CN112043833A - 一种视网膜色素细胞rpe的自噬和凋亡的抑制剂及其应用 - Google Patents

一种视网膜色素细胞rpe的自噬和凋亡的抑制剂及其应用 Download PDF

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刘彩莹
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Abstract

本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞RPE的自噬和凋亡的抑制剂及其应用，涉及生物医药技术领域。本发明一种视网膜色素上皮细胞RPE的自噬和凋亡的抑制剂，所述抑制剂包括肿瘤坏死因子超家族受体FAS的拮抗剂Met。经验证，肿瘤坏死因子超家族受体FAS可以作为GMFB的受体激活下游自噬和凋亡通路，而其拮抗剂Met则将抑制FAS及其下游相关通路的激活，减少细胞凋亡及自噬反应，从而延缓糖尿病视网膜病变的发病过程，可用于制备发病早期延缓和/或治疗糖尿病视网膜病变的药物。

Description

一种视网膜色素细胞RPE的自噬和凋亡的抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种视网膜色素上皮细胞RPE的自噬和凋亡的抑制剂及其应用。
背景技术
糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病的一种特异性微血管并发症，具有慢性、进行性、潜在危害视力等特征，是工作人群及老年人中首要的致盲原因。全球有超过9300万例DR患者，其中1700万例患有增殖性DR(proliferative DR，PDR)，2800万患有威胁视力的DR(vision threatening DR，VTDR)。我国的流行病调查显示，DR与PDR在中国糖尿病罹患人群中的发病率分别为23％和2.83％，有20年以上糖尿病病程的患者几乎有一半会罹患DR。根据病变严重程度以及新生血管的形成状况，可将DR分为NPDR和PDR。NPDR的主要表现为眼底视网膜微血管瘤、点状和斑状视网膜出血、毛细血管闭塞、视网膜水肿等，其中黄斑区水肿可引起视力下降。而PDR则在非增生性病变的基础上，出现视网膜新生血管、玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离等症状。缺血严重的病例可发生虹膜、房角新生血管形成，最终演变为新生血管性青光眼。
由于DR晚期严重损害视力以致不可恢复，所以及时防治十分重要。目前的主要治疗方式有激光光凝术、玻璃体切割术等，抗VEGF、抗炎症药物及PKC抑制剂等也有一定的治疗作用。但由于现行的治疗手段多针对发病晚期，且均有一定的副作用及预后风险，针对发病前期分子机制和治疗方法的研究迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种视网膜色素上皮细胞RPE的自噬和凋亡的抑制剂及其应用，肿瘤坏死因子超家族受体FAS的拮抗体可以抑制其作为GMFB的受体激活下游自噬和凋亡通路，从而减少细胞凋亡及自噬反应，在发病早期延缓糖尿病视网膜病变的发病过程。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞RPE的自噬和凋亡的抑制剂，所述抑制剂包括肿瘤坏死因子超家族受体FAS的拮抗剂。
优选的，所述拮抗剂包括Met。
优选的，所述拮抗剂抑制肿瘤坏死因子超家族受体FAS作为胶质细胞成熟因子β的受体激活下游自噬和凋亡通路。
本发明还提供了上述抑制剂在制备发病早期延缓和/或治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用。
本发明还提供了一种延缓和/或治疗糖尿病视网膜病变的药物，所述药物包括上述的抑制剂。
本发明首次证实了在DR早期玻璃体中胶质细胞成熟因子GMFB作为一种细胞因子影响到RPE细胞的自噬和凋亡途径，进而加速DR的病变过程。本发明实施例在细胞模型和SD大鼠模型中，肿瘤坏死因子超家族受体FAS可以作为GMFB的受体激活下游自噬和凋亡通路，而其拮抗剂Met则将抑制FAS及其下游相关通路的激活，减少细胞凋亡及自噬反应，从而延缓糖尿病视网膜病变的发病过程。在体外模型中，使用0.025μg/μl的GMFB对ARPE19细胞系进行处理，可以升高细胞中凋亡相关蛋白cleaved-caspase3及自噬相关蛋白LC3、p62的表达，并显示出自噬流的异常，而加入FAS受体的拮抗剂Met(10μg/μl)则将抑制其变化；在体内模型中，向SD大鼠玻璃体腔注射0.2μg GMFB，可以损伤视网膜的正常生理功能，同时检测到与细胞实验同步的分子变化，而和同时注射Mutant组相比，Met组视网膜生理功能显著提高，并显示出凋亡水平的减弱和自噬流的正常进行。
附图说明
图1为玻璃体腔GMFB对大鼠视网膜的影响图，其中A表示玻璃体腔注射GMFB导致SD大鼠视网膜电图b波波幅下降，视网膜功能受损；B和C表示玻璃体腔注射GMFB导致大鼠视网膜凋亡水平升高，自噬前期的激活和自噬降解过程的异常，影响自噬流正常进行；
图2为细胞模型中GMFB胞外处理导致ARPE19凋亡水平升高，自噬前期的激活和自噬降解过程的异常，影响自噬流正常进行；
图3为GMFB受体的筛选过程，使用siRNA文库在ARPE19细胞模型中筛选GMFB受体，发现FAS、TGFBR1等八种受体的siRNA可以减少自噬体和自噬溶酶体的数量，有抑制GMFB引起的自噬异常的作用，其中FAS的表达量较高，且随着GMFB处理其转录水平增加；图C表示使用FAS特异性拮抗剂Met可对细胞表面受体FAS进行封闭，与对照组Mutant相比，可阻碍GMFB引起的自噬流异常，证明FAS为GMFB的细胞膜受体之一；
图4为FAS受体拮抗剂Met与GMFB的作用关系图，其中A表示细胞模型中，FAS受体拮抗剂Met可以抑制GMFB引起的凋亡和自噬流异常；B-D表示动物模型中，同时注射FAS受体拮抗剂Met，可以抑制玻璃体腔GMFB注射引起的视网膜凋亡和自噬流异常，同时减轻GMFB对视网膜功能的损伤。
具体实施方式
本发明提供了一种视网膜色素上皮细胞RPE的自噬和凋亡的抑制剂，所述抑制剂包括肿瘤坏死因子超家族受体FAS的拮抗剂。
在本发明中，所述肿瘤坏死因子超家族受体FAS作为胞外胶质细胞成熟因子β(GMFB)的受体激活下游自噬和凋亡通路，而其拮抗剂则将抑制FAS及其下游相关通路的激活，减少细胞凋亡及自噬反应，从而延缓糖尿病视网膜病变的发病过程。本发明所述拮抗剂优选包括Met。在本发明实施例中，通过体外模型证实，使用0.025μg/μl的GMFB对ARPE19细胞系进行处理，可以升高细胞中凋亡相关蛋白cleaved-caspase3及自噬相关蛋白LC3、ATG5、p62的表达，显示出自噬流的异常，而加入FAS受体的拮抗剂Met(10μg/μl)则将抑制其变化；在体内模型中，在SD大鼠玻璃体腔注射0.2μg GMFB，可以损伤视网膜的正常生理功能，同时检测到与细胞实验同步的分子变化，而和同时注射Mutant组相比，Met组视网膜生理功能显著提高，并显示出凋亡水平的减弱和自噬流的正常进行。
本发明还提供了上述抑制剂在制备发病早期延缓和/或治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定。本发明所述药物中优选还包括药学上可接受的辅料。
本发明还提供了一种延缓和/或治疗糖尿病视网膜病变的药物，所述药物包括上述的抑制剂。
本发明还提供了一种延缓和/或治疗糖尿病视网膜病变的方法，可通过玻璃体腔注射Met(5mg/0.1mL)实现，具体剂量及次数以临床试验结果为准。
下面结合实施例对本发明提供的视网膜色素细胞RPE的自噬和凋亡的抑制剂及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验试剂和耗材来源：
ARPE19细胞购自ATCC，培养基为DMEM-F12培养基含10％血清和1％P/S。培养环境是37℃、5％CO2和95％空气。
mRFP-GFP-LC3慢病毒(HB-AP210-0001)购自汉恒公司。
人类细胞因子受体siRNA文库(
Figure BDA0002721689080000041
siRNALibrary-Human Cytokine Receptors)购自GE Dharmacon。
人工合成GMFB蛋白(Cat:13244-HNAE)购自Sino Biological。Penicillin/Streptomycin(15140155)购自Invitrogen。
反转录试剂盒PrimeScriptTMRT MasterMix购自Takara公司，PCR试剂盒SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)购自天根公司。所用引物由苏州金维智公司合成。
所用抗体有来自CST公司的抗Phospho-Bcl-2(Ser70)(#2827)，Cleaved Caspase-3(Asp175)(#9664)，LC3A/B(D3U4C)(#12741)，Phospho-NF-κB p65(Ser536)(#3033)抗体，和来自Proteintech公司的ATG5 Antibody(10181-2-AP)，P62/SQSTM1 Antibody(18420-1-AP)，FAS/CD95 Antibody(13098-1-AP)，HRP-conjugated beta Actin Antibody(HRP-60008)，Cy3–conjugatedAffinipure GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)(SA00009-2)。
实施例1
SD大鼠玻璃体药物注射
1.1大鼠准备：4W约140g重的SD大鼠购自斯莱克公司，饲养在同济大学动物中心SPF房。大鼠随机分为四组，PBS对照组，GMFB处理组，GMFB-Met处理组，GMFB-Mutant处理组。
1.2玻璃体腔注射：注射前大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(1ml/400g体重)进行麻醉，1×速眠新(0.1ml/200g)进行肌肉松弛，然后给予一滴0.5％托吡卡胺散瞳(WuxiShanhe Group，Jiangsu，China)，一滴0.4％盐酸奥布卡因表面麻醉(Eisai Co Ltd，Tokyo，Japan)。在体视显微镜下，先用1ml注射器自角膜缘后垂直进针扎一小孔，然后再用注射针由该孔向玻璃体腔内注入相应液体。每只眼的注射体积为8μl。
实施例2
SD大鼠视网膜电图ERG检测生理功能
2.1仪器：APS全自动视觉电生理检查仪(APS-2000)购于重庆康华科技有限公司。
暗适应：做视觉电生理功能检查前一天，把SD大鼠转移到暗房，进行暗适应。第二天开始做。
2.2大鼠的准备：向大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠(1ml/500g体重)进行麻醉，1×速眠新(0.1ml/200g)进行肌肉松弛，然后给予一滴0.5％托吡卡胺散瞳(Wuxi Shanhe Group，Jiangsu，China)，一滴0.4％盐酸奥布卡因表面麻醉(Eisai Co Ltd，Tokyo，Japan)，每只眼睛各涂一点导电膏。
插电极：地线接大鼠尾巴上，负极接大鼠两耳朵之间，正极接两眼睛角膜上，注意不要触到眼睑和巩膜上。
2.3数据采集：打开软件“视觉电生理图”，点“FERG”，再点1,2通道，一个为左眼通道，另一个为右眼通道，点“设置”，刺激次数为2次，刺激频率为0.05Hz；依次点击刺激强度(1)-0.0006325(cd*s/m)、(5)-0.006325(cd*s/m)、(9)-0.06325(cd*s/m)，每次强度至少间隔2min。点“示波”，待波的基线平稳时，点击“采集”，等听到“嘀”的一声后，采集完毕，点击“保存”。再点击“设置”，修改文档号和刺激强度，依次类推。等所有强度做完后，换下一只大鼠。所有大鼠做完后，打开“文件”，进行标定，双击曲线，曲线变为白色，点击“标定”。标定完a波后，按空格键，标定b波。所有标定完毕，点击“打印”，保存为.PDF格式。点击左下角按钮，退出软件，关闭电脑，关闭放大器。
数据如图1中A和图4中C的代表波形图及统计图所示，GMFB处理组较PBS组b波波幅明显下降，说明玻璃体腔GMFB的上升将损伤视网膜功能；而GMFB-Met处理组和GMFB-Mutant处理组相比b波波幅较大，说明FAS受体拮抗剂Met能够对GMFB造成的视网膜功能损伤起保护作用。
实施例3
药物处理或注射后Western-blot检测凋亡或自噬相关蛋白变化水平
3.1蛋白的提取：将细胞接种在六孔细胞培养皿中，经相应的处理后，每孔加150μl含有Protease Inhibitor Cocktail的RIPA裂解液，用细胞刮收集细胞到新的EP管中，放冰上孵育30min，10000rpm，4℃离心15min，轻轻吸出上清至干净的离心管中，-80℃保存备用。
3.2蛋白浓度的测定：蛋白定量采用BCA定量法，具体方法如下：配制标准蛋白溶液2μg/μl，-20℃保存备用；根据标准品和样品的数目配制工作液，试剂A和试剂B按50:1的体积比充分混匀，现配现用；工作液总体积＝(标准品个数+待测样品个数)×(2个复孔数)×(200μl工作液)。将标准品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、16μl的体积加到酶标孔中，每孔加入200μl的BCA工作液，制作标准曲线；待测样品每孔加入2μl，再加入200μl的BCA工作液，37℃孵育30min；用多功能酶标仪测定560nm处的吸光度值。
3.3蛋白样品的准备：根据准备上样的蛋白量和蛋白浓度，加入5×loadingbuffer，混合后于100℃加热10min，使其充分的变性，4℃，12000rpm，离心2min，除去沉淀，-80℃贮存备用。
3.4SDS-PAGE电泳：分离胶的制备：10％的分离胶(10ml)配制方法如下：30％聚丙烯酰胺3.3ml，ddH2O 2.7ml，1M Tris(pH 8.8)3.8ml，10％SDS 0.1ml，10％过硫酸铵0.1ml，TEMED 0.004ml；灌胶前加APS和TEMED，加完后充分混匀，迅速灌胶。用移液枪将配制好的分离胶溶液缓慢加入到装配好的玻璃板中，分离胶溶液高度约为6cm，给浓缩胶留出1.5cm高的位置，加好后在凝胶顶部缓缓加入无水乙醇促进胶凝，使凝胶表面呈一条直线；放置1h左右直到凝胶完全凝固，当无水乙醇和凝胶之间有一条折线时说明凝胶已经凝固，倒掉胶上的无水乙醇，用滤纸吸干。制备5％的浓缩胶(4ml)方法如下：30％聚丙烯酰胺0.67ml，ddH2O2.7ml，1M Tris(pH 6.8)0.5ml，10％SDS 0.04ml，10％过硫酸铵0.04ml，TEMED 0.004ml；灌胶前加APS和TEMED，加完后充分混匀，迅速灌胶。用移液枪将配制好的浓缩胶溶液缓慢加入分离胶的上层，直至玻璃板的边缘，然后小心插入梳子，注意不要产生汽包，放置约1h左右凝胶，凝胶之后拔出梳子，准备电泳。将准备好的蛋白样品和蛋白标记分子加入到加样孔中，防止气泡产生，使用Bio-Rad电泳仪，槽内加满电泳液以后即可开始电泳，电泳条件为：80V电压，30min，换120V电压，1h30min左右。电泳至溴酚蓝刚好跑出分离胶底部停止。
3.5转膜：SDS-PAGE凝胶电泳结束以后，将玻璃板撬开后小心分离出凝胶，切去浓缩胶的部分，保留分离胶，浸泡于去离子水中；剪取与凝胶大小相似的PVDF膜放入无水甲醇中浸泡2min；将切好的凝胶、滤纸以及事先用无水甲醇浸泡过的PVDF膜放入转膜平衡液中平衡10min；采用Bio-Rad的转膜系统，以夹三明治的方式，从黑面到白面的顺序依次为：黑面(负极)-海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白面(正极)，滤纸、凝胶和PVDF膜要对齐，彻底清除内部气泡，然后放入装满转膜液的转膜仪中，转膜条件为300毫安，2h；转膜槽置于冰浴中。转膜结束后可以参考蛋白Marker转上PVDF膜作为转膜成功的标志，也可将膜用1×丽春红染液染色，然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
3.6免疫杂交反应：用1×PBST洗掉丽春红，配置5％的BSA闭液，室温封闭1h。加入用PBST稀释的一抗，4℃过夜；1×PBST洗膜3次，每次10min。加入PBST稀释的HRP标记的二抗，室温1h。1×PBST洗膜3次，每次10min。ECL化学发光采集结果，以Gapdh作为对照内参。
3.7数据统计分析：用Image J软件western条带的灰度分析，然后与对应的Gapdh进行相比，然后再利用Graphpad Prism软件进行统计分析及作图。
实验结果如图1中C、图2中A以及图4中A和B所示，其中图1中C和图2中A分别在动物和细胞模型上证明，胞外GMFB的注射或处理将升高凋亡水平，增加LC3II对LC3I的比例，ATG5的含量，以及自噬降解标志物p62的含量，说明GMFB将激活自噬的早期过程，并通过影响降解过程阻碍正常自噬流的进行。而图4中A和B则表明，相比于在GMFB处理的同时加入Met对照变异体Mutant，同时加入FAS受体拮抗剂Met组的凋亡水平较低，并且可以抑制由GMFB造成的自噬流阻碍。
实施例4
视网膜冰冻切片的准备
4.1眼球准备：药物处理后的SD大鼠分别在2w和4w的时间点收取眼球样本，SD大鼠脱臼处死后，仔细摘除眼球，注意保留视神经；
4.2固定：置于4％多聚甲醛固定过夜；
4.3解剖：在解剖显微镜下沿角巩膜缘上缘解剖眼球，小心去除角膜，虹膜和晶状体，形成完整的视杯，注意操作轻柔防治造成视网膜脱离；
4.4脱水：用30％的蔗糖过夜脱水；
4.5包埋：用组织包埋液OCT包埋4℃平衡过夜；
4.6液氮速冻：将眼球用液氮快速冷冻，冷冻之前使得眼球的位置尽量垂直居中。-80℃保存冰冻样品。
4.7切片：用冰切机按8μm的厚度进行连续切片，取过视神经乳头的切片。将切片放在-80℃保存，使用前吹干。
实施例5
视网膜冰冻切片的免疫荧光染色
5.1切片准备：取实施例4中所得的眼球冰冻切片样品进行免疫荧光染色检测。
5.2烤片：50℃烤片0.5h。
5.3固定：4％PFA固定10min，再用PBS清洗三次，每次5min。
5.4透膜：用0.25％Triton-X100透膜15min，PBS洗3次，每次5min。
5.5封闭：5％胎牛血清室温封闭1h；
5.6一抗：加5％胎牛血清稀释的相应一抗，置于湿盒内防止干燥，4℃孵育过夜(TUNEL实验可忽略)。
5.7二抗：PBS洗3次，每次5min；加5％胎牛血清稀释的荧光标记的与一抗同种属来源的二抗，或TUNEL试剂盒所述反应液，置于湿盒内，避光37℃孵育1h。
5.8DAPI染核：PBS洗3次，每次5min；用0.5μg/ml DAPI染细胞核1min，PBS洗3次，每次5min。
5.9封片：用荧光封片剂封片。
5.10拍照观察：在显微镜下拍照观察。
结果如图1中B和图4中D所示，其中图1中B结果表示，玻璃体注射GMFB后凋亡细胞标志红色荧光在RPE层增加，即增加视网膜色素上皮细胞的凋亡水平；而图4中D所示，同时注射FAS受体拮抗剂Met可以降低GMFB诱导的凋亡水平的增加。
实施例6
mRFP-GFP-LC3细胞系的建立和siRNA转染、药物处理后自噬流变化检测
6.1 mRFP-GFP-LC3细胞系的建立按照汉恒生物产品HB-AP210-0001的使用指南进行。ARPE19细胞汇合率介于50～70％时感染自噬双标腺病毒并于2h后换液，感染24h后开始观察到GFP、RFP表达，对阳性细胞使用Puromycin进行筛选和扩大培养，形成稳定表达细胞系。mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭，此时只能检测到红色荧光。在显微镜成像后红绿荧光通过merge后出现的黄色斑点即指示自噬体，红色的斑点指示自噬溶酶体。
6.2将已建立的细胞系铺板于已加有coverslip的24孔板，培养至50～70％并贴壁。
6.3针对siRNA转染组，每孔使用5μl Lipo2000对不同受体的siRNA进行转染，24～48h后进行GMFB处理；针对FAS抗体处理组，每孔使用5μl抗体37℃封闭2h。
6.4 siRNA转染或抗体封闭后吸出原培养基，使用0.01μg/μl GMFB处理。
6.5 GMFB处理不同时间后使用PBS冲洗3次，4％PFA固定10min。
6.6观察与计数：在显微镜下拍照观察并记录自噬体和自噬溶酶体的数量。
结果如图2中B、图3中A和C所示，其中图2中B显示GMFB处理后merge图中黄色斑点和红色斑点均有增多，说明自噬体形成增多但自噬后期降解过程出现阻碍。图3中A显示通过siRNA文库筛选，发现FAS、TGFBR1等八种受体的siRNA可以减少自噬体和自噬溶酶体的数量，有抑制GMFB引起的自噬异常的作用；图3中C显示提前使用FAS拮抗剂Met进行封闭，可以减弱GMFB引起的自噬功能异常。
实施例7
GMFB处理后ARPE19中不同细胞受体的mRNA表达量
7.1 ARPE19细胞均匀铺板于六孔板并培养至70～80％后，使用0.01μg/μl GMFB处理。
7.2 GMFB处理不同时间后，使用PBS冲洗3次，每孔加入1ml Trizol进行吹打，并收集到离心管中。
7.3向Trizol收集样品中加入200μl氯仿，剧烈混匀后，以12000rpm的转速4℃离心10min。
7.4离心后，将上清转移到新的离心管中，注意不要取到中间的蛋白层，加入等体积的异丙醇。
7.5 12000转4℃离心10min，弃去上清，将沉淀用75％的乙醇洗1～2次。
7.6将沉淀室温干燥后，用适量的20μl DEPC水溶解。
7.7使用Nanodrop进行定量，并计算反转录所需的体积。
7.8 RNA反转录：20μl体系，1000ng的RNA，取4μl的Takara的逆转录试剂supermix，再加ddH2O补到20μl。置于PCR仪中37℃15min，85℃5s，结束后-20℃保存备用。
7.9定量PCR
(1)将RNA反转录后得到的cDNA稀释4倍作为模板，设计引物如表1。
(2)利用天根公司的SYBR Green实时荧光定量PCR检测试剂盒，qPCR的体系为20μl：2μl的cDNA模板，1μl引物，10μl 2×PCR Mix，7μl ddH2O，检测目的基因的表达量。PCR扩增条件：94℃变性10min，进入循环(95℃5sec，60℃60sec)，一共40个循环，并收集溶解曲线。
(3)数据分析，采用2-△△Ct法进行处理，以Gapdh做为内参。
实验结果如图3中B所示，即在未处理状态下受体FAS的表达量大于其他受体，GMFB处理后FAS表达量出现上升后下降。
表1 q-PCR中所用到的引物信息
Figure BDA0002721689080000101
Figure BDA0002721689080000111
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 同济大学
<120> 一种视网膜色素细胞RPE的自噬和凋亡的抑制剂及其应用
<150> 202010892836.2
<151> 2020-08-31
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgcctaagt ggagataagg aaa 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagttcatca cctgcccgct 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgagcctga ccttcgtg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acattgtcac tggatcagcg 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagcctggag ttgactgtg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcctcacag attgcgtcc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagctctttc acttcggagg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggcattaac acttttggac g 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttgcatacc ttgtcaactt cg 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttaagctcag tcccaaacag g 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggagcctctc aacataagac ag 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggaggtgtc gttatagttg tc 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gttgctctgg acaagttaaa tcc 23
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aagtatcagg cccctttgaa g 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgcagccca ttatgaagtt c 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtgactataa actccccgat ctg 23
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tccgattcca cacttgattc tc 22
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttgattcgaa caggctctcc 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cttgccccta attttcgatg g 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
actgcagctc cctaagtttt c 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tctcagtcac tttggcacag 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatgtgagag ttggctggtc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtgggcagaa tccagatgag 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggtgtctctg gtatgtgaag c 21

Claims (5)

1.一种视网膜色素细胞RPE的自噬和凋亡的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括肿瘤坏死因子超家族受体FAS的拮抗剂。
2.根据权利要求1所述抑制剂，其特征在于，所述拮抗剂包括Met。
3.根据权利要求1或2所述抑制剂，其特征在于，所述拮抗剂抑制肿瘤坏死因子超家族受体FAS作为胶质细胞成熟因子β的受体激活下游自噬和凋亡通路。
4.权利要求1～3任一项所述的抑制剂在制备发病早期延缓和/或治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用。
5.一种延缓和/或治疗糖尿病视网膜病变的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1～3任一项所述的抑制剂。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022041645A1 (zh) * 2020-08-31 2022-03-03 同济大学 一种视网膜色素细胞rpe的自噬和凋亡的抑制剂及其应用
CN114404421A (zh) * 2022-02-28 2022-04-29 同济大学 选择性自噬激活剂qx77在制备干预或治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140341846A1 (en) * 2009-03-03 2014-11-20 The Regents Of The University Of Michigan Methods of inhibiting photoreceptor apoptosis
CN105154527A (zh) * 2015-07-21 2015-12-16 同济大学 Gmfb的应用、gmfb干扰剂及gmfb干扰剂的应用
CN105943548A (zh) * 2016-06-06 2016-09-21 同济大学 一种视网膜变性模型及其药物筛选方法
CN108939066A (zh) * 2018-07-13 2018-12-07 同济大学 Gmfb抗体作为制备糖尿病视网膜病治疗药物的应用
WO2019183246A1 (en) * 2018-03-20 2019-09-26 Onl Therapeutics, Inc. Compositions and methods of fas inhibition

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112043833A (zh) * 2020-08-31 2020-12-08 同济大学 一种视网膜色素细胞rpe的自噬和凋亡的抑制剂及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140341846A1 (en) * 2009-03-03 2014-11-20 The Regents Of The University Of Michigan Methods of inhibiting photoreceptor apoptosis
CN105154527A (zh) * 2015-07-21 2015-12-16 同济大学 Gmfb的应用、gmfb干扰剂及gmfb干扰剂的应用
CN105943548A (zh) * 2016-06-06 2016-09-21 同济大学 一种视网膜变性模型及其药物筛选方法
WO2019183246A1 (en) * 2018-03-20 2019-09-26 Onl Therapeutics, Inc. Compositions and methods of fas inhibition
CN108939066A (zh) * 2018-07-13 2018-12-07 同济大学 Gmfb抗体作为制备糖尿病视网膜病治疗药物的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAGRI G. BESIRLI ET AL: "Autophagy Activation in the Injured Photoreceptor Inhibits Fas-Mediated Apoptosis", 《INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE》 *
GAGRI G.BESIRLI ET AL: "Inhibition of Retinal Detachment-Induced Apoptosis in Photoreceptors by a Small Peptide Inhibitor of the Fas Receptor", 《INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE》 *
MERCY PAWAR ET AL: "FAS apoptotic inhibitory molecule 2 is a stress-induced intrinsic neuroprotective factor in the retina", 《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》 *
SHUNAI JIANG ET AL: "Fas Mediates Apoptosis and Oxidant-Induced Cell Death in Cultured hRPE Cells", 《INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022041645A1 (zh) * 2020-08-31 2022-03-03 同济大学 一种视网膜色素细胞rpe的自噬和凋亡的抑制剂及其应用
CN114404421A (zh) * 2022-02-28 2022-04-29 同济大学 选择性自噬激活剂qx77在制备干预或治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用
CN114404421B (zh) * 2022-02-28 2023-04-28 同济大学 选择性自噬激活剂qx77在制备干预或治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用

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