烯烃配体S-1,3-bpeb吡啶上质子化的氮离子和含有取代基的苯甲酸HOCA上的COO-离子相互连接，三者形成一维配位聚合物[Cd2(S-1,3-bpeb)2(OCA)4]n，再经由[2+2]光环加成反应得到含氮双环丁烷衍生物；
所述S-1,3-bpeb为二-(4-乙烯基吡啶)苯衍生物；其化学结构通式如式(Ⅴ)：(Ⅴ)
其中，R为-CH3；
所述HOCA的化学结构通式为式(Ⅶ)：
所述含氮双环丁烷衍生物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将镉盐、S-1,3-bpeb和HOCA放置于装有混合溶剂的玻璃耐压管中，加入浓硝酸调节pH至5～7后，密闭反应，将所得物质冷却、洗涤、干燥，即得到配位聚合物；
(2)将所述配位聚合物置于光源下光照8h～15h，得到光照后物质；
(3)将光照后物质经分解、萃取、除水后，即得含氮双环丁烷衍生物。
4.根据权利要求3所述含氮双环丁烷衍生物的制备方法，其特征在于,所述S-1,3-bpeb是由双溴代苯衍生物与4-乙烯基吡啶在N’N-二甲基甲酰胺溶剂中加入催化剂，经heck偶联反应后分离提纯得到；所述双溴代苯衍生物的化学结构通式如式(Ⅵ)：
5.根据权利要求3所述含氮双环丁烷衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述混合溶剂是N,N’-二甲基甲酰胺、甲醇、乙腈中任一种与水的混合物；所述镉盐为3CdSO4·8H2O、Cd(NO3)2·4H2O、CdCl2·H2O、Cd(CH3COO)2·3H2O任一种；所述S-1,3-bpeb、镉盐、HOCA的摩尔比为0.20～0.25：0.30～0.4：0.75～0.9；所述反应是在温度120～140℃下反应10～12h。
6.根据权利要求3所述含氮双环丁烷衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述分解是于3.5～4mol/L的NaOH或KOH溶液中常温搅拌25-30min；所述萃取是用二氯甲烷进行萃取；所述含氮双环丁烷衍生物的产率为88％～99％。
7.一种如权利要求1-2任一项所述含氮双环丁烷衍生物的应用，其特征在于，所述含氮双环丁烷衍生物a化学结构式选自式(Ⅱ)：
8.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分为权利要求7式(Ⅱ)所述含氮双环丁烷衍生物：
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