CN112070711A - 一种微液滴图像检测法中微液滴的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种微液滴图像检测法中微液滴的分析方法,所述分析方法包括以下步骤:训练一个能对输入图像进行二分类的卷积神经网络分类器,利用霍夫变换处理待检测微液滴图像,得到所述微液滴图像中每个液滴疑似物的具体位置,将所有所述微液滴疑似物的图像提取出来;和每个微液滴疑似物图像送入S1训练好的分类器中,分类器判读该待测微液滴图像中液滴哪些是合格的液滴,哪些是不合格的液滴。本发明本法采用霍夫变换和深度学习的方法,相比于传统数字图像处理方法,不仅能够更准确的识别微液滴,而且能够对识别到的微液滴进行质检,避免不合格液滴对后续分析带来的干扰而带来的假阳性情况。
Description
技术领域
本发明涉及微液滴领域,特别涉及一种微液滴图像检测法中微液滴的分析方法。
背景技术
微液滴数字PCR由于其极高的灵敏度与准确性,已经在生物医学检测领域取得了广泛的应用,该技术将DNA或者RNA样本稀释并分散在几万个甚至几百万个独立的微液滴中,每个反应单元中包含零个或一个或多个目标份子(DNA或者RNA模版),在所有的微液滴完成扩增后,分析每个液滴中的荧光信号强度,并结合数学工具实现样本中核酸浓度的检测。
在对扩增后的微液滴进行检测时,成像法是一种成熟且优良的检测方法。然而在大视野成像中,一张图像中可能含有几十万甚至百万个微液滴,由于光照条件往往是不均匀的,处在边缘的液滴往往表现出与处在中央部分的液滴不同的特征。在传统的处理方法中,常常使用霍夫变换作为基本原理,这种方法需要预先设置霍夫变换的严格程度,如果采用标准严格的霍夫变换,往往会产生漏检现象,如果采用标准宽松的霍夫变换,往往会产生误检现象。
在液滴的生成、扩增过程中,可能会将不溶性的杂质引入微液滴中;在液滴的检测过程中,微流控芯片上也可能吸附空气中的灰尘,二者都使得原本的液滴图像被破坏,在后续的检测过程中,不合格的液滴往往具有极高的荧光强度,很有可能产生假阳性问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述微液滴图像处理方法的不足,提供一种微液滴图像检测法中微液滴的分析方法,其特征在于,所述分析方法包括以下步骤:S1:训练一个能对输入图像进行二分类的卷积神经网络分类器,该网络用于识别和判断待检测微液滴图像中液滴哪些是合格的液滴,哪些是不合格的液滴;S2:利用霍夫变换处理待检测微液滴图像,得到所述微液滴图像中每个液滴疑似物的具体位置;S3:将所有所述微液滴疑似物的图像提取出来;S4:将每个微液滴疑似物图像送入S1训练好的分类器中,分类器判读该待测微液滴图像中液滴哪些是合格的液滴,哪些是不合格的液滴。
在一种实施方式中,所述S1包括以下步骤:S11:利用检测器在成像参数下拍摄一定数量的微液滴图像;S12:利用霍夫曼变换对S11中拍摄的微液滴图像进行识别,得到微液滴图像中所有微液滴疑似物在各自图像中的具体位置;S13:将S12中每一个微液滴疑似物的小型图像截取取出来,使微液滴疑似物的中心位于所述小型图像中心;S14:手动标记S13中得到的每一个液滴疑似物的小型图像,区分所述微液滴疑似物中哪些是合格的微液滴或者不合格的微液滴,将这些小型图像和手动标注的标签整合形成数据集;S15:搭建一个含有输入层、卷基层一、池化层一、卷基层二、池化层二、全链接层一、全链接层二、输出层的卷积神经网络;和S16:把S14中得到的所述数据集进行预处理,然后输入S15中搭建的卷积神经网络中训练,直到该神经网络成为对输入图像进行二分类的卷积神经网络分类器。
在一种实施方式中,S12中霍夫变换借助Matlab软件中的imfindcircle函数实现,该函数通过霍夫变换识别图像中的圆形物体。
在一种实施方式中,S16中把S14中得到的所述数据集进行预处理,包括将S14中数据集的每一张小型图像转化为灰度图,并对灰度图像进行归一化处理,使灰度值在0到1之间。
在一种实施方式中,S15中模仿“LeNet”网络结构搭建所述卷积神经网络。
在一种实施方式中,S16中将所述数据集中一部分数据作为为训练集,另外一部分作为测试集,将训练集送入S15中搭建的卷积神经网络中,对该网络进行反复训练,并利用测试集不断测试,直到该网络的分类表现达到成为对输入图像进行二分类的卷积神经网络分类器的要求。
在一种实施方式中,S2中还包括利用检测器获得待检测微液滴的原始图像,成像时参数与S11中成像参数保持一致。
在一种实施方式中,S2中霍夫曼变换与S12中霍夫曼变换的参数保持一致。
在一种实施方式中,S3中图像提取出来的尺寸与S13中小型图像尺寸一致。
在一种实施方式中,S4中还包括将每个微液滴疑似物图像进行预处理,即将S3中得到的每一个液滴疑似物的小型图像转化为灰度图并进行归一化处理,使灰度值在0到1之间。
本发明方法能够准确在多种复杂成像条件下准确识别液滴的个数与位置,并且能够对液滴进行质检,标记出不合格的液滴,提高后续荧光分析的准确度,避免假阳性的现象。
本发明方法采用霍夫变换和深度学习的方法,相比于传统数字图像处理方法,不仅能够更准确的识别微液滴,而且能够对识别到的微液滴进行质检,避免不合格液滴对后续分析带来的干扰而带来的假阳性情况。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明的一种实施方式的流程图;
图2是本发明一种实施方式中搭建的卷积神经网络分类器的结构图;
图3是本发明中利用霍夫变换得到的原始图片中所有液滴疑似物的具体位置的图像;和
图4是本发明的展示给使用者的液滴质检结果图。。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都应当属于本申请保护的范围。
本发明的目的是利用明场图像准确识别一张图像中微液滴的个数并标记出合格的液滴与不合格的液滴。
本发明中不合格的液滴是成像不清晰的液滴、内部有杂质的液滴、霍夫变换产生的误检液滴、被芯片表面的灰尘覆盖的液滴。本发明中所述的合格液滴是成像清晰且内部无杂质,表面无灰尘覆盖的液滴。
在一种实施方式中,本发明中所述的微液滴单层平铺在一个透明的微流控芯片中,微液滴直径约为70微米,图像可以被检测器采集。
在一种实施方式中,本发明利用单反相机作为检测器,所拍摄的图像为4096x6620像素的RGB图像,每张图像中大约含有1万个微液滴。
如图1所示,本发明一种微液滴图像检测法中微液滴的分析方法,该分析方法通过霍夫变换和深度学习对液滴进行识别与质检,具体方法如下:
S1:训练一个能对输入图像进行二分类的卷积神经网络分类器,该网络用于识别和判断待检测微液滴图像中液滴哪些是合格的液滴,哪些是不合格的液滴;
S2:利用霍夫曼变换处理待检测微液滴图像,得到所述微液滴图像中每个微液滴疑似物的具体位置;
S3:将所有微液滴疑似物的图像提取出来;
S4:将每个微液滴疑似物图像送入S1训练好的分类器中,分类器判读该待测微液滴图像中液滴哪些是合格的液滴,哪些是不合格的液滴。
在本实施例中,所述S1步骤包括:
S11:在确定的光照强度下,单反相机曝光时间0.1s、ISO值为3200,拍摄10张不同批次微液滴的图像,所有图像中微液滴的总数大约为10万个。
S12:利用霍夫变换对10张液滴图像进行识别处理,得到10张图像中所有液滴疑似物的具体位置,为后续数据集的建立做准备。本步骤中的霍夫变换借助Matlab软件中的imfindcircle函数实现,该函数通过霍夫变换识别图像中的圆形物体。imfindcircle函数需要提前设置查找模式A、目标半径极值Rmax和Rmin、严格程度h等参数。A、Rmax、Rmin的大小根据实际情况确定(本实施例中A为“bright”,Rmax为13,Rmin为10),h的大小需要通过不断调试确定。
h的取值范围是[0,1]。h越接近零时,函数严格程度越高,此时只有严格的圆形物体才会被检测出来;h越接近1,函数的严格程度越低,此时只要稍有圆形特征的物体都会被检测出来。检测到的结果不论是真正的液滴还是误检产生的错误,我们统一将识别得到的结果称为液滴疑似物。
数据集需要既包含真正的液滴图像,也包含误检产生的错误图像。所以在此步骤中,为了使得霍夫变换的识别结果中既有真正的液滴,也有误检的结果,我们应该采取较高的h值。
h值的确定方法如下:首先设定一个偏小的h值(h0),本实施例中h0为0.3;然后利用h等于h0的imfindcircle函数处理某一张图像,观察识别结果,如果结果中不存在误检现象,那么应该不断增大h的值使得误检情况出现;当误检情况出现后,进一步增大h值,直到误检结果数大约为总液滴数的10%时,停止增大h并记录当前h值(h1),本实施例中h1为0.93;将h1值作为imfindcircle函数的严格程度参数批量处理所有10张图像,便可得到所有液滴疑似物的具体位置。
S13:将S12中每一个液滴疑似物的小型图像提取出来,使液滴疑似物的中心位于小型图像中心;小型图像的尺寸应该与分类器的输入层结构一致,本实施例中小型图像的大小应该为32像素x32像素。
S14:手动标记S13中得到的每一个液滴疑似物的小型图像,区分哪些液滴疑似物是合格的液滴,哪些液滴疑似物是不合格的液滴,将这些小型图像和手动标注的标签整合形成数据集。
S15:搭建一个含有输入层,卷积层一,池化层一,卷积层二,池化层二,全链接层一,全链接层二,输出层的卷积神经网络;该网络在搭建时,模仿了经典的“LeNet”网络结构,详见图2。
S15中所述的输入层可以输入32x32像素的RGB图像,卷积层一共有32张特征图,每张图像的尺寸为32x32像素,该层卷积核的大小为5x5像素;池化层一共有32张特征图,每张特征图的尺寸为16x16像素,池化层一采用2x2最大池化的方法;卷积层二共64张特征图,每张特征图的大小为16x16像素;池化层二共有64张特征图,每张特征图的尺寸为8x8,池化层二采用2x2最大池化的方法;全链接层一共有4096个神经元;全链接层二共有1024个神经元;输出层只有一个神经元,采用sigmoid激活函数。
S16:预处理过程,将S14中数据集的每一张小型图像转化为灰度图,并对灰度图像进行归一化处理,使灰度值在0到1之间。这使得后续的神经网络计算更准确快速。取数据集中80%的数据作为训练集,取剩下20%的数据作为测试集。在选取时,应该保证训练集和测试集中合格液滴与不合格液滴的比例近似相同。将训练集送入S16中搭建的卷积神经网络中,对网络进行反复训练,并利用测试集不断测试。直到该网络的分类表现达到要求。
在本实施例中,所述S2步骤包括:利用单反相机拍摄待检测液滴的原始图像,光照条件和单反相机的成像参数应该与步骤S11保持一致。设置霍夫变换所需要的参数,其中imfindcircle函数的所有参数应该与S12中的参数保持一致。利用imfindcircle函数查找原始图像中的圆形部分,我们将得到原始图像中所有液滴疑似物的具体位置,将所有液滴疑似物用黑色的圆圈标出,如图3所示。
本实施例中,所述s3步骤包括:在原始图像中,截取每个液滴疑似物的小型图像,液滴疑似物的中心应该位于小型图像中心,小型图像应该与S13中小型图像的尺寸相同。
在本实施例中,所述S4步骤包括:预处理过程,将S3中得到的每一个液滴疑似物的小型图像转化为灰度图并进行归一化处理,使灰度值在0到1之间。将每个预处理后的液滴疑似物的小型图像送入S1训练好的分类器中,分类器判断哪些液滴疑似物是合格的液滴,哪些液滴疑似物是不合格液滴。
在一些实施方式中,本发明方法还包括S5后续处理步骤,其包括:
S51:如果分类器判断某个液滴疑似物是合格液滴,则在检测结果中保留该合格液滴,它可以参与后续的荧光分析,如果该液滴疑似物是不合格液滴,则在检测结果中删除该不合格液滴,它不参与后续的荧光分析;
S52:将合格的液滴用黑色圆圈在原始图像中表示出来,将不合格的液滴用白色叉符号在原始图像中表示出来,展示在使用者面前。使用者也可以根据实际情况补充或修改液滴识别与质检的结果。展示结果如图4所示。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (10)
1.一种微液滴图像检测法中微液滴的分析方法,其特征在于,所述分析方法包括以下步骤:
S1:训练一个能对输入图像进行二分类的卷积神经网络分类器,该网络用于识别和判断待检测微液滴图像中液滴哪些是合格的液滴,哪些是不合格的液滴;
S2:利用霍夫变换处理待检测微液滴图像,得到所述微液滴图像中每个液滴疑似物的具体位置;
S3:将所有所述微液滴疑似物的图像提取出来;
S4:将每个微液滴疑似物图像送入S1训练好的分类器中,分类器判读该待测微液滴图像中液滴哪些是合格的液滴,哪些是不合格的液滴。
2.根据权利要求1的所述分析方法,其特征在于,所述S1包括以下步骤:
S11:利用检测器在成像参数下拍摄一定数量的微液滴图像;
S12:利用霍夫曼变换对S11中拍摄的微液滴图像进行识别,得到微液滴图像中所有微液滴疑似物在各自图像中的具体位置;
S13:将S12中每一个微液滴疑似物的小型图像截取取出来,使微液滴疑似物的中心位于所述小型图像中心;
S14:手动标记S13中得到的每一个液滴疑似物的小型图像,区分所述微液滴疑似物中哪些是合格的微液滴或者不合格的微液滴,将这些小型图像和手动标注的标签整合形成数据集;
S15:搭建一个含有输入层、卷基层一、池化层一、卷基层二、池化层二、全链接层一、全链接层二、输出层的卷积神经网络;
S16:把S14中得到的所述数据集进行预处理,然后输入S15中搭建的卷积神经网络中训练,直到该神经网络成为对输入图像进行二分类的卷积神经网络分类器。
3.根据权利要求2的所述分析方法,其特征在于,S12中霍夫变换借助Matlab软件中的imfindcircle函数实现,该函数通过霍夫变换识别图像中的圆形物体。
4.根据权利要求2的所述分析方法,其特征在于,S16中把S14中得到的所述数据集进行预处理,包括将S14中数据集的每一张小型图像转化为灰度图,并对灰度图像进行归一化处理,使灰度值在0到1之间。
5.根据权利要求2的所述分析方法,其特征在于,S15中模仿“LeNet”网络结构搭建所述卷积神经网络。
6.根据权利要求2的所述分析方法,其特征在于,S16中将所述数据集中一部分数据作为为训练集,另外一部分作为测试集,将训练集送入S15中搭建的卷积神经网络中,对该网络进行反复训练,并利用测试集不断测试,直到该网络的分类表现达到成为对输入图像进行二分类的卷积神经网络分类器的要求。
7.根据权利要求2的所述分析方法,其特征在于,S2中还包括利用检测器获得待检测微液滴的原始图像,成像时参数与S11中成像参数保持一致。
8.根据权利要求2的所述分析方法,其特征在于,S2中霍夫曼变换与S12中霍夫曼变换的参数保持一致。
9.根据权利要求2的所述分析方法,其特征在于,S3中图像提取出来的尺寸与S13中小型图像尺寸一致。
10.根据权利要求1的所述分析方法,其特征在于,S4中还包括将每个微液滴疑似物图像进行预处理,即将S3中得到的每一个液滴疑似物的小型图像转化为灰度图并进行归一化处理,使灰度值在0到1之间。
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