CN111921017A - 一种原位在体凝胶制剂的制备和在内镜黏膜下切除和剥离术中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，具体是一种原位在体凝胶制剂，所述凝胶制剂包含丙烯酸酯化的泊洛沙姆407(PA)和巯基封端的泊洛沙姆407(PSH)的混合物，以及作为标记物的美兰、靛蓝等染色物质。本发明凝胶的溶胶‑凝胶转变温度低于人体温度，接触人体温度后可由液态的溶胶转变为半固体的凝胶形式。所述制剂通过原位注射的方式给药，可应用于膀胱癌、胃癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、子宫癌、卵巢癌等的内镜粘膜下切除术和剥离术。所述凝胶制剂能增加粘膜隆起高度，并防止标记物在粘膜下层的扩散，从而确保在内镜黏膜下剥离手术中切割完整，减少穿孔和出血的风险，提高手术的安全性和效率，减轻患者的痛苦。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种原位在体凝胶制剂的制备和在内镜黏膜下切除和剥离术中的应用。
背景技术
肿瘤是世界上威胁人类的第一大死因，外科手术仍然是目前的主要治疗手段，但通过外科手术对癌进行根治以及术后生存率的比例很低，主要原因是对早期癌症的漏诊、误诊。早期癌症的临床症状不明显，因而正确掌握癌前病变的诊断和合理的处置，特别是对重度的或疑似癌变的异型增生，采用手术切除或内镜进行处理的治疗手段，对患者的健康及我国有限的医疗资源均有重要意义。
内镜黏膜下切除和剥离术(endoscopic submucosal dissection，ESD)是一种安全有效的内镜下微创治疗早期肿瘤及癌前病变的新技术。ESD可完整切除较大病灶、提供病理诊断材料，为早期胃癌及癌前病变的诊疗开辟了新的途径。目前ESD术中使用的标记物是含有美兰或靛蓝等标记物的高渗甘油果糖溶液或有美兰或靛蓝等标记物的生理盐水溶液，在手术过程中，容易出现美兰扩散，标记不清，隆起效果不明显现象。内镜下ESD治疗的并发症包括疼痛、出血和穿孔。术后疼痛程度多较为温和，出血是最常见的并发症，穿孔是危险程度最大的并发症。
热敏性药物组合物能形成原位凝胶，凝胶原位注射能增加粘膜隆起高度，有助于ESD手术将病灶完整切割，减少穿孔和出血的风险，提高手术的安全性和效率，减轻患者的痛苦。
泊洛沙姆(Poloxamer)是聚氧乙烯(PEO)—聚氧丙烯(PPO)—聚氧乙烯(PEO)三嵌段共聚物，商品名普兰尼克(Pluronic)，分子量范围介于1100-15000。为美国食品药品监督管理局(FDA)和国家药品食品监督管理局(SFDA)批准的用于人体的药用辅料，已被国家药典收载，在体内降解成脂肪酸和蔗糖，都是人体内的正常代谢产物，具有良好的生物相容性和可生物降解性，无刺激性。Poloxamer含有亲水的PEO基团和疏水的PPO，分子量大的Poloxamer同系物具有温敏特性，能够形成可逆的反相凝胶，低温下为流动的液体，升高温度溶液粘度增大最终变为固态凝胶，如Poloxamer407(泊洛沙姆407，简称P407)。Poloxamer作为热敏性凝胶主要应用于药物缓释释放方面，利用凝胶缓慢溶解的特性，延长药物的释放时间，提高药效，这种特性可应用于短期的治疗方面，如止痛、消炎、避孕等。除了注射之外，Poloxamer还有其它的给药途径，如直肠、阴道、眼科用药等。有关专利为WO9730693，WO9734580，WO0050005，CN1311873C，其中公开了胶凝温度介于30-37℃的泊洛沙姆肛门栓剂及阴道用制剂。P407已被用作蛋白药物组合物中的赋形剂(Jeong B.，et al.，Adv DrugDel Rev,2002,54(1):37-51)。Poloxamer凝胶的主要缺点是稳定性差，在水环境条件下快速溶解，从而影响其温敏胶凝特性，由于凝胶强度不高，需要高浓度比例的Poloxamer才能保持一定的强度，但高浓度的Poloxamer在室温下粘度太大，对室内温度的控制要求高，若温度稍高，Poloxamer在室温下粘度大，无法注射通过导管，据报导和实验表明，浓度25％(w/w)的P407在室温下已形成凝胶。因此，采用低浓度的Poloxamer，对其进行修饰，以确保室温下良好的溶解性和流动性。
发明内容
本发明要解决目前内镜黏膜下剥离术(ESD)中缺乏隆起效果明显且可完全剥离的标记物载体的技术问题，同时解决通常温敏凝胶溶液在注射时凝固堵塞注射导管的问题。
基于此目的，本发明提供一种原位在体凝胶制剂，其在室温条件下以液体形式存在，原位注射至作用部位接触人体后，在人体生理条件下则可通过PA与PSH交联转变为半固体的凝胶形式。与之前授权的PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶(授权公告号CN104031361B)相比，本发明的原位在体凝胶可在体外低于人体室温条件下，保持液体形式，可防止在注射时堵塞注射导管，而注射进入体内后，又可快速形成凝胶，增加黏膜隆起高度。可确保在ESD手术中切割完整，并且可减少穿孔和出血的风险，提高手术的安全性和效率，减轻患者的痛苦。可用于膀胱癌、胃癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、子宫癌、卵巢癌等内镜粘膜下切除和剥离术。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
本发明的第一方面，提供一种原位在体凝胶，所述原位在体凝胶由丙烯酸酯化的泊洛沙姆407(PA)和巯基封端的泊洛沙姆407(PSH)按照摩尔比1-10混合所得。
优选的，所述的丙烯酸酯化的泊洛沙姆407(PA)和巯基封端的泊洛沙姆407(PSH)的摩尔比是1-5。最优是1.2-1.8。
本发明研制了一种主要由丙烯酸酯化的P407(简称PA)和巯基封端的P407(简称PSH)组成的混合物，该混合物以一定浓度溶解在水或缓冲盐溶液中，在人体生理条件(pH7.4，37℃)下发生交联，由澄清的溶液向半固体凝胶状态改变，其转变机制是一定浓度的PA和PSH混合溶液，在体外呈溶液状态，当注射到体内后，凝胶制剂接触到人体温度后，PA与PSH发生内部交联聚集，PA的丙烯酸酯与PSH的巯基发生交联，进而形成凝胶化的泊洛沙姆407，即PA-PSH。
所述原位在体凝胶是一种热敏性、热可逆性材料组合物。具体涉及泊洛沙姆407(Poloxamer 407，P407)的交联聚合物，由丙烯酸酯化的P407和巯基封端的P407交联所得，用染色剂标记，用水或缓冲盐溶液配制成可注射的原位在体凝胶制剂，可应用于内镜黏膜下切除和剥离手术。
进一步的，将一定浓度PA和PSH溶解在缓冲盐溶液或水溶剂中，该溶液具有在人体生理条件下具有可逆的温敏特性，且溶胶-凝胶转变温度低于人体温度(在15-36℃之间)。即在体外0℃到低于溶胶-凝胶转变温度范围内为无色自由流动的透明溶胶，而原位注射进入人或动物体内，可转化为透明的半固体凝胶。
本发明的第二方面，提供一种如上所述的原位在体凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(A)丙烯酸酯化的泊洛沙姆407(PA)的合成：将摩尔比为1:1-1:8(最优是1:4)的泊洛沙姆407和盐酸三乙胺溶解在干燥的四氢呋喃中；将反应溶液离心以除去盐酸三乙胺，并将上清液滴入石油醚中；沉淀后，真空干燥获得丙烯酸酯化的泊洛沙姆407(PA)；
(B)巯基封端的泊洛沙姆407(PSH)的合成：将摩尔比为1:1-4:1(最优是2:1)的3,3-二硫代二丙酸(DTDP)和亚硫酰氯添加到圆底烧瓶中，然后将混合物加热至60-95℃(最优是85℃)，当白色粉末变成黄色液体时，DTDP完全反应；将混合物在60-95℃(最优是85℃)，真空下蒸馏以除去未反应的亚硫酰氯，然后获得二硫代二丙酰氯；将P407，三乙酰胺和二硫代二丙酰氯溶解在四氢呋喃中，摩尔比在1:1～8:1～8之间(最优是1:4:4)；将该溶液在60-90℃(最优是75℃)下持续搅拌，反应4h以上(最优是6h)；然后，冷却至室温，离心去除沉淀；将上清液滴入石油醚中沉淀，获得产物，此步重复多次(最优3次)；所获沉淀真空干燥得PSH；
(C)PSH中二硫键的裂解：二硫苏糖醇与PSH的摩尔比在1:10-1:50(更优是1:20-1:40，最优是1:30)；氮气保护下，在pH 6.0-8.0(最优是pH7.0)条件下，反应2h以上(最优是4h)；其中PSH的重量比在5-30％之间(最优为10％)；反应后，用盐酸将溶液的pH调节至3.0-4.0(最优是3.5)，将上清液滴入石油醚中沉淀，获得产物，此步重复多次(最优3次)；所获沉淀真空干燥得去除二硫键的PSH；
(D)PA与混合物的配比：PA和步骤(C)去除二硫键的PSH之间的混合摩尔比在1-10(更优是1-5，最优是1.2-1.8)，溶解于水或缓冲盐溶液中，pH调节至3.0-4.0(最优是3.5)；将溶液冷冻干燥后，获得PA和PSH混合物。
进一步的，本发明的PA和PSH的混合物可在人体生理条件下(pH7.4，37℃)发生交联，形成凝胶。
进一步的，本发明的PA和PSH的混合物以冻干粉的形式保存，保存于低温环境下(特指4℃以下的低温环境)，临用前用pH3.5-5.5(最优pH4.0)的水或缓冲盐溶液稀释至一定浓度，浓度范围可为3-50％，并加入美兰或靛蓝等染色标记物，染色标记物的浓度应不大于1％，最优是0.1-0.3％。
进一步的，所述原位在体凝胶在内镜黏膜下剥离术中的使用浓度为3～50％。
进一步的，所述原位在体凝胶，其临用前用pH3.5-5.5，最优是4.0的水或者缓冲盐溶液溶解，完全溶解后，即可用于原位注射。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的原位在体凝胶的应用，用于制备内镜黏膜下切除和剥离术中的标记物载体。本发明的原位在体凝胶具有辅助手术治疗用途。
进一步的，所述的内镜黏膜下切除和剥离术为膀胱癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、子宫癌、卵巢癌等内镜黏膜下切除和剥离术。
进一步的，所述的标记物载体中原位在体凝胶的质量百分比浓度为3～50％。
进一步的，所述的标记物为临床常用内镜黏膜下剥离术染色标记物，包括但不局限于美兰、靛蓝等。所述的染色标记物，在标记物载体中的浓度在1％(w/w)及以下，更优是0.05-0.5％(w/w)，最优是0.1-0.3％(w/w)。
本发明的第四方面，提供一种用于内镜黏膜下切除和剥离术的原位在体凝胶制剂，所述凝胶制剂包含如上所述的原位在体凝胶，和染色标记物。
进一步的，所述的PA和PSH混合物、以及染色标记物制备成冻干粉末保存于低温环境下，特别指4℃以下，临用前在室温下特别指4-25℃之间，用水或缓冲盐溶液溶液溶解，配置成溶液。
在本发明的一个优选实施方式中，本发明的靛蓝或美兰等标记的丙烯酸酯与巯基封端PA407混合物(PA-PSH)原位在体凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：
①PA的合成：将摩尔比为1:4的P407和盐酸三乙胺溶解在干燥的四氢呋喃中。将反应溶液离心以除去盐酸三乙胺，并将上清液滴入石油醚中。沉淀后，真空干燥获得PA。
②PSH的合成：将摩尔比为2:1的DTDP和亚硫酰氯添加到圆底烧瓶中，然后将混合物加热至85℃，当白色粉末变成黄色液体时，DTDP完全反应。将混合物在85℃，真空下蒸馏以除去未反应的亚硫酰氯，然后获得二硫代二丙酰氯。将摩尔比为1:4:4的P407，三乙酰胺和二硫代二丙酰氯溶解在四氢呋喃中。将该溶液在75℃下持续搅拌，反应6h。然后，冷却至室温，离心去除沉淀。将上清液滴入石油醚中沉淀，获得产物，此步重复3次。所获沉淀真空干燥得PSH。
③PSH中二硫键的裂解：二硫苏糖醇与PSH的摩尔比为1:30。氮气保护下，在pH7.0条件下，反应4h。其中PSH的重量比为10％。反应后，用盐酸将溶液的pH调节至3.5，将上清液滴入石油醚中沉淀，获得产物，此步重复3次。所获沉淀真空干燥得去除二硫键的PSH。
④PA-PSH冻干粉的制备：PA和去除二硫键的PSH之间摩尔比为1:1.5，溶解于水中，pH调节至3.5。将溶液冷冻干燥后，获得PA-PSH，冻干粉存储于-20℃。
⑤称取PA-PSH冻干粉溶解于pH4.0的PBS缓冲液中，加入靛蓝或美兰染色标记物，配制成含靛蓝或美兰的PA-PSH原位在体凝胶溶液。
用本发明制备的美兰或靛蓝等标记的PA-PSH原位在体凝胶制剂，在ESD术中能起到很好的固定标记的作用。
在本发明PA-PSH的制备过程中，可通过进一步调整各步骤加入的试剂比例和温度，及PA-PSH凝胶在水或缓冲盐溶液中的浓度，来调整原位在体凝胶注射进入人体后的厚度。
在内镜黏膜下切除和剥离术(ESD)前，将染色标记的本发明原位在体凝胶制剂通过内镜注射针注入到癌变部位的粘膜下层，原位在体凝胶制剂接触人体温度后，会自发交联向半固体凝胶状转变，保持在手术期间粘膜隆起，能有效防止染色标记物在粘膜下层的扩散，有利于剥除粘膜表层增加手术的准确性，可以保护粘膜下层不被误伤。并且，本发明原位在体凝胶溶液应用在ESD手术中，能减少出血风险，增加隆起高度，有利于手术顺利进行。
本发明的原位在体凝胶，是一种可逆性的温敏凝胶，在体外以溶液状态存在，注射到人体或动物组织中，遇人体温度，溶液交联形成凝胶，该特性决定了原位在体凝胶作为标记物载体在病变部位的固定性，同时可以防止凝胶在注射时凝固堵塞注射导管，并且该凝胶材料具有生物可降解性和生物相容性，可广泛应用于医药行业。
本发明优点在于：
1、本发明的凝胶，溶胶-凝胶转变温度低于人体温度，接触人体温度后可由液态的溶胶转变为半固体的凝胶形式。该制剂通过原位注射的方式给药，可应用于膀胱癌、胃癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、子宫癌、卵巢癌等的内镜粘膜下切除术和剥离术；
2、该凝胶能增加粘膜隆起高度，并防止标记物在粘膜下层的扩散，从而确保在内镜黏膜下剥离手术中切割完整，减少穿孔和出血的风险，提高手术的安全性和效率，减轻患者的痛苦。
附图说明
图1是P407和PA的核磁共振氢谱(1H-NMR)结果。
图2是本发明实施例6原位在体凝胶制剂在离体猪胃中的标记作用及ESD切除结果；图中：
17％，即实施例1：17％PA-PSH(PA:PSH＝1.5)；
3％，即实施例2：3％PA-PSH(PA:PSH＝1.5)；
10％，即实施例3：10％PA-PSH(PA:PSH＝1.5)；
14％，即实施例4：14％PA-PSH(PA:PSH＝1.5)；
甘油果糖：即甘油果糖溶液；
NaCl，即生理盐水溶液。
图3是本发明实施例7原位在体凝胶制剂在巴马猪胃镜ESD手术中的标记作用结果；
样品1：PA-PSH-1，即实施例1：17％PA-PSH(PA:PSH＝1.5)；
样品2：PA-PSH-2，即实施例4：14％PA-PSH(PA:PSH＝1.5)；
Gly：甘油果糖溶液。
图4是本发明实施例8温敏水凝胶在离体猪胃中的标记作用和剥离效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：
本实施例制备含美兰的PA-PSH原位在体凝胶溶液，包括步骤如下：
①PA的合成：称取34.4g P407(4.0mmol)和1.9g盐酸三乙胺(16.0mmol)溶解在干燥的四氢呋喃中。将反应溶液离心以除去盐酸三乙胺，并将上清液滴入石油醚中。沉淀后，真空干燥获得PA。
②PSH的合成：称取4.2g DTDP(10mmol)溶于10mL亚硫酰氯中并添加到圆底烧瓶中，然后将混合物加热至85℃。反应完全后，将混合物在85℃，真空下蒸馏除去未反应的亚硫酰氯，得二硫代二丙酰氯。称取17.2g P407(2.0mmol)，1.0g三乙酰胺(8.0mmol)，2.0g二硫代二丙酰氯(8.0mmol)溶解在四氢呋喃中。将该溶液在75℃下持续搅拌，反应6h。然后，冷却至室温，离心去除沉淀。将上清液滴入石油醚中沉淀，纯化3次。所获沉淀真空干燥得PSH。
③PSH中二硫键的裂解：氮气保护下，取1mmol二硫苏糖醇与30mmol PSH，在pH7.0条件下，反应4h。其中PSH在水溶液中的重量比为10％。反应后，用盐酸将溶液的pH调节至3.5，将上清液滴入石油醚中沉淀，获得产物，此步重复3次。所获沉淀真空干燥得去除二硫键的PSH。
④PA-PSH冻干粉的制备：PA和去除二硫键的PSH之间摩尔比为1:1.5，溶解于水中，pH调节至3.5。将溶液冷冻干燥后，获得PA-PSH。
⑤称取PA-PSH冻干粉17g溶解于100mL pH4.0的PBS缓冲液中，加入美兰染色标记物100mg，配制成含美兰浓度为0.1％(w/w)的17％浓度的PA-PSH原位在体凝胶溶液。
利用1H-NMR考察P407，PA，结果如图1所示，与P407相比，PA在1.2ppm和6.0-6.5ppm处的信号分别来自丙烯酸和环氧丙烷单元的质子。
图1显示了PA，PSH的成功合成。
实施例2：
本实施例制备含美兰的PA-PSH原位在体凝胶溶液，包括步骤如下：
①PA的合成：称取17.2g P407和8.5g盐酸三乙胺溶解在干燥的四氢呋喃中。将反应溶液离心以除去盐酸三乙胺，并将上清液滴入石油醚中。沉淀后，真空干燥获得PA。
②PSH的合成：称取2.1g DTDP溶于10mL亚硫酰氯中并添加到圆底烧瓶中，然后将混合物加热至85℃。反应完全后，将混合物在85℃，真空下蒸馏除去未反应的亚硫酰氯，得二硫代二丙酰氯。称取8.6g P407，0.5g三乙酰胺，1.0g二硫代二丙酰氯溶解在四氢呋喃中。将该溶液在75℃下持续搅拌，反应6h。然后，冷却至室温，离心去除沉淀。将上清液滴入石油醚中沉淀，纯化3次。所获沉淀真空干燥得PSH。
③PSH中二硫键的裂解：氮气保护下，取1mmol二硫苏糖醇与30mmol PSH溶解于水中，在pH7.0条件下，反应4h。其中PSH在水溶液中的重量比为10％。反应后，用盐酸将溶液的pH调节至3.5，将上清液滴入石油醚中沉淀，所获沉淀真空干燥得去除二硫键的PSH。
④PA-PSH冻干粉的制备：PA和去除二硫键的PSH之间摩尔比为1:1.5，溶解于水中，pH调节至3.5。将溶液冷冻干燥后，获得PA-PSH。
⑤称取PA-PSH冻干粉3g溶解于100mL pH4.0的PBS缓冲液中，加入美兰染色标记物100mg，配制成含美兰浓度为0.1％(w/w)的3％浓度的PA-PSH原位在体凝胶溶液。
实施例3：
本实施例制备含美兰的PA-PSH原位在体凝胶溶液，包括步骤如下：
①PA的合成：称取17.2g P407和8.5g盐酸三乙胺溶解在干燥的四氢呋喃中。将反应溶液离心以除去盐酸三乙胺，并将上清液滴入石油醚中。沉淀后，真空干燥获得PA。
②PSH的合成：称取2.1g DTDP溶于10mL亚硫酰氯中并添加到圆底烧瓶中，然后将混合物加热至85℃。反应完全后，将混合物在85℃，真空下蒸馏除去未反应的亚硫酰氯，得二硫代二丙酰氯。称取8.6g P407，0.5g三乙酰胺，1.0g二硫代二丙酰氯溶解在四氢呋喃中。将该溶液在75℃下持续搅拌，反应6h。然后，冷却至室温，离心去除沉淀。将上清液滴入石油醚中沉淀，纯化3次。所获沉淀真空干燥得PSH。
③PSH中二硫键的裂解：氮气保护下，取1mmol二硫苏糖醇与30mmolPSH溶解于水中，在pH7.0条件下，反应4h。其中PSH在水溶液中的重量比为10％。反应后，用盐酸将溶液的pH调节至3.5，将上清液滴入石油醚中沉淀，所获沉淀真空干燥得去除二硫键的PSH。
④PA-PSH冻干粉的制备：PA和去除二硫键的PSH之间摩尔比为1:1.5，溶解于水中，pH调节至3.5。将溶液冷冻干燥后，获得PA-PSH。
⑤称取PA-PSH冻干粉10g溶解于100mL pH4.0的PBS缓冲液中，加入美兰染色标记物100mg，配制成含美兰浓度为0.1％(w/w)的10％浓度的PA-PSH原位在体凝胶溶液。
实施例4：
本实施例制备含美兰的PA-PSH原位在体凝胶溶液，包括步骤如下：
①PA的合成：称取34.4g P407和17.0g盐酸三乙胺溶解在(ha干燥的四氢呋喃中。将反应溶液离心以除去盐酸三乙胺，并将上清液滴入石油醚中。沉淀后，真空干燥获得PA。
②PSH的合成：称取4.2g DTDP溶于10mL亚硫酰氯中并添加到圆底烧瓶中，然后将混合物加热至85℃。反应完全后，将混合物在85℃，真空下蒸馏除去未反应的亚硫酰氯，得二硫代二丙酰氯。称取17.2g P407，1.0g三乙酰胺，2.0g二硫代二丙酰氯溶解在四氢呋喃中。将该溶液在75℃下持续搅拌，反应6h。然后，冷却至室温，离心去除沉淀。将上清液滴入石油醚中沉淀，纯化3次。所获沉淀真空干燥得PSH。
③PSH中二硫键的裂解：氮气保护下，取1mmol二硫苏糖醇与30mmol PSH溶解于水中，在pH7.0条件下，反应4h。其中PSH在水溶液中的重量比为10％。反应后，用盐酸将溶液的pH调节至3.5，将上清液滴入石油醚中沉淀，所获沉淀真空干燥得去除二硫键的PSH。
④PA-PSH冻干粉的制备：PA和去除二硫键的PSH之间摩尔比为1:1.5，溶解于水中，pH调节至3.5。将溶液冷冻干燥后，获得PA-PSH。
⑤称取PA-PSH冻干粉14g溶解于100mL pH4.0的PBS缓冲液中，加入美兰染色标记物100mg，配制成含美兰浓度为0.1％(w/w)的14％浓度的PA-PSH原位在体凝胶溶液。
实施例5：
①PA的合成：称取68.8g P407和34.0g盐酸三乙胺溶解在干燥的四氢呋喃中。将反应溶液离心以除去盐酸三乙胺，并将上清液滴入石油醚中。沉淀后，真空干燥获得PA。
②PSH的合成：称取8.4g DTDP溶于20mL亚硫酰氯中并添加到圆底烧瓶中，然后将混合物加热至85℃。反应完全后，将混合物在85℃，真空下蒸馏除去未反应的亚硫酰氯，得二硫代二丙酰氯。称取34.4g P407，2.0g三乙酰胺，4.0g二硫代二丙酰氯溶解在四氢呋喃中。将该溶液在75℃下持续搅拌，反应6h。然后，冷却至室温，离心去除沉淀。将上清液滴入石油醚中沉淀，纯化3次。所获沉淀真空干燥得PSH。
③PSH中二硫键的裂解：氮气保护下，取2mmol二硫苏糖醇与60mmol PSH溶解于水中，在pH7.0条件下，反应4h。其中PSH在水溶液中的重量比为10％。反应后，用盐酸将溶液的pH调节至3.5，将上清液滴入石油醚中沉淀，所获沉淀真空干燥得去除二硫键的PSH。
④PA-PSH冻干粉的制备：PA和去除二硫键的PSH之间摩尔比为1:1.5，溶解于水中，pH调节至3.5。将溶液冷冻干燥后，获得PA-PSH。
⑤称取PA-PSH冻干粉50g溶解于100mL pH4.0的PBS缓冲液中，加入美兰染色标记物100mg，配制成含美兰浓度为0.1％(w/w)的50％浓度的PA-PSH原位在体凝胶溶液。
实施例6：
使用实施例1-4制备的含美兰的PA-PSH原位在体凝胶溶液，将该溶液2mL注入到新鲜的离体猪胃粘膜下层，观察隆起效果。
使用含美兰0.1％(w/w)的甘油果糖溶液2mL注入到新鲜的离体猪胃粘膜下层，观察隆起效果结果。
使用含美兰0.1％(w/w)的生理盐水溶液2mL注入到新鲜的离体猪胃粘膜下层，观察隆起效果。
结果如图2所示，实施例1-4与生理盐水和甘油果糖溶液组相比，含美兰的PA-PSH原位在体凝胶可快速在猪胃黏膜下层形成原位在体凝胶，隆起的高度显著，且2h内不塌陷，而生理盐水和甘油果糖溶液组15min内即快速塌陷，生理盐水组的扩散面积最大。2h切除各组胃黏膜下凝胶，实施例1-4美兰标记的凝胶块厚度和面积明显大于生理盐水和甘油果糖溶液组，可在黏膜下较长时间内保持交联的半固体凝胶形式，有利于ESD手术的指导和开展。
实施例7：
使用实施例1和实施例4制备的含美兰的PA-PSH原位在体凝胶溶液，在胃镜指导下，使用一次性的23号导管注射针原位注射10mL于巴马猪胃肿瘤黏膜下部，同时注射甘油果糖溶液作为对照。
结果如图3所示，注入含美兰的PA-PSH原位在体凝胶溶液(PA-PSH-1和PA-PSH-2)后，可在肿瘤黏膜下部快速形成凝胶，且30min内不塌，而甘油果糖溶液组在胃黏膜下快速塌陷，15min内即完全扩散，黏膜下无明显隆起。
对比例1：
PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物，合成步骤如下：
①将聚乙二醇1000(PEG1000)和聚乙二醇1500(PEG1500)以1:1的质量比加入到三颈瓶中，在转速200r/min条件下，油泵控制真空度在-0.1MPa，外温145℃，内温130℃真空冷水回流2h，去除PEG1000和PEG1500中的少数水分；
②然后通高纯氮气冷却至室温，加入丙交酯(LA)、乙交酯(GA)，使LA/GA的比例为2:1，(LA+GA)/PEG比例为1:1，抽真空条件下外温加热至100℃5min至固体溶解；
③通氮气冷却至室温，加入催化剂辛酸亚锡后，装上回流冷凝装置，于外温120℃反应6h，反应液呈浅黄色澄清，停止加热抽真空20min，自然冷却至室温；
④用蒸馏水在4℃冰浴中溶解所得产物，加热至60℃产生沉淀，弃去上清液，重复操作3次，去除未反应的乙交酯、丙交酯和低分子量共聚物，收集未溶于水的沉淀得到粘稠无色和浅黄色透明产物；
⑤将所得产物真空冷冻干燥后于-20℃保存。
实施例8：
使用对比例1制备的PLGA-PEG-PLGA三嵌段凝胶配制成20％wt浓度的溶液10mL，加入0.02mL的美兰，将该混合溶液注入到猪胃黏膜下层，保证离体猪胃在37℃恒温条件下，观察隆起效果。
使用生理盐水溶液10mL，加入0.02mL的美兰，将该混合溶液注入到猪胃黏膜下层，保证离体猪胃在37℃恒温条件下，观察隆起效果。
使用高渗甘油果糖溶液10mL，加入0.02mL的美兰，将该混合溶液注入到猪胃黏膜下层，保证离体猪胃在37℃恒温条件下，观察隆起效果。
将注射的凝胶组隆起的粘膜表层剥离，沿隆起的标记边缘剥离粘膜表层，观察剥离效果。
结果如图4所示，图4(a)显示的是不同美兰溶液注射在猪胃粘膜下层的隆起高度和扩散程度，结果显示凝胶组的隆起高度最显著；图4(b)显示的是剥离粘膜表层后的效果图，生理盐水组美兰扩散面积最大，凝胶组扩散面积小；图4(c)显示凝胶组在剥离粘膜上层后，在手术结束时可以将注入的凝胶完全剥离，不会有凝胶残留在创口。
实施例1-4与对比例1相比，具有相似的粘膜下隆起和剥离效果，但对比例1中PLGA-PEG-PLGA三嵌段凝胶需要达到20％wt才具有较好的效果，而本发明的PA-PSH原位在体凝胶实施例可在3-17％范围内具有良好的粘膜下隆起和剥离效果，具有更大的应用潜力。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.一种原位在体凝胶，其特征在于，由丙烯酸酯化的泊洛沙姆407和巯基封端的泊洛沙姆407按照摩尔比1-10混合所得。
2.根据权利要求1所述的原位在体凝胶，其特征在于，所述的丙烯酸酯化的泊洛沙姆407和巯基封端的泊洛沙姆407的摩尔比是1-5。
3.一种原位在体凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)丙烯酸酯化的泊洛沙姆407的合成：将摩尔比为1:1-1:8的泊洛沙姆407和盐酸三乙胺溶解在干燥的四氢呋喃中；将反应溶液离心以除去盐酸三乙胺，并将上清液滴入石油醚中；沉淀后，真空干燥获得丙烯酸酯化的泊洛沙姆407；
(B)巯基封端的泊洛沙姆407的合成：将摩尔比为1:1-4:1的3,3-二硫代二丙酸和亚硫酰氯添加到圆底烧瓶中，然后将混合物加热至60-95℃，当白色粉末变成黄色液体时，DTDP完全反应；将混合物在60-95℃，真空下蒸馏以除去未反应的亚硫酰氯，然后获得二硫代二丙酰氯；将泊洛沙姆407，三乙酰胺和二硫代二丙酰氯溶解在四氢呋喃中，摩尔比在1:1～8:1～8之间；将该溶液在60-90℃下持续搅拌，反应4h以上；然后，冷却至室温，离心去除沉淀；将上清液滴入石油醚中沉淀，获得产物，此步重复多次；所获沉淀真空干燥得巯基封端的泊洛沙姆407；
(C)巯基封端的泊洛沙姆407中二硫键的裂解：二硫苏糖醇与巯基封端的泊洛沙姆407的摩尔比在1:10-1:50；氮气保护下，在pH 6.0-8.0条件下，反应2h以上；其中巯基封端的泊洛沙姆407的重量百分比在5-30％之间；反应后，用盐酸将溶液的pH调节至3.0-4.0，将上清液滴入石油醚中沉淀，获得产物，此步重复多次；所获沉淀真空干燥得去除二硫键的巯基封端的泊洛沙姆407；
(D)丙烯酸酯化的泊洛沙姆407与混合物的配比：丙烯酸酯化的泊洛沙姆407和步骤(C)去除二硫键的巯基封端的泊洛沙姆407之间的混合摩尔比在1-10，溶解于水或缓冲盐溶液中，pH调节至3.0-4.0；将溶液冷冻干燥后，获得丙烯酸酯化的泊洛沙姆407和巯基封端的泊洛沙姆407的混合物。
4.一种如权利要求1或2所述的原位在体凝胶的应用，用于制备内镜黏膜下切除和剥离术中的标记物载体。
5.根据权利要求4所述的原位在体凝胶的应用，其特征在于，所述的内镜黏膜下切除和剥离术为膀胱癌、食道癌、肠癌、胰腺癌、子宫癌、卵巢癌内镜黏膜下切除和剥离术。
6.根据权利要求4所述的原位在体凝胶的应用，其特征在于，所述的标记物载体中原位在体凝胶的质量百分比浓度为3～50％。
7.根据权利要求4所述的原位在体凝胶的应用，其特征在于，所述的标记物为临床常用内镜黏膜下剥离术染色标记物，包括但不局限于美兰、靛蓝；所述的染色标记物，在标记物载体中的浓度在1％(w/w)及以下。
8.一种用于内镜黏膜下切除和剥离术的原位在体凝胶制剂，其特征在于，所述凝胶制剂包含如权利要求1或2所述的原位在体凝胶，和染色标记物。
9.根据权利要求8所述的用于内镜黏膜下切除和剥离术的原位在体凝胶制剂，其特征在于，所述的制剂中原位在体凝胶的质量百分比浓度为3～50％。
10.根据权利要求8所述的用于内镜黏膜下切除和剥离术的原位在体凝胶制剂，其特征在于，所述的染色标记物为临床常用内镜黏膜下剥离术染色标记物，包括但不局限于美兰、靛蓝；所述的染色标记物，在制剂中的浓度在1％(w/w)及以下。
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