CN112292461B - 用于测序的隧穿结 - Google Patents

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Abstract

可以借由在隧穿结处进行隧穿识别来分析分子(例如，进行核酸分子的测序)。本发明的实施例可以允许使用隧穿结来检测个体核苷酸以及进行核酸分子的测序。通过用某一部分标记特定核苷酸，隧穿结可以生成具有合适信噪比的信号。所述隧穿识别使用主要穿过所述部分而不是主要穿过所述目的核苷酸或目的分子的一部分的隧穿电流。由于可以使用具有合适信噪比的信号来检测单个核苷酸，所以本发明的实施例可以允许使用隧穿电流快速检测核苷酸，所述信号由穿过所述部分的隧穿电流产生。

Description

用于测序的隧穿结
背景技术
用于分析单个分子(例如核酸)的技术包括在两个导电层之间具有亚分子大小的间隙的隧穿结装置。隧穿结使用隧穿识别。隧穿识别基于将分子或分子部位(例如核酸的核苷酸)放置在导电层之间。当分子或分子部位接触或足够接近两个层时，分子或分子部位的轨道将会允许电子从一个层转移到另一个层，从而产生隧穿电流。可以分析隧穿电流以鉴定分子或分子部位。
为了鉴定分子部位，诸如核苷酸，间隙的尺寸通常将必须处于纳米数量级，包括小于2nm，或者甚至是亚纳米级。产生如此小的间隙需要精密且昂贵的技术。减小隧穿结的尺寸还可以使分子接触的频率降低并且持续时间较短。此外，如此小的间隙尺寸可能会造成短路，并可能导致高的背景隧穿电流。
因此，仍然需要改进用于化学和生物学检测以及涉及该装置的过程的隧穿结的设计和可制造性。设计和可制造性的改善不应以准确且精确的分析为代价。这些和其他问题由本文档中描述的技术解决。
发明内容
本发明的实施方案可以允许通过在隧穿结处的隧穿识别进行分子的分析(例如，核酸分子的测序)。隧穿结可以是电隧穿结或磁隧穿结。本发明的实施方案可以允许检测个体核苷酸，并且因此可以使用隧穿结实现核酸的精确测序。通过用某一部分标记一个特定的核苷酸，隧穿结可以产生一个二进制信号，该信号以合适的信噪比清晰可见。所述隧穿识别使用主要穿过所述部分而不是主要穿过所述目的核苷酸或目的分子的一部分的隧穿电流。
隧穿结装置可以专注于一次读取单个核苷酸。附接在DNA分子模板链上的聚合酶可以在隧穿结中被栓系在介电质上。使用模板链通过聚合酶合成双链DNA分子。单一类型的核苷酸(例如，A核苷酸)可以用某一部分标记并引入装置中。如果所述核苷酸在当前位置与模板链互补，则将其并入DNA分子中。该装置可以包括许多隧穿结，每个隧穿结具有单独的聚合酶-DNA复合物。可以洗涤该装置中过量的游离核苷酸。如果将所述核苷酸添加到DNA分子中，则该部分可能在隧穿结中造成电流信号。如果所述核苷酸未添加到DNA分子，则电流可能接近零。然后可以去除该部分。可以将下一种类型的标记核苷酸引入设备中，并且可以重复该过程。由该部分产生的电流信号可以比穿过核苷酸本身的背景电流更高。
由于可以使用具有合适信噪比的信号来检测单个核苷酸，所以本发明的实施例可以允许使用隧穿电流快速检测核苷酸，所述信号由穿过所述部分的隧穿电流产生。通过检测穿过该部分而不是核苷酸本身的电流，隧穿结中的介电质可能比单个核苷酸的大小厚。因此，可以更容易、更便宜和更快地制造隧穿结。
隧穿结装置可以利用半导体加工技术来制造。用于检测核苷酸的读取时间可以接近或等于闪存驱动器的读取时间。将多个隧穿结并入到单个测序装置中可以允许多路复用。本发明的实施方案可以允许许多隧穿结，其类似于闪存驱动器中的隧穿结数量。换句话说，数十亿个隧穿结可以并入到闪存驱动器大小(平方厘米量级的面积)的设备中。高度复用的系统可以实现快速、准确的测序。
参考以下具体实施方式和附图，可以更好地理解本发明的实施方案的性质和优点。
附图说明
图1示出根据本发明实施方案的随机电报噪声(RTN)的图。
图2A和2B示出根据本发明实施方案的穿过具有和不具有某一部分的核苷酸的隧穿电流的图。
图3A和3B示出根据本发明的实施方案对具有和不具有某一部分的核苷酸的隧穿电流响应。
图4A、4B和4C示出根据本发明实施方案的化合物的示例，该化合物是用有机金属部分(OM)标记的修饰的核苷酸。
图5A、5B和5C示出根据本发明的实施方案的可用来鉴定合适的部分的构造。
图6示出根据本发明实施方案的确定核酸序列的方法。
图7示出根据本发明实施方案的使用电隧穿结确定核酸序列的步骤。
图8示出根据本发明实施方案的使用磁隧穿结确定核酸序列的步骤。
图9示出根据本发明实施方案的具有电隧穿结的示例系统。
图10示出根据本发明实施方案的具有磁隧穿结的示例系统。
图11示出根据本发明实施方案的用于制造多个磁隧穿结的加工阶段。
图12示出根据本发明实施方案制造的垂直电隧穿结的构造。
图13A和13B示出根据本发明实施方案的测试垂直隧穿结的电学结果。
图14A和14B示出根据本发明实施方案的横向电隧穿结的图示。
图15A、15B、15C和15D示出根据本发明实施方案的测试横向电隧穿结的电学结果。
图16示出根据本发明实施方案的分析系统。
图17示出根据本发明实施方案的计算机系统。
图18示出根据本发明实施方案的计算机系统。
具体实施方式
术语
术语“接触”可以指使一个物体靠近另一物体，使得电子可以从一个物体隧穿穿过另一物体。在亚原子水平上，两个物体可能永远不会彼此物理接触，因为物体中电子云的排斥力可能会阻止这些物体更近地接近。
“核酸”可以指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语可以涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键合的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性。此类类似物的示例可包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)。
除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体 (例如，简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子替换可通过产生序列来实现，其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换(Batzer等人， Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
除非上下文另外明确指出，否则术语“核苷酸”除了指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体外，还可理解为是指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其在使用该核苷酸的特定情况下(例如，与互补碱基杂交)在功能上是等同的。
术语“振荡”可以指由于布朗运动或其他力而导致的物体在流体中的运动。在没有人或机器主动干预的情况下，物体可能会振荡。在某些情况下，由于施加的电场或压力驱动的流动，物体可能会振动。
当技术术语“部分”用于化学中时，该术语可以包括官能团。另外，部分也可以指键合在一起的原子或原子团，其可以形成较大化合物的一部分。部分可包括磁性纳米颗粒。
方向性术语诸如用于半导体加工层和步骤的“之上”或“在顶部上”可以使用参照系，其中这些术语表示远离由基板的表面限定的平面的位置。“底部”可以是基板的底侧或朝向基板的底侧。本领域技术人员将理解，即使颠倒地处理基板，层的“底部”仍然可以指该层的最靠近基板的底侧或未处理侧的一侧。
术语“电特征”可以理解为是指与电路有关的任何特性。电特征可以指电压、电流、电阻、阻抗、电感或电容及其时间变化(例如，电流频率)。
隧穿识别是用于鉴定分子或分子部位(例如核酸)的技术。隧穿结可以包括电隧穿结或磁隧穿结。电隧穿结可以包括将绝缘层夹在中间的两个导体。当一个分子或分子部位与两个导体接触或足够靠近两个导体时，从一个导体到另一个导体的隧穿电流就会改变。分子或分子部位可以通过诱导直接传导或陷阱辅助隧穿来改变电流的幅度。
磁隧穿结可以包括将绝缘层夹在中间的两种铁磁材料。当磁性纳米颗粒靠近铁磁材料时，磁畴的相对取向发生变化，并且从一个导体隧穿到另一导体的电流也发生变化。隧穿电流的量取决于铁磁材料的磁化方向(即自旋)。具有相同自旋(即，平行)的铁磁材料的电流高于具有相反自旋 (即，反平行)的两种铁磁材料的电流。
对于任一结，隧穿电流可以根据接触两个导体的分子或分子部位的属性以及多少分子在接触导体与不接触导体之间振荡而发生变化。如果测量仅穿过核酸的单个核苷酸的电流，则绝缘层通常将必须小于核苷酸的大小，以使得核苷酸可以跨绝缘层接触两个导体。
然而，即使是1nm的厚度也大约是三个核苷酸的大小，这可能给检测单个核苷酸造成问题。即使当绝缘层的厚度在1至2nm的数量级时，制造仍然可能是困难的，并且穿过薄绝缘层的背景隧穿电流可能太大，以至于不能检测到来自核苷酸的信号，或者这种薄绝缘层可能无法防止短路。增加绝缘层的厚度可以使制造更容易，但是随后需要可测量的隧穿电流穿过甚至更多的核苷酸。穿过多个核苷酸的信号将牵涉更复杂的信号分析，以鉴定单个核苷酸。
本技术的实施方案可以降低电流信号中的噪声，并且不需要大约1至 2nm的薄绝缘层。隧穿结装置可以专注于一次读取单个核苷酸。聚合酶可以被栓系到隧穿结(例如，绝缘层)。可以通过聚合酶从模板母链合成双链DNA分子。实施方案可以在同一装置上包括许多隧穿结，从而允许多路复用。
在一些实施方案中，用某一部分标记一组单一类型的核苷酸(例如， A核苷酸)并将其引入装置中。当所述核苷酸是与模板母链互补的类型时，可以将这些核苷酸添加至新生链。可以在引入额外的标记核苷酸之后的这个时候或之后的一个周期中，清洗掉过量的游离核苷酸。如果将所述核苷酸添加到DNA分子中，则该部分在隧穿结中造成电流信号。如果所述核苷酸未添加到DNA分子，则电流可能接近零。然后可以去除该部分。可以将下一种类型的标记核苷酸引入装置中，并且可以重复该过程，从而允许检测在每个位置是否并入了特定核苷酸。通过该部分产生的电流信号可以高于穿过核苷酸本身的背景电流，从而提供具有较少噪声的信号。
I.使用随机电报噪声(RTN)
穿过一个或多个核苷酸本身的隧穿电流可能不会产生具有合适信噪比的足够高的电流信号。所述核苷酸可以与导体短时间接触，并且不同核苷酸或核苷酸序列之间的隧穿电流差异可能很小。因此，需要更强且更容易检测的信号。
A.RTN
为了产生具有合适信噪比的电流信号，本发明的实施方案的电流信号可以模仿随机电报噪声(RTN)，其先前被称为隧穿结中不需要的电流信号的问题。不希望受特定理论的束缚，对RTN的一种解释是杂质引起不想要的电流信号。杂质可能已经入陷了电荷，并可能在相当长的时间内维持较高的电流。杂质可能是隧穿结的氧化物中的缺陷，起到类似电荷陷阱的作用。这些杂质可包括氧化物中的氧空位，在金属氧化物基质中被捕获的离子以及替代离子(例如，掺杂剂)。在杂质不再捕获电荷或杂质去除之后，电流下降。本发明的实施方案中的装置用标记的核苷酸的标签有意地再现了这种RTN现象。
图1以电流对时间的曲线图示出RTN的曲线图100。该图示出较高电流的区域(例如，区域102)和接近零的较低电流的区域(例如，区域 104)。较高电流的区域可能会有捕获的电荷，而较低电流的区域可能没有捕获的电荷。然后，对是否可以捕获电荷的分析可以取决于鉴定出哪里存在高于背景电流的电流。
B.部分的用法
为了有意模拟RTN，可以将产生RTN的某一部分附接至目的分子。例如，如果待分析的分子是核酸，则可以将某一部分附接至待并入正在生长的核酸链中的核苷酸。
图2A和2B示出某一部分可以如何用于产生电流信号。DNA聚合酶202延长正在与模板母链206杂交的新生链204。在图2A中，添加到新生链204的最后一个核苷酸包括部分208。部分208允许电子从第一导体210 隧穿到第二导体212。隧穿电子可以产生类似于曲线图220的随时间变化的电流信号。电流信号的随机性质可以是捕获和释放被捕获的电荷状态和/ 或电容效应(即，充电和放电)的结果。电容效应可能是捕获的电子改变隧穿结附近的电荷分布的结果，这可能会改变隧穿势垒的高度。流经该结的电流的幅度可以指数地取决于势垒高度。由陷阱状态的随机充电和放电引起的势垒高度的小幅变化可以导致隧穿电流的大幅变化，这在图2A中显而易见。
在图2B中，当不存在部分时，电子不能从第一导体210隧穿至第二导体212。在图2B中，类似于曲线图222，隧穿电流应接近零或接近背景隧穿电流。因此，可以通过测量大于零或背景隧穿电流的隧穿电流来检测部分208，并且因此可检测核苷酸。
该部分应该是一个实体，该实体允许基于所施加的某一电势而使隧穿电流穿过。图3A示出当没有部分附接至核苷酸时的隧穿电流响应。聚合酶302附接至隧穿结304。聚合酶302与模板母链306杂交。不存在部分，也没有捕获的电荷。隧穿结处于共振阱关闭状态308，其不允许电流从一个导体隧穿至另一导体。结果是电流对时间的曲线图310，其中电流接近零且处于背景水平。
图3B示出当某一部分附接至核苷酸时的隧穿电流响应。聚合酶312 附接至隧穿结314。聚合酶312与模板母链316杂交。添加的核苷酸具有部分318。部分318以电子转移频率捕获电荷。隧穿结处于共振阱打开状态320。电流可以从一个导体穿过该部分隧穿到另一导体。结果是电流对时间的曲线图322，其中电流达到非零电流和高于背景水平的电流。
II.具有部分的标记化合物
所用的部分可以是标记化合物的一部分，该标记化合物包括比仅该部分更多的组分。本文所述的方法和系统中使用的化学化合物可包括核苷酸、可裂解的接头和部分。核苷酸可以包括四种DNA核苷酸中的任何一个，包括腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。核苷酸还可以包括四种RNA核苷酸，包括腺嘌呤、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤和胞嘧啶。标记化合物可以足够长，以使得当核苷酸与模板母链杂交时允许该部分与隧穿结接触。
A.组成
对于电隧穿结，该部分可以选自由有机金属基团、纳米颗粒、共轭芳族基团和导电有机分子组成的组。导电有机分子可以没有带隙，并且可以不是绝缘体或半导体。作为示例，有机金属基团可包括二茂铁、金属酞菁、钌、锇和过渡金属有机金属化合物。作为示例，纳米颗粒可以包括金、银、铂、镁或氮化钛纳米颗粒。纳米颗粒可以包括具有特征尺寸1至10nm，包括1至5nm和5至10nm的任何颗粒。如果纳米颗粒是球形，则特征尺寸可以是纳米颗粒的直径。然而，如果纳米颗粒不是球形，则特征尺寸可以是具有与非球形纳米颗粒相同体积的球形的直径。在一些情况下，特征尺寸可以是纳米颗粒的宽度、长度或高度的最小值。共轭芳族基团可包括具有几个苯环的化合物，包括具有两个至九个苯环的化合物、蒽、菲、并四苯、苯并菲、芘、并五苯、苯并芘、心环烯、苯并二萘嵌苯、晕苯、卵苯和苯并芴。共轭芳族基团可包括具有以线性结构排列的苯环的化合物。作为示例，导电有机分子可以包括短聚合物，该短聚合物包括聚吡咯和聚苯胺。
如上所述，该部分可以通过将电荷保持在共振阱打开状态而允许隧穿电流。在一些实施方案中，相同的部分可以附接至四个核苷酸。在其他实施方案中，不同的部分可以用于不同的核苷酸，每个部分对于施加的电压产生不同的隧穿电流。该部分可以包含多个基团，诸如多个有机金属基团。
对于磁隧穿结，该部分可以选自由铁磁材料或超顺磁材料组成的组。材料可以包括磁性纳米颗粒(例如，FePt、FeCuPt、Fe2O3)。纳米颗粒的直径或特征尺寸可小于1μm、500nm、100nm或10nm。
该化学化合物可以具有由N-X-S-M表示的结构，其中N是核苷酸，X 是可裂解的接头，S是间隔体，并且M是该部分。核苷酸可以直接与可裂解的接头键合。
可裂解的接头可以使标记化合物在检测后从并入的核苷酸中裂解。可裂解的接头在本领域中是已知的，并且已经在例如美国专利号7,057,026、 7,414，116及其继续申请和改进申请中描述。在一些实施方案中，标记通过包含烯丙基或叠氮基基团的接头附接至嘧啶的5-位或嘌呤的7-位。在其他实施方案中，接头包含二硫键、吲哚或Sieber基团。接头可进一步包含一个或多个选自烷基(C1-6)或烷氧基(C1-6)、硝基、氰基、氟基团或具有类似性质的基团的取代基。简而言之，接头可以被水溶性膦或基于膦的含过渡金属的催化剂裂解。其他接头和接头裂解机制是本领域已知的。例如，包含三苯甲基、对烷氧基苄基酯和对烷氧基苄基酰胺以及叔丁氧羰基(Boc) 基团和缩醛系统的接头可以在酸性条件下通过释放质子的裂解剂裂解。硫缩醛或其他含硫的接头可以使用亲硫金属诸如镍、银或汞裂解。裂解保护基团也可以考虑用于制备合适的接头分子。含酯和二硫键的接头可在还原条件下裂解。含有三异丙基硅烷(TIPS)或叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)的接头可在F离子存在下裂解。在不影响反应混合物的其他组分的波长下裂解的可光裂解的接头包括包含O-硝基苄基基团的接头。包含苄氧基羰基基团的接头可以被基于Pd的催化剂裂解。
作为示例，可裂解的接头X可以被金属催化剂(例如烯丙基基团)、酶(例如蛋白酶裂解位点，烟草蚀刻病毒[TEV]裂解位点)、光(例如硝基苯)、还原反应(例如二硫化物)、酸(例如乙缩醛、甲氧基甲基或保护的乙缩醛(例如O-CH2-N3或-O-CH(N3)-))、碱(例如琥珀酸酯、乙酰基)、氧化反应(例如邻二醇)或磷酸酶(例如磷酸盐)裂解。可裂解的接头可以包括-O-NH2，其可以被亚硝酸盐裂解。
作为示例，间隔体可以是聚乙二醇(PEG)、烷基或芳基间隔体、肽、阳离子间隔体(例如精胺)、核酸、碳水化合物或其组合。
图4A示出化学化合物的示例。在图4A中，接头-间隔体-部分附接至脱氧核糖的3′OH基团。核苷酸与X(可裂解的接头)、间隔体以及随后的有机金属(OM)部分链接。封闭3′-OH基团可自动终止聚合酶反应。然而，带有庞大化合物的3′-OH可能不容易被聚合酶接受。
图4B示出另一种化学化合物的示例。接头-间隔体-部分附接至所述核苷酸的碱基。修饰碱基通常被聚合酶很好地接受。然而，因为3′-OH基团没有被封闭，所以图4B中的化合物可能导致不到100％的终止。
图4C示出化学化合物的另一个示例。碱基和3′OH基团两者都可以键合至可裂解的接头X。键合至碱基的接头X可以与键合至3′OH基团的X 相同。然而，在一些实施方案中，两个接头可以是不同的化合物。图4C 中的化合物可以结合图4A中的化合物和图4B中的化合物两者的优点。在3′-OH基团上添加一个小的可裂解终止子基团可以确保在并入后停止。大的X-S-M化合物附接至碱基上可能不会过多地干扰聚合酶。但是，图4C 可能需要在两个位点而不仅在一个位点进行裂解。
接头-间隔体-部分可以充当闪电终止子(Stupi，B.P.等人，“Stereochemistry ofbenzylic carbon substitution coupled with ring modification of 2-nitrobenzylgroups as key determinants for fast-cleaving reversible terminators”，Angew.Chem.Int.Ed.，51，1724-1727(2012)，可在 onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.201106516获得)或作为虚拟终止子(Bowers，J.等人，“Virtual terminatornucleotides for next-generation DNA sequencing”，Nature Methods，6，593-595(2009)，可在 www.nature.com/articles/nmeth.1354.pdf获得，并且相关补充信息可在media.nature.com/original/nature-assets/nmeth/journal/v6/n8/extref/nmeth.1354- S1.pdf获得)。
该化学化合物还可以包括终止子。终止子可以停止聚合过程。例如，对于聚合酶，终止子可以令聚合酶停止添加核苷酸直到终止子被移除。接头、间隔体、部分或其组合可以充当终止子。图4A、4B和4C中的标记化合物可各自包括终止子。
如果待分析的分子不是核酸，则可以相应地调整化学化合物。标记化合物可以附接至生物聚合物的单个单元上。例如，如果待分析的化合物是蛋白质，则标记化合物可以附接至氨基酸而不是核苷酸。
B.表征部分
图5A、5B和5C示出可用于鉴定合适部分的构造。图5A示出具有第一电极502、第二电极504和绝缘层506的电隧穿结。第一电极502连接至电源508，并且第二电极504连接至电流表510。电极是导体。与绝缘层 506相邻的任一电极的宽度可以为约50nm，从45nm至55nm，从40nm 至60nm或从35nm至65nm。任一电极的高度可以是20nm、15nm至25 nm或10nm至30nm。结面积(即，绝缘层506和任一电极之间的界面的面积)可以在103nm2或102nm2的量级。感测面积(即，为了与待感测的部分或其他化合物接触而暴露的绝缘层的面积)为约20nm2。
图5B示出附接至绝缘层506的系链化合物520。系链化合物520可以是对苯二酚SpyTag。SpyTag是一种短肽，在遇到其蛋白伴侣SpyCatcher 时会形成一个异肽键(Reddington，S.C.等人，“Secrets of a covalent interaction for biomaterials andbiotechnology：SpyTag和SpyCatcher.”Current Opinion in Chemical Biology，2015，29：94-99，可在 dx.doi.org/10.1016/j.cbpa-2015.10.002获得)。
图5C示出具有部分532的化合物530。化合物530附接至系链化合物 520。化合物530可以包括SpyCatcher。部分532可以是本文描述的任何可能类型的部分。可以针对电流的幅值和其他特征来表征穿过部分532的隧穿电流。可以测试其他类型的部分。将根据产生最佳信号强度的那些信号 (包括幅度和持续时间)来选择性能最好的部分。从不同部分的数据中，可以选择合适类型的部分。可以选择部分以获得强的、稳定的电流信号。在一些实施方案中，可以鉴定多种类型的部分，每个部分具有可与其他信号区别的电流信号。多种类型的部分可以用于标记不同类型的核苷酸。
III.分子分析方法
隧穿结可以是电隧穿结或磁隧穿结。两种类型的隧穿结在方法和系统上都有共同点。任何一种隧穿结均可用于使用测序装置确定核酸的序列。该方法可以包括将一组核苷酸添加到测序装置中。核苷酸组中的每个核苷酸可以附接至标记化合物。标记化合物可以包括某一部分。测序装置可包括一个结。该结可以包括通过绝缘层隔开的第一导体和第二导体。
方法可以进一步包括使用附接至隧穿结并连接至待测序的模板母链的聚合酶来延伸新生链。延伸可包括通过与模板母链杂交而将核苷酸组的第一核苷酸并入新生链的聚合酶。
方法可以包括通过第一导体、附接至第一核苷酸的第一标记化合物的第一部分和第二导体测量电特征值或磁特征值。方法可包括使用电特征值或磁特征值检测与所述模板母链杂交的所述第一核苷酸。
特定地用于电隧穿结和磁隧穿结的方法如下所述。
A.电隧穿结构造
图6示出用于确定核酸序列的构造。在构造600中，聚合酶602附接至隧穿结604。隧穿结604是电隧穿结。隧穿结604可以包括第一电极606、第二电极608和绝缘层610。第一电极606和第二电极608是描述用于隧穿结的导体的示例。绝缘层610可以将第一电极606和第二电极608 分隔开。隧穿结604可以是本文描述的任何隧穿结，并且在下面进行更详细的讨论。
在构造620中，聚合酶602延伸新生链622，新生链622与模板母链 624杂交以形成双链核酸分子。
构造640示出在具有第一核苷酸642和多个第二核苷酸的第一液体与隧穿结604接触之后的系统。将具有第一部分644的第一核苷酸642添加至新生链622。第一核苷酸642可以在聚合酶602附近。第一部分644可以接触隧穿结604或足够接近第一电极606和第二电极608，使得电子可以隧穿穿过第一部分644和电极。具有第二部分的多个第二核苷酸，诸如具有第二部分648的第二核苷酸646，可以保留在隧穿结604附近的液体中。
构造660显示在多个第二核苷酸已被移除之后并且正在测量穿过第一部分644的隧穿电流662的隧穿结604。当电流大于背景隧穿电流时，可以生成二进制信号1以表明第一核苷酸的存在，如构造660中所示。如果电流不超过背景隧穿电流，则可能会产生信号0，以表明不存在第一核苷酸。在一些实施方案中，电流信号可以不是二进制的，而是取决于由特定类型的第一部分644产生的电流幅值。
因为通过聚合酶并入新生链的第一核苷酸与模板母链上的核苷酸互补，所以也可以鉴定模板母链上的互补核苷酸。例如，在图6中，可以鉴定第一核苷酸642，这也将导致鉴定模板母链624上的互补核苷酸。任一核苷酸均可为通过本文所述方法确定的核酸序列的一部分。
第一核苷酸642可以附接至终止子，其阻止了新生链622的进一步延伸。移除附接终止子的第一核苷酸642和第一部分644，使系统恢复到类似于构造620的构造，不同之处在于新生链622包括第一核苷酸642。
B.电隧穿结的示例方法
图7示出根据本技术实施方案的使用测序装置确定核酸序列的方法 700。测序装置可以包括电隧穿结、电源和仪表装置。隧穿结包括通过绝缘层隔开的第一电极和第二电极。
方法700可以包括将模板母链引入隧穿结。模板母链可以通过流体注入系统引入隧穿结。模板母链可获自生物样品。
在框702处，可以将一组核苷酸添加到测序装置。核苷酸组中的每个核苷酸可以附接至标记化合物，其中标记化合物包括某一部分。可以通过将核苷酸组包括在与测序装置接触的液体中来将核苷酸组添加到测序装置。该液体可以是离子液体。该部分可以选自由有机金属化合物、纳米颗粒和共轭芳族化合物组成的组，或者可以是本文所述的任何部分。核苷酸组中的每个核苷酸可以附接至包括相应部分的相应标记化合物。在一些实施方案中，核苷酸组中的每个核苷酸可以是相同类型的核苷酸。例如，核苷酸组中的每个核苷酸可以是G核苷酸。每个标记化合物的每个部分可以是相同类型的部分。在其他实施方案中，核苷酸组可以包括两种、三种或四种类型的核苷酸。在这些实施方案中，每个核苷酸可以附接至不同类型的部分。具有核苷酸组的液体可以储存在储器中，并通过注入系统引入隧穿结。
在框704处，可以通过附接至隧穿结并连接至待测序模板母链的聚合酶来延伸新生链。新生链可以是单链核酸分子。延伸该链可包括通过与模板母链杂交而将核苷酸组的第一核苷酸并入新生链。新生链和模板母链可以一起形成双链核酸分子的一部分。
标记化合物可以包括构造为防止新生链进一步延伸的终止子。测序中常规隧穿结的问题可能是待分析的分子可能过快地流过该结，因此与电极接触的时间较短。这样，电流信号可能会太短而难以表征。另外，即使在框704中仅添加一种类型的核苷酸，模板母链中的特定序列也可以多次且连续地包括相同类型的核苷酸。这样，核酸分子可以在一次引入中添加相同类型的多个核苷酸。结果，当已添加多个核苷酸时，该设备可能只为一个核苷酸生成一个信号。终止子可以停止聚合酶的作用，直到终止子被移除。以此方式，一次只能添加一个核苷酸，从而给待测量的电流信号留出足够的时间。
除了第一核苷酸之外的核苷酸组可以从与隧穿结的接触中移除。移除核苷酸可以包括用水冲洗隧穿结。用于冲洗隧穿结的液体可以是没有核苷酸的水或离子液体。这一冲洗液可以存储在储器中，并通过注入系统引入隧穿结。移除核苷酸组可以发生在测量电特征值之前。在其他实施方案中，在测量电特征值之前可以不移除核苷酸组。
在框706处，可以在测序装置的第一电极和第二电极之间施加电压。该电压可以是适用于产生穿过与隧穿结接触的实体的隧穿电流的任何电压。可以在移除第一核苷酸以外的核苷酸组之后(例如，冲洗后)施加电压。在一些实施方案中，电压可以施加更长的持续时间，包括在冲洗之前、在延伸期间(例如，框704)或在添加核苷酸组期间(框702)。在一些实施方案中，可以在整个方法中施加恒定电压。
在框708处，可以测量穿过第一电极、部分和第二电极的电特征值。电特征可以是电流、电压、电阻、电感或脉冲宽度。该值可以是平均值 (均值、中值、众数值、均方根)、局部或全局最大值、或瞬时测量值。该值可以大于10nA，大于100nA或大于1μA。
在框710处，使用所述电特征值，可检测与所述模板母链杂交的所述第一核苷酸。方框712和714描述了如何可以检测第一核苷酸。
在框712处，可以将电特征值与电特征参考值进行比较。参考值可以是穿过第一电极和第二电极并且不穿过该部分的背景隧穿电流的值。参考值可以基于背景隧穿电流。例如，参考值可以设置为背景隧穿电流的最大水平，或者设置为与背景电特征具有统计学差异的值。例如，参考值可以设置为与平均背景隧穿电流相差一个、二个或三个标准偏差。在一些实施方案中，参考值可以是零。
在框714处，可以将该值确定为超过参考值。例如，该值可以确定为大于背景隧穿电流。当确定该值超过参考值时，可以将电流信号转换为二进制信号1。
方法700可以包括从第一核苷酸裂解第一标记化合物。裂解第一标记化合物移除了终止子，这使聚合酶可以延伸带有另外核苷酸的新生链。可以通过光裂解来裂解第一标记化合物，这可以包括使特定波长或波长范围的光闪烁以影响第一标记化合物的光敏部位。在一些实施方案中，裂解第一标记化合物可包括通过引入裂解剂进行化学裂解，所述裂解剂可包括pH 调节剂(例如酸或碱)、酶或化学试剂。在一些实施方案中，裂解可以是金属(例如钯)催化的裂解、还原裂解、氧化裂解、亲核裂解或亲电裂解。
1.用另一个核苷酸重复测量
方法700可以进一步包括在裂解第一标记化合物之后用另一个核苷酸重复测量和检测。方法700可以包括将第二组核苷酸添加到测序装置。第二组核苷酸中的每个核苷酸均附接至包含第二部分的第二标记化合物。第二组核苷酸中的每个核苷酸是与第一核苷酸不同类型的核苷酸。每个第二标记化合物可以与第一标记化合物相同。每个第二部分可以是与第一部分相同类型的部分。
在通过并入第一核苷酸使新生链延伸之后，新生链可以变成延伸的新生链(即，添加有第一核苷酸的新生链)。方法700可以包括通过聚合酶进一步延伸该延伸的新生链。酸聚合酶可以并入附接至第二标记化合物的第二组核苷酸的包括第二部分的第二核苷酸。
可以测量穿过第一电极、第二部分和第二电极的电特征的第二值。基于电特征的第二值，可检测与所述模板母链杂交的所述第二核苷酸。测量和检测可以与针对第一核苷酸描述的任何测量和检测相同。在聚合酶不将第二核苷酸或第二核苷酸组的任何核苷酸并入的实施方案中，电特征的第二值可以确定为在统计学上等同于参考值，并且可以确定不存在另外的核苷酸。
2.核苷酸组中的多种类型的核苷酸
在一些实施方案中，在框704中添加的核苷酸组可以包括两种或更多种类型的核苷酸。核苷酸组可以包括附接至包含第二部分的第二标记化合物的第二核苷酸。在框710中检测被杂交的所述第一核苷酸可以包括在框 712中进行电特征值的比较。在方法700中，可通过将所述电特征值与电特征第二参考值进行比较，基于所述电特征值确定所述第二核苷酸未与模板链杂交。第二参考值可以具有与第一参考值相同或不同的值。
第一部分可以生成在一定范围内或在一定值之上或之下的电特征值。第二部分可以生成在不同范围内或在一定值之上或之下的电特征值。可以将电特征的测量值与不同范围或值进行比较，以确定通过电特征值鉴定出了哪个部分，并因此确定鉴定出了哪个核苷酸。第一参考值和第二参考值可以是第一部分或第二部分的值范围内的端点。
3.多个隧穿结
方法700可以包括使用多个隧穿结来确定核酸的序列。每个隧穿结可以包括相应的第一电极、相应的第二电极和相应的绝缘层。每个相应的隧穿结附接至相应的聚合酶。
方法700可以包括用于多个隧穿结的每个隧穿结的步骤。可以在相应的第一电极和相应的第二电极上施加相应的电压。可以使用附接至相应的隧穿结并连接至待测序的相应母链的相应聚合酶来延伸相应的新生链。延伸可包括相应的聚合酶通过与相应的模板母链杂交而将核苷酸组的相应的核苷酸并入相应的新生链中。可以通过相应的第一电极、附接至相应的核苷酸的相应的标记化合物的相应的部分以及相应的第二电极来测量相应的电特征值。可以使用相应的电特征值检测与相应的模板母链杂交的相应的核苷酸。
多个隧穿结中的每个隧穿结可以确定与模板母链杂交的核苷酸的存在或不存在。在单个装置中，大约一平方厘米内多个结的数目可以为数千、数百万或数十亿。因为检测涉及鉴定二选制信号0或1，所以隧穿结的读取时间可能类似于闪存驱动器中的读取时间。基于闪存驱动器，隧穿结的读取时间可以是80兆位/秒(即每秒约8000万个结)至5吉比特/秒(即每秒约50亿个结)，甚至更快。在数百亿个隧穿结的情况下，所有隧穿结的读取时间可能只有几秒钟。隧穿结的清洗周期可能约为100μs，短于读取时间。
在实施方案中，在添加第二组核苷酸之前移除第一组核苷酸。在其他实施方案中，在添加第二组核苷酸之前，可以不移除第一组核苷酸(例如，通过冲洗步骤)。以这种方式，第二核苷酸可以在某些隧穿结处与模板母链杂交。具有电流信号的隧穿结的总数将来自具有来自第一组核苷酸的核苷酸或来自第二组核苷酸的核苷酸的任何母链。因为核苷酸的添加是依序进行的，所以可以基于在添加第一组核苷酸时未出现的信号推导具有来自第二组核苷酸的核苷酸的结。然后可以用剩余的核苷酸重复这一过程。然后可以在引入多组核苷酸后进行清洗。
在一些实施方案中，由于具有多个隧穿结，可以一次引入两种不同类型的核苷酸而不是单个核苷酸。可以进行测量以查看哪些隧穿结已经包括具有两种不同标记化合物的两种不同类型核苷酸中的任何一种。然后使用核苷酸特异性移除过程移除第一种类型的核苷酸。例如，具有第一种类型的核苷酸的标记化合物可以用一定波长的光移除，而具有第二种类型的核苷酸的标记化合物可以不从新生链中移除。移除后，进行另一种测量以鉴定具有第二种类型的核苷酸的隧穿结。作为这一技术的结果，可以确定并入了第一种类型的核苷酸的隧穿结和并入了第二种类型的核苷酸的隧穿结。这一技术还可以用于两种以上类型的核苷酸，只要可以选择性地移除该类型核苷酸的标记化合物即可。
方法700可以适于分析除核酸序列以外的分子。例如，如果待分析蛋白质的氨基酸序列，则可以将聚合酶替换为核糖体。是氨基酸而不是核苷酸将会被标记。取决于待分析的分子，也可以将聚合酶替换为解旋酶、核酸外切酶以及其他酶。
C.磁隧穿结构造
图8示出根据本技术实施方案的使用测序装置确定核酸序列的方法 800。测序装置可以包括磁隧穿结、电源和仪表装置。隧穿结包括通过绝缘层隔开的第一铁磁层和第二铁磁层。铁磁层和第二铁磁层是描述用于隧穿结的导体的示例。
方法800可以包括将模板母链引入隧穿结。模板母链可以通过流体注入系统引入隧穿结。模板母链可获自生物样品。
在框802处，可以将一组核苷酸添加到测序装置。核苷酸组中的每个核苷酸可以附接至标记化合物，其中标记化合物包括某一部分。可以通过将核苷酸组包括在与测序装置接触的液体中来将核苷酸组添加到测序装置。该液体可以是离子液体。该部分可以选自由铁磁材料或超顺磁材料组成的组。该材料可以包括磁性纳米颗粒(例如，FePt、FeCuPt、Fe2O3)，或者可以是本文所述的任何部分。核苷酸组中的每个核苷酸可以附接至包括相应部分的相应标记化合物。在一些实施方案中，核苷酸组中的每个核苷酸可以是相同类型的核苷酸。例如，核苷酸组中的每个核苷酸可以是G 核苷酸。每个标记化合物的每个部分可以是相同类型的部分。在其他实施方案中，核苷酸组可以包括两种、三种或四种类型的核苷酸。在这些实施方案中，每个核苷酸可以附接至不同类型的部分。具有核苷酸组的液体可以储存在储器中，并通过注入系统引入隧穿结。
在框804处，可以通过附接至隧穿结并连接至待测序模板母链的聚合酶来延伸新生链。新生链可以是单链核酸分子。延伸该链可包括通过与模板母链杂交而将核苷酸组的第一核苷酸并入新生链。新生链和模板母链可以一起形成双链核酸分子的一部分。
标记化合物可以包括构造为防止新生链进一步延伸的终止子。类似于与电隧穿结一起使用的标记化合物，与磁隧穿结一起使用的标记化合物构造为通过包含终止子来允许更长的信号。
除了第一核苷酸之外的核苷酸组可以从与隧穿结的接触中移除。移除核苷酸可以包括用水冲洗隧穿结。用于冲洗隧穿结的液体可以是没有核苷酸的水或离子液体。这一冲洗液可以存储在储器中，并通过注入系统引入隧穿结。移除核苷酸组可以发生在测量电特征值之前。在其他实施方案中，在测量电特征值之前可以不移除核苷酸组。
在框806处，可以施加磁场以设置第二铁磁层的极性。第一铁磁层可以是永磁体并且可以具有第一极性。可以将磁场施加到第二铁磁层以将极性设置为与第一极性反平行的第二极性。磁场可以由外部磁体施加。可以在移除第一核苷酸以外的一组核苷酸之后(例如，冲洗后)施加磁场。在一些实施方案中，电压可以施加更长的持续时间，包括在冲洗之前、在延伸期间(例如，框804)或在添加核苷酸组期间(框802)。在一些实施方案中，可以在整个方法中施加恒定磁场。
在框808处，可以测量穿过第一铁磁层、部分和第二铁磁层的电特征值或磁特征值。电特征可以是电流、电压、电阻、电感或脉冲宽度。该值可以是平均值(均值、中值、众数值、均方根)、局部或全局最大值、或瞬时测量值。该值可以大于10nA，大于100nA或大于1μA。磁特征可以是由磁性纳米颗粒引起并通过磁力传感器测量的磁场扰动。
在框810处，可以使用电特征值或磁特征值检测与所述模板母链杂交的所述第一核苷酸。方框812和814描述了如何可以检测第一核苷酸。
在框812处，可以将电特征值或磁特征值与电特征参考值或磁特征参考值进行比较。参考值可以是穿过第一铁磁层和第二铁磁层并且不穿过该部分的背景隧穿电流、电阻或其他电特征的参考值。参考值可以基于背景隧穿电流。例如，参考值可以设置为背景隧穿电流的最大水平，或者设置为与背景电特征具有统计学差异的值。例如，参考值可以设置为与平均背景隧穿电流相差一个、二个或三个标准偏差。在一些实施方案中，参考值可以是零。
在框814处，可以将该值确定为超过参考值。例如，该值可以确定为大于背景隧穿电流。当确定该值超过参考值时，可以将电流信号转换为二进制信号1。
方法800可以包括从第一核苷酸裂解第一标记化合物。裂解第一标记化合物移除了终止子，这使聚合酶可以延伸带有另外核苷酸的新生链。可以通过光裂解来裂解第一标记化合物，这可以包括使特定波长或波长范围的光闪烁以影响第一标记化合物的光敏部位。在一些实施方案中，裂解第一标记化合物可包括通过引入裂解剂进行化学裂解，所述裂解剂可包括pH 调节剂(例如酸或碱)、酶或化学试剂。在一些实施方案中，裂解可以是金属(例如钯)催化的裂解、还原裂解、氧化裂解、亲核裂解或亲电裂解。
方法800可以包括使用另一核苷酸、核苷酸组中的多种类型的核苷酸和/或类似于已经针对电隧穿结描述的多个隧穿结进行重复测量。类似于方法700，方法800可以适于分析除核酸序列以外的分子。
IV.分析系统
确定核酸序列的方法可包括使用具有隧穿结的系统。隧穿结可以包括通过绝缘层隔开的第一导体和第二导体。导体可以是电极或铁磁层。聚合酶可以附接至该结并连接至模板母链。聚合酶可以构造为延伸与模板母链杂交的新生链。电源可以与第一导体和第二导体中的至少一个电通信。该系统可以包括一组核苷酸。核苷酸组中的每个核苷酸可以附接至标记化合物。标记化合物可以包括某一部分。该系统可以进一步包括仪表装置，该仪表装置构造为经由该部分来测量穿过第一导体和第二导体的电特征值。
该系统可以包括存储多个指令的计算机可读介质。当由处理器执行时，多个指令可以使处理器测量穿过第一导体和第二导体的电特征值。指令还可以使处理器将电特征值与电特征参考值进行比较。一确定该值超过参考值，该指令就可使处理器检测核苷酸为与所述模板母链杂交的。
下面描述特定地用于电隧穿结和磁隧穿结的系统。
A.电隧穿结系统
图9示出示例系统900。系统900可以包括隧穿结。隧穿结包括第一电极904、第二电极908和绝缘层912。电极材料可以包括金、银、铂或钯。电极可以包括任何金属，该金属的金属氧化物在用作待分析分子的介质的水溶液中是化学稳定的。其他金属可以包括钽、镍、铬、钛和铜。
绝缘层912可以包括介电材料，包括氧化铝(Al2O3)、二氧化铪 (HfO2)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、玻璃、石英、氧化镁(MgO)、二氧化钛(TiO2)或二氧化锆(ZrO2)。绝缘层912可以具有大于2nm的厚度。该厚度可以是第一电极904和第二电极908之间的距离。因为隧穿结的操作不需要核酸分子的一个或多个核苷酸与两个电极接触，所以绝缘层的宽度可以大于一个或多个核苷酸的大小。另外，绝缘层的宽度可以大于该部分的大小，因为即使该部分小于电极之间的间隙，隧穿仍然可能发生。
隧穿结可以横向定向，使得隧穿方向基本上平行与第一电极和第二电极接触的基板的表面。新生链的延伸长方向可以平行于基板的表面。绝缘层可具有与基板正交的纵轴。美国专利公开号2018/0031523 A1中描述了横向定向隧穿结的示例，该专利的内容通过引用并入本文以用于所有目的。
核酸聚合酶916可以通过由系链化合物913和化合物914形成的系链化合物附接至隧穿结。系链化合物913可包含SpyTag，化合物914可包含 SpyCatcher。核酸聚合酶916可以在绝缘层912处附接至隧穿结。核酸聚合酶916也可以在第一电极904或第二电极908处附接至隧穿结。核酸聚合酶916可以构造成用于添加如图6中所述的具有构造640的核苷酸。一种或多种化合物可以将核酸聚合酶916栓系到绝缘层912。例如，对苯二酚、SpyTag或SpyCatcher可用于将核酸聚合酶916栓系到绝缘层912。核酸聚合酶916可以构造为用于延伸新生链。新生链可以与模板母链杂交。
系统900可以包括电源920。电源920可以与第一电极904和第二电极908中的至少一个电通信。电源920可以将电压施加到第一电极904和第二电极980。电源920可以构造为用于维持期望的电流或期望的电压。电源920可以提供0到1V，包括10mV到100mV、100mV到200mV、 200mV到300mV、300mV到500mV或500mV到1V的电压。在一些实施方案中，电源920可以提供0到30nA，包括1pA到10pA、10pA到 100pA、100pA到1nA、1nA到10nA或10nA到30nA的电流。
系统900还可以包括仪表装置924。仪表装置924可以构造为用于测量穿过第一电极904和第二电极908的电特征值。仪表装置924可以是电流表、电压表或示波器。电特征可以是电流或电压。
系统900可以包括计算机系统930。计算机系统928可以与电源920 和仪表装置924通信。计算机系统928也可以与将流体输送到隧穿结的控制系统通信。计算机系统928可以包括处理器和计算机可读介质。计算机可读介质可以存储多个指令。多个指令由进程执行时，可以使处理器执行本文所述的任何方法。例如，多个指令在被执行时可以使处理器测量穿过第一电极和第二电极的电特征值。还可以使处理器将该电特征值与电特征参考值进行比较。一确定该值超过参考值，就可以进一步使处理器检测核苷酸为与模板母链杂交的。一确定该值不超过参考值时，可以进一步使处理器确定不存在与模板母链杂交的核苷酸。下面更详细地描述计算机系统 928。
系统900可以包括附接至标记化合物936的核苷酸932。标记化合物 936可以包括某一部分。标记化合物936可以是本文所述的任何标记化合物。该部分可以是本文所述的任何部分。
系统900可以包括储器940。储器940可以与隧穿结流体连通。注入系统可以构造为用于将液体从储器940输送到隧穿结。储器940可以包括附接至标记化合物936的核苷酸932。储器940可以包括水。在一些实施方案中，系统900可以包括多个储器。每个储器可包括要注入到隧穿结的不同液体。例如，四种核苷酸中的每一种可以使用不同的储器。可以包括另外的储器来输送水以冲洗隧穿结处的核苷酸。
系统900可以包括多个隧穿结。多个隧穿结的数量可以为每平方厘米数千、数百万或数十亿。每个隧穿结可以在同一基板的表面上。基板可以包括半导体晶片，该半导体晶片包括硅晶片或绝缘体上硅晶片。可以使用半导体加工技术来制造每个隧穿结。每个隧穿结可以是相同的。电源920 可以与多个隧穿结电通信。仪表装置924或多个仪表装置可以与多个隧穿结电通信。
B.磁隧穿结系统
1.单个磁隧穿结
图10示出示例系统1000。系统1000可以包括隧穿结。隧穿结包括第一铁磁层1004、第二铁磁层1008和绝缘层1012。用于铁磁层的材料可以包括钴；Co/I/La2/3Sr1/3MnO3(LSMO)，其中I为SrTiO3(STO)、Ce0.69La0.31或O1.845(CLO)；CoGd；CoPt；CoFe；CoFeB；CoFeTb；铁；Fe2O3； FeOFe2O3；NiOFe2O3；CuOFe2O3；MgOFe2O3；MnBi；Ni；MnSb； MnOFe2O3；Y3Fe5O12；MnAs；Gd；Tb；Dy或EuO。两个铁磁层的材料可以相同或不同。一个铁磁层可以是具有一种极性的永磁体。另一铁磁层的极性可以通过施加的磁场来设定。
绝缘层1012可以包括介电材料，包括氧化铝(Al2O3)、二氧化铪 (HfO2)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、玻璃、石英、氧化镁(MgO)、二氧化钛(TiO2)或二氧化锆(ZrO2)。绝缘层1012可以具有大于2nm的厚度。该厚度可以是第一铁磁层1004和第二铁磁层1008之间的距离。因为隧穿结的操作不需要核酸分子的一个或多个核苷酸与两个铁磁层接触，所以绝缘层的宽度可以大于一个或多个核苷酸的大小。另外，绝缘层的宽度可以大于该部分的大小，因为即使该部分小于铁磁层之间的间隙，隧穿仍然可能发生。
隧穿结可以横向定向，使得隧穿方向基本上平行与第一电极和第二电极接触的基板的表面。新生链的延伸长方向可以平行于基板的表面。绝缘层可具有与基板正交的纵轴。美国专利公开号2018/0031523 A1中描述了横向定向隧穿结的示例，该专利的内容通过引用并入本文以用于所有目的。
核酸聚合酶1016可以附接至隧穿结。核酸聚合酶1016可以在绝缘层 1012处附接至隧穿结。一种或多种化合物可以将核酸聚合酶1016栓系到绝缘层1012。例如，对苯二酚、SpyTag或SpyCatcher可用于将核酸聚合酶1016栓系到绝缘层1012。核酸聚合酶1016可以构造为用于延伸新生链。新生链可以与模板母链杂交。
然而，核酸聚合酶1016可以不附接至隧穿结。磁隧穿结不需要某一部分与隧穿结的任何部位接触，因为来自部分的磁场可以与空白空间一起传播穿过材料。磁隧穿结可以嵌入非铁磁材料中，该非铁磁材料可以附接至核酸聚合酶1016。
系统1000可以包括电源1020。电源1020可以与第一铁磁层1004和第二铁磁层1008中的至少一者电通信。电源1020可以将电压施加到第一铁磁层1004和第二铁磁层1008。电源1020可以构造为用于维持期望的电流或期望的电压。电源1020可以提供0到3V，包括10mV到100mV、 100mV到200mV、200mV到300mV、300mV到500mV、500mV到1 V、1V到2V或2V到3V的电压。在一些实施方案中，电源1020可以提供0到10μA，包括1pA到10pA、10pA到100pA、100pA到1nA、 1nA到10nA、10nA到30nA、30nA到100nA、100nA到500nA、500 nA到1μA或1μA到10μA的电流。
系统1000还可以包括仪表装置1024。仪表装置1024可以构造为用于测量穿过第一铁磁层1004和第二铁磁层1008的电特征值或磁特征值。仪表装置1024可以是电流表、电压表或示波器。电特征可以是电流或电压。仪表装置1024可以是用于测量磁场的磁传感器。
系统1000可以包括计算机系统1028。计算机系统1028可以与电源 1020和仪表装置1024通信。计算机系统1028也可以与将流体输送到隧穿结的控制系统通信。计算机系统1028可以包括处理器和计算机可读介质。计算机可读介质可以存储多个指令。多个指令由进程执行时，可以使处理器执行本文所述的任何方法。例如，多个指令在被执行时可以使处理器测量穿过第一铁磁层和第二铁磁层的电特征值。还可以使处理器将该电特征值与电特征参考值进行比较。一确定该值超过参考值，就可以进一步使处理器检测核苷酸为与模板母链杂交的。一确定该值不超过参考值时，可以进一步使处理器确定不存在与模板母链杂交的核苷酸。下面更详细地描述计算机系统1028。
系统1000可以包括附接至标记化合物1036的核苷酸1032。标记化合物1036可以包括某一部分。标记化合物1036可以是本文所述的任何标记化合物。该部分可以是本文所述的任何部分。
系统1000可以包括储器1040。储器1040可以与隧穿结流体连通。注入系统可以构造为用于将液体从储器1040输送到隧穿结。储器1040可以包括附接至标记化合物1036的核苷酸1032。储器1040可以包括水。在一些实施方案中，系统1000可以包括多个储器。每个储器可包括要注入到隧穿结的不同液体。例如，四种核苷酸中的每一种可以使用不同的储器。可以包括另外的储器来输送水以冲洗隧穿结处的核苷酸。
2.多个隧穿结
系统1000可以包括多个隧穿结。多个隧穿结的数量可以为每平方厘米数千、数百万或数十亿。每个隧穿结可以在同一基板的表面上。基板可以包括半导体晶片，该半导体晶片包括硅晶片或绝缘体上硅晶片。可以使用半导体加工技术来制造每个隧穿结。每个隧穿结可以是相同的。电源 1020可以与多个隧穿结电通信。仪表装置1024或多个仪表装置可以与多个隧穿结电通信。
图11示出用于制造多个磁隧穿结的加工阶段。在阶段1110，将导电材料沉积到基板1114上并图案化为线1112。在完成的设备中，线1112可以类似于常规存储系统中的字线或位线。
在阶段1120，将第一铁磁材料1122、绝缘材料1124和第二铁磁材料 1126作为层沉积在线1112的顶部上。
在阶段1130，将第一铁磁材料1122、绝缘材料1124和第二铁磁材料 1126图案化以形成包括隧穿结1132的多个隧穿结。隧穿结1132作为圆柱形示出。然而，隧穿结1132可以包括其他形状，包括实心矩形、立方体或圆锥形。
在阶段1140，沉积绝缘材料1142。绝缘材料1142可以沉积到与隧穿结1132相同的高度。绝缘材料1142可以填充隧穿结之间的空间，同时使第二铁磁材料1126暴露。
在阶段1150，在绝缘材料1142上沉积导电材料并图案化为线1152。线1152与多个隧穿结的第二铁磁材料1126接触。线1152可以类似于常规存储系统中的字线或位线，而线1152是作为线1112的另一种类型的线。
在阶段1160，将绝缘材料1142图案化以暴露线1112。图案形成由线 1152和线1152下方的绝缘材料1142限定的通道1162。通道1162可以促进核苷酸和流体流向隧穿结。
图1170示出隧穿结1172的放大图。隧穿结1172可以嵌入在绝缘材料块1174中。当部分1176在隧穿结1172附近时，隧穿结1172可能会产生高于参考值的隧穿电流，但是部分1176不与隧穿结1172接触。部分 1176可以与绝缘材料1174接触。线1178和线1180可用于检测穿过隧穿结1172的隧穿电流。
V.实施例
A.制造垂直电隧穿结
制造垂直电隧穿结以测试具有不同厚度的绝缘层、不同的绝缘材料和不同的施加电压的隧穿电流。
图12示出用于材料表征的所制造的垂直电隧穿结的构造。隧穿结是通过绝缘层1212隔开的第一铂层1204和第二铂层1208。绝缘层1212的材料是氧化铝(Al2O3)、二氧化铪(Hf1O2)或氧化镁(MgO)。
沉积二氧化硅1216并将其图案化以将触点1220、1224和1228电隔离。触点1220、1224和1228是金。隧穿结可以连接至电源1240和电流表 1244。
B.垂直电隧穿结的电学结果。
图13A和13B示出测试具有与图12所示类似构造的垂直隧穿结的电学结果。垂直隧穿结制造为圆形而不是正方形。R7和R8是指结直径为 500nm的装置。R9和R10是指结直径为750nm的装置。R11和R12是指结直径为1μm的装置。图13A示出装置的电流与电压的关系。该装置示出整流行为，其表明通过隧穿进行电子传输。图13B示出装置的电流量除以电压平方对电流除以电压所得的自然对数。该图示出从直接隧穿到 Fowled-Nordheim隧穿的过渡，证实了通过隧穿进行的电子传输。这些图表明，制造的垂直隧穿结可以通过量子隧穿而不是陷阱辅助隧穿来描述，这将显示RTN的证据。
C.制作横向电隧穿结
制造横向电隧穿结以测试具有不同厚度的绝缘层、不同的绝缘材料和不同的施加电压的隧穿电流。
图14A示出制造的横向隧穿结装置1400的构造。第一电极1404和第二电极1408通过绝缘层1412隔开。第一电极1404和第二电极1408均为铂。绝缘层1412的材料是氧化铝(Al2O3)、二氧化铪(HfO2)或氧化镁 (MgO)。第一电极1404和第二电极1408可以与电源1416和电流表1420 电通信。第一电极1404、第二电极1408和绝缘层1412中的每一个的厚度为20nm。与电极接触绝缘层1412的位置相邻的第一电极1404、第二电极 1408和绝缘层1412的宽度为50nm。结面积为1,000nm2。感应面积为20 nm2。
图14B是制造的横向隧穿结的图示。绝缘平面1424设置在第一电极 1404、第二电极1408和绝缘层1412的顶部上。绝缘平面1424可以是二氧化硅，并且可以在通过CMP限定结区域之后沉积。触点1428和1432允许与隧穿结的电通信。横向隧穿结在基板1436的顶部上。标记1440是用于确定电极高度的度量标记，设备功能不需要它。
D.横向隧穿结的电学结果
图15A、15B、15C和15D示出测试具有图14B中所示构造的横向电隧穿结的电学结果。
图15A示出不同厚度的Al2O3绝缘层的电流与电压的关系。测试的厚度为1.04nm、2.54nm、3.49nm和4.23nm。较厚的绝缘层导致在不同电压下的隧穿电流较小。
图15B示出2.53nm厚的绝缘层的电流与电压的关系。不同的线用于 400nm、500nm、600nm、700nm、800nm和1,300nm的结宽度。IV曲线示出整流行为，其表明通过隧穿进行电子传输。电流波动示出RTN归因于制造过程中引入的电荷陷阱的证据。
图15C示出对于具有2.53nm厚的绝缘层的装置的电流量除以电压平方对电流除以电压所得的自然对数。
图15D示出3.49nm厚的绝缘层的电流与电压的关系。不同的线用于 400nm、500nm、600nm、700nm、800nm和1,300nm的结宽度。IV曲线示出整流行为，其表明通过隧穿进行电子传输。电流波动示出RTN归因于制造过程中引入的电荷陷阱的证据。
VI.示例系统
图16示出示例性的分析系统。图16所示的系统包括分析装置1602 和作为计算机系统1606的一部分的智能模块1604。分析装置1602可以包括系统900、系统1000或本文描述的任何系统。计算机系统1606可以包括计算机系统10的一部分或全部。经由网络连接或直接连接将数据集(电特征性数据集)从分析装置1602传送到智能模块1604，反之亦然。例如数据集可以被处理以鉴定核苷酸。鉴定步骤可以由存储在计算机系统1606 的硬件上的软件来实现。可以通过在处理器上运行并存储在智能模块的存储装置上的计算机代码来处理数据集，并且在处理后将其传输回分析模块的存储装置，其中修改后的数据可以在显示设备上显示。在一些实施方案中，智能模块也可以在分析装置中实现。
图17示出计算机系统1700可以包括施加模块1710，其可以包括例如在通过绝缘层分开的第一电极和第二电极之间施加电压。计算机系统1700 可以是现场可编程门阵列(FPGA)或专用集成电路(ASIC)计算机。计算机系统1700还可包括测量模块1720，其可包括测量穿过第一电极和第二电极的电特征值。计算机系统1700可进一步包括接收模块，其可包括从分析系统接收电特征值。计算机系统1700还可包括检测模块，例如，其可包括使用该电特征值检测与所述模板母链杂交的核苷酸。
本文提到的任何计算机系统都可以利用任何合适数量的子系统。这种子系统的示例在图18的计算机系统1 0中示出。在一些实施方案中，计算机系统包括单个计算机设备，其中子系统可以是计算机设备的组件。在其他实施方案中，计算机系统可以包括多个计算机设备，每个计算机设备是具有内部组件的子系统。计算机系统可以包括台式计算机和膝上型计算机、平板电脑、移动电话和其他移动装置。计算机系统10可以是现场可编程门阵列(FPGA)或专用集成电路(ASIC)计算机。
图18所示的子系统经由系统总线75互连。示出附加子系统，诸如打印机74、键盘78、存储装置79、监视器76(其与显示适配器82联接) 等。联接至输入/输出(I/O)控制器71的外围装置和I/O装置可以通过本领域中已知的任何数量的机构(例如输入/输出(I/O)端口77(例如USB，Thunderbolt)与计算机系统连接。例如，I/O端口77或外部接口81(例如，以太网，Wi-Fi等)可用于将计算机系统10连接至广域网诸如因特网、鼠标输入装置或扫描仪。通过系统总线75的互连允许中央处理器73与每个子系统通信并控制来自系统存储器72或一个或多个存储装置 79(例如，固定磁盘诸如硬盘，或光盘)的指令的执行以及子系统之间的信息交换。系统存储器72和/或存储装置79可以具体表现为计算机可读介质。另一个子系统是数据收集装置85，诸如照相机、麦克风、加速计等。本文提到的任何数据都可以从一个组件输出到另一组件，并可以输出给用户。
计算机系统可以包括多个相同的组件或子系统，例如通过外部接口81 或内部接口连接在一起。在一些实施方案中，计算机系统、子系统或装置可以在网络上通信。在这种情况下，一台计算机可视为客户端，另一台计算机可视为服务器，其中每台计算机可视为同一计算机系统的一部分。客户端和服务器可以各自包含多个系统、子系统或组件。
应当理解的是，本发明的任何实施方案都可以使用硬件(例如，专用集成电路或现场可编程门阵列)和/或使用具有模块化或集成模式的一般可编程处理器的计算机软件以控制逻辑的形式实现。如本文所用，处理器包括单核处理器、在同一集成芯片上的多核处理器、或在单个电路板上或联网的多个处理单元。基于本文提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将知道并理解使用硬件以及硬件和软件的组合来实现本发明的实施方案的其他方式和/或方法。
可以使用任何合适的计算机语言诸如Java、C、C++、C#、Objective- C、Swift或脚本语言诸如Perl或Python，使用例如传统技术或面向对象技术，将本申请中描述的任何软件组件或功能实现为由处理器执行的软件代码。可以将软件代码作为一系列指令或命令存储在计算机可读介质上，以进行存储和/或传输。合适的非暂时性计算机可读介质可以包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、磁性介质诸如硬盘驱动器或软盘、或者光学介质诸如光盘(CD)或DVD(数字通用光盘)、闪存等。计算机可读介质可以是此类存储装置或传输装置的任何组合。
也可以使用载波信号对此类程序进行编码和传输，该载波信号适合于通过符合包括互联网在内的各种协议的有线、光学和/或无线网络进行传输。这样，可以使用以此类程序编码的数据信号来创建根据本发明的实施方案的计算机可读介质。可以将以程序代码编码的计算机可读介质与兼容装置打包在一起，或者与其他装置分开提供(例如，通过互联网下载)。任何此类计算机可读介质可以驻留在单个计算机产品(例如，硬盘驱动器、CD或整个计算机系统)上或内部，并且可以存在于系统或网络内的不同计算机产品上或内部。计算机系统可以包括监视器、打印机或其他合适的显示器，用于向用户提供本文提到的任何结果。
本文描述的任何方法可以由包括一个或多个处理器的计算机系统完全或部分地执行，该计算机系统可以构造为用于执行步骤。因此，实施方案可以针对构造为用于执行本文描述的任何方法的步骤的计算机系统，可能具有执行相应步骤或相应步骤组的不同组件。尽管以编号的步骤呈现，但是本文的方法的步骤可以同时或以不同顺序执行。另外，这些步骤的部分可以与其他方法的其他步骤的部分一起使用。而且，步骤的全部或部分可以是可选的。另外，任何方法的任何步骤都可以用模块、单元、电路或其他用于执行这些步骤的机构来执行。
在不脱离本发明实施方案的精神和范围的情况下，可以以任何合适的方式组合特定实施方案的具体细节。然而，本发明的其他实施方案可以针对与每个单独方面或者这些单独方面的特定组合有关的特定实施方案。
为了说明和描述的目的，已经给出了本发明的示例实施方案的以上描述。并不旨在穷举本发明或将本发明限制为所描述的精确形式，并且根据以上教导，许多修改和变化是可能的。
在前面的描述中，出于解释的目的，已经阐述了许多细节以便提供对本技术的各种实施方案的理解。然而，对于本领域技术人员将显而易见的是，可以在没有这些细节中的一些或具有其他细节的情况下实践某些实施方案。
已经描述了几个实施方案，本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神的情况下，可以使用各种修改、替代架构和等同形式。另外，为了避免不必要地使本发明晦涩难懂，没有描述许多众所周知的过程和元件。另外，任何特定实施方案的细节可能并不总是存在于该实施方案的变型中，或者可以添加到其他实施方案。
在提供值的范围的情况下，应理解的是，除非上下文另外明确指出，否则也具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，精确至下限单位的十分之一。涵盖了规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围外，并且其中一个或两个限值包括在较小范围内或两个限值均不包括在较小范围内的每个范围也都为本发明所涵盖，以任何被具体排除在规定范围外的限值为准。在规定范围包括一个或两个限制的情况下，还包括排除那些包括的限制中的一个或两个的范围。
如在本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一种方法”包括多种此类方法，并且提及“该部分”包括提及本领域技术人员已知的一个或多个部分及其等同物，等等。为了清楚和理解的目的，现在已经详细描述了本发明。但是，应当理解，在所附权利要求书的范围内可以进行某些改变和修改。

Claims (11)

1.一种使用测序装置确定核酸序列的方法，所述方法包括：
向所述测序装置添加一组核苷酸，其中：
所述一组核苷酸中的每个核苷酸均附接至包含某一部分的标记化合物，其中，所述部分选自由有机金属化合物、纳米颗粒、共轭芳族化合物和导电有机分子组成的组；
所述测序装置包括隧穿结，并且
所述隧穿结包括由绝缘层隔开的第一导体和第二导体；
使用附接至所述隧穿结并连接至待测序模板母链的聚合酶来延伸新生链，其中所述延伸包括使用聚合酶通过与所述模板母链杂交而将所述一组核苷酸中的第一核苷酸掺入所述新生链中；
测量穿过所述第一导体、附接至所述第一核苷酸的第一标记化合物的第一部分和所述第二导体的电特征或磁特征的值；以及
使用所述电特征或所述磁特征的值检测与所述模板母链杂交的所述第一核苷酸；其中：
所述第一导体是第一电极，
所述第二导体是第二电极，
测量所述电特征或所述磁特征的值包括测量所述电特征的值，并且检测与所述模板母链杂交的所述第一核苷酸包括使用所述电特征的值；
并且所述方法进一步包括：
在所述第一导体和所述第二导体之间施加电压；并且
其中，基于所述电特征的值检测与所述模板母链杂交的所述第一核苷酸，其包括：
将所述电特征的值与所述电特征的参考值进行比较，以及
确定所述值超过参考值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述参考值是穿过所述第一电极和所述第二电极并且不穿过所述部分的背景隧穿电流的值。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述电特征是电流，并且所述值大于10nA。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标记化合物包含终止子，所述终止子构造为阻止所述新生链的进一步延伸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述一组核苷酸中的每个核苷酸都是相同类型的核苷酸，并且
附接至所述一组核苷酸中的每个核苷酸的每个标记化合物的每个部分都是相同类型的部分。
6.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述一组核苷酸包含第二核苷酸，所述第二核苷酸附接至包含第二部分的第二标记化合物，
基于所述电特征的值检测与所述模板母链杂交的所述第一核苷酸，其包括：
将所述电特征的值与所述电特征的第一参考值进行比较，所述方法进一步包括：
通过比较所述电特征的值与所述电特征的第二参考值，基于所述电特征的值确定所述第二核苷酸未与模板母链杂交。
7.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述测序装置包括多个隧穿结，
每个隧穿结包括相应第一电极、相应第二电极和相应绝缘层，并且每个相应隧穿结均附接至相应聚合酶，
所述方法进一步包括：
对于所述多个隧穿结中的每个隧穿结：
使用附接至所述相应隧穿结并连接至待测序的相应模板母链的所述相应聚合酶来延伸相应新生链，其中所述延伸包括使用所述相应聚合酶通过与所述相应模板母链杂交而将所述一组核苷酸中的相应核苷酸掺入所述相应新生链中；
跨所述相应隧穿结的所述相应第一电极和所述相应第二电极施加相应电压，
测量穿过所述相应第一电极、附接至所述相应核苷酸的相应标记化合物的相应部分和所述相应第二电极的所述电特征的相应值，以及
使用所述电特征的相应值检测与所述相应模板母链杂交的所述相应核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其进一步包括：
去除所述一组核苷酸中的尚未掺入新生链中的剩余核苷酸，其中去除所述一组核苷酸发生在测量所述电特征的值之前。
9.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述第一导体包含第一铁磁材料，并且
所述第二导体包含第二铁磁材料。
10.一种用于分析核酸分子的系统，所述系统包括：
隧穿结，其包含由绝缘层隔开的第一导体和第二导体；
聚合酶，其附接至所述隧穿结并连接至模板母链，所述聚合酶构造为延伸与所述模板母链杂交的新生链；
电源，其与所述第一导体和所述第二导体中的至少一者电通信；
一组核苷酸，所述一组核苷酸中的每个核苷酸均附接至包含某一部分的标记化合物，其中，所述部分选自由有机金属化合物、纳米颗粒、共轭芳族化合物和导电有机分子组成的组，
仪表装置，其配置为测量经由所述部分穿过所述第一导体和所述第二导体的特征的值，所述特征是电特征或磁特征；和
一种存储有多个指令的非暂时性计算机可读介质，所述多个指令在由处理器执行时使所述处理器：
测量穿过所述第一导体和所述第二导体的所述特征的值，
将所述特征的值与所述特征的参考值进行比较，并且
一确定所述值超过所述参考值，则检测核苷酸为与所述模板母链杂交的，其中：
所述第一导体是第一电极，
所述第二导体是第二电极，
所述隧穿结设置在基板的表面上，
所述绝缘层具有与所述基板的表面平行的表面，并且
所述特征是所述电特征；并且
其中，所述聚合酶在与所述基板平行的所述表面处的所述绝缘层处附接至所述隧穿结。
11.根据权利要求10所述的系统，其中：
所述第一导体包含第一铁磁材料，并且
所述第二导体包含第二铁磁材料。
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