CN111826337B - 一种皮肤组织的体外培养基及应用 - Google Patents

Abstract

本公开属于皮肤组织体外培养技术领域，具体涉及一种皮肤组织的体外培养基及应用。hSOC作为一种模型对于人体皮肤相关疾病的研究具有重要意义，目前培养技术难以实现皮肤组织在体外培养过程中的长期保存，严重的限制了研究的进行。本公开提供了一种皮肤体外培养基——在William’s E培养基中添加Y‑27632，该培养基能够有效延长皮肤组织体外培养时间，维持皮肤组织结构的完整性。另外针对现有技术中报道的ROCK抑制剂对角质形成细胞的增殖促进作用，本公开进一步提供了Y‑27632通过激活PI3K/AKT、抑制RAF/ERK通路实现调节作用，提供了更为精确的作用机制。

Description

一种皮肤组织的体外培养基及应用

技术领域

本公开属于皮肤组织培养技术领域，具体涉及ROCK抑制剂在皮肤组织体外培养基中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

人体皮肤器官培养物(The human skin organ culture，hSOC)作为一种离体模型，相比体外模型能够更好的模拟机体状况。一个世纪之前，本领域开展了以hSOC作为模型的研究，该技术已被广泛运用于人体皮肤发育、分化功能等各个方面，便于展开皮肤相关疾病及皮肤附属物的生物学研究。然而，目前的培养技术难以实现皮肤组织在体外培养过程中的长期保存，严重的限制了研究的进行；在长时间的体外培养中保持表皮结构的完整性及hSOC的生理环境是个严峻的挑战。Zeltinger等人测试了11种培养基用于培养胎儿皮肤组织，发现无血清的DMEM/F12培养基能够较长时间的维持皮肤活力和完整性。Lu.等人采用无血清的William’s E培养基培养人的头皮皮肤并在16d时能够观测到毛发的生长，但是在培养的第5天皮肤组织就开始出现将进行变薄和过度角质化。Kleszczynski和Fisher采用相同的培养基对腹部皮肤进行培养，但只能维持48h。近期，Buckingham等人采用MEM添加的培养基培养包皮研究水痘-带状疱疹病毒感染后新生儿皮肤的自噬反应。发明人认为上述研究中的皮肤保存方法仍然无法实现长期保存，并且在培养过程中无法维持皮肤结构的完整性。

Rho相关蛋白激酶(Rho-associated kinase,ROCK)，包括两种同种型ROCK1和ROCK2。ROCK最初被发现具有调节细胞形状和迁移细胞骨架的作用，进一步研究表明它实际上具有多种生物学调节活性，如细胞存活、增殖和凋亡下游目标。Y-27632，一种成熟的ROCK抑制剂，可阻断ROCK1和ROCK2的调节作用，已被证明对多种干细胞的培养具有有益效果，其中包括人胚胎干细胞(hESCs)和人诱导的多能干细胞(hiPSCs)等。

发明内容

针对上述研究背景，本公开针对ROCK抑制剂——Y-27632应用于皮肤体外培养进行了研究，研究结果表明采用Y-27632添加的培养基对皮肤进行体外培养，能够显著的延长皮肤组织体外培养保存时间，同时维持皮肤结构完整性，维持表皮细胞数量。

McMullan R等人的研究表明Y-27632可显著增强表皮干细胞增殖并抑制角质形成细胞分化。本公开进一步的研究表明，Y-27632不仅能促进角质细胞的增殖和早期分化，还能维持角质细胞增殖、分化的平衡，一方面是通过激活PI3K/AKT通路来作用，另一方面是通过抑制RAF/ERK通路来作用。

针对上述研究结果，本公开提供以下技术方案：

本公开第一方面，提供ROCK抑制剂在制备体外培养皮肤组织的培养基中的应用。

优选的，所述皮肤组织为人体离体皮肤组织、动物离体皮肤组织、组织工程学皮肤、人工皮肤等。

相比现有技术中认为无血清培养基能够延长皮肤组织的体外培养时间，本公开研究结果表明，在无血清培养基中加入ROCK抑制剂——Y-27632能够有效的延长皮肤组织体外培养的维持时间，维持表皮结构完整性及表皮细胞数量，培养时间可达到28d。并且，本领域公知，皮肤包括表皮层及真皮层，其中表皮层又包括角质层及生发层，其中包含神经、血管、淋巴管、皮肤附属器等多种组织和不同类型的细胞，针对这样一个复杂的整体，本公开提供了一种成分简单的培养基，可以实现上述整体在体外培养状况下较长时间的维持，对于提供一种方便研究的体外皮肤模型具有重要意义。

本公开第二方面，提供ROCK抑制剂作为角质形成细胞增殖促进剂或早期分化促进剂的应用。

优选的，所述ROCK抑制剂作为PI3K/Akt通路激动剂或RAF/ERK通路阻断剂。

优选的，所述ROCK抑制剂作为角质形成细胞中Ki67、K1或K10激动剂。

优选的，所述ROCK抑制剂作为角质形成细胞中Loricrin或Fllaggrin抑制剂。

本公开第三方面，提供一种皮肤组织体外培养基，所述培养基为添加ROCK抑制剂的William’s E培养基。

优选的，所述培养基为悬浮培养基。

优选的，上述第一、第二或第三方面中，所述ROCK抑制剂为Y-27632。

进一步优选的，所述Y-27632的浓度为8～50μM。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

1.本公开提供了一种皮肤体外培养基——在William’s E培养基中添加Y-27632，该培养基能够有效延长皮肤组织体外培养时间，维持皮肤组织结构的完整性，维持表皮细胞数量。通过在培养基中添加Y-27632，可以有效将皮肤组织体外培养时间延长至28d。

2.另外针对现有技术中报道的ROCK抑制剂对角质形成细胞的增殖促进作用，本公开进一步提供了Y-27632不仅能促进角质细胞的增殖和早期分化，还能维持角质细胞增殖、分化的平衡，一方面是通过激活PI3K/AKT通路来作用，另一方面是通过抑制RAF/ERK通路来作用，提供了更为精确的作用机制。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为实施例中Y-27632促进维持hSOC中表皮结构；

其中，图1A为不同时间对照组及实验组皮肤HE染色结果，图中条带长度为100μm；

图1B中左则为培养3周时对照组和实验组的皮肤组织厚度对比图，右侧为培养第2周和第3周表皮组织厚度直方图，图中条带长度为20μm；

图1C中左侧为培养3周时对照组和实验组细胞核染色对比图，右侧为培养第2周和第3周阳性细胞计数直方图，图中条带长度为,50μm；

图2为实施例1中Y-27632对表皮组织维持效果图；

其中，图2A为对照组及实验组中K5表达含量荧光图；

图2B为对照组及实验组中K10表达含量荧光图；

图2C为对照组及实验组中Loricrin表达含量荧光图；图中条带长度为100μm。

图3为实施例1中Y-27632对角质形成细胞增殖和早期分化促进作用结果图，图中条带长度为100μm；

图3A为24h、48h及72h对照组及实验组中Ki67染色结果图；

图3B为24h、48h及72h对照组及实验组中Ki67阳性细胞数量直方图；

图3C为24h、48h及72h对照组及实验组中Ki67含量直方图；

图3D为24h、48h及72h对照组及实验组中K1含量直方图；

图3E为24h、48h及72h对照组及实验组中K10含量直方图；

图3F为24h、48h及72h对照组及实验组中Loricrin含量直方图；

图3G为24h、48h及72h对照组及实验组中Fllaggrin含量直方图；

图3H为培养72h是对照组及实验组中K5、K10及Loricrin染色效果图，图中条带长度为100μm。

图4为实施例1中Y-27632对悬浮培养的角质形成细胞增殖和早期分化的促进效果图；

其中，图4A为培养8h，24h，48h时对照组及实验组中Ki67含量直方图；

图4B为培养8h，24h，48h时对照组及实验组中K1含量直方图；

图4C为培养8h，24h，48h时对照组及实验组中K10含量直方图；

图4D为培养8h，24h，48h时对照组及实验组中Loricrin含量直方图；

图4E为培养8h，24h，48h时对照组及实验组中Fllaggrin含量直方图；

图4F为培养8h，24h，48h时K1,K10,Loricrin电泳条带图。

图5为实施例1中Y-27632对悬浮培养的角质形成细胞中Akt和ERK的调控作用结果图；

其中，图5A为培养1h、2h、4h、6h、8h、12h时p-Akt、Akt、P-Erk、Erk电泳条带图；

图5B为培养24h、48h、72h时p-Akt、Akt、P-Erk、Erk电泳条带图；

图5C为对照组及实验组中不同时间点p-Akt及p-Erk表达含量直方图；

图5D为对照组及实验组中p-Akt免疫组化染色结果图；

图5E为对照组及实验组中p-Akt表达含量直方图；

图5F为对照组及实验组中p-Erk免疫组化染色结果图；

图5G为对照组及实验组中p-Erk表达含量直方图。

图6为实施例中Y-27632通过调节PI3K/Akt和RAF/ERK保持hSOC中表皮结构的完整性结果图；

其中，表皮细胞培养48h后收集并进行qRT-PCR分析，图6A-6F依次为标志物Ki67,K1,K10,Loricirin，Fallagrin，involucrin表达含量直方图；注释：CON:control,Y:Treated with Y-27632,W:wortmannin,Y+W:Y27632+wortmannin,S:sorafenib,Y+S:Y-27632+Sorafenib

图6G为对照组、Y-27632组、wortmannin组及索拉非尼组培养第1周和第3周组织学染色结果图；

图6H为对照组、Y-27632组、wortmannin组及索拉非尼组培养第1周和第3周表皮厚度直方图；

图6I为对照组、Y-27632组、wortmannin组及索拉非尼组DAPI染色阳性细胞数量直方图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中尚无法实现皮肤组织的长期体外培养，并且在较长时间的体外培养过程中，无法维持皮肤组织的结构完整性。为了解决如上的技术问题，本公开提供了ROCK抑制剂在皮肤组织体外培养中的应用，通过向William’s E培养基中添加适量的Y-27632，可以有效的提高皮肤组织在体外培养的时间，且培养过程中，皮肤组织的结构性更加完整。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

1.材料

hSOC获取方法按照文献“Lu et al.Towards the development of a simplifiedlong-term organ culture method for human scalp skin and it appendages underserum-free conditions.Exp Dermatol.2007；16(1):37-44.”中公开的方法获得。将人类乳房部分皮肤切割成为5mm*5mm的块状，保存于培养基中，使其漂浮于空气/液面界面处，每日更换培养基。其中，实验组使用添加Y-72632(30μM)的William’s E培养基，对照组使用无添加的William’s E培养基。

2.Y-27632促进维持hSOC中的表皮结构

如图1A所示，分别在7d、14d、21d and 28d收集皮肤组织进行组织学分析。HE染色结果表明：14d时，皮肤组织明显变薄；21d时，皮肤组织仅剩下一层细胞并在22d时与表皮组织脱离。采用Y-27632进行培养的皮肤组织结构可以维持2周以上，如图1A所示，加入Y-27632进行培养的皮肤组织在28d时仍然能够保留若干层表皮细胞。如图1B所示，培养至21d时，Y-27632培养组的皮肤厚度显著优于对照组，通过细胞核染色针对表皮细胞计数的结果如图1C所示，实验组皮肤中表皮细胞数量显著多于对照组。

3.Y-27632维持hSOC中表皮的分化状态

为了维持表皮的完整性，角质形成细胞需要经历一个被高度监管的正常分化计划，角蛋白5(K5)是一种仅在基底角质形成细胞表达的物质，为了分析表皮的状态，本实施例采用免疫荧光(IF)染色未分化的标记物K5。如图2A所示，在实验组及对照组中，多数K5阳性细胞位于表皮的基底部分，培养至14d时，实验组及对照组中仍然能够观察到K5阳性细胞的存在。

为了进一步分析，本实施例中还选取了基底细胞标记物角蛋白10(K10)，如图2所示，基底细胞中并不表达K10。如图2B所示，在对照组中，随着培养时间的延长，阳性细胞逐渐消失，培养持续至14d时，一些基底上细胞中K10表达降低，培养至21d时，仅能检测到一层K10表达阳性细胞。与之相反的，在实验组中，基底上细胞能够稳定且大量表达K10，培养至21天时，仍然能够检测到多层K10阳性细胞。

最后，本实施例对终末分化标记物loricrin进行了检测，该标记物与表皮屏障功能相关。如图2C所示，loricrin表达位于两组中表皮的最外层，对照组中，loricin阳性层在培养7d后中断，并且一些loricin阳性表达细胞中含有细胞核结构。实验组的皮肤中loricin表达的模式相对正常，表明采用Y-27632培养能够保持角质层的完整性。综合上述K5,K10,loricrin的检测结果可以很好的证明，采用Y-27632对皮肤结果进行培养有利于角质形成细胞的正常分化，延长表皮结构完整性的维持时间。

4.Y-27632促进角质形成细胞的增殖及K1和K10表达

本实施例对角质形成细胞的早期增殖和分化进行研究。首先，在前三天培养过程中，通过IF染色对皮肤组织中的Ki-67进行标记，如图3A所示，在对照组和实验组中，增殖细胞主要位于皮肤组织的基底层，并且实验组中增殖细胞数量更多。如图3B所示，通过定量分析实验表明，培养24h至72h过程中，对照组表皮结构中增殖细胞的百分比降低，而实验组中增殖细胞百分比数量增加，进一步证实了Y-27632的处理能够促进角质形成细胞的增殖。如图3C表示，采用实时PCR对皮肤组织中Ki-67的表达进行分析，实验组自24h至72h显示出显著的表达含量增加。图3D-E显示K1表达增加，通过总RNA分析不同标志物的表达，图3D-E显示了每个时间点实验组中K1和K10的表达情况；依据图3F-G的显示，实验组的皮肤结构中loricin和flaggrin在培养的24h内可以被观察到，在48h或72h，对照组和实验组的终末分化标志物表达没有明显的差异。为了进一步确认Y-27632对角质形成细胞分化的应用，本实施例采用IF染色对分化标志物K5,K10和loricrin对培养72h的组织进行染色。从图3H中可以看出，在Y-27632处理的皮肤中，K10的染色更强，而K5和loricrin的表达与对照组没有明显的差异。以上数据可以表明Y-27632可以增加角质形成细胞的增殖和器官培养过程中K1和K10分化标志物的含量。

5.Y-27632促进悬浮培养状态下角质形成细胞的增殖和K1、K10的表达

为了进一步确认Y-27632在角质形成细胞的增殖和分化的影响，本实施例采用悬浮培养的方式对角质形成细胞进行培养，将其诱导形成分化的体外细胞模型，同时培养基中加入10μM Y-27632。在不同的时间点收集角质形成细胞，通过qPCR分析细胞增殖和分化标志物的含量。

图4A表示Y-27632促进了Ki-67的表达，图4B-C显示，相比对照组，Y-27632可诱导角质形成细胞中K1和K10的表达，针对hSOC进行培养也显示相同的结果。然而，Y-27632显著降低了角质形成细胞中Loricrin和filaggrin的含量，在hSOC中却没有观测到这种表现。为了证实qPCR的结果，本实施例对不同时间点的角质形成细胞裂解处理，通过western-blot分析其中的标志物，结果如图4F所示，Y-27632诱导悬浮培养的角质形成细胞中K1和K10的表达，但是抑制了角质形成细胞中loricrin的表达。

6.Y-27632促进角质形成细胞中的Akt、抑制ERK

为了进一步研究Y-27632影响皮肤组织中角质形成细胞增殖和分化的机制，本实施例对Akt和ERK通路进行分析，上述通路在调节角质形成细胞增殖和分化过程中具有重要的作用。图5A-B为western-blot检测Akt和ERK的磷酸化水平结果，量化的数据结果如图5C所示。依据图5A所示，悬浮培养6h后，采用Y-27632培养的角质形成细胞中Akt的活性相比未添加Y-27632培养的细胞显著增加，并且对Akt的激动作用可以持续到72h(图5B)。相反的，Y-27632培养组中在悬浮培养1h后ERK活性下调，而随着培养时间的延长，对照组及实验组中p-ERK的表达差异逐渐变小，直到72h时表达差异无法区分。根据量化结果显示，对照组在没有Y-27632的情况下，Akt活性降低，ERK活性随着培养时间延长而增加(图5C)。此外，通过检测培养1周的hSOC衍生的皮肤细胞中p-Akt及p-ERK(图5D，F)及相应的量化分析(图5E,G),进一步证实了Y-27632对Akt活性的激动作用及对ERK的抑制作用。

7.Y-27632通过调节Akt和ERK的活性来维持hSOC中完整的皮肤结构

为了验证Y-27632是否通过Akt和ERK途径调节角质形成细胞的增殖和分化，本实施例分别在对照组和实验组悬浮培养基中加入Akt抑制剂——Wortmannin或ERK通路阻断剂——索拉非尼。培养至48h，将细胞裂解后通过RT-PCR分析增殖标志物Ki-67及分化标志物，如图6A所示，Y-27632诱导的Ki-67表达能够被Wortmannin阻断，但不能被索拉非尼阻断，表明Y-27632可能是通过激活Akt实现增殖作用。图6B-C显示Y-27632诱导的K1/K10表达可被Akt和ERK抑制剂所阻断。图6D-F显示Akt抑制剂没有明显的降低终末分化标志物的表达，无法改善Y-27632对终末分化的抑制作用，然而ERK抑制剂能够明显的阻断悬浮培养诱导的分化，无论Y-27632是否存在。之后，本实施例在Wortmannin及索拉非尼存在的条件下培养hSOC，并测试Y-27632是否依然还能够维持表皮结构以及调节Akt和ERK活性。第一周，图6G对照组中，表皮结构能够保持一定的完整性，Y-27632及索拉非尼培养组、wortmannin培养组开始出现角质层缺失。第三周时，wortmannin培养组中表皮结构完全丧失。虽然，索拉非尼培养组中表皮结构相比wortmannin培养组要完整的多，但相比Y-27632培养的皮肤组织更薄，该结果表明单独采用ERK抑制剂并不能保持表皮结构的完整性。通过分析表皮的厚度及表皮细胞数量(图6H)进一步验证了上述结果。综合上述结果，Y-27632通过调节hSOC组织中Akt和ERK的活性来维持表皮结构的完整性。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (2)

1.ROCK抑制剂作为角质形成细胞早期分化促进剂的应用，其特征在于，所述应用中，培养基为添加ROCK抑制剂的William’s E培养基，所述培养基为悬浮培养基，所述ROCK抑制剂为Y-27632。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Y-27632的浓度为8～50μM。

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